Tài liệu Nghiên cứu quy trình tách chiết, phân tích adn và tế bào phôi thai tự do trong máu ngoại vi mẹ để chẩn đoán trước sinh

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Triệu Tiến Sang NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT, PHÂN TÍCH ADN VÀ TẾ BÀO PHÔI THAI TỰ DO TRONG MÁU NGOẠI VI MẸ ĐỂ CHẨN ĐOÁN TRƢỚC SINH LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC 1 Hà Nội, 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Triệu Tiến Sang NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT, PHÂN TÍCH ADN VÀ TẾ BÀO PHÔI THAI TỰ DO TRONG MÁU NGOẠI VI MẸ ĐỂ CHẨN ĐOÁN TRƢỚC SINH Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62420121 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS.TS Trần Văn Khoa 2 2. PGS.TS Đinh Đoàn Long Hà Nội, 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Luận án là công trình nghiên cứu thực sự của cá nhân, được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS. Trần Văn Khoa và PGS.TS. Đinh Đoàn Long. Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình. Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Nghiên cứu sinh Triệu Tiến Sang 3 LỜI CẢM ƠN Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành và sâu sắc tới PGS.TS. Trần Văn Khoa – Chủ nhiệm Bộ môn Sinh học và Di truyền y học – Học viện Quân y, Trưởng phòng Công nghệ Gen và Di truyền tế bào –Trung tâm nghiên cứu Sinh Y dược – Học viện Quân y và PGS.TS. Đinh Đoàn Long – Chủ nhiệm Bộ môn Y dược học cơ sở , Phó Chủ nhiệm Khoa Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội đã tận tình hướng dẫn tôi trong quá trình nghiên cứu để hoàn thành luận án tiến sĩ. Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Thị Hồng Vân – Chủ nhiệm Bộ môn Di truyền học, các thầy cô giáo Bộ môn Di truyền học và Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội đã chỉ bảo tận tình và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới GS.TS. Hoàng Văn Lƣơng – Phó giám đốc Học viện Quân y, Giám đốc Trung tâm Nghiên cứu Sinh y Dược – HVQY; PGS.TS Nguyễn Duy Bắc, Phó Phòng Công nghệ Gen và Di truyền tế bào và các đồng chí, đồng nghiệp tại Bộ môn Sinh học và Di truyền y học; cùng các đồng chí tại Phòng Công nghệ gen và Di truyền tế bào – Trung tâm nghiên cứu Sinh Y Dược học – Học viện Quân y đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn Trung tâm Nghiên cứu gen và protein – Đại học Y Hà Nội, Phòng Xét nghiệm Di truyền – Bệnh Viện Từ Dũ và Trung tâm Nghiên cứu Sinh Y Dược – Học viện Quân y đã cung cấp mẫu phục vụ cho các nghiên cứu của luận án. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và tất cả những người thân, bạn bè đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu vừa qua. Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Nghiên cứu sinh Triệu Tiến Sang 4 CHỮ VIẾT TẮT Nghĩa Tiếng Việt Từ viết tắt Nghĩa tiếng Anh A Adenine Adenine ADN Deoxyribonucleic Acid Acid Deoxyribonucleic AF Amniotic Fluid Dịch ối AFP Alpha-fetoprotein Alpha-fetoprotein AIHW Australian Institute of Health and Viện sức khỏe và phúc lợi Úc Welfare ATP Adenosine Triphosphate Adenosine Triphosphate Bp Base pairs Cặp bazơ C Cytosine Cytosine CAH Congenital Adrenal Hyperplasia Tăng sản thượng thận bẩm sinh CVS Chorionic villous sampling Lấy mẫu gai rau dNTPs Deoxyribonucleotide Deoxyribonucleotide Triphosphate Triphosphate Dị tật bẩm sinh DTBS Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid Fluorescence-activated