Tài liệu Nghiên cứu tác dụng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết cây huyền diệp (polyalthia longifolia var.pendula) và điều trị thử nghiệm bệnh viêm vú trên đàn bò sữa tại khu vực gia lâm – hà nội

MỤC LỤC Lời cam đoan....................................................................................................... ii Lời cảm ơn ......................................................................................................... iii Mục lục ............................................................................................................. iv Danh mục bảng ................................................................................................. vii Danh mục hình ................................................................................................. viii MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 1 1.1. Đặt vấn đề .................................................................................................... 1 1.2. Mục tiêu của đề tài: ...................................................................................... 2 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ....................................................... 3 1.3.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài ................................................................ 3 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài ................................................................. 3 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................... 4 1.1. Hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn và tồn dư kháng sinh trong sản phẩm chăn nuôi ........................................................................................... 4 1.1.1. Hiện tượng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn ............................... 4 1.1.2. Vấn đề tồn dư kháng sinh trong các sản phẩm chăn nuôi..................... 5 1.2. Tình hình nghiên cứu và sử dụng sản phẩm thảo dược trên thế giới và Việt Nam ................................................................................................................. 6 1.2.1. Tình hình nghiên cứu và sử dụng sản phẩm thảo dược trên thế giới ............6 1.2.2. Tình hình nghiên cứu và sử dụng sản phẩm thảo dược ở Việt Nam ...........10 1.3. Cây Huyền diệp (Polyalthia longifolia var.pendula Hort.) ........................... 13 1.3.1. Nguồn gốc phân loại ......................................................................... 13 1.3.2. Mô tả thực vật................................................................................... 14 1.3.3. Thành phần hóa học .......................................................................... 14 1.3.4. Tổng quan các nghiên cứu về tác dụng kháng vi sinh vật của cây Huyền diệp ........................................................................................ 16 1.4. Bệnh viêm vú ở Bò sữa ............................................................................... 18 1.4.1. Khái niệm về bệnh. ..................................................................................... 18 1.4.2. Nguyên nhân gây bệnh viêm vú bò .......................................................... 18 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iv 1.4.3. Chẩn đoán bệnh Viêm vú .......................................................................... 21 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......... 25 2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................... 25 2.2. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................. 25 2.2.1. Bò sữa........................................................................................................... 25 2.2.2. Cao khô lá cây Huyền diệp ........................................................................ 25 2.2.3. Vi khuẩn nghiên cứu .................................................................................. 26 2.2.4. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất thí nghiệm................................................. 26 2.3. Nội dung nghiên cứu .................................................................................. 26 2.4. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................ 27 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................... 31 3.1. Khảo sát tình hình chăn nuôi bò sữa và tỷ lệ bò mắc bệnh viêm vú tại xã Phù Đổng, huyện Gia Lâm, Hà Nội. ............................................................. 31 3.1.1. Cơ cấu đàn bò sữa tại xã Phù Đổng những năm qua.............................. 31 3.1.2. Cơ cấu giống đàn bò sữa tại xã Phù Đổng............................................... 32 3.1.3. Kết quả khảo sát tỷ lệ bò sữa mắc bệnh viêm vú lâm sàng tại xã Phù Đổng. .................................................................................................... 34 3.2. Nghiên cứu những nhân tố ảnh hưởng đến bệnh viêm vú bò sữa................. 35 3.2.1. Khảo sát tỷ lệ bò mắc bệnh viêm vú theo mùa tại xã Phù Đổng .......... 