Tài liệu Nghiên cứu sự ảnh hưởng của các thành phần môi trường tới sinh khối sợi nấm và một số hoạt tính chiết xuất từ sợi nấm linh chi (ganoderma lucidum)

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH - MÔI TRƯỜNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG TỚI SINH KHỐI SỢI NẤM VÀ MỘT SỐ HOẠT TÍNH CHIẾT XUẤT TỪ SỢI NẤM LINH CHI (GANODERMA LUCIDUM) CHU THỊ KIỀU OANH Đà Nẵng, năm 2022 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH - MÔI TRƯỜNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG TỚI SINH KHỐI SỢI NẤM VÀ MỘT SỐ HOẠT TÍNH CHIẾT XUẤT TỪ SỢI NẤM LINH CHI (GANODERMA LUCIDUM) Ngành: Công nghệ sinh học Khóa: 2018-2022 Sinh viên: Chu Thị Kiều Oanh Người hướng dẫn: ThS. Nguyễn Thị Bích Hằng Đà Nẵng, năm 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan các dữ liệu trình bày trong khóa luận này là trung thực. Đây là kết quả nghiên cứu của tác giả và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác trước đây. Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm nếu vi phạm bất kì quy định nào về đạo đức khoa học. Tên SV i LỜI CẢM ƠN Ðể có thể hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô bộ môn Công nghệ sinh học, khoa Sinh - Môi trường, trường Ðại học Sư phạm - Ðại học Ðà Nẵng. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô ThS. NCS. Nguyễn Thị Bích Hằng và cô TS. Phạm Thị Mỹ cùng các thầy cô là giảng viên khoa Sinh-Môi trường đã tận tâm định hướng, tận tình chỉ dạy tôi những kiến thức về mặt chuyên ngành cũng như tạo mọi điều kiện hỗ trợ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận. Tôi xin chân thành cảm ơn anh Bùi Đức Thắng và anh Trần Đình Chí đã luôn giúp đỡ, hướng dẫn những kỹ năng bổ ích trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Cảm ơn các anh đã luôn theo sát, động viên tôi thực hiện đề tài nghiên cứu. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô giáo khoa Sinh - Môi trường, những người đã trực tiếp giảng dạy, truyền đạt cũng như giúp tôi trau dồi kiến thức và kĩ năng thực hành thí nghiệm. Đồng thời, tạo điều kiện về trang thiết bị, dụng cụ và hóa chất để tôi thực hiện tốt đề tài nghiên cứu của mình. Và lời cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè, những người đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm khóa luận. Tôi xin chân thành cảm ơn! Đà Nẵng, ngày….tháng….năm 2022 Sinh viên ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................................. i LỜI CẢM ƠN ......................................................................................................................ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................................... v DANH MỤC BẢNG BIỂU ................................................................................................ vi DANH MỤC HÌNH ẢNH .................................................................................................vii TÓM TẮT ........................................................................................................................ viii MỞ ĐẦU ............................................................................................................................. 1 1. Tính cấp thiết của đề tài ................................................................................................... 1 2. Mục tiêu đề tài ................................................................................................................. 