cell Phân loại tế bào bằng hoạt hóa sorting FACS Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid EDTA huỳnh quang FISH Fluorescence in-situ hybridization Lai tại chỗ huỳnh quang fNRBCs Fetal nucleated red blood cells Tế bào hồng cầu có nhân của phôi thai G Guanine Guanine 5 HCĐ Down syndrome Hội chứng Down Kb Kilo base Kilo base Khoảng sáng sau gáy KSSG MACS Magnetic activated cell sorting Phân loại tế bào hoạt hóa từ tính Nhiễm sắc thể NST PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi nhờ polymerase PUBS Percutaneous umbilical cord Lấy mẫu máu cuống rốn qua da blood sampling Quantitative fluorescence - Phản ứng chuỗi định lượng Polymerase Chain Reaction huỳnh quang STR Short Tandem Repeat Lặp lại liên tiếp đoạn ngắn T Thymine Thymine Taq – Thermus aquaticus polymerase QF-PCR polymerase TBE Tris - Boric – EDTA Tris - Boric – EDTA TOP Termination of pregnancy Đình chỉ thai UV Ultra Violet Tia cực tím β hCG Beta_human chronic Beta_human chronic gonadotropin gonadotropin 6 DANH MỤC BẢNG TRANG STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Bảng 1.1. Thống kê so sánh 4 sản phẩm thương mại của kỹ thuật NIPT Bảng 1.2. Các Kít sử dụng kỹ thuật NIPT ứng dụng tại Mỹ Bảng 2.1. Thành phần hóa chất của bộ QIAamp ADN blood Mini Kit Bảng 2.2. Trình tự và kích thước sản phẩm khuếch đại gen SRY và GAPDH Bảng 2.3. Thành phần của phản ứng PCR vòng 1 và vòng 2 Bảng 2.4. Chu trình nhiệt của phản ứng nhân gen mồi ngoài và mồi trong gen SRY và chu trình nhiệt nhân gen GAPDH Bảng 2.5. Trình tự mồi và đầu dò của phản ứng định lượng huỳnh quang gen DYS14 và GAPDH Bảng 2.6. Chu trình nhiệt của phản ứng Realtime-PCR Bảng 2.7. Công thức và ứng dụng của các chất gắn trên bề mặt hạt từ tính Bảng 2.8. Các locus STR trên các NST 13, 18, 21 và NST X, Y Bảng 2.9. Thành phần và thể tích của phản ứng QF-PCR Bảng 2.10. Chu trình nhiệt của phản ứng QF-PCR Bảng 2.11. Các thành phần cho 1 mẫu điện di Bảng 2.12. Chu trình nhiệt biến tính sản phẩm PCR cho điện di mao quản Bảng 2.13. Phân tích tỷ lệ các peak huỳnh quang STR Bảng 2.14. Độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật Nested PCR hoặc Realtime PCR Bảng 3.1. Nồng độ ADN (ng/µl) của phương pháp tách bằng nhiệt và phương pháp tách bằng bộ Kít Qiagen Bảng 3.2. Kết quả số bản copy gen DYS14 (A: copy/ml) và nồng độ gen DYS14/GAPDH (B: %) ở các tuần 6 đến 12 của thai kỳ của các trường hợp thai nam Bảng 3.3. Kết quả số bản copy gen GAPDH (A: copy/ml) ở các tuần 6 đến 12 của thai kỳ của các trường hợp thai nữ Bảng 3.4. So sánh kết quả của kỹ thuật Nested PCR, Realtime 7 33 34 49 50 51 51 52 53 54 57 58 58 59 59 61 62 63 71 72 75 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 PCR với siêu âm ở tuần thứ 16/ sau sinh (A) Bảng 3.5. Độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật Nested PCR và Realtime-PCR ở 6 tuần tuổi thai Bảng 3.6. Độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật Nested PCR và Realtime-PCR ở 7 tuần tuổi thai Bảng 3.7. Độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật Nested PCR và Realtime-PCR ở tuổi thai >8 tuần. Bảng 3.8. Độ nhạy và độ đặc hiệu của 2 kỹ thuật Realtime PCR và Nested PCR ở các tuần tuổi thai Bảng 3.9. Kết quả nhân gen SRY (trước sinh: A) và kiểm chứng sau sinh (B) của 189 mẫu nghiên cứu tuổi thai từ 7+6 đến 9+2 Bảng 3.10. Kết quả nồng độ ADN biến thiên sau sinh Bàng 3.11. Nồng độ ADN phôi thai tự do trong huyết tương mẹ mang