Tài liệu Nghiên cứu sinh tổng hợp naringenin glucoside bằng phương phương nuôi cấy hỗn hợp hai chủng vi khuẩn escherichia coli cải biến di truyền

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐÀ NẴNG VÕ TRẦN KHÁNH HUYỀN NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP NARINGENIN GLUCOSIDE BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY HỖN HỢP HAI CHỦNG VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI CẢI BIẾN DI TRUYỀN LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT ĐÀ NẴNG - NĂM 2017 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐÀ NẴNG VÕ TRẦN KHÁNH HUYỀN NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP NARINGENIN GLUCOSIDE BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY HỖN HỢP HAI CHỦNG VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI CẢI BIẾN DI TRUYỀN Chuyên Ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã Ngành : 60420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Người hướng dẫn khoa học 1: TS. NGUYỄN HUY THUẦN Người hướng dẫn khoa học 2: TS. ĐẶNG ĐỨC LONG ĐÀ NẴNG - NĂM 2017 LỜI CẢM ƠN Hoàn thành luận văn cao học này, việc đầu tiên tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Thầy TS. Nguyễn Huy Thuần (Hướng dẫn khoa học 1), người đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn, hỗ trợ tôi rất nhiều để thực hiện đề tài nghiên cứu thành công và dành nhiều thời gian để đọc, sửa chữa luận văn cho tôi. Tôi xin chân thành cảm ơn Thầy TS. Đặng Đức Long (Hướng dẫn khoa học 2) và Cô Trưởng bộ môn Công nghệ sinh học – GVC. TS. Lê Lý Thùy Trâm đã quan tâm, chỉ bảo và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin được gửi lời cảm ơn tới các thầy, cô và kỹ thuật viên tại Trung tâm sinh học Phân tử - Viện Nghiên cứu và Phát triển công nghệ cao, Đại Học Duy Tân bao gồm thầy TS. Nguyễn Minh Hùng, TS. Nguyễn Thành Trung, TS. Nguyễn Thị Hà, TS. Lê Thành Đô, TS. Hồ Viết Hiếu và cử nhân Đặng Thị Kim Mai đã cho phép tôi được sử dụng các trang thiết bị và hướng dẫn các kỹ thuật cơ bản để tiến hành tốt các thí nghiệm. Và nơi đây chính là môi trường đã giúp tôi trưởng thành hơn rất nhiều trong công tác nghiên cứu. Bên cạnh đó, tôi xin gửi lời tri ân đến các cán bộ, giảng viên trường Đại học Bách Khoa và một số trường khác đã giảng dạy chúng tôi những kiến thức nền tảng đầy thú vị và bổ ích trong suốt quá trình học tập. Xin cảm ơn các anh, chị cùng khóa K32.CSH – Đại học Bách Khoa Đà Nẵng và sinh viên K19 khoa Dược – Đại học Duy Tân gồm em Nguyễn Hồng Phong, học viên cao học Phạm Thị Uyên đã động viên, hỗ trợ tôi rất nhiều trong thực hành thí nghiệm. Chúng tôi chân thành cảm ơn Ban Giám đốc Đại học Đà Nẵng; Ban Giám hiệu, Phòng đào tạo Sau đại học Trường đại học Bách Khoa Đà Nẵng; Ban Chủ nhiệm khoa Hóa – bộ môn Công nghệ Sinh học và Ban lãnh đạo trường Đại học Duy Tân đã quan tâm và tạo điều kiện tốt nhất trong học tập và hoàn thành luận văn. Nhân dịp này, con vô cùng biết ơn những người thân trong gia đình, đặc biệt là bố mẹ, luôn là nền tảng động lực phía sau, tạo mọi điều kiện có thể nhất giúp con vững tin hoàn thành tốt khóa học và thực hiện nghiên cứu thành công đề tài luận văn cao học này. Đà Nẵng, ngày… tháng… năm… Tác giả luận văn Võ Trần Khánh Huyền LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu và kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan, nghiêm