35 3.2.2. Ảnh hưởng của lứa đẻ đến bệnh viêm vú bò sữa tại xã Phù Đổng....... 36 3.2.3. Ảnh hưởng của giống bò sữa tới bệnh viêm vú tại xã Phù Đổng ......... 38 3.3. Kết quả phân lập vi khuẩn và thử kháng sinh đồ ......................................... 39 3.3.1. Kết quả xác định loài vi khuẩn trong mẫu sữa dương tính.................... 39 3.3.2. Kết quả xác định tính mẫn cảm của các vi khuẩn phân lập được từ sữa bò bị viêm vú với một số thuốc kháng sinh và hoá trị liệu ....... 41 3.4. Đánh giá khả năng kháng khuẩn in vitro của dịch chiết lá Huyền diệp ........ 43 3.4.1. Khả năng kháng khuẩn của dịch chiết lá cây Huyền diệp đối với vi khuẩn Staphylococcus aureus phân lập từ sữa bò bị viêm vú .......... 43 3.4.2. Khả năng kháng khuẩn của dịch chiết lá cây Huyền diệp đối với vi khuẩn Streptococcus spp. phân lập từ sữa bò bị viêm vú ................. 46 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page v 3.4.3. Đánh giá khả năng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết lá Huyền diệp khi pha loãng. ..................................................................................... 48 3.5. Sử dụng cao dịch chiết lá Huyền diệp điều trị thử nghiệm trên bò bị viêm vú. ................................................................................................................. 50 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................... 53 KẾT LUẬN ....................................................................................................... 53 KIẾN NGHỊ ...................................................................................................... 54 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vi DANH MỤC BẢNG STT 2.1 Tên hình Trang Bảng tiêu chuẩn đánh giá khả năng mẫn cảm và kháng thuốc của vi khuẩn [tiêu chuẩn CLSI 2010].......................................................... 28 3.1 Kết quả khảo sát cơ cấu đàn bò sữa tại xã Phù Đổng ............................ 31 3.2 Cơ cấu giống đàn bò sữa tại xã Phù Đổng ............................................ 33 3.3 Kết quả khảo sát tỷ lệ bò mắc bệnh viêm vú lâm sàng .......................... 34 3.4 Tỷ lệ bò mắc bệnh viêm vú theo mùa tại xã Phù Đổng ......................... 35 3.5 Tỷ lệ bò sữa mắc bệnh viêm vú theo lứa đẻ tại xã Phù Đổng ................ 37 3.6 Bệnh viêm vú bò sữa tại xã Phù Đổng theo các giống .......................... 38 3.7 Thành phần loài vi khuẩn có trong sữa bò bình thường và sữa bò viêm vú ................................................................................................ 40 3.8 Kết quả thử nghiệm tính mẫn cảm với các kháng sinh chuẩn................ 42 3.9 Kết quả kháng sinh đồ các dịch chiết lá huyền diệp đối với vi khuẩn Staphylococcus aureus phân lập từ sữa bò bị viêm vú ................ 44 3.10 Kết quả kháng sinh đồ các dịch chiết lá huyền diệp đối với vi khuẩn Streptococcus spp ...................................................................... 46 3.11 Khả năng ức chế vi khuẩn khi pha loãng cao khô dịch chiết lá cây Huyền diệp .................................................................................... 49 3.12 Kết quả thử nghiệm điều trị bò bị viêm vú lâm sàng............................. 51 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vii DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 1.1. Cây và các bộ phận của cây Huyền diệp................................................ 14 2.1. Hệ nồng độ pha loãng cao đặc để xác định nồng độ tối thiểu tác dụng trên vi khuẩn thử nghiệm .............................................................. 29 3.1. Cơ cấu đàn bò hiện nay tại xã Phù Đổng ............................................... 32 3.2. Cơ cấu về giống của đàn bò sữa xã Phù Đổng ....................................... 33 3.3. Tỷ lệ bò mắc bệnh viêm vú lâm sàng .................................................... 34 3.4. Tỷ lệ bò mắc bệnh viêm vú theo mùa tại xã Phù Đổng .......................... 36 3.5. Tỷ lệ bò sữa viêm vú theo lứa đẻ xã Phù Đổng...................................... 37 3.6. Bệnh viêm vú bò sữa tại xã Phù Đổng theo các giống ........................... 38 3.7. Thành phần vi khuẩn trong sữa bò bình thường và sữa bò bị viêm vú .............41 3.8. Kết quả làm kháng sinh đồ của 02 chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus và Streptococcus spp. đối với 14 loại kháng sinh ....................... 43 3.9. Kết quả kháng sinh đồ của 5 loại DC trên vi khuẩn Staphylococcus aureus ......................................................................... 45 3.10. Kết quả so sánh tác dụng kháng khuẩn của 5 loại DC trên vi khuẩn Streptococcus spp ................................................................................. 47 3.11. Khả năng diệt khuẩn in vitro của cao khô dịch chiết lá cây Huyền diệp, ở nồng độ 100mg/ml .................................................................... 47 3.12. Tỷ lệ bò hết triệu chứng viêm vú theo thời gian điều trị ........................ 