MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1
TỔNG QUAN .................................................................................................... 3
1
1.1
Tổng quan về curcumin ...................................................................................... 3
1.2
Một số tính chất hóa l của curcumin ................................................................ 3
1.2.2 Hoạt tính sinh học của curcumin ................................................................. 7
1.2.3 Tính khả dụng sinh học của curcumin ....................................................... 13
1.2.4 Các phƣơng pháp cải thiện tính khả dụng sinh học của curcumin ............ 16
1.3
Các nghiên cứu về tổng hợp và hoạt tính sinh học của dẫn xuất curcumin ..... 18
1.3.1 Các phƣơng pháp tổng hợp một số dẫn xuất của curcumin ....................... 19
1.3.2 Hoạt tính sinh học của các dẫn xuất curcuminoid ..................................... 24
1.4
Giới thiệu về tinh dầu và các phƣơng pháp trích ly curcuminoid và tinh
dầu từ củ Nghệ vàng ......................................................................................... 29
1.4.1 Giới thiệu về tinh dầu củ Nghệ vàng (Curcuma longa L.) ........................ 29
1.4.2 Tổng quan một số nghiên cứu về trích ly curcuminoid từ củ Nghệ
vàng ............................................................................................................ 31
THỰC NGHIỆM VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 34
2
2.1
Mục tiêu nghiên cứu ......................................................................................... 34
2.2
Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị .......................................................................... 34
2.2.1 Nguyên liệu ................................................................................................ 34
2.2.2 Hóa chất ..................................................................................................... 34
2.2.3 Thiết bị ....................................................................................................... 35
2.3
Nội dung thực hiện ........................................................................................... 36
2.3.1 Nghiên cứu trích ly curcuminoid và tinh dầu từ củ Nghệ vàng
(Curcuma longa L.) Bình Dƣơng ............................................................... 36
2.3.2 Nghiên cứu phân lập 3 thành phần curcumin, DMC và BDMC từ hỗn
hợp curcuminoid ........................................................................................ 40
2.3.3 Tổng hợp dẫn xuất pyrazole và isoxazole của curcuminoid ...................... 41
2.3.4 Xác định hoạt tính sinh học của tinh dầu, curcuminoid và các dẫn
xuất curcuminoid tổng hợp đƣợc ............................................................... 48
KẾT QUẢ - BÀN LUẬN ................................................................................. 53
3
3.1
Kết quả nghiên cứu trích ly curcuminoid và tinh dầu từ củ nghệ .................... 53
3.1.1 Kết quả khảo sát quy trình trích ly curcuminoid và tinh dầu từ củ
nghệ ............................................................................................................ 53
v
3.1.2 Kết quả phân tích hàm lƣợng và thành phần tinh dầu, curcuminoid
thu đƣợc bằng phƣơng pháp GC-MS, HPLC và LC-MS .......................... 54
3.1.3 Kết quả khảo sát trích ly curcuminoid bằng phƣơng pháp đun hồi lƣu
trực tiếp có sự hỗ trợ của vi sóng ............................................................... 57
3.2
Kết quả nghiên cứu phân lập 3 thành phần curcumin, DMC và BDMC từ
hỗn hợp curcuminoid ........................................................................................ 60
3.2.1 Kết quả quá trình kết tinh lại ..................................................................... 60
3.2.2 Kết quả quá trình sắc k cột phân lập 3 thành phần curcuminoid ............. 62
3.2.3 Kết quả xác định một số tính chất hóa l các thành phần curcuminoid .... 62
3.2.4 Kết quả nhận danh và xác định cấu trúc các thành phần curcuminoid ...... 64
3.3
Kết quả tổng hợp dẫn xuất của curcuminoid .................................................... 66
3.3.1 Nhận xét chung về quá trình tổng hợp ...................................................... 66
3.3.2 Kết quả định danh, xác định cấu trúc các dẫn xuất ................................... 68
3.4
Kết quả khảo sát hoạt tính sinh học của tinh dầu, curcuminoid và dẫn
xuất ................................................................................................................. 115
3.4.1 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm và kháng oxy
hóa của tinh dầu Nghệ vàng ..................................................................... 115
3.4.2 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của curcuminoid
và dẫn xuất ............................................................................................... 117
3.4.3 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của curcuminoid và dẫn
xuất ........................................................................................................... 118
3.4.4 Kết quả khảo sát hoạt tính gây độc tế bào của curcuminoid và dẫn
xuất ........................................................................................................... 124
4
KẾT LUẬN .................................................................................................... 129
5
CÁC TÀI LIỆU CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ ................................................ 131
6
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................. 132
vi
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Cấu trúc của các thành phần curcuminoid [1] ................................................ 3
Hình 1.2. a) Phổ UV-Vis của curcumin. ___ dung dịch curcumin 3.09×10-5 M
trong NaOH 0.5M, --- dung dịch curcumin 3.04 × 10-5M trong acid acetic
băng; b) Phổ UV-Vis của dung dịch curcumin 4.99 × 10−5 M trong NaOH
0.091M theo thời gian [7] ..................................................................................... 4
Hình 1.3. Các sản phẩm phân hủy curcumin trong môi trƣờng kiềm [8]........................ 5
Hình 1.4. Phản ứng đóng v ng đề xuất cho curcumin khi phơi sáng (> 400 nm) ....... 6
Hình 1.5. Sự phân hủy của curcumin trong isopropanol (> 400 nm) [11] .................... 6
Hình 1.6. Curcumin tác động vào các giai đoạn khác nhau trong quá trình phát
triển ung thƣ ......................................................................................................... 8
Hình 1.7. Cơ chế đề nghị cho phản ứng tạo phức của curcumin-Fe2+ .......................... 10
Hình 1.8. DHZ( 4-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-3-buten-2-one ) – half