túc và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Nếu có gì sai sót, tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm. Đà Nẵng, ngày… tháng… năm… Tác giả luận văn Võ Trần Khánh Huyền SINH TỔNG HỢP NARINGENIN GLUCOSIDE BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY HỖN HỢP HAI CHỦNG VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI CẢI BIẾN DI TRUYỀN Võ Trần Khánh Huyền1, Đặng Đức Long2, Nguyễn Huy Thuần3, 1 Bộ môn Công nghệ Sinh học, Khoa Hóa học, Đại học Bách Khoa Đà Nẵng. 2 Viện VN-UK – Đại học Đà Nẵng. 3 Viện Nghiên cứu và Phát triển, Đại học Duy Tân. Tóm tắt Hợp chất thứ cấp flavonoid đã được chứng minh có chứa nhiều hoạt tính sinh học quý như chống oxy hóa, kháng viêm, chống khối u, lão hóa, v.v, do đó, được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu y sinh dược và thực tiễn. Hiện nay, người ta có nhiều phương pháp điều chế, tổng hợp để thu nhận flavonoid như tách chiết từ thực vật, tổng hợp hóa học và vi sinh vật học. Tuy nhiên, phương pháp vi sinh vật học ngày càng được quan tâm vì đơn giản, cho sản lượng cao, dễ tiến hành và thân thiện với môi trường. Trong đó, các nhà nghiên cứu thường sử dụng chủng vi sinh vật thuần khiết (dạng tự nhiên hoặc tái tổ hợp di truyền) và tiến hành nuôi cấy. Trong bài báo này, chúng tôi trình bày kết quả sinh tổng hợp naringenin-7-O-glucoside bằng hệ thống đồng nuôi cấy hai chủng vi khuẩn Escherichia coli cải biến di truyền (EC1 và EC2). Kết quả nghiên cứu cho thấy naringenin 7-O-glucoside đã được tổng hợp thành công từ cơ chất axit p-coumaric với hàm lượng cao nhất đạt 4,82 µM sau 48 giờ nuôi cấy với tỷ lệ phối trộn hai chủng là EC1:EC2 = 1:8 (v:v) dựa trên mật độ quang mỗi chủng ban đầu OD600nm= 2,2-2,4, nhiệt độ 32oC. Do đó, nghiên cứu này chứng minh đồng nuôi cấy có tiềm năng ứng dụng trong sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp khác ở vi sinh vật. Từ khóa: Đồng nuôi cấy, E. coli, cải biến di truyền, naringenin glucoside, sinh tổng hợp --------------------------------------------------------------------------------------------------BIOSYNTHESIS OF NARINGENIN GLUCOSIDE USING CO-CULTURE OF METABOLICALLY ENGINEERED ESCHERICHIA COLI Vo Tran Khanh Huyen1, Dang Duc Long2, Nguyen Huy Thuan3* 1 Department of Biotechnology, Faculty of Chemistry, University of Science and Technology - The University of Da Nang 2 VN-UK - The University of Da Nang 3 Center for Molecular Biology, Duy Tan University ABSTRACT Flavonoids, type of secondary metabolites, have been demonstrated to contain numerous valuable bioactivities such as antioxidant, anti-inflammatory, anti-tumor, anti-aging, etc. Thereby those compounds are widely used in pharmaceutical and biomedical researches and practical applications. There are various methods of synthesis and production of the desired flavonoid compounds including the extraction techniques from plants, chemical and microbiological synthesis. Among them, microbiological methods have gained much interest due to its simplicity, simple implement, high yield and environment frendly. Traditionally, microorganism strains (type of natural or recombinant) are usually used in pure culture for biosynthesis of target compound. In the present paper, we described the biosynthetic method of naringenin -7-O-glucoside using co-culure system with two metabolically