2 3. Ý nghĩa của đề tài ............................................................................................................ 3 4. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................................ 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................................. 4 1.1. Giới thiệu về nấm Linh chi ........................................................................................... 4 1.2. Thành phần hóa học của nấm Linh chi ......................................................................... 4 1.3. Giá trị dược liệu của nấm Linh chi ............................................................................... 7 1.4. Tổng quan về Polysaccharide ....................................................................................... 8 1.5. Giới thiệu chung về phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM) ........................................... 8 1.6. Một số nghiên nghiên cứu trong và ngoài nước. .......................................................... 9 1.6.1. Một số nghiên cứu trong nước ................................................................................... 9 1.6.2. Một số nghiên cứu trên thế giới ............................................................................... 11 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................... 14 2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu .............................................................................. 14 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu .............................................................................................. 14 2.1.2. Phạm vi nghiên cứu ................................................................................................. 14 2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................................ 14 2.2.1. Phương pháp nhân giống ......................................................................................... 14 2.2.2. Phương pháp tối ưu bề mặt. ..................................................................................... 14 2.3.3. Phương pháp thu sinh khối hệ sợi nấm .................................................................... 16 2.3.4. Phương pháp tách chiết polysaccharide nội bào ...................................................... 16 2.3.5. Phương pháp xác định hàm lượng PS ...................................................................... 17 2.3.6. Phương pháp xác định Lipid, Protein. ..................................................................... 19 2.3.7. Phương pháp đánh giá khả năng kháng oxy hóa. .................................................... 19 2.3.8. Phương pháp xác định hàm lượng kim loại nặng. ................................................... 19 2.3.9. Phương pháp xử lý số liệu ....................................................................................... 19 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..................................................................... 20 iii 3.1. Khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường đến sự sinh trưởng và phát triển của hệ sợi nấm Linh chi. ........................................................................................................... 20 3.2. Xác định hàm lượng một số hoạt chất của hệ sợi nấm Linh chi ................................. 24 3.2.1. Xác định hàm lượng polysaccharide tổng số trong sinh khối sợi nấm Linh chi. .... 