thai nam bình thường Bảng 3.12. Nồng độ ADN phôi thai tự do trong huyết tương mẹ mang thai nam bất thường Bảng 3.13. Kết quả sàng lọc bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh Bảng 3.14. Kết quả sàng lọc bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne Bảng 3.15. Chu trình nhiệt của phản ứng nhân gen RhD Bảng 3.16. Kết quả chẩn đoán nhóm máu Rh của thai nhi ở tuần thứ 8 Bảng 3.17. Kết quả thử nghiệm trên các tế bào phôi thai tự do 8 76 76 77 77 85 87 98 99 107 110 111 112 116 DANH MỤC CÁC HÌNH TRANG STT 1 Hình1.1: Các bước chình của kỹ thuật FISH 24 2 Hình 1.2: Nguyên tắc của phản ứng Nested PCR (PCR lồng) 25 3 Hình 1.3. Phương pháp Real-time PCR với mẫu dò TaqMan 26 4 Hình 1.4. Tóm tắt cơ chế hoạt động của Taqman probe trong Realtime- 27 PCR 5 Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu 48 6 Hình 2.2. Trình tự đoạn gen DYS14 53 7 Hình 2.3. Trình tự đoạn gen GAPDH 53 8 Hình 2.4. Các chất gắn trên bề mặt ha ̣t từ tính 54 9 Hình 2.5. Phân tích kết quả QF-PCR bình thường 59 10 Hình 2.6. Phân tích tính kết quả tỷ lệ giữa các alen 60 11 Hình 2.7. Ảnh phân tích kết quả QF-PCR locus bị Trisomy 61 12 Hình 3.1. Ảnh điện di của gen SRY và GAPDH của các mẫu nghiên cứu 65 13 Hình 3.2. Ảnh điện di của gen SRY và GAPDH của các mẫu nghiên cứu từ 811 - 825 66 14 Hình 3.3. Ảnh kết quả điện di của gen SRY và GAPDH của các mẫu nghiên cứu từ 826 - 840 67 15 Hình 3.4. Phân tích đường chuẩn của gen DYS14 và gen GAPDH 70 16 Hình 3.5. Ảnh điện di các mẫu ở tuổi thai 6 tuần tuổi từ mẫu 269 đến 78 mẫu 301 17 Hình 3.6. Ảnh nhân gen GAPDH ở tuổi thiai 6 tuần tuổi từ các mẫu 269 đến 297 78 18 Hình 3.7. Ảnh điện di các mẫu ở tuổi thai 7 tuần tuổi từ mẫu 269 đến 79 9 mẫu 321 19 Hình 3.8. Ảnh điện di các mẫu ở tuổi thai 8 tuần tuổi từ mẫu 269 đến 80 mẫu 321 24 Hình 3.9. Biểu đồ biến thiên nồng độ ADN tự do của trường hợp 269 81 25 Hình 3.10. Biểu đồ biến thiên nồng độ ADN tự do của trường hợp 277 82 26 Hình 3.11. Biểu đồ biến thiên nồng độ ADN tự do của trường hợp 296 83 27 Hình 3.12. Biểu đồ biến thiên nồng độ ADN tự do của trường hợp 551 84 28 Hình 3.13. Biểu đồ biến thiên nồng độ ADN phôi thai tự do sau khi sinh 88 29 Hình 3.14. Ảnh điện di mao quản của sản phẩm QF-PCR của mẫu QF64 (tương ứng mẫu nghiên cứu BT05) nam bình thường 90 30 Hình 3.15. Ảnh điện di mao quản của sản phẩm QF-PCR của mẫu QF 61 92 (tương ứng với mẫu DT 02) nam mang hội chứng Down 31 Hình 3.16. Ảnh điện di mao quản của sản phẩm QF-PCR điện di mao quản của sản phẩm QF-PCR của mẫu DT02 với các cặp mồi extra 93 Marker 21 32 Hình 3.17. Ảnh điện di mao quản của sản phẩm QF-PCR của mẫu QF56 (tương ứng với mẫu DT03) mang hội chứng Klinefelter 94 33 Hình 3.18. Ảnh điện di mao quản của sản phẩm QF-PCR của mẫu DT03 (QF56) với các mồi extra marker trên locus X, Y 95 34 Hình 3.19. Ảnh điện di mao quản của sản phẩm QF-PCR của mẫu DT08 mang hội chứng Edward 96 35 Hình 3.20. Ảnh nhuộm FISH tế bào phôi thai của mẫu số 831 101 36 Hình 3.21. Ảnh nhuộm FISH tế bào phôi thai của mẫu số 837 102 37 Hình 3.22. Ảnh điện di mao quản của sản phẩm QF-PCR của mẫu nghiên cứu 964 với các locus trên NST giới tính X, Y 104 38 39 10 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT [1]. Trịnh Văn Bảo (2004), Dị dạng bẩm sinh, NXB Y học. [2]. Trịnh Văn Bảo (2002-2007), “Tư vấn di truyền- sàng lọc và chẩn đoán trước sinh tại bộ môn y sinh học- di truyền đại học y Hà Nội”, Báo cáo toàn văn, Hội nghị