engineered Escherichia coli strains (EC1 and EC2 strain). The results of study showed successfull biosynthesis of naringenin -7-O-glucoside from p-coumaric acid as substrate and the highest concentration of 4.82 µM after 48 hours culture with the mixing ratio of EC1:EC2 = 1:8 (v:v) based on starting optical density of each strains OD600nm = 2.2-2.4 and temperature of 32 oC. Therefore, the present research showed that co-culture has a great potential for application in the biosynthesis of other secondary metabolites using microoraganisms. Keywords. Co-culture, Escherichia coli, metabolic engineering, naringenin glucoside, biosynthesi MỤC LỤC PHẦN MỞ ĐẦU................................................................................................................... 1 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI ..................................................................................... 1 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU .............................................................................................. 2 3. ĐỐI TƯỢNG – PHẠM VI NGHIÊN CỨU ...................................................................... 2 4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................................................................... 3 5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI ................................................ 4 6. BỐ CỤC NỘI DUNG LUẬN VĂN .................................................................................. 4 CHƯƠNG 1- TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................ 5 1.1. TỔNG QUAN VỀ HỢP CHẤT FLAVONOID .......................................................... 5 1.2. ĐẶC TÍNH SINH DƯỢC HỌC CỦA NARINGENIN GLYCOSIDE ..................... 8 1.2.1. Giới thiệu sơ bộ về hợp chất glycoside ........................................................................ 8 1.2.2. Hợp chất naringenin glycoside và một số tác dụng. .................................................. 10 1.3. CON ĐƯỜNG SINH TỔNG HỢP NARINGENIN VÀ NARINGENIN GLUCOSIDE ..................................................................................................................... 12 1.3.1. Con đường sinh tổng hợp naringenin (NRN) ............................................................ 12 1.3.2. Quá trình tổng hợp glycoside ở thực vật và vi khuẩn ................................................ 14 1.4. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP HIỆN ĐẠI SINH TỔNG HỢP CHẤT THỨ CẤP ... 18 1.4.1. Sinh tổng hợp theo phương pháp nuôi cấy đơn (mono-culture) ................................ 18 1.4.2. Sinh tổng hợp theo phương pháp nuôi cấy hỗn hợp .................................................. 21 CHƯƠNG 2- NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................... 25 2.1. NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU ............................................................................... 25 2.1.1. Hệ thống chủng vi khuẩn mang vector và plasmid tái tổ hợp ................................... 25 2.1.2. Môi trường nuôi cấy .................................................................................................. 26 2.1.3. Hóa chất và phương tiện nghiên cứu ......................................................................... 