24 3.2.2. Xác định hàm lượng lipid và protein trong sinh khối sợi nấm Linh chi .................. 25 3.3. Khả năng kháng oxy hóa của polysaccharide chiết xuất từ hệ sợi nấm Linh chi ....... 26 3.4. Đánh giá hàm lượng kim loại nặng trong sinh khối sợi nấm Linh chi ....................... 27 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................................... 29 1. Kết luận .......................................................................................................................... 29 2. Kiến nghị ........................................................................................................................ 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 30 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT PS Polysaccharide IPS Intracellular polysaccharide EPS Exopolysaccharide CCD Central composite design BBD Box-Behnken design RSM Response surface methodology KLN Kim loại nặng VTM C Vitamin C v DANH MỤC BẢNG BIỂU STT Kí hiệu bảng Tên bảng Trang 1 1.1 Thành phần hóa dược tổng quát của nấm Linh chi 5 2 1.2 Các hoạt chất sinh học và dẫn xuất trong nấm Linh chi 6 3 2.1 Giá trị của các yếu tố ảnh hưởng trong mô hình thí nghiệm 15 4 2.2 Bố trí thí nghiệm 16 5 3.1 6 3.2 7 3.3 8 3.4 95 3.5. Các nghiệm thức trong thí nghiệm tối ưu hóa và kết quả Phân tích phương sai (ANOVA) cho kết quả thí nghiệm của mô hình bậc hai BBD của sinh khối sợi nấm Thể hiện giá trị khảo sát của các biến độc lập và mã thí nghiệm Hàm lượng lipid và protein trong sinh khối khô sợi nấm Linh chi Kết quả phân tích kim loại nặng của sợi nấm Linh chi ở các mẫu vi 20 21 23 25 28 DANH MỤC HÌNH ẢNH STT Kí hiệu hình 1 2.1 2 3.1 3 3.2 4 3.3 Tên hình Đường chuẩn D – Glucose Số trang 18 Mô hình phản ứng bề mặt 3D của sinh khối sợi nấm Linh chi 22 Kháng oxi hóa của PS và VTMC 26 Hoạt tính kháng oxi hóa của polysaccharide chiết xuất từ hệ sợi nấm Linh chi. vii 27 TÓM TẮT Thiết kế Box - Behnken của phương pháp đáp ứng bề mặt RSM được áp dụng để tối ưu hóa quá trình nuôi sinh khối sợi nấm. Ưu điểm của phương pháp này là khảo sát được không chỉ những ảnh hưởng đơn lẻ mà còn cả tác động tổng hợp của các biến độc lập lên biến đáp ứng và biểu thị kết quả dưới dạng một mô hình toán học cũng như các biểu đồ trực quan. RSM cũng cho phép cải thiện quá trình thực nghiệm bằng cách đề xuất những bộ thí nghiệm mới (Aydar, 2018). Trong nghiên cứu này, các yếu tố được tối ưu trong mô hình nuôi sinh khối hệ sợi nấm Linh chi là glucose, cao nấm men và pH, phương trình dự báo đối với mô hình nuôi sinh khối hệ sợi nấm Linh chi là là Y = 2,77333- 0,02x1 +0,0325x2 - 0,14x3 + 0,15 x1 x2 + 0,2 x1 x3 -0,02x2x3 - 0,324167x12 - 0,514167 x2 2 - 0,379167 x3 2 với bộ điều kiện x1= -0,03, x2=0,033 , x3= -0,193, tương ứng với các giá trị glucose = 25,18g/L, cao nấm men = 2,516 g/L và pH = 5,902 sinh khối hệ sợi tối đa dự đoán đạt được là 2.78g/L. Tuy nhiên, dựa vào các thông số thì mô hình được đánh giá là chưa phù hợp. Cần có những nghiên cứu thực nghiệm tiếp theo để hoàn thiện phương trình dự báo và tìm ra điều kiện tối ưu đối với nuôi sinh khối hệ sợi nấm Linh chi. Sinh khối sau khi thu được từ nghiệm thức tối thích nhất của mô hình đã được phân tích một số hoạt chấtnhư sau: hàm lượng polysaccharide chiết xuất từ hệ sợi nấm đạt được là là 0,88±0,02 g/L tổng khối lượng sợi nấm khô, protein và lipid chiếm tỉ lệ 2,82% và Protein là 14,28% cho khối lượng sợi nấm khô. Bên cạnh đó nghiên cứu cũng đánh giá khả năng kháng oxy hóa với hiệu suất bắt gốc tự do của polysaccharide được xác định bằng phương pháp khử màu ABTS.