curcumin ............................................................................................................. 11
Hình 1.9. Phản ứng trung hòa gốc tự do của curcumin. ................................................ 13
Hình 1.10. Chuyển hóa sinh học và các sản phẩm chuyển hóa đề nghị cho
curcumin trong huyết thanh chuột khi đƣa vào bằng đƣờng i.p. [63] ................ 15
Hình 1.11. 4,4’-di-O-(glycinoyl-di-N-piperoyl) curcumin, 4,4’-di-O-acetyl
curcumin và 4,4’-di-O-piperoyl curcumin [108] ................................................ 24
Hình 1.12. Diester của curcumin với valine, glycine, glutamic acid và
demethylen piperic acid [109] ............................................................................ 25
Hình 1.13. Các dẫn xuất của curcumin trong nghiên cứu của nhóm Chen [39] ........... 25
Hình 1.14. Sự hình thành gốc tự do ortho-hydroxyphenol [39] ................................... 26
Hình 1.15. Các dẫn xuất trong nghiên cứu của nhóm Selvam [101] ............................ 26
Hình 1.16. Các dẫn xuất trong nghiên cứu của nhóm Zang [93] .................................. 27
Hình 1.17. Các dẫn xuất (4)-(9) trong nghiên cứu nhóm Ishida [91]............................ 27
Hình 1.18. Các dẫn xuất trong nghiên cứu [95] ............................................................ 28
Hình 2.1. Quy trình 1 ..................................................................................................... 37
Hình 2.2. Sơ đồ lắp ráp hệ thống trích ly có sự hỗ trợ của vi sóng .............................. 40
Hình 2.3. Phản ứng quét gốc tự do DPPH của chất kháng oxy hoá [138] .................... 49
Hình 3.1. Phổ HPLC – MS của mẫu curcuminoid thu đƣợc từ quy trình 1 ................. 56
Hình 3.2. Kết quả SKBM của curcuminoid ban đầu và sau kết tinh............................. 61
Hình 3.3. Sắc k đồ HPLC (phụ lục 7a ) của mẫu curcuminoid ban đầu (A) ............... 61
Hình 3.4. SKBM các phân đoạn sau chạy cột (CH2Cl2:CH3OH:98:2 (v/v))................. 62
Hình 3.5. (A) curcumin, (B) DMC, (C) BDMC ............................................................ 62
Hình 3.6. Sắc k đồ HPLC của (A) curcumin, (B) DMC, (C) BDMC (phụ lục 8)....... 63
vii
Hình 3.7. Phổ UV-vis (trong ethanol) của (A) curcumin, (B) DMC, (C) BDMC ........ 63
Hình 3.8. a) Cấu trúc dẫn xuất 8 (4FPHC), b) SKBM của curcumin (vết 1) và
4FPHC (vết 2) dƣới đèn UV (hệ dung môi DCM:EA 96/4, c) SKBM hiện
màu bằng hơi iod. ............................................................................................... 68
Hình 3.9. Cấu trúc của dẫn xuất isoxazole curcumin (dẫn xuất 1)................................ 68
Hình 3.10. Cấu trúc của dẫn xuất pyrazole curcumin (dẫn xuất 2) ............................... 70
Hình 3.11. Hoạt tính quét gốc tự do DPPH (so sánh IC50) của curcumin, DMC,
BDMC và một số dẫn xuất của curcumin và BDMC ....................................... 119
Hình 3.12. Cơ chế đề nghị trong phản ứng trung hòa gốc tự do của curcumin .......... 120
Hình 3.13. Cơ chế trung hòa gốc tự do DPPH thông qua tách H methylene [40] ..... 120
Hình 3.14. Cấu trúc cộng hƣởng của gốc tự do curcumin khi tách H của OH
phenol [56] ........................................................................................................ 121
Hình 3.15. Liên kết H nội phân tử giữa OH và OCH3 trên vòng phenyl của
curcumin ........................................................................................................... 121
viii
DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1. Các thông số hoá lý của các thành phần curcuminoid [6] .............................. 4
Bảng 1.2. Tỉ lệ của các thành phần curcuminoid trong một số sản phẩm curcumin
trên thị trƣờng (phân tích HPLC) [1] ............................................................ 33
Bảng 2.1. Danh mục tác chất, điều kiện phản ứng, phƣơng pháp tinh chế từng dẫn
xuất................................................................................................................ 43
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát quy trình tách curcuminoid và tinh dầu từ củ nghệ .......... 53
Bảng 3.2. Các chỉ số hóa lý của tinh dầu Nghệ vàng Bình Dƣơng ............................... 54
Bảng 3.3. Kết quả phân tích thành phần hóa học tinh dầu Nghệ vàng Bình Dƣơng
và tinh dầu trích từ Nghệ vàng Đồng Nai, Quảng Nam, Nghệ An (phụ
lục 3) ............................................................................................................. 55
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát điều kiện trích ly curcuminoid có sự hỗ trợ của vi sóng ... 57
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát trích ly curcuminoid theo phƣơng pháp Soxhlet và
phƣơng pháp đun hồi lƣu trực tiếp có sự hỗ trợ vi sóng............................... 60
Bảng 3.6. Kết quả quá trình kết tinh lại ......................................................................... 60
Bảng 3.7. Kết quả tính HPLC của hỗn hợp curcuminoid .............................................. 62
Bảng 3.8: Tính chất vật l đặc trƣng của các curcuminoid ........................................... 63
Bảng 3.9. Độ dịch chuyển hóa học (ppm) trong phổ 1H-NMR (dung môi DMSOd6) của curcumin, DMC và BDMC phân lập từ hỗn hợp curcumin ............. 64
Bảng 3.10. Độ dịch chuyển hóa học (ppm) trong phổ 13C-NMR của curcumin,
DMC và BDMC phân lập từ hỗn hợp curcumin .......................................... 65
Bảng 3.11. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (dung môi DMSO-d6) của dẫn xuất
1 .................................................................................................................... 68
Bảng 3.12. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (dung môi DMSO-d6) của dẫn xuất
2 .................................................................................................................... 71
Bảng 3.13. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (dung môi CDCl3) của dẫn xuất 3...... 72
Bảng 3.14. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (dung môi CDCl3) của dẫn xuất 4...... 74
Bảng 3.15. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (dung môi CDCl3) của dẫn xuất 5...... 76
Bảng 3.16. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (dung môi CDCl3) của dẫn xuất 6...... 77
Bảng 3.17. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (dung môi CDCl3) của dẫn xuất 7...... 79
Bảng 3.18. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (dung môi CDCl3) của dẫn xuất 8...... 81
Bảng 3.19. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (dung môi CDCl3) của dẫn xuất 9 .... 83
Bảng 3.20. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (dung môi CDCl3) của dẫn xuất 10 .. 84
Bảng 3.21. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (dung môi CDCl3) của dẫn xuất 11 .. 85
Bảng 3.22. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (dung môi CDCl3) của dẫn xuất 12 .. 86