29 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ....................................................................................... 30 2.2.1. Nội dung thứ nhất ...................................................................................................... 30 2.2.2. Nội dung thứ hai ........................................................................................................ 30 2.2.3. Nội dung thứ ba ......................................................................................................... 30 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................................... 31 2.3.1. Phương pháp sinh học phân tử ................................................................................... 33 2.3.2. Các phương pháp tổng hợp naringenin và naringenin glucoside trong điều kiện invivo ....................................................................................................................................... 33 a. Phương pháp nuôi cấy hỗn hợp (co-culture) .............................................................. 34 b. Phương pháp nuôi cấy đơn (mono-culture) ................................................................ 35 2.3.3. Các phương pháp phổ ứng dụng trong phân tích sản phẩm chuyển hóa. .................. 36 a. Kỹ thuật tách chiết sản phẩm ...................................................................................... 36 b. Định tính và định lượng sản phẩm .............................................................................. 37 2.3.4. Xử lý, phân tích số liệu và dữ kiện ............................................................................ 40 CHƯƠNG 3- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................................... 41 3.1. TỔNG HỢP NRN VÀ NGS BẰNG NUÔI CẤY ĐƠN TỔNG HỢP (MONOCULTURE)......................................................................................................................... 41 3.1.1. Tổng hợp NRN từ cơ chất axit pCA .......................................................................... 41 3.1.2. Đường hóa cơ chất NRN thành NGS......................................................................... 42 3.1.3. Chuyển hóa tổng hợp NRN trung gian và sản phẩm NGS từ cơ chất pCA ............... 43 3.2. TỔNG HỢP NGS TỪ CƠ CHẤT PCA BẰNG NUÔI CẤY HỖN HỢP ............... 44 3.2.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ nuôi cấy (EC1/EC2) đến hiệu suất sản phẩm NGS trong môi trường TB lỏng .................................................................................................................... 45 3.2.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ nuôi cấy (EC1/EC2) đến hiệu suất sản phẩm NGS trong môi trường M9 lỏng (+ 2% glucose)........................................................................................... 49 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................................... 