+ là 77,66%. Ngoài ra, hàm lượng kim loại nặng trong sinh khối sợi nấm cũng được xác định là rất thấp so với ngưỡng cho phép Thủy ngân có hàm lượng là 26,25 ppb, Cadmi có 25,12ppb; Asen và Chì có hàm lượng <15ppb. Từ khóa: Nấm Linh chi, RSM, polysaccharide, lipid, protein, kim loại nặng. viii MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Kể từ nền văn minh sơ khai, nấm đã được công nhận là một nguồn dược liệu tự nhiên và là nguồn dinh dưỡng quý giá. Trong nhiều năm gần đây, con người càng nhận thức được rằng sự ổn định, cân bằng chế độ ăn uống là chìa khóa giúp cho chức năng cơ thể hoạt động bình thường và duy trì sức khỏe ổn định. Vì vậy, việc tiêu thụ các nguồn thực phẩm có hoạt tính dược liệu tự nhiên đặc biệt là nấm đã ngày càng tăng lên và điều đó khiến nhiều người quan tâm, tìm đến những dòng thảo dược, cây thuốc hay các loại nấm dược liệu. Trong đó, chúng ta không thể không nhắc đến nấm Linh chi, một loài nấm dược liệu quý giá và phổ biến tại nước ta. Linh chi không những có giá trị về mặt dinh dưỡng mà còn có giá trị dược liệu cao. Theo thống kê của cuốn sách "Thần nông bản thảo”, cách đây 2000 năm, Linh chi được xếp vào loại "Thượng dược”, có tác dụng bồi dưỡng cơ thể và chữa bệnh xếp trên Nhân sâm. Cấu trúc độc đáo của Linh chi chính là thành phần khoáng tố vi lượng đủ loại (119 chất), trong đó một số khoáng tố như germanium hữu cơ, vanadium, crôm… hay các hợp chất polysaccharides và triterpenoids... đã được khẳng định là nhân tố quan trọng cho nhiều loại phản ứng chống ung thư, dị ứng, lão hóa, xơ vữa, đông máu nội mạch, giúp điều chỉnh dẫn truyền thần kinh, bảo vệ cấu trúc của nhân tế bào…(Trần Hùng, 2014), (Ngô Xuân Mạnh và cs, 2015). Quả thể và bào tử của nấm Linh chi đã được báo cáo là có hiệu quả trong việc điều hòa hệ thống miễn dịch, ức chế khối u, điều trị tăng đường huyết, và các bệnh viêm… qua đó nó được sử dụng rộng rãi làm thành phần chính trong nhiều hỗn hợp hoặc bổ sung dinh dưỡng của y học cổ truyền Trung Quốc. Do các ứng dụng y học tiềm năng khác nhau của nấm Linh chi và các nghiên cứu về các thành phần hoạt tính sinh học của nấm nó đã tiếp tục trong nhiều thập kỷ. Mà hầu hết trong số đó là tập trung vào các acid triterpenoid và các polysaccharide, hai nhóm chất này được coi là các thành phần có hoạt tính sinh học chính của loại nấm này (Hao và c.s., 2020). Nhờ những giá trị dinh dưỡng và dược học quý giá mà hiện nay, nhu cầu mở rộng diện tích và tăng năng suất nấm Linh chi ngày càng cao, giúp sử dụng hiệu quả phế phụ phẩm nông lâm nghiệp, tạo việc làm cho người lao động đồng thời cung cấp nguồn dược liệu quý đáp ứng nhu cầu của xã hội. Nấm Linh chi (Ganoderma Lucidum) là loại thảo 1 dược có giá trị dược liệu và có hàm lượng polysaccharide cao. Việc nuôi cấy quả thể nấm thường mất vài tháng để thu quả thể đầu, do thời gian trồng nấm liên tục kéo dài. Bên cạnh đó, trong quá trình nuôi trồng thu quả thể để tăng năng suất, người trồng nấm thường lạm dụng các hóa chất vào trong việc xử lý nguyên liệu, dẫn đến việc nấm bị nhiễm kim loại nặng. Quá trình lên men chìm được xem là một phương pháp nuôi cấy thay thế đầy hứa hẹn để tăng trưởng hiệu quả sinh khối sợi nấm và sản xuất PS. Quá trình lên men chìm cung cấp sự hấp thụ sinh khối sợi nấm và polysaccharide nhanh hơn trong một khoảng thời gian ngắn hơn trong một