Tài liệu Nghiên cứu quá trình lên men bia nồng độ cao sử dụng nấm men cố định trên alginate

- vi - MỤC LỤC Trang TRANG PHỤ BÌA LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN TÓM TẮT LUẬN ÁN i ii iii iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ ĐỊNH NGHĨA DANH MỤC CÁC BẢNG ix xi DANH MỤC CÁC HÌNH xiii MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Tình hình phát triển của ngành công nghiệp sản xuất bia Việt Nam 3 3 1.2. Nấm men bia cố định 4 1.2.1. Định nghĩa 4 1.2.2. Yêu cầu đối với chất mang và phương pháp cố định nấm men bia 4 1.2.3. Chất mang cố định nấm men 5 1.2.4. Phương pháp cố định nấm men 6 1.3. Lên men bia nồng độ cao 9 1.3.1. Định nghĩa 9 1.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men bia nồng độ cao 9 1.3.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ chất khô ban đầu trong dịch nha 9 1.3.2.2. Ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng trong dịch nha 10 1.3.2.3. Ảnh hưởng của mật độ nấm men gieo cấy ban đầu 10 1.3.2.4. Ảnh hưởng của hàm lượng oxy trong dịch nha ban đầu 11 1.3.2.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men 12 1.3.2.6. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol trong dịch lên men 13 1.4. Ứng dụng nấm men cố định trong quá trình lên men bia nồng độ cao 1.4.1. Tính chất sinh lý của nấm men cố định 1.4.2. Khả năng sử dụng cơ chất 1.4.3. Khả năng chịu đựng những yếu tố bất lợi 1.4.4. Khả năng sinh tổng hợp các sản phẩm trao đổi chất 13 13 14 14 15 - vii - 1.5. Chất mang alginate 1.5.1 Cấu trúc của alginic acid 1.5.2 Khả năng tạo gel của alginate 1.6. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về kỹ thuật lên men bia nồng độ cao sử dụng nấm men cố định trong gel alginate 1.6.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 1.6.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 1.7. Nội dung nghiên cứu của luận án 16 17 17 19 CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Nguyên liệu 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Thiết bị lên men 2.2.2. Phương pháp thực nghiệm 2.2.3. Bố trí thí nghiệm 2.2.4. Một số quy trình chuẩn bị nguyên liệu cho thí nghiệm 2.3. Phương pháp phân tích 2.4. Phương pháp xử lý số liệu thực nghiệm 2.5. Công thức tính toán 26 26 27 27 28 29 45 46 47 48 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 50 3.1. Ảnh hưởng của việc cố định tế bào trong gel alginate đến hình thái và khả năng lên men bia nồng độ cao của nấm men cố định 3.1.1. So sánh hoạt tính lên men của nấm men tự do và nấm men cố định khi nồng độ dịch nha thay đổi 3.1.2. Quan sát hình thái của nấm men trong điều kiện stress áp lực thẩm thấu và stress ethanol tăng cao 3.1.3. Xác định mật độ tế bào và nồng độ alginate thích hợp trong 1mL gel để cố định nấm men ứng dụng trong quá trình lên men bia nồng độ cao 3.1.4. Quan sát hình thái hạt gel trong quá trình lên men bia nồng độ cao theo phương pháp chu kỳ 3.1.5. So sánh hoạt tính lên men của nấm men cố định và nấm men tự do trong quá trình tái sử dụng để lên men bia nồng độ cao theo phương pháp chu kỳ 3.2. Nghiên cứu ứng dụng nấm men cố định để lên men dịch nha 24oBx từ malt đại mạch 3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy đến khả năng lên men của 50 19 21 23 50 62 65 68 70 75 75 - viii - nấm men cố định 3.2.2. Đánh giá ảnh hưởng của thời gian sục khí trong giai đoạn đầu của quá trình lên men đến khả năng lên men của nấm men cố định 3.3. Sử dụng nấm men cố định để lên men dịch nha có bổ sung thế liệu syrup maltose 3.