56 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC QUYẾT ĐỊNH GIAO ĐỀ TÀI (BẢN SAO) HỒ SƠ HỘI ĐỒNG ĐÁNH GIÁ LUẬN VĂN THẠC SỸ (BẢN SAO) NHẬN XÉT LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tên đầy đủ 4CL 4-coumaroyl-CoA ligase CHI Chalcone isomerase CHS Chalcone synthase CPR cytochrome P450 reductase DMSO Dimethyl sulfoxide F3H Flavone 3β-hydroxylase F3GT Flavonol 3-O-glycosyltransferase FLS Flavonol synthase GT Glycosyltransferase HPLC High-performance liquid chromatography IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside KLPT Khối lượng phân tử LB Lysogeny broth LC-ESI/MS Liquid Chromatography Electrospray Spectroscopy NDP nucleotide diphosphate OD Optical density OMT O-methyltransferase PAL phenylalanine amoniac lyase TAL Tyrosine amoniac lyase TB Terrific Broth TDP Thymidine diphosphate UDP Uridine diphosphate UGT Uridine diphosphate glycosyltransferase NRN Naringenin NGS Naringenin glucoside Ionization Mass DANH MỤC CÁC BẢNG Số hiệu bảng 2.1. Tên bảng Danh sách các chủng vi khuẩn Escherichia coli tái tổ hợp được sử dụng trong nghiên cứu Trang 26 2.2. Tỷ lệ thành phần dinh dưỡng trong môi trường LB thạch 27 2.3. Tỷ lệ thành phần dinh dưỡng trong môi trường TB lỏng 28 2.4. Danh sách nguyên – vật liệu sử dụng trong đề tài 29 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Số hiệu Tên hình vẽ hình vẽ Trang 1.1. Cấu trúc khung của flavonoid 5 1.2. Phân nhóm chính của hợp chất flavonoid 6 1.3. Các loại hợp chất thuộc phân nhóm euflavonoid 6 1.4. Cấu trúc của naringenin 8 1.5. Cấu trúc chung của hợp chất O-glycoside 9 1.6. Cấu trúc của naringin 11 1.7. Cấu trúc của prunin 11 1.8. Con đường sinh tổng hợp naringenin ở thực vật 13 1.9. Quá trình đường hóa các hợp chất aglycone tạo glycoside 15 1.10. 2.1. 2.2. 3.1. 3.2. 3.3. Hai cơ chế tác dụng chính của enzyme glycosyltransferase Sơ đồ thể hiện quy trình chung tiến hành thí nghiệm Sơ đồ thiết kế chủng vi khuẩn E. coli tái tổ hợp và phương thức hoạt động tạo ra NGS từ cơ chất p-coumaric Chuyển hóa cơ chất pCA tổng hợp thành NRN ở chủng vi khuẩn E. coli EC1 Chuyển hóa cơ chất NRN tổng hợp thành NGS ở chủng vi khuẩn E. coli EC2 Tổng hợp NGS từ cơ chất pCA ở chủng vi khuẩn E. coli ECNGS 16 32 34 42 43 44 3.4. 3.5. 3.6. Tổng hợp NGS sử dụng nuôi cấy hỗn hợp với các tỷ lệ phối trộn (R1, R2, R3, R4) trong môi trường TB Tổng hợp NGS sử dụng nuôi cấy hỗn hợp với các tỷ lệ phối trộn (R1’, R2’, R3’) trong môi trường TB Phân tích định tính chuyển hóa pCA thành các chất NRN và NGS bằng phương pháp HPLC đảo pha 45 46 48 Tổng hợp NGS sử dụng nuôi cấy hỗn hợp với các tỷ lệ 3.7. phối trộn (R1, R2, R3, R4) trong môi trường M9 (+2% 49 glucose) Tổng hợp NGS sử dụng nuôi cấy hỗn hợp với các tỷ lệ 3.8. phối trộn (R1’, R2’, R3’) trong môi trường M9 (+2% 50 glucose) 3.9. 3.10. So sánh hiệu suất tổng hợp NGS của nuôi cấy hỗn hợp trong hai môi trường TB và M9 (+2% glucose) Kết quả phân tích LC-ESI/MS (positive mode). 51 52 1 PHẦN MỞ ĐẦU 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Hiện nay, nhu cầu sử dụng các loại thực vật làm dược liệu và chăm sóc sức khỏe con người ngày càng tăng cao. Do đó, việc khai thác các hợp chất quý giá này đang trở thành một vấn đề quan trọng mang tính toàn cầu và ngày càng được thương mại hóa nhiều hơn. Tuy nhiên, phương pháp tách chiết hoạt chất trực tiếp từ thực vật hay tổng hợp bằng hóa học các hợp chất quý trong đó có glycoside rất khó khăn do phải phụ thuộc vào thời gian sinh trưởng của cây, khó nuôi cấy, năng suất thấp, chi phí cho công nghệ sản xuất cao và có những thành phần hóa chất thải gây độc môi trường, con người. Với sự phát triển công nghệ sinh học ngày nay, các thành tựu của kỹ thuật di truyền, protein tái tổ hợp và cải biến trao đổi chất đã được kết hợp