Bảng 3.23. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (dung môi CDCl3) của dẫn xuất 13 .. 88
ix
Bảng 3.24. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (dung môi DMSO-d6) của dẫn
xuất 14........................................................................................................... 89
Bảng 3.25. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (dung môi DMSO-d6) của dẫn
xuất 15........................................................................................................... 91
Bảng 3.26. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (dung môi CDCl3) của dẫn xuất 16 .. 93
Bảng 3.27. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (dung môi DMSO-d6) của dẫn
xuất 17........................................................................................................... 94
Bảng 3.28. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (dung môi DMSO-d6) của dẫn
xuất 18........................................................................................................... 96
Bảng 3.29. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (dung môi CDCl3) của dẫn xuất 19 .. 98
Bảng 3.30. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (dung môi CDCl3) của dẫn xuất 20 100
Bảng 3.31. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (dung môi CD3OD) của dẫn xuất
21 ................................................................................................................ 101
Bảng 3.32. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (dung môi CDCl3) của dẫn xuất 22 . 103
Bảng 3.33. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (dung môi DMSO-d6) của dẫn xuất
23 ................................................................................................................ 104
Bảng 3.34. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (dung môi CD3OD) của dẫn xuất
24 ................................................................................................................ 107
Bảng 3.35. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (dung môi CD3OD) của dẫn xuất
25 ................................................................................................................ 108
Bảng 3.36. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (dung môi DMSO-d6) của dẫn xuất
26 ................................................................................................................ 109
Bảng 3.37. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (dung môi CD3OD) của dẫn xuất
27 ................................................................................................................ 111
Bảng 3.38. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (dung môi CD3OD) của dẫn xuất
28 ................................................................................................................ 112
Bảng 3.39. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (dung môi CD3OD) của dẫn xuất
29 ................................................................................................................ 113
Bảng 3.40. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (dung môi CD3OD) của dẫn xuất
30 ................................................................................................................ 114
Bảng 3.41. Nồng độ ức chế tối thiểu MIC (µg/ml môi trƣờng) của tinh dầu Nghệ
vàng Bình Dƣơng, Đồng Nai, Quảng Nam, Nghệ An đối với một số
chủng vi khuẩn, vi nấm ............................................................................... 115
Bảng 3.42. Giá trị IC50 trong thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa theo phƣơng
pháp DPPH và MDA của tinh dầu Nghệ vàng Bình Dƣơng và các
vùng khác .................................................................................................... 116
Bảng 3.43. Nồng độ ức chế tối thiểu MIC (µg/ml môi trƣờng) của các thành phần
curcuminoid và một số dẫn xuất đối với một số chủng vi khuẩn, vi
nấm.............................................................................................................. 117
x
Bảng 3.44. Giá trị IC50 của curcuminoid và dẫn xuất trong thử nghiệm hoạt tính
kháng oxy hóa DPPH.................................................................................. 119
Bảng 3.45. Hoạt tính kháng oxy hóa theo phƣơng pháp MDA của curcuminoid và
dẫn xuất ....................................................................................................... 123
Bảng 3.46. Hoạt tính gây độc tế bào với 3 dòng tế bào Hep-G2, RD, Lu của
curcuminoid và các dẫn xuất ...................................................................... 124
Bảng 3.47. Giá trị IC50(M) và SI trong thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào với
dòng tế bào ung thƣ tuyến tiền liệt PC3 và tế bào lành NFF ...................... 126
xi
DANH MỤC ĐỒ THỊ
Đồ thị 3.1. Ảnh hƣởng của nồng độ ethanol ................................................................. 58
Đồ thị 3.2. Ảnh hƣởng của tỷ lệ R/L ............................................................................. 58
Đồ thị 3.3. Ảnh hƣởng của thời gian trích ly................................................................. 59
Đồ thị 3.4. Hoạt tính kháng oxy hóa theo phƣơng pháp DPPH của curcuminoid
và dẫn xuất ................................................................................................................... 118
xii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Cur: curcumin
DMC: demethoxycurcumin
BDMC: bisdemethoxycurcumin
THC: tetrahydrocurcumin
IR: infrared
UV-Vis: ultraviolet - visible
MS: mass spectrometry
NMR: nuclear magnetic resonance
HPLC: high performance liquid chromatography
LC-MS: liquid chromatography – mass spectrometry
SKBM: sắc k bản mỏng
SKC: sắc k cột
DCM: dichloromethane
MeOH: methanol
EA: ethyl acetate
PE: petroleum ether
DMSO: dimethyl sulfoxide
AAPH: 2,2′-azobis(-amidinopropane) dihydrochloride
DPPH: 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl
ABTS: 2,2′-azinobis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonate)
tnc: nhiệt độ nóng chảy
xiii
MỞ ĐẦU
Cây Nghệ vàng Curcuma longa L. thuộc họ gừng (Zingiberaceae), đƣợc trồng
nhiều ở những v ng khí hậu nóng ẩm nhƣ Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia, Jamaica,
Peru… và Việt Nam. Củ nghệ từ lâu đã đƣợc sử dụng rộng rãi làm gia vị, chất bảo
quản và chất tạo màu trong thực phẩm. Ngoài ra, củ nghệ c ng là một trong những
phƣơng thuốc dân gian hiệu quả trong chữa trị nhiều loại bệnh nhƣ vàng da, các bệnh
về gan, dạ dày, u nhọt, viêm khớp…Trong những thập kỷ gần đây có rất nhiều nghiên
cứu đã đƣợc công bố về hoạt tính sinh học và dƣợc học của củ Nghệ vàng c ng nhƣ
các thành phần chiết xuất từ củ nghệ, trong đó curcuminoid và tinh dầu nghệ đã đƣợc
chứng minh là những thành phần chính tạo nên dƣợc tính cao của củ Nghệ vàng.