không gian nhỏ hơn và ít nguy cơ nhiễm bẩn hơn, (Ahmad và cs., 2013). Phương pháp đáp ứng bề mặt (Response surface method - RSM) sử dụng các kỹ thuật thống kê, đồ họa và toán học khác nhau nhằm nghiên cứu, cải thiện hoặc tối ưu hóa một quy trình trong trường hợp biến đáp ứng chịu ảnh hưởng bởi nhiều hơn một biến độc lập. Ưu điểm của phương pháp này là khảo sát được không chỉ những ảnh hưởng đơn lẻ mà còn cả tác động tổng hợp của các biến độc lập lên biến đáp ứng và biểu thị kết quả dưới dạng một mô hình toán học cũng như các biểu đồ trực quan. RSM cũng cho phép cải thiện quá trình thực nghiệm bằng cách đề xuất những bộ thí nghiệm mới (Aydar, 2018). Vì vậy, nghiên cứu này nhằm mục đích khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố: một số yếu tố dinh dưỡng và pH đến sinh khối hệ sợi nấm Linh chi và áp dụng phương pháp đáp ứng bề mặt để tối ưu hóa một số yếu tố môi trường nhằm đạt được hiệu suất sinh khối cao. Xuất phát từ cơ sở trên, tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu sự ảnh hưởng của thành phần môi trường tới sinh khối hệ sợi nấm và một số hoạt chất chiết xuất từ sợi nấm Linh chi (Ganoderma Lucidum)”. 2. Mục tiêu đề tài - Đánh giá được sự ảnh hưởng của thành phần môi trường tới sinh khối hệ sợi nấm và một số hoạt chất chiết xuất từ sợi nấm Linh chi (Ganoderma Lucidum). 2 3. Ý nghĩa của đề tài 3.1. Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu từ đề tài sẽ là dẫn liệu khoa học về sự ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy đến sinh khối hệ sợi nấm và hàm lượng polysaccharide nội bào thu được từ sợi nấm Linh chi. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả nghiên cứu được sẽ đưa ra được tổ hợp tối ưu nuối sinh khối sợi nấm đồng thời chứng minh tiềm năng sinh học của polysaccharide nội bào được chiết xuất từ hệ sợi nấm, cung cấp thêm các nguồn để ứng dụng và sản xuất prebiotic thay vì từ thực vật. Kết quả cũng là tiền đề mở ra hướng nghiên cứu ứng dụng mô hình nuôi sinh khối hệ sợi nấm vào quy mô lớn và phát triển sản phẩm mới từ nấm tốt cho sức khỏe của con người. 4. Nội dung nghiên cứu - Khảo sát ảnh hưởng của một số thành phần môi trường đến sự sinh trưởng và phát triển của hệ sợi nấm Linh chi. - Xác định hàm lượng một số hoạt chất của hệ sợi nấm Linh chi. - Đánh giá khả năng kháng oxy hóa của polysaccharide chiết xuất từ hệ sợi nấm Linh chi. - Đánh giá hàm lượng kim loại nặng trong sinh khối sợi nấm Linh chi. 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về nấm Linh chi Linh chi có tên khoa học là Ganoderma Lucidum tên tiếng anh là Varnished Conk hay Linh chi, ở Việt Nam Linh chi được gọi là nấm Lim. Trong thư tịch cổ nấm Linh chi còn được gọi với tên khác như Tiên thảo, Nấm trường thọ, Vạn niên nhung… Vị trí phân loại của nấm Linh chi: Giới : Mycota hay Fungi Ngành : Eumycota Ngành phụ : Basidiomycotina Lớp : Hymenomycetes Lớp phụ : Hymenomycetes Bộ : Ganodermataceae Họ : Ganodermataceae Chi : Ganoderma Loài : Ganoderma Lucidum 1.2. Thành phần hóa học của nấm Linh chi Các phân tích của G- Bing Lin đã chứng minh các thành phần hóa dược tổng quả của nấm Linh chi như sau: 4 Bảng 1. Thành phần hóa dược tổng quát của nấm Linh chi Thành phần Tỉ lệ các chất Nước 12 - 13% Cellulose 54 - 56% Lignine 13 - 14% Lipid 1.9 - 2.0% Monosaccharide 4.5 - 5.0% Polysaccharide 1.0-1.2% (chống hoạt động khối u, tăng sức đề kháng và hệ miễn dịch cho cơ thể) Sterol 0.14 - 0.16% Protein 0.08 - 0.12% Thành phần K, Zn, Ca, Mn, Na, khoáng thiết yếu, nhiều vitamin, amino acid, khác enzyme và hợp chất alkaloid Từ những năm 90 đến nay, bằng các phương pháp hiện đại: phổ kế UV (tử ngoại), IR (hồng ngoại), phổ kế khối lượng – sắc kí khí (GC – MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân và đặc biệt là kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp (HPLC) cùng phổ kế plasma (ICP), đã xác định chính xác gần 100 hoạt chất và dẫn xuất trong nấm Linh chi (Lê Xuân Thám, 1996). 