quốc tế tư vấn di truyền- sàng lọc và chẩn đoán trước sinh, Hà Nội, tr.114-120. [3]. Trịnh Văn Bảo, Trần Thị Thanh Hương (2010), Di truyền y học, Nhà xuất bản giáo dục. [4]. Trịnh Văn Bảo (2006), “Tư vấn di truyền-một biện pháp có hiệu quả để phòng chữa bệnh tật di truyền”, Tạp chí Nghiên cứu y học, 40(1), tr.72-75. [5]. Nguyễn Huy Cận, Bùi Thị Tía (1967), “Tật bẩm sinh ở sơ sinh tại Bệnh viện C từ 1963 đến 1966”, Nội san Sản phụ khoa, 2, tr.6 -8. [6]. Huỳnh Thị Kim Chi (1994), Tình hình DTBS tỉnh Sông Bé và vai trò của các yếu tố nguy cơ gây DTBS tại địa phương, Luận văn tốt nghiệp BSCK cấp II, Trường Đại học Y khoa Hà Nội. [7]. Nguyễn Trần Chiến, Trần Văn Khoa (2011), Di truyền y học, NXB Quân đội nhân dân. [8]. Đào Thị Chút (1994), Nhận xét 30 trường hợp DTBS tại bệnh viện phụ sản Hải phòng, Luận văn tốt nghiệp bác sĩ chuyên khoa cấp II Trường Đại học Y khoa Hà Nội. [9]. Trần Danh Cường (2005), “Một số nhận xét về kết quả chọc hút nước ối trong chẩn đoán trước sinh tại Bệnh viện phụ sản trung ương”, Nội san Sản Phụ khoa, số đặc biệt, tr.348-356. [10]. Trần Danh Cường (2005), “Một số nhận xét về kết quả siêu âm hình thái thai nhi trong chẩn đoán trước sinh tại bệnh viện Phụ sản Trung ương”, Nội san Sản Phụ Khoa, số đặc biệt, tr.336-347. 11 [11]. Trần Danh Cường (2007), “Hình ảnh siêu âm ở thai nhi bất thường nhiễm sắc thể”, Báo cáo toàn văn, Hội nghị quốc tế tư vấn di truyền- sàng lọc và chẩn đoán trước sinh, Hà Nội, tr.156-167. [12]. Phạm Gia Đức (1971), “Tình hình DTBS qua 12 năm 1958 đến 1970 tại Viện bảo vệ bà mẹ và trẻ sơ sinh và phương huớng nghiên cứu hiện nay”. Y học Việt Nam, 1, tr.21-29. [13]. Nguyễn Khắc Hân Hoan (2007), “Chẩn đoán di truyền phân tử bệnh Thalassaemia tại bệnh viện Từ Dũ”, Hội nghị quốc tế tư vấn di truyền- sàng lọc và chẩn đoán trước sinh, Hà Nội, tr.214-218. [14]. Phan Thị Hoan (2002), “Phân tích một số yếu tố nguy cơ sinh con DTBS ở một số nhóm dân cơ miền Bắc Việt Nam”, Tạp chí Di truyền học và ứng dụng, chuyên san di truyền - y học, số đặc biệt chào mừng 100 năm trường đại học Y Hà nội, tr.25-34. [15]. Hoàng Thị Ngọc Lan, Nguyễn Việt Hùng, Trịnh Văn Bảo, Trần Thị Thanh Hương (2004), “Chẩn đoán xác định một số dị tật thai nhi trong phân tích nhiễm sắc thể tế bào ối nuôi cấy”, Tạp chí nghiên cứu Y học, 28(2), tr.5-12. [16]. Mai Thu Liên, Phùng Như Toàn, Nguyễn Khắc Hân Hoan (2007), Kết quả nuôi cấy gai nhau tại Bệnh viện Từ Dũ, Báo cáo hội nghị quốc tế tư vấn di truyền sàng lọc và chẩn đoán trước sinh, Đại học Y Hà nội. [17]. Nguyễn Thị Phượng (2002), “DTBS và bệnh di truyền tại Viện nhi quốc gia Hà Nội”, Tạp chí di truyền học và ứng dụng, chuyên san di truyền - y học, số đặc biệt chào mừng 100 năm Trường Đại học Y Hà Nội, tr.16-24. [18]. Ngô Gia Thạch, Trịnh Văn Bảo, Dương Tử Kỳ, Thái Phương Liên (1986), “Các DTBS qua điều tra 6661 trẻ sơ sinh”. Thông tin di truyền y học, 1, tr.20-25. 12 TÀI LIỆU TIẾNG NƢỚC NGOÀI [19]. Abudu O.O., Awonuga A.O. (1989), “Fetal macrosomia and pregnancy outcome in Lagos”, Int. J. Gynaecol. Obstet., 28(3), pp. 257-62. [20]. Adinolfi M. (2001), “Prenatal detection of chromosomal disorders by QF-PCR”, Lancet, 358, pp. 1030-1031. [21]. Akolekar, Kirstin F., Ramesh K. (2011), “Fetal RHD Genotyping in Maternal Plasma at 11–13 Weeks of Gestation”, Fetal. Diagn. Ther., 29, pp. 301–306. [22]. Alen Chan K.C. (2004), “Size Distribution of maternal and Fetal DNA in maternal Plasma”, Clin. Chimi., 