Việt Nam có nguồn Nghệ vàng phong phú, phân bố ở nhiều tỉnh thành nhƣ V nh
Phúc, Hải Dƣơng, Hƣng Yên, Nghệ An, Quảng Nam, Đồng Nai, Bình Dƣơng…
Thành phần, hàm lƣợng curcuminoid và tinh dầu trong củ Nghệ vàng ở các v ng khác
nhau có sự thay đổi lớn do ảnh hƣởng của điều kiện khí hậu, thổ nhƣ ng, điều kiện
trồng trọt, chăm sóc...Việc nghiên cứu về đặc trƣng củ Nghệ vàng của mỗi v ng sẽ
giúp đánh giá đầy đủ hơn giá trị sử dụng, từ đó có đƣợc sự định hƣớng tốt hơn cho
việc phát triển nguồn Nghệ vàng trong nƣớc. Các nghiên cứu về Nghệ vàng ở trong
nƣớc cho đến nay chủ yếu mới chỉ tập trung ở một số v ng Nghệ vàng phía Bắc nhƣ ở
H a Bình, V nh Phúc, Hƣng Yên. Chính vì vậy, để góp phần vào việc tìm hiểu thêm
về các nguồn Nghệ vàng khác trong nƣớc, trong đề tài này, chúng tôi chọn đối tƣợng
nghiên cứu là củ Nghệ vàng Bình Dƣơng, với đề tài “Nghiên cứu quy trình tách chiết,
tổng hợp dẫn xuất và xác định tính chất, hoạt tính của tinh dầu và curcumin trích từ
cây Nghệ vàng (Curcuma longa L.) Bình Dương”. Quy trình phân lập curcuminoid từ
củ nghệ đƣợc định hƣớng khảo sát là trích ly curcuminoid kết hợp tách tinh dầu và
không qua giai đoạn loại béo. So với những quy trình hiện sử dụng để tách
curcuminoid từ củ nghệ, quy trình này sẽ giúp tận thu đƣợc nguồn tinh dầu từ củ Nghệ
vàng, giảm lƣợng dung môi hữu cơ sử dụng mà vẫn đảm bảo thu đƣợc curcuminoid từ
củ nghệ với hiệu suất và độ tinh khiết cao. Với mục tiêu trên, chúng tôi hy vọng sẽ góp
phần tìm ra một quy trình mới có tính ứng dụng cao để có thể mở rộng ở quy mô sản
xuất lớn hơn.
1
Một hƣớng nghiên cứu thứ hai quan trọng và trọng tâm của công trình này là
tổng hợp dẫn xuất của curcuminoid và khảo sát hoạt tính sinh học. Curcumin mặc d
đã đƣợc chứng minh có rất nhiều hoạt tính mạnh và đa dạng, một trong những nhƣợc
điểm lớn của curcumin là tính khả dụng sinh học (bioavailability) thấp thể hiện ở sự
hấp thu kém, sự chuyển hóa nhanh và sự đào thải lớn khi vào cơ thể. Chính những yếu
tố trên đã làm ảnh hƣởng lớn đến dƣợc l của curcumin. Phƣơng pháp biến đổi cấu
trúc curcumin nhằm cải thiện hoạt tính và tính khả dụng sinh học là hƣớng nghiên cứu
đang rất đƣợc quan tâm hiện nay. Mặc d chƣa có nhiều nghiên cứu về mối quan hệ
giữa sự biến đổi cấu trúc curcumin với sự cải thiện tính khả dụng sinh học của
curcumin, rất nhiền dẫn xuất c ng đã đƣợc chứng minh in vitro và in vivo có hoạt tính
sinh học cao hơn curcumin. Đặc biệt trong số đó, các dẫn xuất isoxazole, pyrazole
curcumin và dẫn xuất của pyrazole curcumin đƣợc chứng minh có nhiều hoạt tính sinh
học mạnh hơn so với curcumin nhƣ hoạt tính kháng oxy hóa, kháng viêm, ức chế chọn
lọc enzyme COX-2 và đặc biệt là hoạt tính kháng ung thƣ. Việc biến đổi cấu trúc diketone của curcumin thành các dị v ng isoxazole, pyrazole đã đƣợc chứng minh
giúp tăng hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ của curcumin với nhiều d ng tế bào khác
nhau.
Chính vì vậy trong đề tài nghiên cứu này, các dẫn xuất isoxazole và pyrazole
curcuminoid được định hướng tổng hợp, đồng thời khảo sát một số hoạt tính sinh học
của các dẫn xuất này so với curcumin như hoạt tính kháng khuẩn, kháng oxy hóa và
kháng ung thư.