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ thế liệu đến hoạt tính lên men của nấm men cố định trong quá trình lên men bia nồng độ cao 3.3.2. Đánh giá ảnh hưởng của phương pháp bổ sung Tween 80 vào dịch nha đến hoạt tính lên men của nấm men cố định 3.3.3. Đánh giá ảnh hưởng của phương pháp bổ sung ergosterol vào dịch nha đến hoạt tính lên men của nấm men cố định 3.3.4. Đánh giá ảnh hưởng của phương pháp bổ sung kết hợp Tween 80 và ergosterol đến hoạt tính lên men của nấm men cố định 3.3.5. Thiết lập phương trình cân bằng vật chất của quá trình lên men chính khi sử dụng nấm men cố định và nấm men tự do 3.4. Bước đầu thử nghiệm sử dụng nấm men cố định lên men dịch nha có bổ sung thế liệu bằng phương pháp lên men liên tục. 3.5. So sánh các phương án lên men bia nồng độ cao sử dụng nấm men cố định trong gel alginate 84 93 93 98 100 102 110 118 126 KẾT LUẬN 129 KIẾN NGHỊ DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ TÀI LIỆU THAM KHẢO 131 132 133 - ix - DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ ĐỊNH NGHĨA A. CHỮ VIẾT TẮT - o - o - DEAE: Diethylaminoethyl - DCM (Delignified cellulose materials): Nguyên liệu cellulose đã tách lignin - EDTA: Ethylen diamin tetraacetic acid - FAN (Free amino nitrogen): Nitơ amin tự do - SEM (Scanning electron microscope): Kính hiển vi điện tử quét - VDK: Vicinal diketones - YE (Yeast extract): Chất chiết nấm men - YPC (Yeast peptide complex): Hỗn hợp peptide được trích ly từ nấm men - M/G: Tỷ lệ D-mannuronic acid/L-guluronic acid của chế phẩm alginate Bx: Độ Brix Pt: Độ Plato B. ĐỊNH NGHĨA - Độ Brix: là đơn vị đo hàm lượng đường hòa tan trong dung dịch. Một độ Brix tương ứng với 1 gam saccharose hòa tan trong 100 gam dung dịch ở 20oC. Theo lý thuyết, 1oBx tương đương với 1oPt và tương đương với 1%w/w. - Nấm men cố định: là nấm men được gắn trên chất mang hoặc được nhốt trong chất mang hoặc có vị trí hoạt động bị giới hạn trong một vùng không gian nhất định của bình lên men nhưng vẫn có khả năng duy trì được hoạt tính trao đổi chất. - Khả năng sinh trưởng thực của nấm men hay số lượng tế bào nấm men sinh trưởng thực: là hiệu số giữa tổng số tế bào nấm men cực đại trong quá trình lên men bia và số lượng tế bào nấm men gieo cấy ban đầu. -x- - Lên men bia nồng độ cao: là kỹ thuật lên men dịch nha với nồng độ chất khô ban đầu rất cao (>15oPt), sau đó pha loãng sản phẩm bia thu được để đạt nồng độ ethanol theo giá trị mong muốn. - Độ lên men: là tỷ lệ giữa hàm lượng đường khử đã được nấm men sử dụng và hàm lượng đường khử ban đầu của dịch nha. Độ lên men được tính theo đơn vị là phần trăm khối lượng (%w/w). - Lên men chính: là quá trình chuyển hóa dịch nha thành bia non. Phần lớn các đường lên men trong dịch nha sẽ được chuyển hóa thành ethanol, CO2, aldehyde, rượu cao phân tử, ester, acid hữu cơ... - Bia non: là bia được hình thành sau quá trình lên men chính. - Tỷ lệ pha loãng: là tỷ lệ giữa lưu lượng dịch nha được bơm vào bình lên men và thể tích sử dụng của bình lên men. Trong phương pháp lên men liên tục