50, pp. 88-92. [23]. Andonova S., Dimitrova V., Boneva I., Kremensky I. (2008), “A case of a bloodstained amniotic fluid sample from a pregnant woman with Down syndrome analyzed by QF-PCR after low-speed centrifugation”, Prenat. Diagn., 28(5), pp. 457-9. [24]. Aykut A., Onay H., Sagol S., Gunduz C., Ozkinay F., Cogulu O. (2013), “Determination of fetal rhesus d status by maternal plasma DNA analysis”, Balkan. J. Med. Genet., 16(2), pp. 33-8 [25]. Babochkina, Mergenthaler S., Dinges T.M., Holzgreve W., and Hahn S. (2005), “Direct detection of fetal cells in maternal blood: a reappraisal using a combination of two different Y chromosome-specific FISH probes and a single X chromosome-specific probe”, Arch. Gynecol. Obstet., pp. 1-4. [26]. Bayrak-Toydemir P., Pergament E., Fiddler M. (2003), “Are fetal cells in maternal plasma Really there? We think they are”, J. Hum. Genet., 48, pp. 665667. [27]. Benn P. (2002), “Advance in prenatal screening for Down syndrome: General principles and second trimester testing”, Clin. Chimi. Acta., 323, pp.1-16. 13 [28]. Bianchi D., Flint A., Pizzimenti M., Knoll J., Latt S. (1990), “Isolation of fetal DNA from nucleated erythrocytes in maternal blood”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 87, pp. 3279-3283. [29]. Bianchi D., Mahr A., Zickwolf G., Houseal T., Flint A., Klinger K. (1992), “Detection of fetal cells with 47,XY,+21 karyotype in maternal peripheral blood”, Hum. Genet., 90, pp. 368-370. [30]. Bianchi D., Simpson J., Jackson L. (2002), “Fetal gender and aneuploidy detection using fetal cells in maternal blood: analysis of NIFTY I data. National Institute of Child Health and Development Fetal Cell Isolation Study”, Prenat. Diagn., 22, pp. 609-615. [31]. Bianchi D., Williams J., Sullivan L. (1997), “PCR quantitation of fetal cells in maternal blood in normal and aneuploid pregnancies”, Am. J. Hum. Genet., 61, pp. 822-829. [32]. Bianchi D., Zickwolf, Gretchen K., Weil, Gary J. (1996), “Male fetal progenitor cells persist in maternal blood for as long as 27 years postpartum”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, pp. 705-708. [33]. Bischoff F. (1998), “Prenatal diagnosis of fetal cell isolated from maternal blood: Five-color fluorecent in situ hybridization analysis on flow-sorter cells for chromosomes X, Y, 13, 18 and 21”, Am. J. Obstet. Gynecol., 170(1), pp. 203209. [34]. Bombard, Akolekar, Farkas, (2011), “Fetal RHD genotype detection from circulating cell-free fetal DNA in maternal plasma in non-sensitized RhD negative women”, Prenat. Diagn., 31, pp. 802–808. [35]. Boyd P., Chamberlain P., Hicks N. (1998), “6-year experience of prenatal diagnosis in an unselected population in Oxford, UK”, Lancet, 352, pp. 15771581. [36]. Buchanan A., Sachs A., Toler T., Tsipis J. (2014), “NIPT: current utilization and 14 implications for the future of prenatal genetic counseling”, Prenat. Diagn., 34, pp. 850–857. [37]. Buscaglia M., Ghisoni L., and Levi-Setti P. (1996), “Alpha-fetoprotein elevation in maternal serum after percutaneous umbilical blood sampling (PUBS)”, Prenat. Diagn, 16, pp. 375-376. [38]. Bussani C., Cioni R., Mattei A., Fambrini M., Marchionni M., Scarselli G. (2007), “Prenatal diagnosis of common aneuploidies in transcervical samples using quantitative fluorescent-PCR analysis”, Mol. Diagn. Ther., 11(2), pp. 117121. [39]. Cacheux V., Milesi-Fluet C., Tachdjian G., Druart