2
1
TỔNG QUAN
1.1 Tổng quan về curcumin
Cây Nghệ vàng có tên khoa học là Curcuma longa L. thuộc họ gừng
(Zingiberaceae). Trên thế giới, Nghệ vàng phân bố ở các v ng nhiệt đới, cận nhiệt đới
và đƣợc trồng chủ yếu ở các nƣớc châu Á nhƣ Ấn Độ, Trung Quốc, Pakistan,
Bangladesh, Indonesia... và Việt Nam [1].
Thành phần hóa học chính quan trọng nhất của thân rễ Nghệ vàng Curcuma
longa L. là curcuminoid (2-8%), thành phần tạo màu vàng cho củ nghệ. Hỗn hợp
curcuminoid bao gồm 3 thành phần chính : curcumin (Cur), demethoxycurcumin
(DMC) và bisdemethoxycurcumin (BDMC) (Hình 1.1) chiếm lần lƣợt khoảng 77%,
17%, 3% [1-4].
(1)
R1=R2=OCH3
(Curcumin)
(2)
R1=OCH3, R2=H
(Demethoxycurcumin)
(3)
R1=R2=H
(Bisdemethoxycurcumin)
Hình 1.1: Cấu trúc của các thành phần curcuminoid [1]
Curcumin, danh pháp quốc tế 1,7-bis-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-hepta-1,6diene-3,5-dione, chiếm hàm lƣợng cao nhất trong 3 thành phần và c ng đƣợc chứng
minh có nhiều hoạt tính sinh học mạnh và đa dạng hơn so với 2 thành phần c n lại.
1.2 Một số tính chất hóa lý của curcumin
Curcumin là chất rắn kết tinh màu vàng cam, tan trong chất béo, ethanol,
methanol, dichloromethane, acetone, acetic acid băng và hầu nhƣ không tan trong
nƣớc ở môi trƣờng acid hay trung tính (độ tan < 10 µg/ml ở 25oC). Trong môi trƣờng
kiềm, curcumin tạo dung dịch màu đỏ [1, 4, 5].
Dung dịch curcumin trong dung môi hữu cơ có độ hấp thu cực đại ở bƣớc sóng
từ 420-430 nm (Bảng 1.1) [1].
3
Bảng 1.1. Các thông số hoá l của các thành phần curcuminoid [6]
Thông số
o
Điểm chảy ( C)
UV-Vis λmax trong ethanol (nm)
Đặc trƣng
Curcumin
DMC
BDMC
184
429
172
424
222
419
1.2.1.1 Sự phân hủy curcumin trong môi trường kiềm
Dung dịch curcumin có màu không ổn định do sự phân hủy của curcumin hoặc
do thay đổi dung môi. Trong môi trƣờng acid, dung dịch có màu vàng và chuyển sang
đỏ nâu và đỏ đậm trong môi trƣờng kiềm. Phổ hấp thu trong môi trƣờng acid, base thể
hiện trong hình 1.2 [7]
a)
b)
Hình 1.2. a) Phổ UV-Vis của curcumin. ___ dung dịch curcumin 3.09×10-5 M trong
NaOH 0.5M, --- dung dịch curcumin 3.04 × 10-5M trong acid acetic băng; b) Phổ UVVis của dung dịch curcumin 4.99 × 10−5 M trong NaOH 0.091M theo thời gian [7]
Độ bền của curcumin phụ thuộc vào pH môi trƣờng [8, 9], phản ứng phân hủy
xảy ra nhanh hơn trong môi trƣờng trung tính – kiềm [9]. Khi tiếp xúc liên tục với môi
trƣờng kiềm sẽ có sự thay đổi màu rất rõ rệt sang màu vàng nâu hoặc vàng nhạt (gần
nhƣ không màu).
4
Sản phẩm ngưng tụ
Hình 1.3. Các sản phẩm phân hủy curcumin trong môi trƣờng kiềm [8]
Nghiên cứu của Tonnesen và cộng sự [8] cho thấy, phản ứng phân hủy curcumin
trong dung dịch pH 8.5 xảy ra nhanh ngay sau 5 phút. SKBM của dung dịch curcumin
bị phân hủy hoàn toàn cho 8-17 vết, phụ thuộc vào thời gian phản ứng và pH môi
trƣờng. Các sản phẩm phân hủy của curcumin đƣợc nhóm tác giả xác định thông qua
HPLC – MS bao gồm ferulic acid, feruloylmethane và các sản phẩm phân hủy của
feruloylmethane là vanilin và acetone (Hình 1.3). Màu vàng đến vàng nâu của dung
dịch đƣợc dự đoán là do các sản phẩm ngƣng tụ từ thành phần feruloylmethane.
Trong môi trƣờng giả sinh l (đệm phosphate, pH 7.2, 37oC ) không có huyết
thanh, 90% curcumin phân hủy trong 30 phút. Tuy nhiên khi có mặt huyết thanh,
curcumin bền hơn: trong môi trƣờng nuôi cấy tế bào chứa 10% huyết thanh bào thai b
và trong máu ngƣời, sau 1 giờ chỉ ít hơn 20% curcumin bị phân hủy và sau 8 giờ, chỉ
khoảng 50% curcumin bị phân hủy. Sản phẩm chính trong phản ứng phân hủy đƣợc
xác định là trans-6-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2,4-dioxo-5-hexenal, vanilin, ferulic
acid và feruloylmethane [9].