5 Bảng 2: Các hoạt chất sinh học và dẫn xuất trong nấm Linh chi (Lê Xuân Thám, 1996. Nấm Linh chi - dược liệu quý ở Việt Nam. Nhà xuất bản Mũi Cà Mau. Tr 107) Hoạt chất Nhóm Ức chế giải phóng histamin Cyclooctasulfur Adenosine dẫn xuất Tác dụng dược lý Nucleotide Ức chế kết dính tiểu cầu, thư giãn cơ, giảm đau Lingzhi – 8 Proteine Chống dị ứng phổ rộng, điều hòa miễn dịch Ganodosterone Steroide Giải độc gan Lanosporeric acid A, Lanosterol Steroide Ức chế sinh tổng hợp cholesterol Ganoderma A, B, C Polysaccharide Hạ đường huyết Beta –D-Glucan Polysaccharide Chống ung thư, tăng cường miễn 1,3,4,5 dịch BN-3B: 1, 2, 3. D -6 Polysaccharide Tăng tổng hợp protein, tăng chuyển hóa acid nucleic Ganoderic acid R, S Triterpenoid Ức chế giải phóng histamin Ganodermadiol Ganoderic acid Triterpenoid Hạ huyết áp B, D, F, H, K, Y. 6 Triterpenoid Ức chế sinh tổng hợp Cholesterol Triterpenoid Bảo vệ gan Ganosporelacton A, B Triterpenoid Chống khối u Oleic acid dẫn xuất Acid béo Ức chế giải phóng histamin Ganodermic acid M, F Ganoderic acid Lucidone A 1.3. Giá trị dược liệu của nấm Linh chi Linh chi chủ yếu được dùng như thuốc bổ, đặc biệt là như chất điều biến miễn dịch. Linh chi được dùng để tăng cường chức năng miễn dịch và đề phòng nhiễm trùng cơ hội trong các phác đồ điều trị cho bệnh nhân nhiễm HIV (Phạm Bảo Trương và cộng sự, 2015). Nhờ khả năng điều biến miễn dịch và ức chế sự sản sinh histamine, nấm Linh chi cũng có thể được dùng như tác nhân chống viêm trong điều trị hen suyễn và dị ứng. Linh chi cũng được dùng trong điều trị viêm khớp, viêm phế quản dị ứng... (Trần Hùng, 2014; Lê Đình Vũ và cs., 2015). Vì germanium trong Linh chi có thể tăng cường khả năng cung cấp oxy cho tế bào, Linh chi được dùng để giải tỏa sự căng thẳng; chữa đau đầu, chóng mặt, buồn nôn, mất ngủ; giảm tình trạng thiếu oxy do động mạch vành bị tắc nghẽn; giúp cơ thể chịu được tình trạng huyết áp thấp (Lê Đình Vũ và cs., 2015). Các nghiên cứu chứng minh Linh chi còn có các tác động tích cực đến hệ tuần hoàn và chức năng tim mạch: giảm cholesterol thừa trong máu, chống tình trạng mỡ máu cao, làm giãn mạch vành và tăng cường sự lưu thông máu, chống xơ vữa động mạch, tăng tần số và biên độ co tim, có tác dụng nhất định trong điều trị bệnh tim, điều hòa huyết áp, giảm lượng đường trong máu, chống sự kết tụ của tiểu cầu. Thành phần dược tính quan trọng (polysaccharide và triterpenoid) trong Linh chi có khả năng ức chế sự nhân bản của HIV, virus viêm gan siêu vi B, virus Herpes, v.v. (Lê Đình Vũ và cs., 2015). 7 Polysaccharide và triterpenoid trong Linh chi đỏ thể hiện khả năng chống oxy hóa in vitro. Các hoạt chất trong Linh chi giúp cơ thể tiêu diệt các gốc tự do, chống oxy hóa, từ đó ngăn ngừa ung thư và các bệnh mãn tính khác (Lê Đình Vũ và cs., 2015), (Chi.H.J. Kaol và cs., 2012). Ngoài ra, Linh chi còn tăng cường trí nhớ và chức năng hô hấp; chống lão hóa, làm tăng tuổi thọ; an thần; giảm đau; chống xơ hóa, bảo vệ gan, chữa trị viêm gan mãn tính; giải độc, ngăn tác hại của chất phóng xạ; hạ đường huyết; cải thiện chuyển hóa dinh dưỡng; hỗ trợ chữa trị tiểu đường type II; điều trị ho do cảm cúm, ho có đờm, chứng giảm bạch cầu, cơn đau thắt ngực; có tác dụng nhất định đến suy nhược thần kinh, suy nhược tim, đau lá lách, đau dạ dày, đau thận, đau nửa đầu, đau mật,... ( Trần Hùng, 2014), ( Lê Đình Vũ và cộng sự, 2015), ( Phạm Bảo Trương và cs, 2015). 