với nhau và ứng dụng rộng rãi trong việc tổng hợp các hợp chất thứ cấp tự nhiên nói chung và tổng hợp flavonoid glycoside nói riêng. Phương pháp sinh tổng hợp này có thể khắc phục được các nhược điểm nói trên, vì có tính đặc hiệu rất cao, năng suất tốt và tiết kiệm thời gian, chi phí vận hành, dễ dàng gia tăng sản xuất với quy mô lớn [34], [42], [43]. Vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn là nguồn vi sinh vật được sử dụng chủ yếu để sản xuất các hợp chất mong muốn trong phương pháp sinh học. Trong đó, vi khuẩn Escherichia coli là loại cơ bản và phổ biến nhất thường được ứng dụng làm vật chủ (host) trong các thí nghiệm tổng hợp hoạt chất tự nhiên hoặc chất mới. Nguyên nhân là người ta đã biết rất rõ các đặc điểm sinh lý, sinh hóa, di truyền cũng như khả năng nhân đôi mạnh mẽ, nguồn phân lập phong phú của loại vi khuẩn này [35]. Trước đây, người ta chủ yếu nuôi cấy lên men chỉ với một chủng vi khuẩn duy nhất trong suốt quá trình sinh tổng hợp các hợp chất tự nhiên, 2 phương pháp này được gọi là nuôi cấy đơn (mono-culture). Hình thức sinh tổng hợp này tuy đơn giản, dễ thực hiện nhưng cũng hạn chế phạm vi ứng dụng của các kỹ thuật di truyền và protein tái tổ hợp. Ví dụ, nếu đưa nhiều tái tổ hợp di truyền vào trong vi sinh vật chủ sẽ làm giảm hiệu suất biểu hiện các chuỗi gene mã hóa enzyme của chúng và xuất hiện nhiều hợp chất phụ không mong muốn, có khả năng gây ức chế cảm ứng, làm giảm sự sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn, hoặc thậm chí gây chết tế bào [52]. Do đó, gần đây đã xuất hiện xu hướng nghiên cứu sinh tổng hợp hoạt chất bằng nuôi cấy hỗn hợp hai hoặc nhiều chủng vi sinh vật để tổng hợp các hợp chất như axit hữu cơ, flavonoid, v.v. Các kết quả bước đầu cho thấy nuôi cấy hỗn hợp có kết quả tốt trong quy mô phòng thí nghiệm và có tiềm năng ứng dụng lớn trong công nghiệp. Do đó, xuất phát từ những cơ sở trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sinh tổng hợp naringenin glucoside bằng phương pháp nuôi cấy hỗn hợp hai chủng vi khuẩn Escherichia coli cải biến di truyền”. 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Trong luận văn này, chúng tôi đề xuất các thí nghiệm thực hiện phương pháp nuôi cấy hỗn hợp hai chủng vi khuẩn E. coli tái tổ hợp để tổng hợp naringenin glucoside với mục tiêu tạo ra một công cụ tổng hợp giúp làm giảm thao tác di truyền phức tạp và nâng cao hiệu quả tổng hợp hoạt chất. Luận giải chi tiết về phương pháp sẽ được trình bày trong các phần tiếp theo. 3. ĐỐI TƯỢNG – PHẠM VI NGHIÊN CỨU ➢ Đối tượng nghiên cứu: - Chủng vi khuẩn Escherichia coli XL1 (tách dòng) và chủng vi khuẩn Escherichia coli BL21 (DE3) (biểu hiện) cung cấp bởi công ty Promega, Mỹ được cải biến di truyền. 3 - Hợp chất pCA (axit p-coumaric), NRN (naringenin) và NGS (naringenin glucoside) được cung cấp bởi công ty hóa chất SigmaAldrich, Mỹ. ➢ Phạm vi nghiên cứu: - Địa điểm thực hiện: Toàn bộ quá trình thiết kế và tiến hành thí nghiệm được thực hiện tại Trung tâm Sinh học phân tử - Viện Nghiên cứu và phát triển công nghệ cao – Trường Đại học Duy Tân – Đà Nẵng. - Thời gian thực hiện: 02/2017 - 12/2017. 