chemostate, lưu lượng dịch nha được bơm liên tục vào bình lên men sẽ bằng với lưu lượng dịch lên men được tháo liên tục ra khỏi bình. - xi - DANH MỤC CÁC BẢNG trang CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN Bảng 1.1: Các phương pháp và chất mang cố định ứng dụng trong lên men bia 7 CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Bảng 2.1: Một số chỉ tiêu chất lượng của malt sử dụng trong luận án 26 Bảng 2.2 Ma trận thực nghiệm trong phương án cấu trúc có tâm, trực giao bậc 2 – hai yếu tố. 42 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Bảng 3.1: Mật độ tế bào cực đại và tỷ lệ sống sót của nấm men tự do và nấm men 50 cố định khi quá trình lên men kết thúc (Nồng độ dịch nha thay đổi từ 12 đến 28oBx) Bảng 3.2: Nồng độ của một số sản phẩm phụ trong bia non (mg/L) sau khi pha loãng 61 về 5% ethanol khi sử dụng nấm men cố định và nấm men tự do với nồng độ dịch nha thay đổi từ 12-28oBx. Bảng 3.3: Ảnh hưởng của mật độ tế bào nấm men trong 1mL gel đến hoạt tính lên men 65 của nấm men cố định với dịch nha 24oBx (Thời gian khảo sát là 150 ngày) Bảng 3.4: Ảnh hưởng của nồng độ alginate trong 1mL gel alginate-nấm men đến khả 66 năng lên men của nấm men cố định với dịch nha 24oBx Bảng 3.5: Thời gian lên men và hàm lượng ethanol có trong bia non theo phương pháp 71 lên men chu kỳ khi sử dụng nấm men cố định và nấm men tự do Bảng 3.6: Nồng độ của một số sản phẩm phụ trong bia non (mg/L) trong quá trình 74 tái sử dụng nấm men cố định và nấm men tự do Bảng 3.7: Nồng độ của một số sản phẩm phụ trong bia non (mg/L) khi sử dụng nấm 91 men cố định và thời gian sục khí thay đổi (dung dịch bia non được pha loãng với hàm lượng ethanol là 5%v/v) Bảng 3.8. Ảnh hưởng của tỷ lệ thế liệu syrup maltose đến quá trình lên men dịch nha 94 24oBx với nấm men cố định trong gelalginate. Bảng 3.9: Nồng độ của một số sản phẩm phụ trong bia non (mg/L) khi lên men dịch 97 nha 24oBx, sử dụng sử dụng thế liệu maltose syrup với các tỷ lệ khác nhau Bảng 3.10: Ảnh hưởng của việc bổ sung Tween 80 vào dịch nha trong quá trình lên men 99 bia nồng độ cao sử dụng nấm men cố định trong gel alginate (Dịch nha 24oBx có sử - xii - dụng 30% thế liệu syrup maltose) Bảng 3.11: Ảnh hưởng của việc bổ sung ergosterol vào dịch nha trong quá trình lên men bia 101 nồng độ cao sử dụng nấm men cố định trong gel alginate (Dịch nha 24oBx có sử dụng 30% thế liệu syrup maltose) Bảng 3.12. Ma trận bố trí thí nghiệm và kết quả quy hoạch thực nghiệm ảnh hưởng 102 của Tween 80 và ergosterol đến quá trình lên men bia nồng độ cao sử dụng nấm men cố định trong gel alginate Bảng 3.13: Coefficient, effects, standard errors and P-value đối với hàm mục tiêu 103 là hàm lượng ethanol trong bia non (YE) khi sử dụng phương pháp quy hoạch thực nghiệm. hàm lượng ethanol trong bia non (YE) sử dụng phương pháp quy hoạch thực nghiệm. Bảng 3.14: Nồng độ của một số sản phẩm phụ trong bia non (mg/L) khi sử dụng nấm 109 men cố định trong lên men bia nồng độ cao với sự bổ sung thành phần Tween 80 và ergosertol (dung dịch bia non được pha loãng với hàm lượng ethanol là 5%v/v). Bảng 3.15: Thành phần acid amin trong dịch nha (mg/100g) và trong bia non (mg/100g)114 được lên men bởi nấm men cố định trong gel alginate và nấm men tự do (Dịch nha 24oBx, tỷ lệ thế