L., Bruch J., Hsi B., Uzan S. (1992), “Detection of 47,XYY trophoblast fetal cells in maternal blood by fluorescence in situ hybridization after immunomagnetic lymphocyte depletion and flow cytometric sorting”, Fetal. Diagn. Ther., 7, pp. 190-194. [40]. Campbell R. (1998), The latest in ultrasound:three-demensional imaging. Part II. Europe J Radiol, 27, pp. 183-187. [41]. Canfield M., Honein M., Yuskiv N., Xing J., Mai C., Collins J., Devine O., Petrini J., Ramadhani T., Hobbs C., Kirby R. (2006), “National estimates and race/ethnic-specific variation of selected birth defects in the United States 19992001”, Birth Defects Res. A. Clin. Mol. Teratol., 76(11), pp. 747-756. [42]. Chetty S., Garabedian J., Norton E. (2013), “Uptake of noni nvasive prenatal testing (NIPT) in women following positive aneu ploidy screening”, Prenat. Diagn., 33, pp. 542–546 [43]. Chiu R., Chan K., Gao Y., Lau V., Zheng W., Leung T. (2008), “Noninvasive prenatal diagnosis of fetal chromosomal aneuploidy by massively parallel genomic sequencing of DNA in maternal plasma”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA.,105, pp. 20458–20463. [44]. Chris M.,Tianhua H. (2003), “Accuaracy of trisomy 18 screening using the 15 second-trimester triple test”, Prenat. Diagn., 23, pp. 443-446. [45]. Chung S., Wong S., Clarke B., Patterson M., Walker W., Chui D. (1984), “Human embryonic zeta-globin chains in adult patients with alphathalassemias”. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 81, pp. 6188-6191. [46]. Chungwen W. (2001), “Screening cell-free fetal DNA in maternal plasma”, Clin. Chem., 47, pp. 336. [47]. Chungwen W., Devereux N., Saller (2001), “Detection and Quantification by Homogeneous PCR of Cell-free Fetal DNA in Maternal Plasma”, Clin. Chem., 47(2), pp. 336-338. [48]. Clayton E., Feldhaus W., Whiteacre F. (1964), “Fetal erythrocytes in the maternal circulation of pregnant women”, Obs. Gynecol., 23, pp. 915-919 [49]. Costa J., Benachi A., Gautier E., Jouannic J., Ernault P., Dumez Y. (2001), “First-trimester fetal sex determination in maternal serum using Real-time PCR”, Prenat. Diagn., 21, pp. 1070–1074. [50]. Cuckle H., Aitken D., Goodburn S. (2004), “Age- standardisation when target setting and auditing performance of Down syndrome screening programmes”, Prenat. Diagn., 24(11), pp. 851-856. [51]. Cullough M., Almasri A., Guan X., Jennifer A., Susan C., Amin R., Cosmin D., Paul O., Allan T. (2014), “Non- Invasive Prenatal Chromoso mal Aneuploidy Testing - Clinical Experience: 100,000 Clinical Samples” PLoS ONE, 9(10), pp. 1-9. [52]. Dai L., Zhu J., Liang J. Wang H., Mao M. (2011), “Birth defects surveillance in China”, World. J. Pediatr., 7(4), pp. 302-310. [53]. Dennis L., Zhang, Leung, Lau, (1999), “Rapid clearance of fetal DNA from maternal plasma”. Am. J. Hum. Genet. 64, pp. 218–224. [54]. Douglas G., Thomas L., Carr M., Cullen N., Morris R. (1959), “Trophoblast in the circulating blood during pregnancy”. Am. J. Obstet. Gynecol.,78, pp. 960-973. 