52 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page viii MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Năm 2001, Thủ tướng Chính phủ ký Quyết định số 167/2001/QĐ/TTg về một số biện pháp và chính sách phát triển chăn nuôi bò sữa giai đoạn 2001- 2010, trong đó quy định rất nhiều chính sách hỗ trợ hấp dẫn cho các tổ chức và cá nhân tham gia chăn nuôi và kinh doanh bò sữa. Năm 2011, Thành phố Hà Nội ký Quyết định 2801/QĐ-UBND về việc phê duyệt “Chương trình Phát triển chăn nuôi theo vùng, xã trọng điểm và chăn nuôi quy mô lớn ngoài khu dân cư giai đoạn 2011-2015”. Nhiều tỉnh cũng đưa ra nghị quyết lấy bò sữa làm con vật nuôi chủ lực để chuyển đổi cơ cấu kinh tế và có các chính sách ưu đãi đặc biệt với ngành chăn nuôi bò sữa. Tuy nhiên trong chăn nuôi bò sữa hiện nay việc chăm sóc nuôi dưỡng bò sữa theo các quy trình kỹ thuật, đặc biệt các quy trình vệ sinh phòng bệnh cho bò sữa với người chăn nuôi còn hạn chế nhiều nên các bệnh xảy ra làm ảnh hưởng không nhỏ đến hiệu quả chăn nuôi. Một trong những bệnh gây thiệt hại lớn đến ngành chăn nuôi bò sữa là bệnh viêm vú. Bệnh xảy ra gây thiệt hại lớn về kinh tế, làm giảm sản lượng, chất lượng sữa, điều trị tốn kém, một số thuốc thường dùng trước đây đến giờ tỏ ra bất lực và khả năng phải loại thải bò, gây tâm lý lo lắng cho người chăn nuôi (Nguyễn Ngọc Nhiên và cs., 1997; Trần Tiến Dũng, 1999; Trương Quang và cs., 2008). Thông thường, bò bị vú sẽ được điều trị với kháng sinh. Điều này làm nảy sinh ba vấn đề quan trọng đó là thiệt hại kinh tế, mất an toàn vệ sinh thực phẩm và kháng kháng sinh ở vi khuẩn. Nhằm tháo gỡ những khó khăn đó, nhiều nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu, sử dụng chiết xuất của các thảo dược nhằm điều trị viêm vú cho bò mắc bệnh. Với những nguồn gốc tự nhiên, chiết xuất thảo dược được cho là an toàn đối với bò và người sử dụng sữa. Rất nhiều thảo dược đã được các nhà nghiên cứu trên toàn thế giới chứng minh là có tác dụng với vi khuẩn gây bệnh. Việc sử dụng cây thuốc trong điều trị các bệnh do vi khuẩn đang ngày càng được ưa chuộng bởi tính an toàn, ít tác dụng phụ và khả năng gây kháng chậm (Nguyễn Văn Thanh và Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 1 Nguyễn Thanh Hải, 2014). Các chất có nguồn gốc thiên nhiên, dù được sử dụng dưới dạng truyền thống hay các dạng đã được tinh chế và chiết tách được đánh giá là một nguồn đáng kể cho việc tìm hiểu và khám phá ra các thuốc thay thế các chất hóa học tổng hợp. Thảo dược đang ngày càng chứng minh vai trò quan trọng của mình trong nền công nghiệp dược phẩm như là một giải pháp an toàn thay thế cho các thuốc hóa học tổng hợp (Mahesh and Satish, 2008; Nguyễn Thanh Hải và Bùi Thị Tho, 2013). Cây Huyền diệp (Polyalthia longifolia var.pendula Hort.) thuộc họ Mãng Cầu (Na) – Annonaceae còn gọi là cây Hoàng Nam hay Tùng Ấn Độ, được phân bố rộng rãi ở Bangladesh , Srilanka và trải đều tại các vùng nóng của Ấn Độ. Hiện nay cây Huyền diệp đã được du nhập vào Việt Nam. Tại Ấn Độ và các nước Nam Á cây Huyền diệp được sử dụng như một loại thảo dược khá thông dụng để giải nhiệt, điều trị sốt, cảm lạnh, hạ huyết áp, đái đường, bệnh lậu, rong kinh, bệnh viêm tử cung (Chanda and Nair, 2010). Các tài liệu cho thấy hầu hết những cây thuộc họ Annonaceae đều có chứa các hoạt chất chống ung thư. Các hoạt chất được chiết xuất từ những bộ phận của cây Huyền diệp có tính kháng khuẩn, chống viêm, loét, giải độc, bảo vệ gan, hạ huyết áp và kháng nấm tốt (Saleem et al., 2005; Malairajan et al., 2008; Misra et al., 2010; Singh et al.,2012; Anzana Parvin et al., 2013). Xuất phát từ thực tế trên, nhằm giảm thiệt hại, giảm chi phí điều trị và khắc phục hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh viêm vú chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu tác dụng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết cây Huyền diệp (Polyalthia longifolia var.pendula) và điều trị thử nghiệm bệnh viêm vú trên đàn bò sữa tại khu vực Gia Lâm – Hà Nội”. 1.2. Mục tiêu của đề tài: Nắm được thực trạng tỷ lệ bò mắc bệnh viêm vú trên địa bàn xã Phù Đổng huyện Gia Lâm, thành phố Hà Nội. Phân lập và đánh giá tỷ lệ các loài vi khuẩn có trong sữa bò bị viêm vú bò sữa. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 2 Thử kháng sinh đồ với 02 chủng vi khuẩn Staphylococus aureus và Streptococus spp. phân lập từ sữa bò bị viêm vú. Đánh giá khả năng kháng khuẩn in vitro của cao khô dịch chiết lá cây Huyền diệp sử dụng các dung môi khác nhau đối với vi khuẩn Staphylococus aureus và Streptococus spp. phân lập từ sữa bò mắc bệnh viêm vú. Dựa trên kết quả nghiên cứu khả năng diệt khuẩn in vitro, điều trị thử nghiệm bò bị viêm vú sử dụng cao khô dịch chiết lá cây Huyền diệp. 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 1.3.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài Chứng minh một cách khoa học về khả năng diệt khuẩn của lá cây Huyền diệp. Sơ bộ định tính được các nhóm chức có khả năng diệt khuẩn (kháng sinh thực vật) có trong lá cây. Góp phần bổ sung cơ sở lý luận về tác dụng dược lý và ứng dụng trong dân gian của dược liệu lá cây Huyền diệp. 