1.2.1.2 Độ bền quang hóa của curcumin
Curcumin đã đƣợc WHO thông qua là chất màu trong thực phẩm [10]. Tuy nhiên
curcumin không thích hợp cho mọi loại sản phẩm do nó mất màu rất nhanh khi tồn trữ
trong môi trƣờng kiềm. Ngoài ra, curcumin c ng dễ bị quang phân dƣới tác dụng của
bức xạ UV/Vis cả ở dạng h a tan và dạng màng rắn [11].
SKBM của dung dịch curcumin trong isopropanol (1 mg/100 ml) sau khi chiếu
xạ dƣới ánh sáng 400-510 nm trong 245 phút cho 1 sản phẩm phân hủy chính có Rf
5
gần với curcumin, đƣợc xác định (bằng phƣơng pháp MS, NMR) là do sự v ng hóa
của curcumin (sản phẩm I, hình 1.4).
Hình 1.4. Phản ứng đóng v ng đề xuất cho curcumin khi phơi sáng (> 400 nm) [11]
Ngoài sản phẩm chính v ng hóa, có 6 sản phẩm phụ khác đƣợc xác định bằng
MS và HPLC, gồm có vanillin, vanillic acid, ferulic aldehyde, ferulic acid và 4vinylguaiacol (Hình 1.5).
Hình 1.5. Sự phân hủy của curcumin trong isopropanol (> 400 nm) [11]
Dƣới tác dụng của bức xạ liên tục ở 240-600 nm, curcumin phân hủy nhanh hơn.
Sau 100 phút dung dịch mất màu hoàn toàn. Kết quả GC-MS cho nhiều sản phẩm phân
hủy khác chứng tỏ tác động của tia UV đã gây sự thay đổi đáng kể trong cấu trúc
curcumin.
Sự quang phân curcumin chịu ảnh hƣởng của dung môi [11]. Trong methanol tốc
độ quang phân của curcumin chậm nhất so với trong ethyl acetate, chloroform, và
6
acetonitrile, có thể do dung môi hỗ trợ sự hình thành các liên kết hydro nội phân tử và
liên phân tử trong curcumin và khả năng lọc sáng (inner-filter) của dung môi.
Tốc độ mất màu của curcumin ở 400-750 nm chậm lại khi có mặt các tác nhân
dập tắt oxy singlet nhƣ -carotene hoặc DABCO (1,4-diazabicylco-(2,2,2)octane),
trong khi đó các tác nhân nhạy sáng nhƣ methylene blue xúc tác, làm tăng tốc cho
phản ứng quang phân curcumin. Tuy nhiên khi chiếu sáng bức xạ liên tục trong
khoảng 240-600 nm, các tác nhân bắt oxy singlet này không gây ảnh hƣởng gì đến sự
phân hủy curcumin. Điều đó chứng tỏ curcumin bị quang phân theo cơ chế tự xúc tác
khi có mặt oxy singlet (bƣớc sóng trên 400 nm) tuy nhiên có thể curcumin c ng bị
phân hủy theo một cơ chế khác khi không có mặt oxy singlet. Do vậy, việc sử dụng
các tác nhân bắt oxy singlet không hiệu quả để ngăn chặn phản ứng quang phân
curcumin, curcumin nên đƣợc lƣu trữ trong các bình màu nâu và loại trừ các nguồn tạo
oxy singlet khác.
1.2.2 Hoạt tính sinh học của curcumin
Từ lâu Nghệ vàng đã đƣợc sử dụng rộng rãi ở nhiều quốc gia châu Á với vai tr
làm gia vị, chất tạo màu trong thực phẩm, chất bảo quản và c ng là một phƣơng thuốc
dân gian hiệu quả chữa trị nhiều loại bệnh khác nhau nhƣ rối loạn tiêu hóa, viêm loét
dạ dày, rối loạn chức năng gan mật, thấp khớp, viêm xoang, hỗ trợ điều trị viêm
nhiễm, giúp mau lành vết thƣơng, mau liền da và làm đẹp da.
Chính vì vậy, trong nhiều thập kỷ qua, curcumin đã trở thành đối tƣợng thu hút
hàng nghìn các nghiên cứu khác nhau và đã đƣợc chứng minh có nhiều hoạt tính sinh
học mạnh và đa dạng, đóng vai tr quan trọng đem lại hoạt tính cao của củ Nghệ vàng.
Hàng loạt công trình nghiên cứu in vitro, in vivo và nhiều nghiên cứu lâm sàng
đã cho thấy curcumin có tác dụng hỗ trợ và điều trị rất nhiều loại bệnh l khác nhau.
Curcumin giúp làm giảm cholesterol máu, ức chế sự oxy hóa LDL (lipoprotein tỷ
trọng thấp), ức chế sự kết tụ tiểu cầu, ngăn ngừa chứng nghẽn mạch, bệnh nhồi máu cơ
tim, ngăn chặn các triệu chứng liên quan đến tiểu đƣờng tuyp 2, hỗ trợ ngăn ngừa các
loại bệnh nhƣ viêm thấp khớp, các bệnh đa xơ cứng, bệnh suy giảm trí nhớ
(Alzheimer), ức chế sự nhân bản của virus HIV, hỗ trợ làm lành vết thƣơng, hỗ trợ bảo
vệ gan, tăng sự đào thải, hỗ trợ trong việc bảo vệ cơ thể khỏi các bệnh đục thủy tinh
thể, các bệnh về phổi, xơ hóa phổi, bệnh xơ vữa động mạch…[3] . Trong số đó, kháng
7
oxy hóa và kháng ung thƣ là những hoạt tính quan trọng của curcumin và là đối tƣợng
của rất nhiều công trình nghiên cứu. Hai hoạt tính này sẽ đƣợc trình bày sâu hơn trong
phần này.