1.4. Tổng quan về Polysaccharide Polysaccharide (PS) là polyme thiên nhiên thuộc nhóm carbohydrate và thường được coi là các polyme sinh học đa năng với các chức năng được biết đến như là nguồn năng lượng dự trữ (tinh bột, glycogen); tạo nên cấu trúc vững chắc cho thực vật hoặc động vật (cellulose, chitin); chất bảo vệ (exopolysaccharide của vi sinh vật) (De Vuyst & Degeest, 1999). Tabassum Khan (2019), đã đánh giá về tiềm năng chống ung thư của polysaccharide, cho thấy rằng: polysaccharide là một trong những chất tiềm năng để chống lại tế bào ung, nó thể hiện hoạt động chống ung thư tốt trên nhiều dòng tế bào và có thể được phát triển như chất thay thế của các chất hóa trị liệu ung thư hiện nay, có hoạt tính chọn lọc chống lại các tế bào khối u với tác dụng phụ thấp (T. Khan và cs., 2019). 1.5. Giới thiệu chung về phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM) Phương pháp bề mặt đáp ứng (Response surface method - RSM) là một phương pháp toán thống kê được ứng dụng rộng rãi trong mô hình hóa và phân tích các quá trình mà trong đó biến đáp ứng chịu ảnh hưởng bởi nhiều biến độc lập (Braimah và cs., 2016). Mục đích của phương pháp này là để tối ưu hóa giá trị của biến đáp ứng (Rushing, và cs., 2013). Trong phương pháp này, một mối quan hệ gần đúng phù hợp giữa các biến độc lập và biến đáp ứng được khảo sát, xây dựng thành mô hình và trực quan hóa dưới dạng đồ thị địa hình (topography graph). Dựa trên mô hình đó, các điểm tối ưu, tối thiểu cục bộ (local maximum and local minimum), các đường dốc (ridge) được xác định và dùng để 8 tìm ra vị trí mà giá trị của biến đáp ứng là tối đa (điểm tối ưu) (Bradley, 2007). Dữ liệu đầu vào của RSM là dữ liệu thu thập được từ các thí nghiệm được thiết kế. Thiết kế BoxBehnken (BBD) và thiết kế hỗn hợp trung tâm (CCD) là hai dạng thiết kế thí nghiệm chính được sử dụng trong phương pháp phản ứng bề mặt (Koc and Kaymak-Ertekin, 2010). Thiết kế CCRD và thiết kế FCCD cũng đã được áp dụng cho các nghiên cứu tối ưu hóa trong những năm gần đây (Prakash Maran và cs., 2013; Şahin và cs., 2017; Wang và cs., 2008) Thiết kế các thí nghiệm là giai đoạn quan trọng nhất của RSM. Bước này nhằm mục đích lựa chọn các điểm phù hợp nhất trong đó biến đáp ứng cần được khảo sát có khả năng cho giá trị tối ưu nhất. Các mô hình toán học được xây dựng trong RSM cũng chủ yếu liên quan đến dạng thiết kế thí nghiệm, do đó, việc lựa chọn thiết kế thí nghiệm có ảnh hưởng lớn trong việc xác định tính chính xác của việc xây dựng mô hình đáp ứng bề mặt. Tuy nhiên, phương pháp phản ứng bề mặt cũng cho phép sử dụng các kết quả thí nghiệm như những thí nghiệm sàng lọc để khám phá bề mặt của biến đáp ứng và đưa ra những đề xuất thí nghiệm tiếp theo để đạt được vị trí tối ưu mong muốn (Aydar, 2018). 