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài Kết quả của nghiên cứu này giúp ta hiểu rõ hơn về khả năng ứng dụng của lá cây Huyền diệp trong điều trị bệnh do vi khuẩn Staphylococus aureus. và Streptococus spp. phân lập từ sữa bò mắc bệnh viêm vú. Trên cơ sở của kết quả nghiên cứu có thể nghiên cứu điều trị thử nghiệm trên quy mô lớn. Tiến tới ứng dụng dịch chiết lá cây Huyền diệp trong phòng và điều trị bệnh viêm vú bò nói riêng và vật nuôi nói chung trong thực tiễn, góp phần giảm thiểu sự tồn dư kháng sinh trong sản phẩm chăn nuôi đồng thời hạn chế sự kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn, góp phần bảo vệ môi trường và sức khỏe cộng đồng. Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở cho việc đề ra những biện pháp cụ thể nhằm quản lý, bảo vệ và phát triển đàn bò sữa của địa phương cả về số lượng và chất lượng, đồng thời đề tài giúp người chăn nuôi bò sữa có những kỹ thuật cơ bản trong công tác phòng và trị bệnh viêm vú, giảm thiểu thiệt hại do bệnh gây ra góp phần sản xuất sữa sạch, an toàn cho người tiêu dùng, nâng cao năng suất của đàn bò sữa và thu nhập của người chăn nuôi. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 3 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn và tồn dư kháng sinh trong sản phẩm chăn nuôi 1.1.1. Hiện tượng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn Tổ chức Y tế thế giới (WHO) ngày 30-4-2014 ra cảnh báo kháng thuốc kháng sinh là mối đe dọa nghiêm trọng đến sức khỏe cộng đồng. Sau khi thu thập dữ liệu tại 114 quốc gia trên toàn cầu về tình trạng kháng thuốc, trong đó đặc biệt là kháng sinh, báo cáo của WHO nêu rõ mối đe dọa nghiêm trọng này không còn là dự báo cho tương lai mà đang diễn ra ở mọi khu vực trên thế giới, có nguy cơ ảnh hưởng tới mọi người dân ở mọi lứa tuổi và các quốc gia khác nhau. Theo Trợ lý Tổng Giám đốc WHO, Keiji Fukuda, nếu không phối hợp hành động tức thời, thế giới sẽ đối mặt với một kỷ nguyên “hậu thuốc kháng sinh”, khi đó các bệnh truyền nhiễm thông thường hoặc những vết thương nhỏ trước đó có thể chữa trị được thì nay có thể gây chết người do kháng thuốc kháng sinh (WHO, 2014). Có rất nhiều nguyên nhân gây ra hiện tượng kháng thuốc kháng sinh của vi sinh vât, như sự sử dụng thuốc kháng sinh một cách bừa bãi, không đúng cách, không tôn trọng liều lượng và thời gian trị liệu, cũng như không chịu uống cho thật hết số thuốc như bác sĩ đã kê toa. Ngoài ra việc lạm dụng thuốc kháng sinh trong chăn nuôi thú y, canh nông và ngư nghiệp cũng dự phần không nhỏ trong sự hình thành của hiện tượng kháng kháng sinh. Cuối cùng là vấn đề dùng các chất diệt khuẩn để chùi rửa quá thường xuyên, không đúng chỉ dẫn cũng có thể giúp sản sinh ra những dòng vi khuẩn có tính kháng thuốc (A report from the American academy of Microbiology, 2009) Theo nghiên cứu của Phạm Khắc Hiếu và Bùi Thị Tho (1999) đã tìm thấy chủng vi khuẩn kháng lại 11 loại kháng sinh, đồng thời cũng chứng minh khả năng di truyền tính kháng thuốc giữa các vi khuẩn thông qua plasmid. Theo nghiên cứu của Cù Hữu Phú và cs. (1999), 80 - 90% vi khuẩn Salmonella phân lập được kháng mạnh với Penicillin và Ampicillin. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 4 Nguyễn Ngọc Nhiên và cs. (2000) khi nghiên cứu các chủng phân lập từ sữa bò bị viêm vú cho thấy hầu hết các chủng phân lập được đều kháng lại nhiều loại kháng sinh như Chloramphenicol, Sulfadimethoxine, Tetracycline... Các chủng vi khuẩn Salmonella có độ mẫn cảm cao với Furazolidon (100%), Chloramphenicol (87,5%), ít mẫn cảm với Penicillin (25%) và hoàn toàn kháng lại Tetracyclin (Đỗ Trung Cứ và cs., 2003) Nghiên cứu tính kháng kháng sinh của 106 chủng vi khuẩn phân lập được từ lợn con theo mẹ bị tiêu chảy ở một số tỉnh phía Bắc, Việt Nam, Đỗ Ngọc Thúy, (2002) đã thu được kết quả các chủng có xu hướng kháng mạnh với các loại kháng sinh thông thường dùng để điều trị đặc biệt với Streptomycin lên tới 88,68%. Hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn với trên 3 loại kháng sinh là khá phổ biến (chiếm 90,57%). Theo số liệu giám sát trong năm 2012 tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương, tỷ lệ kháng ampicilin của E.coli lên tới 81,4%; kháng amoxicillin/clavunanic và ampicillin/sulbactam khoảng 40%. Các kháng sinh nhóm cephalosporin thế hệ ba cũng bị kháng đến gần một nửa, và nhóm fluoroquinolon cũng bị kháng khoảng 45%. Theo nghiên cứu của Nguyễn Bá Phước (2014), E. coli và Salmonella spp. phân lập từ phân chó bị bệnh đã kháng lại nhiều kháng sinh thông dụng, hiện tượng đa kháng (multyresistance) đã xuất hiện. Vi khuẩn E. coli đã kháng lại cùng một lúc 6 loại kháng sinh, tương tự vi khuẩn Salmonella spp. kháng lại 4 loại kháng sinh. Theo nghiên cứu của Phạm Thanh Xuân (2014), vi khuẩn E. coli và Salmonella spp. phân lập từ phân chó bị tiêu chảy đã có hiện tượng kháng với 45 loại kháng sinh thông dụng cùng lúc (đa kháng multyresistance) ( E. coli kháng lại kháng sinh tetracyclin, doxycyclin, norfloxacin, ofloxacin và Salmonella spp. neomycin, kanamycin, tetracyclin). 