16 [55]. Du J., Zou X., Pan Y. (2009), “Noninvasive prenatal diagnosis of congenital adrenal hyperplasia in cell–free fetal DNA with cold-PCR”, de. ES. Ramos., pp. 395. [56]. Dugo N., Padula F., Mobili L., Brizzi C., D’Emidio L., Cignini L, Mesoraca A., Bizzoco D., Cima A., Giorlandino C. (2014), “Six consecutive false positive cases from cell-free fetal DNA testing in a single referring centre”, J. O. Prenat. Medic., 8(1/2), pp.31-35. [57]. Durm M., Haar F.M, Hausmann M., Ludwig H., Cremer C. (1997), “Optimized Fast-FISH with alpha-satellite probes: acceleration by microwave activation”, Braz. J. Med. Biol. Res., 30, pp.15-23. [58]. Durrant L., Martin W., McDowall K., Liu D. (1996), “Isolation of fetal trophoblasts and nucleated erythrocytes from the peripheral blood of pregnant women for prenatal diagnosis of fetal aneuploides”, Early. Hum. Dev., 47, pp. 7983. [59]. Edwards J., Dent T., Kahn J. (1966), “Monozygotic twins of different sex”, J. Med. Genet., 3, pp. 117–123. [60]. Elena P., Gian C., Federica T., Vittorio B., Michela C., Luana P., Fabiana G., Mara M., Giuliana C. (2015), “Non-Invasive Prenatal RHD Genotyping Using Cell-Free Fetal DNA from Maternal Plasma: An Italian Experience”, Transfus. Med. Hemother., 42, pp.22–28. [61]. Fairbrother G., Johnson S., Musci J., Song K. (2013), “Clinical experience of noninvasi ve prenatal testing with cell-free DNA for fetal trisomies 21, 18, and 13, in a general screening population”, Prenat. Diagn., 33, pp. 580–583. [62]. Fernández-Martínez F., Galindo A., Moreno-Izquierdo A. (2007), “Application of QF-PCR for the prenatal assessment of discordant monozygotic twins for fetal sex”, Prenat. Diagn., 27(7), pp. 648-652. 17 [63]. Finegan J., Quarrington B.,. Hughes H. (1990), “Child outcome following midtrimester amniocentesis: development, behaviour, and physical status at age 4 years”, Br. J. Obstet. Gynaecol, 97, pp. 32-40. [64]. Fodor F., Kamory E., Csokay B., Kopa Z., Kiss A., Lantos I., Tisza T. (2007), “Rapid detection of sex chromosomal aneuploidies by QF-PCR: application in 200 men with severe oligozoospermia or azoospermia”, Genet. Test., 11(2), pp. 139-145. [65]. Gahan J., Porto M. (1994), Diagnostic Obtetrical Ultrasound. Lippincotte Company, chapter 8,9,10,11,12, pp.134-282; chapter 16 – 21, pp. 326-475. [66]. Ganshirt D., Borejesson-Stoll R., Burschyk M. (1994), “Successful prenatal diagnosis from maternal blod bwith magnetic-activated cell sorting”, Ann. NY. Acad. Sci., 731, pp. 103-114. [67]. Ganshirt-Ahlert D., Burschyk M., Garritsen, H. (1992), “Magnetic cell sorting and the transferrin receptor as potential means of prenatal diagnosis from maternal blood”, Am. J. Obs. Gynecol., 166, pp. 1350-1355. [68]. Gole L., Lian N., Rauff M., Biswas A., Choolani M. (2008), “Prenatal detection of isochromosome 21 by QF-PCR. A comparison between FISH and traditional karyotyping”, Fetal. Diagn. Ther., 24(1), pp. 47-50. [69]. Groisman B., Bidondo M., Barbero P., Gili J., Liascovich R. (2013), “RENAC: National Registry of Congenital Anomalies of Argentina”, Arch. Argent. Pediatr., 111(6), pp. 484-494. [70]. Grosset L., Barelet V., Ordatchenko N. (1974), “Antenatal fetal sex determination from maternal blood during pregnancy”, Am. J. Obs. Gynecol., 120, pp. 60-63. [71]. Haddow J. (1994), “Reducing the need for amniocentesis in women 35 years of age or older with serum marker for screening”, NEJM, 330(16), pp. 1114-1118. [72]. Hahn S, Schoot C., Chitty L. (2008), “Non-invasive prenatal diagnosis and determination of fetal Rh status”, Semin Fet. Neonatal Med. 13, pp. 63–68. 