1.2.2.1 Hoạt tính kháng ung thư của curcumin
Curcumin thể hiện vai tr là tác nhân vừa hóa ngừa vừa hóa trị với ung thƣ nhờ
vào khả năng can thiệp của curcumin vào các giai đoạn khác nhau trong tiến trình phát
triển ung thƣ bao gồm: ức chế sự biến đổi, sự tăng trƣởng và xâm lấn của tế bào ung
bƣớu (Hình 1.6)[3].
Hoạt hóa cấu trúc các
nhân tố phiên mã:
STAT3, AP-1, NF-B
Các gen ức chế khối u
Tế bào
lành
Sự biến đổi
Biểu hiện quá mức của:
Các gen sinh ung thƣ
HER2
Các nhân tố tăng
trƣởng
(e.g: EGF, PDGF, FGF)
Thụ thể nhân tố tăng
trƣởng
Các nhân tố sống sót
(e.g: Survivin, Bcl-2, Bcl-xl
Gen Cyclin D1
Thụ thể bẫy
Tế bào
ung thƣ
Biểu hiện quá mức của:
Enzyme
Matrix
metalloproteases
Enzyme Cylooxygenase-2
Các phân tử kết dính
Các chemokine
Yếu tố hoại tử khối u
TNF
Tăng trƣởng
Xâm lấn
Khối u
Khối u
CURCUMIN
Hình 1.6. Curcumin tác động vào các giai đoạn khác nhau trong quá trình phát triển
ung thƣ [3]
Ung thƣ là một quá trình nhiều giai đoạn, trong đó xảy ra sự phá v cơ chế điều
khiển của nhiều lộ trình sinh hóa và nhiều phân tử sinh học, gồm các nhân tố tăng
trƣởng, thụ thể của nhân tố tăng trƣởng, các nhân tố phiên mã, các cytokine, các
enzyme, gen điều khiển sự tăng trƣởng và gây chết tế bào theo chƣơng trình...[12].
Hoạt tính kháng ung thƣ của curcumin chính là nhờ khả năng tác động của curcumin
đến rất nhiều mục tiêu phân tử liên quan đến sự hình thành ung thƣ [12-14].
Thông qua khả năng tƣơng tác với nhiều mục tiêu phân tử, curcumin thể hiện
hoạt tính kháng tăng trƣởng tế bào, hiệu ứng gây chết tế bào theo chƣơng trình, ức chế
8
sự sản sinh các chemokine gây viêm bởi các tế bào ung thƣ, ức chế sự di căn, sự tăng
trƣởng mạch ở các tế bào ung bƣớu. Ngoài ra curcumin c n đƣợc biết đến với khả
năng hỗ trợ trong các quá trình hóa trị và xạ trị ung thƣ [12, 14].
Khả năng hóa ngừa và hóa trị ung thƣ của curcumin đã đƣợc chứng minh in vitro
trên nhiều d ng tế bào ung thƣ khác nhau nhƣ: Ức chế sự tăng trƣởng tế bào ung thƣ
vú [15-17], ung thƣ ruột kết (HT-29, HCT-15) [18], ung thƣ tuyến tiền liệt, [16, 18,
19], ức chế sự xâm lấn và gây tiêu diệt tế bào theo chƣơng trình (apoptosis) ở tế bào
ung thƣ biểu mô ngực MCF10A [20], tế bào AK5 [21, 22], tế bào ung thƣ ruột kết
LoVo [23, 24], tế bào bệnh bạch cầu B-cell và T-cell (Jurkat) của ngƣời, tế bào ung
thƣ máu HL-60 [25-30], tế bào ung thƣ thận 293, ung thƣ gan HepG2 [31], ung thƣ da
[32, 33], ức chế sự tăng trƣởng tế bào ung thƣ tuyến tiền liệt [19], tế bào ung thƣ biểu
mô miệng [34, 35], tế bào hủy xƣơng [36] và rất nhiều loại tế bào khác.
Các nghiên cứu trên chuột đã chứng minh curcumin là một tác nhân hóa ngừa
hiệu quả với ung thƣ. Curcumin đƣợc chứng minh ức chế khả năng tạo khối u của
nhiều loại ung thƣ liên quan đến ruột kết, tá tràng, thực quản, dạ dày, gan, ngực, bạch
huyết, nƣớu, tuyến tiền liệt…[13].
1.2.2.2 Hoạt tính kháng oxy hóa của curcumin
Stress oxy hóa đóng vai tr quan trọng trong tiến trình gây bệnh của nhiều loại
bệnh mạn tính, sự thoái hóa, lão hóa và những bệnh l chết ngƣời nhƣ ung thƣ, các
bệnh về tim mạch, thần kinh, phổi, khớp, thận, mắt và thai sản…[37]. Các chất kháng
oxy hóa ngoại sinh đóng vai tr quan trọng trong việc hỗ trợ hệ kháng oxy hóa nội
sinh chống lại stress oxy hóa. Chính vì vậy, một trong những tính chất nổi bật của
curcumin đó là hoạt tính kháng oxy hóa mạnh, đã đƣợc chứng minh bằng nhiều thử
nghiệm kháng oxy hóa khác nhau.
Curcumin thể hiện khả năng kháng peroxide hóa lipid hiệu quả. Peroxide hóa
lipid là quá trình gồm nhiều phản ứng gốc chuỗi đƣợc kích hoạt bởi các thành phần
oxy hoạt động (ROS: reactive oxygene species), là một trong những nguyên nhân
chính gây ra những tổn thƣơng ở màng tế bào, protein, DNA, đƣa đến nhiều loại bệnh
viêm nhiễm, tim mạch và ung thƣ [38]. Curcumin đƣợc chứng minh ức chế hiệu quả
sự peroxide hóa LDL (lipoprotein tỷ trọng thấp) gây ra bởi AAPH và Cu2+[39].