1.1.2. Vấn đề tồn dư kháng sinh trong các sản phẩm chăn nuôi Ngày nay, chất kháng sinh được sử dụng rộng rãi trong ngành nông nghiệp như chăn nuôi, trồng trọt, nuôi trồng thủy hải sản, có tác dụng rất lớn là giúp cho Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 5 vật nuôi trồng chống lại bệnh tật từ vi sinh vật. Tuy vậy, chất kháng sinh như một con dao hai lưỡi. Một mặt giúp sinh vật chông lại bệnh tật, mặt khác, có thể làm cho sinh vật xuất hiện phản ứng phụ, và đặc biệt là lượng chất kháng sinh tồn dư sinh vật có thể ảnh hưởng đến chất lượng thực phẩm, nhất là sức khỏe người tiêu dùng. Theo Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn Thành phố Hồ Chí Minh (TP HCM), trong đợt kiểm tra an toàn thực phẩm những tháng đầu năm 2014, cơ quan chức năng đã phát hiện nhiều mẫu thịt có tồn dư kháng sinh vượt ngưỡng. Cụ thể, khi lấy ngẫu nhiên 60 mẫu thịt (30 mẫu thịt heo, 30 mẫu thịt gia cầm) từ TP HCM và các tỉnh đem về giết mổ tại 2 cơ sở giết mổ lớn trên địa bàn thành phố, cơ quan chức năng phát hiện 13/30 mẫu thịt heo (tỉ lệ 43,33%) có nguồn gốc từ Bình Dương, Bến Tre, Bình Thuận, Đồng Nai, Bà Rịa - Vũng Tàu và 1/30 mẫu thịt gia cầm (3,33%) có hàm lượng kháng sinh sulfadimidin vượt giới hạn cho phép (Báo người Lao Động, 2014). Kháng sinh tetracycline trong 290 mẫu thịt lợn trên thị trường thuộc các quận huyện nội, ngoại thành Hà Nội được xác định bằng phương pháp kiểm tra khả năng ức chế vi khuẩn trên đĩa thạch (agar inhibition test) với chủng Bacillus cereus (ACTT 11778). Các mẫu ghi ngờ được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (high-performance liquid chromatography; HPLC). 5.5% số mẫu nói trên cho kết quả dương tính (có tồn dư kháng sinh tetracycline) (Duong Van Nhiem, 2005). 1.2. Tình hình nghiên cứu và sử dụng sản phẩm thảo dược trên thế giới và Việt Nam 1.2.1. Tình hình nghiên cứu và sử dụng sản phẩm thảo dược trên thế giới Thuốc phòng trị bệnh cho người và thú nuôi hầu hết được bào chế từ hai nguồn dược liệu và hóa chất. Riêng thảo dược theo thống kê của tổ chức Y tế thế giới đạt tới 20.000 loài. Việc sử dụng thảo dược hiện không chỉ các nước Á Đông mà các nước phương Tây cũng tiêu thụ một lượng khá lớn. Ở các nước có nền công nghiệp phát triển có tới 1/4 số thuốc có kê trong đơn đều chứa hoạt chất từ thảo dược. Riêng ở Mỹ năm 1980 con số thuốc này đã có giá trị 8 tỷ USA (Viện Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 6 dược liệu, 2005). Trong những năm gần đây xu hướng thế giới dùng thuốc thảo dược tự nhiên (không tách hoạt chất) ngày càng nhiều. Hiện có rất nhiều biệt dược, đông dược của Trung Quốc được tiêu thụ mạnh ở các nước châu Âu. Ngày nay dược liệu có vai trò sau: + Dược liệu là nguồn cung cấp nguyên liệu cho việc bán tổng hợp một số hóa dược: Từ chất diosgenin của củ mài để bán tổng hợp lên thuốc steroid được sử dụng nhiều trong lâm sàng. + Nhiều hoạt chất quan trọng: quinin, emetin, strychnin, morphin, ajmalin, vincaleucoblastin,… đều phải chiết ra từ dược liệu vì chưa tổng hợp được. + Dược liệu mở đường cho ngành công nghiệp hóa dược phát triển: - Biết được công thức của ephedrin hoá dược đã ngưng tụ L-1-phenuy-1acetyl carbinol với methylamin để có ephedrin tổng hợp. - Dựa vào công thức của quinin trong vỏ canh-ki-na để tổng hợp rất nhiều dẫn chất trị ký sinh trùng sốt rét. - Dựa vào artemisinin của cây thanh hao hoa vàng, các dẫn chất artesunat, arteether, artemether được bán tổng hợp cũng để trị ký sinh trùng sốt rét (Hoàng Thị Tuyết Nhung, 2012). Từ 1950-1980 thế giới đã thử tác dụng chống ung thư như: taxol (paclitaxe) của cây Taxus brevfolia Nutt, họ Taxaceae có tác dụng chữa ung thư buồng trứng ở thời kỳ tiến triển. Năm 1992 ở Mỹ, Canada và Pháp đã sử dụng taxol trên lâm sàng. Hiện nay người ta đang nghiên cứu tổng hợp các dẫn chất mới từ taxol (Kingston et al, 1990; Karpagam et al, 2009). Các kết quả trên chỉ mới bước đầu thử nghiệm sàng lọc các loại thảo dược chưa xác định được thành phần nào trong thực vật có tác dụng trên virus và vi khuẩn. Ngày nay, với kỹ thuật sàng lọc hoạt tính sinh học mới, hiện đại với tốc độ nhanh, lượng mẫu nhỏ, việc phát hiện các hoạt chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học mới là rất có triển vọng. Sau khi phát hiện ra các chất có hoạt tính mới thì việc nghiên cứu chuyển hóa chúng thành dẫn xuất bằng nhiều con đường trong đó có hóa tổng hợp (combinatorial chemistry) để thử hoạt tính sinh học vẫn là Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 7 một lĩnh vực hấp dẫn (Trần Văn Sung, 2011). Ahmed et al, (2014) sử dụng một số chiết xuất thảo dược từ các cây sầu đông (Aradirachta indica), bông Cận Đông (Gossypium berbaceum), bạch hoa xà (Plumbago zeylanica) và keo (Aacacia catechu) để điều trị bệnh viêm tử cung cho bò. Các tác giả trên cho biết với các tính chất kháng nấm, kháng vi khuẩn, kháng virus và kháng viêm của các hoạt tính trong các chiết xuất từ các thảo dược trên, chúng đều có khả năng điều trị bệnh viêm tử cung cho bò. Sử dụng chiết xuất từ tỏi và hormone PGF2α để điều trị bệnh viêm tử cung cho bò, Sarkar et al, (2006) cho thấy tỉ lệ bò khỏi bệnh ở hai nhóm là tương đương nhau. Marquez et al, (2007) cho biết chiết xuất từ cây sim (Montanoa tomentosa) cho hiệu quả điều trị bệnh viêm tử cung ở bò sữa rất cao mà không làm ảnh hưởng đến chức năng