4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ➢ Phương pháp sinh học phân tử - Phương pháp di truyền phân tử: Các thao tác di truyền trên DNA như cắt, nối, phản ứng PCR được thực hiện theo protocol chuẩn của Sambrook và cs (2001) [49]. ➢ Phương pháp nuôi cấy đơn và nuôi cấy hỗn hợp - Nuôi cấy vi khuẩn E. coli trên môi trường đĩa thạch có sử dụng kháng sinh với nồng độ phù hợp. - Nuôi cấy vi khuẩn E. coli trong môi trường ống nghiệm và bình tam giác có sử dụng kháng sinh với nồng độ phù hợp. ➢ Phương pháp hóa phân tích - Tách chiết hoạt chất NRN và NGS bằng phương pháp chiết pha lỏngpha lỏng sử dụng ethylacetate làm dùng môi. Đông khô mẫu trên máy sấy thăng hoa. - Định tính và định lượng chất bằng phương pháp HPLC và LC-ESI/MS. Mô tả chi tiết của các phương pháp trên được tiến hành theo bài báo đã được công bố [61]. 4 5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI ➢ Ý nghĩa khoa học của đề tài Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học và có tính hệ thống về nuôi cấy tổng hợp hoạt chất ở vi sinh vật tái tổ hợp theo phương pháp đồng nuôi cấy in-vivo. ➢ Ý nghĩa thực tiễn của đề tài Kết quả của đề tài luận văn là cơ sở khoa học để phát triển hệ thống nuôi cấy – lên men huyền phù tế bào vi sinh vật nhằm tổng hợp nhanh hợp chất ở qui mô lớn hơn (pilot). Các loại hoạt chất tổng hợp có thể thuộc các loại như thuốc, mỹ phẩm, thực phẩm chức năng. 6. BỐ CỤC NỘI DUNG LUẬN VĂN Nội dung bài luận văn gồm có những chương mục chính sau: - Mở đầu - Chương 1: Tổng quan tài liệu. - Chương 2: Những nghiên cứu thực nghiệm. - Chương 3: Kết quả và thảo luận. - Kết luận và kiến nghị. - Tài liệu tham khảo. - Phụ lục. 5 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN VỀ HỢP CHẤT FLAVONOID Flavonoid là thuật ngữ chung chỉ nhóm các hợp chất thiên nhiên thứ cấp có dạng polyphenol ở thực vật. Cấu tạo khung của flavonoid là chuỗi cacbon C6-C3-C6 (C15) gồm hai vòng thơm (vòng A và vòng B) được nối với nhau bởi “cầu nối” dị vòng 3-cacbon (vòng C) (Hình 1.1) [12]. Hình 1.1. Cấu trúc khung của flavonoid Tùy thuộc vào cách sắp xếp, mức oxy hóa, methyl hóa, alkyl hóa hay glycosyl hóa, cấu trúc khung phenylpropanoid C15 bị phân hóa mạnh và tạo ra tới hơn 9.000 loại dẫn xuất khác nhau. Dựa vào vị trí nối giữa vòng thơm B với nhóm chức benzopyrano (C6-C3), mà người ta phân nhóm hợp chất thứ cấp này thành 3 loại lớn: euflavonoid (2-phenylbenzopyran), isoflavonoid (3benzopyran) và neoflavonoid (4-benzopyran) (Hình 1.2). Với euflavonoid (2phenylbenzopyran), tùy thuộc vào mức oxy hóa và mức bão hòa ở nhóm dị vòng 3C, người ta lại phân ra thành các nhóm nhỏ bao gồm: flavan, flavanone, flavone, flavonol, flavan-3-ol, flavan-4-ol, flavan-3,4-diol, dihydroflavonol được minh họa như (Hình 1.3) [9], [10]. 6 Hình 1.2. Phân nhóm chính của hợp chất flavonoid (1): euflavonoid, (2): isoflavonoid, (3): neoflavonoid. Hình 1.3. Các loại hợp chất thuộc phân nhóm euflavonoid. (1): flavan, (2): flavanone, (3): flavone, (4): flavonol, (5): dihydroflavonol, (6): flavan-3-ol, (7): flavan-4-ol, (8): flavan-3,4-diol 7 Các hợp chất flavonoid rất phổ biến ở thực vật có mạch (vascular plant) và có vai trò sinh lý quan trọng cũng như sự tương tác của cây đối với môi trường. Chúng là những sắc tố có nồng độ khá cao ở lớp biểu bì lá, lớp vỏ của quả và hoa. Do đó, màu sắc của hoa (với sự góp mặt của flavonoid) có vai trò thu hút côn trùng đến thụ phấn và phân tán hạt giống. Ngoài ra, flavonoid còn có khả năng hấp thụ tia cực tím gây hại để bảo vệ bộ gen của cây, kích thích nốt sần cố định đạm và kháng bệnh. Ngoài