1.6. Một số nghiên nghiên cứu trong và ngoài nước. 1.6.1. Một số nghiên cứu trong nước Trong một bài báo năm 2012, Nguyễn Bá Tư cùng cộng sự đã công bố kết quả nghiên cứu sự ảnh hưởng của điều kiện pH và nhiệt độ môi trường lên sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Linh chi trong điều kiện nuôi cấy huyền phù, được thực hiện trường Đại học Thủ Dầu Một và Sở Khoa học và Công nghệ tỉnh Bình Dương. Trong bài báo này, nhiệt độ tối ưu được xác định trong khoảng 25 - 30°C với pH lần lượt là 5,0 sau 7 ngày và 4,0 sau 14 ngày nuôi cấy. Hàm lượng sinh khối thu được tối đa sau 7 ngày là 450 mg/100ml và sau 14 ngày là 630 mg/100ml (Nguyễn Bá Tư và cs., 2012). Một số đặc điểm sinh học và năng suất của một số chủng giống nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) đã được nghiên cứu tại Trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế bởi Lê Đình Hoài Vũ và Trần Đăng Hòa. Nghiên cứu này nhằm so sánh một số đặc điểm sinh học và năng suất của 4 chủng nấm Linh chi (G. lucidum L, G. lucidum K, G. Lucidum DL, G. lucidum X) nuôi trồng ở tỉnh Thừa Thiên Huế. Kết quả cho thấy các chủng giống nấm Linh chi có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt trong điều kiện tự nhiên ở Thừa Thiên Huế. Tuy nhiên, các giống có thời gian từ khi cấy đến khi thu hoạch 9 là khác nhau, trong khoảng từ 76,7 – 86,6 ngày. Ganoderma lucidum L có chiều cao xuống thấp nhưng có đường kính cuống lớn nhất. Đường kính và độ dày của chủng giống G. lucidum L cao hơn so với các chủng giống G. lucidum K, G. lucidum DL và G. lucidum X. Nấm Linh chi có chứa nhiều hợp chất quý trong đó phải kể đến nhóm hợp chất polysaccharide có tác dụng chống ung thư, giảm đường trong máu, ngăn ngừa thoái hóa tế bào, thiết lập hệ thống miễn dịch, giải độc cơ thể. Thành phần chủ yếu có trong nhóm hợp chất polysaccharide gồm hầu hết là beta - glucan (Nguyễn Văn Bình, Phạm Thị Phương, 2018). Phạm Bảo Trương và Nguyễn Minh Thủy tiến hành tối ưu hóa quá trình trích ly hàm lượng polysaccharide và tannin trong nấm Linh chi đỏ. Kết quả nghiên cứu cho thấy nhiệt độ 1300 và thời gian trích ly 30 phút cho hàm lượng polysaccharide trong nước Linh chi cao nhất (684,1 ± 14,5 mg/l). Trong khi đó, hàm lượng tanin cao nhất (630,9 ±18,2 mg/l) đạt được khi thực hiện quá trình trích ở nhiệt độ 1200 và thời gian 45 phút. Mô hình bề mặt đáp ứng diễn tả ảnh hưởng của kết hợp nhiệt độ và thời gian trích ly đến hàm lượng polysaccharide (hoặc tannin) được xác định (Phạm Bảo Trương và cs., 2015). Ngoài nghiên cứu những yếu tố ảnh hưởng đến năng xuất, các nhà khoa học còn nghiên cứu về các hoạt tính sinh học của Linh chi. Đề tài nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa in vitro và in vivo của một số loại nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) và nấm vân chi (Trametes versicolor) được thực hiện tại Trung tâm Sâm và dược liệu Tp. Hồ Chí minh bởi Trương Thị Mỹ Chi và Nguyễn Thị Thu Hương. Trong nghiên cứu này tác dụng chống oxy hóa của nấm Linh chi (Linh chi Việt Nam, Linh chi đỏ sậm giống của Nhật) và nấm vân chi (vân chi vàng, vân chi nâu) được nuôi trồng ở Việt Nam đã được khảo sát. Kết quả cho thấy hoạt tính chống oxy hóa in vitro của Linh chi mạnh hơn vân chi. Các cao chiết của vân chi và Linh chi tác dụng phục hồi sự giảm số lượng bạch cầu gây bởi cyclophosphamide. Các cao cồn và cao nước của nấm Linh chi và vân chi vàng đều có tác dụng làm giảm sự gia tăng MDA trong gan gây bởi cyclophosphamide (Trương Thị Mỹ Chi và cs, 2010). Một nghiên cứu nhằm làm rõ ảnh hưởng của kỹ thuật sơ chế nguyên liệu, chiết xuất đến kết quả khai thác polysaccharide và triterpenoid từ nấm Linh chi (Ganoderma lucidum). Thực nghiệm cho thấy, hiệu suất thu nhận các hoạt chất có thể được cải thiện 10