của buồng trứng. Cui et al, (2014) cho biết dịch chiết từ cây ích mẫu (Herba Leonuri), đương qui (Angelicae Sinensis Radix), hồng hoa (Flos Carthami), cỏ gấu (Rhizoma Cyperi) và mộc dược (Myrrha) hòa tan trong cồn 70 làm tăng nhanh quá trình đào thải nhau thai ở bò bị sát nhau. Esparza-Borges and Ortiz-Márquez (1996) cho biết dịch chiết của tỏi (Allium sativum, L), khuynh diệp (Eucalyptus globules) và rau khúc (Gnaphalium conoideum) có tác dụng rút ngắn thời gian động dục lại sau đẻ của bò bị viêm tử cung. Các chất chiết xuất từ cây rễ vàng (Rhodiola rosea), hương thảo (Rosmarinus officinalis) đều có tính chống oxi hóa cao (Zhang et al., 2013). Chúng ta biết rằng trong quá trình viêm, các chất có tính chất oxi hóa được sinh ra làm trầm trọng thêm tác dụng có hại của viêm đối với tế bào tổ chức. Vì thế nếu các chất chiết thảo dược trên có tác dụng chống oxi hóa thì chúng có thể có tác dụng tốt trong điều trị các quá trình viêm như viêm tử cung ở bò do tác dụng chống lại các chất oxi hóa sinh ra trong quá trình viêm. Một nghiên cứu khác cho thấy kim ngân hoa (honeysuckle), hoa mai (forsythia), bồ công anh (dandelion), hoa violet tokyo (Tokyo violet), ngải cứu (motherwort), đương qui (angelica), xuyên khung (chuanxiong), địa hoàng Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 8 (rehmannia), hồng hoa (safflower), cam thảo (radix glycyrrhizae) có tác dụng là tăng cường khả năng miễn dịch của các tế bào biểu mô tử cung của bò, do đó có thể dùng để điều trị bệnh viêm tử cung (Du et al., 2010). Tính đến năm 2010, có ít nhất 50 loại cây thảo dược đã được nghiên cứu ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản, chi tiết được miêu tả trong bài tổng quan của Citarasu (2010). Chiết xuất thảo dược đã được chứng minh rằng chúng có tác dụng trên cả hai đối tượng tôm và cá nuôi với các vai trò như kích thích tăng trưởng (Chitra, 1995; Rani, 1999; Citarasu et al., 1998; 2002); kích thích ăn uống và sinh sản (Babu, 1999; Mahesshapa, 1993 và Venketramalingam et al., 2007); kích thích miễn dịch (Edahiro et al., 1991; Minomol, 2005; và Sivaram et al., 2004); giảm hiện tượng stress (Citarasu et al., 1998; Hsieh et al., 2008); kháng ký sinh trùng, kháng vi khuẩn (Shangliang, 1990; Immanuel et al., 2004); kháng nấm (Adiguzel et al., 2005; Chitmanat et al., 2005; và Khan et al., 2004) và kháng vi rút (Direkbusarakom et al., 1996a,b; Citarasu et al., 2006; và Yogeeswaran, 2007). Một bài viết tổng quan về thảo dược cho thấy có trên 40 loại thảo dược được sử dụng để chống viêm, điều trị vết thương cho kết quả cao tại châu Phi. Trong nghiên cứu này cũng cho thấy một số thảo dược được sử dụng nhiều là hoa hồng (Acaena argentea), Aristotelia chilensis, Blechnum chilense, Francoa appendiculta, phỉ Chi Lê (Gevuina avellana) và đại hoàng Chi Lê (Laureliopsis philippiana). Đã có hơn 140 hoạt chất được xác định có mặt trong dịch chiết của cây ích mẫu và dịch chiết của cây này cũng cho thấy các tác dụng chống viêm, chống oxi hóa, chống ung thư, đặc biệt là trên tế bào tử cung (Shang et al., 2014). Cỏ ban (Hypericum aethiopicum), đinh lăng (Polygala fruticosa) cũng được chứa các hoạt chất có tác dụng chống lại các vi khuẩn ở đường sinh dục của người (van Vuuren and Naidoo, 2010). Trong một nghiên cứu sử dụng bột tỏi và metronidazole để điều trị bệnh viêm âm đạo cho trên 120 phụ nữ từ 18-44 tuổi, các tác giả của công trình trên cho Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 9 thấy chỉ số Amsel ở nhóm dùng tỏi giảm nhiều hơn so với nhóm dùng kháng sinh (70 và 48.3%), nhóm dùng tỏi cũng có ít tác dụng phụ hơn là nhóm dùng metroniazole (Mohammadzadeh et al., 2014). Ở một nghiên cứu khác cũng cho thấy quế (Cinnamomum zeylanicum), gừng (Zingiber officinale), nghệ (Curcuma longa), trà xanh (Camellia sinensis) đều tăng cường khả năng miễn dịch tế bào trong điều trị bệnh viêm tử cung ở người (Harris and Vlass, 2015). Nghệ (Curcuma longa) cũng có tác dụng tốt trong việc điều trị bệnh lạc nội mạc tử cung nhờ khả năng ức chế estradiol (Zhang et al., 2013). Các chiết xuất từ trà xanh, oải hương (Lavandula angustifolia), nguyệt quế (thyme), bạc hà (Mentha piperita) đều cho khả năng kháng khuẩn cao đối với Enterococcus feralis, E.coli, Staphylococcus aureus, Candida albican ((Thosar et al., 2013). Ứng dụng công nghệ thông tin trong việc thiết kế các phân tử thuốc mới, cũng như trong nghiên cứu mối tương quan Cấu trúc – Hoạt tính đang ngày càng phát triển. Mặc dù đa số các công ty dược trên thế giới trong thời gian qua chưa đầu tư tích cực lắm cho việc nghiên cứu hóa học các hợp chất thiên nhiên. Song, việc nghiên cứu hóa học các hợp chất thiên nhiên vẫn được đấy mạnh trong những thập niên vừa qua và chắc chắn sẽ phát triển mạnh trong thời gian tới. 1.2.2. Tình hình nghiên cứu và sử dụng sản phẩm thảo dược ở Việt Nam Việt Nam có độ đa dạng sinh học cao, có tới 2/3 diện tích đất tự nhiên trong nước là rừng, đồi núi và cao nguyên. Theo Nguyễn Thượng Dong, Việt Nam có 10386 loài thực vật trong đó có 3830 loài có khả năng sử dụng làm thuốc. Trong công nghiệp dược phẩm nhân y đã có 1340/5577 loại thuốc chiếm 