18 [73]. Hahn S., Zhong X., Holzgreve W. (2002), “Single cell PCR in laser capture microscopy”, Methods Enzymol, 356, pp. 295-301. [74]. Hahnemann J., Vejerslev L. (1997), “European collaborative research on mosaicism in CVS (EUCROMIC)-fetal and extrafetal cell lineages in 192 gestations with CVS mosaicism involving single autosomal trisomy”, Am. J. Med. Genet., 70, pp. 179-187. [75]. Herzenberg L., Bianchi D., Schrder J., Cann H., Iverson G. (1979), “Fetal cells in the blood of pregnant women: detection and enrichment by fluorescenceactivated cell sorting”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 73, pp. 1453-1455. [76]. Himmetoglu O., Erdem A., Erdem M., Arslan M., Yazici G., Eskandari R. (2002), “The effect of maternal anemia and iron deficiency on fetal erythropoiesis: comparison between serum erythropoietin, hemoglobin and ferritin levels in mothers and newborns”, J. Matern Fet. Neonatal. Med., 11(5), pp. 329-332. [77]. Iverson G., Bianchi D., Cann H., Herzenberg L. (1981), “Detection and isolation of fetal cells from maternal blood using the flourescenceactivated cell sorter (FACS)”, Prenat. Diagn., 1, pp. 61-73. [78]. Khoshnood B., Greenlees R., Loane M., Dolk H. (2011), “EUROCAT public health indicators for congenital anomalies in Europe”, Birth Defects Res. A. Clin. Mol. Teratol., 91(1), pp. 16-22. [79]. Kolialexi A., Tsangaris G. T., Antsaklis A., Mavrou A. (2004), “Fetal cells in maternal plasma are found in a late state of apoptosis”, Prenat. Diagn., 24, pp. 719-721. [80]. Kondo T., Sekizawa A., Saito H., Jimbo M., Sugito Y., Okai T. (2002), “Fate of fetal nucleated erythrocytes circulating in maternal blood: apoptosis is induced by maternal oxygen concentration”, Clin. Chem., 48, pp. 1618-1620. [81]. Lau T., Cheung S., Lo P., Pursley A., Chan M., Jiang F., Zhang H., Wang W., 19 Jong L., Yuen O., Chan H., Chan W., Choy K. (2014), “Non-invasive prenatal testing for fetal chromosomal abnormalities by low-coverage whole-genome sequencing of maternal plasma DNA: review of 1982 consecutive cases in a single center”, Ultrasound Obstet. Gynecol., 43, pp. 254–264. [82]. Lazjuk G., Nykolaev D., Novykova I. (1996b), “Congential and hereditary pathology in Belarus in view of the Chernobyl catastrophe”. Medicne, 3(12), pp.7-8. [83]. Lin H., Lin S., Chen Y., Hung H., Kao H., Hsu C., Chen M., Chang J., Ho C., Huang F., Shyur S., Lin D., Lee H. (2006), “Clinical characteristics and survival of trisomy 18 in a medical center in Taipei, 1988-2004”, Am. J. Med. Genet. A., 140(9), pp. 945-951. [84]. Lo Y., Bowell P., Selinger M. (1993), “Prenatal determination of fetal RhD status by analysis of peripheral blood of rhesus negative mothers”, Lancet, 341, pp. 1147-1148. [85]. Lo Y., Corbetta N., Chamberlain P. (1997), “Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum”, Lancet, 350, pp. 485–487. [86]. Lo Y., Lau T., Zhang J., Leung T., Chang A., Hjelm N. (1999), “Increased fetal DNA concentrations in the plasma of pregnant women carrying fetuses with trisomy 21”, Clin. Chem., 45, pp.1747–1751. [87]. Lo Y., Patel P., Wainscoat J., Sampietro M., Gillmer M., Fleming K. (1989), “Prenatal sex determination by DNA amplification from maternal peripheral blood”, Lancet, 2, pp. 1363-1365. [88]. Lo Y., Tein M., Lau T., Haines C., Leung T., Poon P. (1998), “Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma and serum: implications for noninvasive prenatal diagnosis”, Am. J. Hum. Genet. 62, pp. 768–775. [89]. Lothar K., Karsten R. (2000), “Detection of aneuploidy in chromosomes X, Y, 13, 18 and 21 by QF-PCR in 662 selected pregnancies at risk”, Mol. Hum. 20