ra, flavonoid còn có tác động đến sự vận chuyển các hormone của cây. Đối với con người, flavonoid được sử dụng làm chất kháng khuẩn, kháng viêm, kháng ung thư, kháng oxy hóa, v.v và được đưa vào cơ thể qua các nguồn thực phẩm và dược phẩm [12]. Cho tới nay, đã có một số bài báo chứng minh được rằng flavonoid ngăn chặn các bệnh như Alzheimer và Parkinson [37]. NRN (4’,5,7-trihydroxyflavanone; CTPT: C15H12O5) là một flavonoid thuộc phân nhóm flavanone (Hình 1.4). NRN tự nhiên được tìm thấy chủ yếu trong nho, vỏ khoai tây, cam, bưởi và các loại trái cây có múi khác [5]. Khi tiêu thụ nông sản có chứa NRN thì hoạt tính sinh học của nó có tác động đáng kể đến sức khỏe con người. Nghiên cứu cho thấy rằng chất này đóng vai trò như một tác nhân chống oxy hóa, có khả năng kích hoạt thụ thể nhân PPARa (Peroxisome proliferator-activated receptor alpha) và PPARg (Peroxisome proliferator-activated receptor gamma) trong khi ngăn chặn thụ thể LXRa (Liver X receptor alpha) để hỗ trợ gan phân hủy axit béo và tăng độ nhạy cảm của insulin dẫn tới kìm hãm, điều trị bệnh tiểu đường [26]. Bên cạnh đó, NRN cũng là một hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn, kháng ung thư mạnh và làm giảm lượng cholesterol trong cơ thể [11], [64]. 8 Hình 1.4. Cấu trúc của naringenin. Tuy vậy, do kém tan trong nước nên NRN khó được cơ thể hấp thu qua ống tiêu hóa, ví dụ, thực nghiệm cho thấy chỉ có 15% lượng NRN được hấp thụ qua dạ dày [1], [26]. 1.2. ĐẶC TÍNH SINH DƯỢC HỌC CỦA NARINGENIN GLYCOSIDE 1.2.1. Giới thiệu sơ bộ về hợp chất glycoside Glycoside là các hợp chất hữu cơ rất phổ biến và thường gặp trong tự nhiên. Về mặt cấu trúc, glycoside bao gồm một hoặc nhiều nhóm đường hay nhóm axit đường (axit uronic) (được gọi chung là glycone) gắn vào một phân tử hữu cơ không phải dạng đường (được gọi chung là aglycone) bằng liên kết glycosidic (Hình 1.5). Dựa vào thành phần aglycone mà người ta phân ra rất nhiều loại glycoside, trong đó có: nhóm alkaloid glycoside, hormone glycoside, kháng sinh glycoside, flavonoid glycoside, alcoholic glycoside,.v.v. Mối liên kết glycosidic giữa hai thành phần trong hợp chất glycoside thường có bốn loại chính đó là liên kết -O- (glycoside), -C- (C-glycoside), -N- (Nglycoside), và -S- (thioglycoside) [8]. 9 Hình 1.5. Cấu trúc chung của hợp chất O-glycoside Có rất nhiều nghiên cứu so sánh hoạt tính sinh học và đặc tính lý hóa giữa hợp chất thứ cấp dạng aglycone và dẫn xuất glycoside đã được công bố gần đây. Theo đó, người ta thấy rằng thông số động lực học của các hợp chất thứ cấp gắn thêm phân tử đường thể hiện mạnh hơn so với aglycone tương ứng. Ví dụ như sức căng bề mặt thấp hơn, khả năng hòa tan trong nước cao hơn hay hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng ung thư tác động rộng hơn [30], [31]. Do vậy, trong nghiên cứu dược phẩm, mỹ phẩm và thực phẩm chức năng, người ta thường thực hiện quá trình đường hóa aglycone để tạo thành hợp chất có dẫn xuất dạng glycoside nhằm khắc phục được các nhược điểm của gốc aglycone và nâng cao tiềm năng ứng dụng. Ví dụ, nhiều loại kháng sinh thuộc dẫn xuất glycoside như streptomycin được sử dụng trong điều trị bệnh lao, vancomycin ức chế tổng hợp vỏ của tế bào vi khuẩn Gram dương hoặc các loại thuốc kháng ung thư như doxorubicin kết hợp với một số loại thuốc khác để điều trị ung thư vú, u xương ác tính [15], [30].