24% được sản xuất từ dược liệu hay hoạt chất từ dược liệu như: berberin, palmatin, artemisinin (Nguyễn Thượng Dong, 2001). Nhân y sử dụng dược liệu với nhiều mục đích khác nhau: thức ăn thay thế, phòng trị các bệnh truyền nhiễm, ký sinh trùng, nội khoa, ngoại khoa, sản khoa, ung thư… với rất nhiều dạng thuốc khác nhau: thuốc sắc, thuốc cao, viên hoàn, viên nén… Ngày nay, nhiều cây thuốc đã có hiệu quả điều trị rõ rệt, nhưng cơ chế tác dụng vẫn chưa được giải thích và chứng minh. Xu hướng chung hiện nay là kết Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 10 hợp Đông y và Tây y với phương châm vừa áp dụng những kinh nghiệm chữa bệnh của cha ông ta bằng thuốc nam, vừa nghiên cứu khảo sát các tính năng tác dụng của cây thuốc bằng cơ sở khoa học hiện đại (Đỗ Tất Lợi, 1999). Các công trình nghiên cứu về lĩnh vực Đông dược, Y dược cổ truyền bên nhân y đã và đang thu hút được sự chú ý của nhiều nhà khoa học ở Việt Nam và trên thế giới. Các nhà khoa học nước ta đã chú ý đến việc sử dụng các loại thảo dược trong phòng và trị bệnh truyền nhiễm; bệnh ký sinh trùng; bệnh nội khoa; bệnh ngoại khoa; bệnh sản khoa,… Riêng lĩnh vực thú y, nghiên cứu về cây thuốc trong phòng trị bệnh cho vật nuôi còn ít và cũng chỉ giới hạn trong việc khai thác, áp dụng các bài thuốc cổ truyền. Về lĩnh vực thú y, các nghiên cứu sử dụng các kháng sinh thực vật trong nuôi dưỡng và phòng trị bệnh cho lợn, đặc biệt bệnh lợn con phân trắng đạt hiệu quả cao (Bùi Thị Tho, 1996). Theo Trần Quang Hùng (1995) trong thuốc lá, thuốc lào có chứa alkaloid thực vật – nicotin và nornicotin trừ được ngoại ký sinh trùng và côn trùng hại rau, cây công nghiệp. Theo Lê Thị Ngọc Diệp (1999) cây Actiso (Cynara Scolymus L) chứa hoạt chất có tác dụng chống viêm, lợi tiểu, thông mật, bổ gan.. Nghiên cứu tác dụng phòng trị bệnh lợn con phân trắng của các cây tỏi, tô mộc, hành, hẹ và hoàng đằng. Đặc biệt, tác giả còn cho thấy vi khuẩn E.coli kháng lại kháng sinh thực vật của tỏi, hẹ lại chậm hơn rất nhiều so với các thuốc hoá học trị liệu khác: tetracyclin, neomycin,… Riêng mảng sử dụng các cây dược liệu: lá thuốc lào, thuốc lá, hạt na, vỏ rễ xoan, hạt cau, củ bách bộ, dây thuốc cá, hạt củ đậu… dùng để trị nội, ngoại ký sinh trùng thú y cũng đã thu được những kết quả nhất định (Nguyễn Văn Tý, 2002). Kết quả nghiên cứu của Bùi Thị Tho và Nguyễn Thành Trung (2010), khi sử dụng dịch chiết cây Xuân hoa trong điều trị lợn con bị viêm ruột tiêu chảy tỷ lệ khỏi theo các công thức khác nhau đạt từ 87,51% đến 100%, thời gian khỏi bình quân là 2,3 – 3,08 (ngày). Bùi Thị Tho (2003) đã nghiên cứu tác dụng của rễ thuốc cá trong phòng trị bệnh ngoại ký sinh trùng thú y cho kết quả tốt. Nhóm tác giả trên cũng đã sản Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 11 xuất thuốc dạng mỡ từ hạt cây củ đậu để điều trị bệnh ghẻ chó và ve kí sinh (Bùi Thị Tho và Nguyễn Mạnh Hiển, 2006; Bùi Thị Tho, 2007). Hơn nữa, việc sử dụng thảo dược điều trị bệnh, hạn chế tồn dư kháng sinh trong sản phẩm chăn nuôi cũng đã được quan tâm từ lâu của nhóm nghiên cứu trên khi các tác giả trên sử dụng bồ công anh ( Lactuca indica L.) chống tồn dư kháng sinh enrofloxacin trong điều trị tiêu chảy ở gà (Bùi Thị Tho và Nguyễn Thị Thanh Hà, 2009). Ở một nghiên cứu khác, lá xuân hoa cho thấy có tác dụng điều trị bệnh tiêu chảy ở lợn con (Bùi Thị Tho và Nguyễn Thành Trung, 2010) Trong định hướng tiến tới sử dụng kháng sinh thảo dược một cách rộng rãi trong chăn nuôi thì việc bảo quản sản phẩm kháng sinh thảo dược cũng có một vai trò then chốt, nhóm nghiên cứu trên cũng đã nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian và điều kiện bảo quản đến tác dụng dược lý của dịch chiết củ Bách bộ (Bùi Thị Tho, 2004). Tác giả cho thấy nên thu dịch chiết trong vòng 24h sau khi thu hái. Việc sử dụng kháng sinh thực vật từ tỏi và hẹ để điều trị các bệnh trên gia súc gia cầm cho thấy nó vừa cho hiệu quả cao, vừa ít bị kháng thuốc, thời gian phát sinh kháng thuốc chậm hơn so với kháng sinh tổng hợp và từ nấm, hơn nữa vi khuẩn lại nhanh tái mẫn cảm với kháng sinh thực vật hơn các thuốc hóa học trị liệu (Bùi Thị Tho, 2001). Tác giả Vĩnh Định và cs., (2002) cho biết thành phần của flavanon của lá cây đơn đỏ có chứa liquiritigenin. Nguyễn Hồng Loan (2010) công bố kết quả nghiên cứu sử dụng chất chiết xuất từ cây hoàng kỳ (Astragalus membranaceus) để tăng cường khả năng đề kháng của cá tra với bệnh mủ gan do nhiễm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri. Nguyễn Thành Tâm và cs (2012) nghiên cứu về tác dụng kháng khuẩn E. ictaluri của dịch chiết từ 3 loại thảo dược, đó là Diệp hạ châu đỏ, Diệp hạ châu xanh và Bạch hoa xà. Ngoài ra vi khuẩn Streptococcus spp gây bệnh lở loét cũng được nghiên cứu điều trị bằng hỗn hợp dịch ép từ củ tỏi và lá húng trên đối tượng cá trê lai (Nguyễn Thị Thanh, 2012). Nguyễn Văn Thanh và Nguyễn Thanh Hải (2014a) cho biết, dịch chiết cây mò hoa trắng tiêu diệt vi khuẩn Salmonella in vitro và cho kết quả điều trị cao Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 12 đối với lợn con bị bệnh phân trắng. Trong nghiên cứu trên, nhóm tác giả đã sử