Curcumin ở nồng độ 15 g/ml (20 M) ức chế 97.3% sự peroxide hóa nh linoleic
9
acid cao hơn so với BHA (95.5%), -tocopherol (84.6%) và trolox (95.6%) và tƣơng
đƣơng với BHT (99.7%) ở nồng độ 45 g/ml (BHA: butylate hydroxyanisole, BHT:
butylate hydroxytoluene - các chất kháng oxy hóa đƣợc sử dụng nhiều làm phụ gia
trong thực phẩm) [40]. Curcumin c ng ức chế hiệu quả sự peroxide hóa lipid trong vi
lạp thể gan chuột in vitro gây ra bởi tia [41]. Điều này góp phần giải thích khả năng
của curcumin trong việc đối phó với những thƣơng tổn gây ra bởi tia phóng xạ. Nghiên
cứu của nhóm Srinivasan [42] đã chứng minh curcumin có khả năng bảo vệ tế bào
bạch huyết ngƣời trong môi trƣờng nuôi cấy khỏi những thƣơng tổn gây ra bởi tia
Curcumin có khả năng ức chế sự oxy hóa Fe2+ trong phản ứng Fenton [43].
Trong các kim loại chuyển tiếp, Fe đƣợc biết đến là chất thân oxy hóa (pro-oxidant)
trong phản ứng oxy hóa lipid do có thể tham gia vào phản ứng Fenton:
Curcumin đƣợc chứng minh có khả năng tạo phức với Fe2+ hiệu quả. Curcumin,
DMC và BDMC ức chế hiệu quả sự peroxide hóa lipid của dịch đồng thể não chuột và
vi lạp thể gan chuột gây ra bởi Fe thông qua khả năng tạo liên kết với ion này [44].
Theo dõi thông qua sự hấp thu của phức Fe2+-ferrozine ở 562 nm, curcumin thể hiện
khả năng tạo phức với Fe2+ tƣơng đƣơng với BHA và BHT, cao hơn so với tocopherol và trolox [40]. Các nhóm OH phenol, C=O trên curcumin có thể là các tâm
tạo phức với kim loại (Hình 1.7) [40].
Hình 1.7. Cơ chế đề nghị cho phản ứng tạo phức của curcumin-Fe2+
Hoạt tính kháng oxy hóa của curcumin c n thể hiện ở khả năng ức chế in vitro và
in vivo hiệu quả với sự tạo thành các dạng oxy hoạt động (ROS) trong cơ thể nhƣ
anion superoxide, H2O2, nitrite oxide, gốc nitrite là những tác nhân đóng vai tr quan
trọng trong quá trình gây viêm nhiễm [45-48]. Trong nghiên cứu của Tuba Ak và cộng
sự [40], curcumin thể hiện khả năng khử H2O2 và ức chế sự tạo thành anion gốc
superoxide cao hơn so với -tocopherol và trolox, trong đó hoạt tính khử H2O2 cao
10
hơn so với BHA và BHT. Curcumin có khả năng ức chế mạnh sự peroxide hóa lipid vi
lạp thể thận gây ra bởi H2O2 [49] và ức chế mạnh với những thƣơng tổn gây ra do
H2O2 trong tế bào sừng, nguyên bào sợi và tế bào NG 108-15 [50, 51]. Curcumin làm
giảm sự tạo thành nitric oxide và ức chế sự kích hoạt enzyme nitric oxide synthase
(NOS) trong đại thực bào đƣợc hoạt hóa in vitro [52]. Ngoài ra, hoạt tính kháng oxy
hóa của curcumin c n thể hiện ở khả năng ngăn chặn sự peroxide hóa lipid trong vi lạp
thể gan, màng hồng cầu và dịch đồng thể não chuột nhờ duy trì hoạt động của những
enzyme kháng oxy hóa nhƣ SOD (superoxide dismutase), catalase và glutathione
peroxidase [53, 54].
Nghiên cứu in vitro của nhóm Ak.Tuba [40] c ng chứng tỏ, curcumin có khả
năng trung h a gốc tự do ABTS, DPPH cao hơn so nhiều so với trolox, và tƣơng
đƣơng so với -tocopherol, BHA và BHT.
Hệ liên hợp c ng với cấu trúc -diketone và nhóm OH phenol đƣợc chứng minh
là nguyên nhân chính đem đến khả năng kháng gốc tự do và kháng oxy hóa cao của
curcumin.
Theo kết quả nghiên cứu của nhóm Slobodan [55], phản ứng bắt gốc tự do của
curcumin xảy ra theo cơ chế nhƣờng nguyên tử hydro (HAT: hydrogen atom transfer)
chủ yếu từ nhóm CH2 trung tâm. Trong môi trƣờng trung tính hoặc acid (pH 3-7),
dạng keto chiếm ƣu thế, curcumin thể hiện khả năng cho nguyên tử H mạnh. Hằng số
tốc độ phản ứng của curcumin với gốc tự do CH3 (trong dung dịch DMSO 40% ở pH
5) và với gốc tự do tertbutoxyl (trong acetonitrile) đều gần với tốc độ điều khiển
khuếch tán (diffusion controlled) với k lần lƣợt là 3.5 × 109 M-1s-1 và 7.5 × 109M-1s-1.
Trong khi đó, DHZ (DHZ - đƣợc xem là cấu trúc 1/2 curcumin, hình 1.8) không phản
ứng với gốc methyl, chứng tỏ sự hiện diện của hydro linh động trong CH2 là chính yếu
trong khả năng cho H của curcumin. Gốc tertbutoxyl phản ứng với DHZ ở tốc độ thấp
hơn gần 10 lần (k = 1.1 × 109 M-1s-1) tƣơng ứng với sự tách H từ nhóm OH phenol.
Hình 1.8. DHZ (4-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-3-buten-2-one ) – half curcumin
11
- Xem thêm -
.PDF 
152 
444 
108 