dụng ethanol ở các nồng độ 35%, 70%, acetic 5% và aceton 70% để chiết xuất phytoncid từ thân, lá và rễ cây mò hòa trắng. Kết quả của nghiên cứu cho thấy rằng, chiết xuất bằng ethanol nồng độ 35% cho dịch chiết có hiệu quả tiêu diệt vi khuẩn và điều trị bệnh lợn con hoa trắng cao nhất. Nhóm tác giả trên cũng thấy rằng dịch chiết từ quả lựu (Punica gramatum) cho kết quả cao khi điều trị các bệnh giun sán cho gia súc (Nguyen Thanh Hai et al., 2014a,b). Nhóm tác giả sử dụng ethanol 5% để chiết xuất phytoncid từ quả lựu, dịch chiết được có thể tiêu diệt giun đũa lợn, sán dây ở lợn, giun đũa ở gà và sán lá ở gà. Các chiết xuất của tỏi gừng cũng được nhóm tác giả trên công bố có khả năng tiêu diệt vi khuẩn E. coli và Salmonella phân lập từ vịt bị tiêu chảy (Nguyen Van Thanh et al., 2014). Trong nghiên cứu này tác giả sử dụng ethanol 5% và acetic 5% để chiết xuất phytoncid từ tỏi và gừng. Kết quả cho thấy phương pháp dùng acetic 5% cho dịch chiết có tính kháng khuẩn cao hơn dịch chiết thu được từ phương pháp dùng ethanol 5%. Nhóm tác giả trên cũng nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết của ngưu tất (Achyranthes Bidentata Blume), muồng trâu (Cassia Alata L ), phi tử (Embelia Ribes Burn ), bìm bìm ( Ipomoea Hederacea Jacq), keo dậu (Leucaena Glauca Benth ) và cà gai leo (Solanumtorvum Swartz ) lên quá trình nở của trứng kí sinh trùng Haemonchus contortus phân lập từ dê (Nguyen Van Thanh et al., 2015). Các giả trên cho thấy muồng trâu và phi tử có tác dụng ức chế trứng nở của Haemonchus contortus tốt nhất, trong khi ngưu tất có tác dụng tốt nhất lên sự chuyển động của ấu trùng. Ở nồng độ 20%, chỉ có chất chiết bìm bìm, keo dậu là có cả hai tác dụng vừa ức chế không cho trứng Haemonchus contortus nở và ức chế sự chuyển động của ấu trùng. 1.3. Cây Huyền diệp (Polyalthia longifolia var.pendula Hort.) 1.3.1. Nguồn gốc phân loại Tên khoa học: Polyathia longifolia var. Pendula Hort. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 13 Tên thông thường: Huyền diệp, Hoàng nam. Thuộc họ Na: Annonaceae. Thuộc chi Nhọc: Polyalthia. Chi Nhọc (Polyalthia) là một chi lớn trong họ Na (Annonaceae), có khoảng 150 loài, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Phi, châu Á và miền bắc nước Úc, số lớn các loài tập trung ở Đông Nam Á. Ở việt Nam có 27 loài, phân bố khắp các vùng. 1.3.2. Mô tả thực vật Cây gỗ nhỡ, cao 5 - 15 m, phân cành sớm từ gốc, dài, cong rũ xuống, tán hẹp dạng thấp, che kín hết thân, xanh quanh năm. Lá đơn mọc cách, trên cành gãy khúc, dạng thuôn dài hẹp, đầu nhọn, gốc tù, dài 8 - 20 cm, rộng 2 - 4 cm, màu xanh nhẵn cả hai mặt, mép lá nhăn nheo. Gân bên không rõ. Cuống lá dài 0,5 – 0,8 cm. Hình 1.1. Cây và các bộ phận của cây Huyền diệp Ra hoa từ tháng hai đến tháng tư. Hoa đơn, hoa hình ngôi sao, màu vàng chanh, cuống ngắn và mảnh. Nhị đực nhiều. Bầu có nhiều lá noãn. Hình thành quả vào tháng bảy, quả có hình trứng hoặc bầu dục dài 2 cm màu đen. Quả mọc thành chùm, mỗi chùm từ 10 – 20 quả. Ban đầu xanh sau chuyển màu tím hoặc đen khi chín. 1.3.3. Thành phần hóa học Từ dịch chiết methanol của cây Huyền diệp đã phân lập được một haliman diterpen mới, 3β,5β,16α - trihydroxyhalima - 13(14) - en - 15,16 - olit, và oxoprotoberberine alkaloid, (-) - 8 - oxopolyathiain trong đó có một số hợp chất có Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 14 hoạt tính kháng một số dòng ung thư. Dịch chiết n-hexan của vỏ cây Huyền diệp đã phân lập được 9 hợp chất clerodan và ent - haliman diterpen mới là: 16 hydroxycleroda - 4(18), 13 - dien - 16,15 - olit; axit 16 - oxocleroda - 4(18), 13E dien - 15 - oic; cleroda - 4(18), - 13 - dien - 16,15 - olit; 16 - hydroxyl - ent Halima - 5(10), 13 - dien - 16,15 - olit; axit 16 - oxo - ent - Halima - 5(10), 13E dien - 15 - oic; ent - Halima - 1(10),13E - dien - 16,15 - olit; axit 16 - oxo - ent halima - 5(10),13E - dien - 15 - oic; ent - Halima - 5(10),13 - dien - 16,15 - olit và ent - Halima - 5(10),13E - dien - 16,15 - olit cùng với 5 clerodan diterpen đã biết. Từ cây Huyền diệp, Chen et al.(2000) đã phân lập được 1 hợp chất A haliman diterpen mới, 3β,5β,16α - trihydroxyhaliman - 13(14) - en - 15,16 - olide, và oxoprotoberberin alkaloid, (-) - 8 - oxopolyalthiain, cùng với 20 hợp chất đã biết, 16α - hydroxycleroda - 3,13 - dien - 15,16 - olit; axit 16 - hydroxycleroda - 3,13 dien - 15 - oic; axit cleroda - 3,13E - dien - 15 - oic; axit 3,12E - lolavadien - 15 oic - 16 - al; (4→2)- abeo - 16 (R và S)- 2,13Z - kolavadien - 15,16 - olit - 3 - al; axit labd - 13E - en - 8 - ol - 15 - oic; (-)- stepholidin, 1 - aza - 4 - methyl - 2 - oxo - 1,2 - dihydro - 9,10 - anthracenedion; 5 - hydroxyl - 6 - methoxyonychin; 6 hydroxyl - 7 - methoxyonychin; liriodenin; oxoxylopin; (-) - anonain; (-) asimilobin; (-) - norboldin; (+) - norboldin; (-) - norpallidin; axit ρ hydroxybenzoic; β - sitosterol và stigmasterol. Một clerodan diterpenoit là 16 - hydroxycleroda - 13 - en - 15,16 – olit - 3 on được phân lập từ vỏ cây Huyền diệp cùng với 23 hợp chất đã biết và các hợp chất phytosteroit. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 15