liệu syrup maltose là 30%). Bảng 3.16: Tỷ lệ thành phần nguyên tố của nấm men bia, các đường lên men, 115 các acid amin trong dịch nha, rượu cao phân tử và acid hữu cơ trong bia non khi lên men bia nồng độ cao sử dụng nấm men cố định và nấm men tự do. Bảng 3.17: Lượng cơ chất đã được nấm men sử dụng hoặc hàm lượng sản phẩm do 116 nấm men sinh ra trong bia non trong quá trình lên men bia nồng độ cao sử dụng nấm men cố định trong gel alginate và nấm men tự do. Bảng 3.18: Số mole cơ chất hoặc sản phẩm tính theo 1 mole đường lên men trong quá 116 trình lên men bia nồng độ cao sử dụng nấm men cố định và nấm men tự do. Bảng 3.19: Hiệu suất (%) tổng hợp sinh khối và sản phẩm tính theo đường lên men 117 trong quá trình lên men bia nồng độ cao sử dụng nấm men cố định và nấm men tự do. Bảng 3.20: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy đến khả năng lên men liên tục của nấm men 121 cố định trong gel alginate Bảng 3.21: Nồng độ của một số sản phẩm trong bia non (mg/l) khi sử dụng nấm men cố định và mật độ giống cấy thay đổi (dung dịch bia non được pha loãng với hàm lượng ethanol là 5%v/v) 125 - xiii - DANH MỤC CÁC HÌNH trang CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN Hình 1.1: Sản lượng bia của Việt Nam từ năm 2003 đến năm 2010 3 Hình 1.2: Phân tử acid aginic 17 Hình 1.3: Sự hình thành gel của alginate với Ca 2+ 18 CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Hình 2.1: Bình lên men sử dụng cho phương pháp lên men chu kỳ 28 Hình 2.2: Hạt gel có chứa nấm men sử dụng trong luận án 28 Hình 2.3: Bình lên men sử dụng cho phương pháp lên men liên tục 29 Hình 2.4: Quy trình cố định nấm men trong gel alginate 46 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Hình 3.1: Tốc độ sử dụng đường khử của nấm men tự do và nấm men cố định khi 53 nồng độ chất khô ban đầu của dịch nha thay đổi 12-28oBx Hình 3.2: Tốc độ sử dụng FAN của nấm men tự do và nấm men cố định khi nồng độ 54 chất khô ban đầu của dịch nha thay đổi 12-28oBx Hình 3.3: Tốc độ sinh ethanol của nấm men tự do và nấm men cố định khi nồng độ 55 chất khô ban đầu của dịch nha thay đổi 12-28oBx Hình 3.4: Thời gian lên men của nấm men tự do và nấm men cố định khi nồng độ 57 o chất khô ban đầu của dịch nha thay đổi 12-28 Bx Hình 3.5: Nồng độ diacetyl trong bia non khi sử dung nấm men tự do và nấm men 58 cố định khi nồng độ chất khô ban đầu của dịch nha thay đổi 12-28oBx Hình 3.6: Nồng độ acetaldehyde trong bia non khi sử dung nấm men tự do và nấm 59 men cố định khi nồng độ chất khô ban đầu của dịch nha thay đổi 12-28oBx Hình 3.7: Nồng độ propanol trong bia non khi sử dung nấm men tự do và nấm men 60 cố định khi nồng độ chất khô ban đầu của dịch nha thay đổi 12-28oBx Hình 3.8: Nồng độ isoamyl alcohol trong bia non khi sử dung nấm men tự do và nấm men cố định khi nồng độ chất khô ban đầu của dịch nha thay đổi 12-28oBx 60 - xiv - Hình 3.9: Nồng độ ethyl acetate trong bia non khi sử dung nấm men tự do và nấm men 61 cố định khi nồng độ chất khô ban đầu của dịch nha thay đổi 12-28oBx Hình 3.10: Hình ảnh của nấm men cố định và nấm men tự do được chụp bởi SEM. 63 Nồng độ Alginate trong hạt gel là 2,5% (w/v) và mật độ nấm men là 5,0x107 tb/mL gel: (A1) (B1) và (C1): hình ảnh ban đầu của nấm men tự do, nấm men cố định trên bề mặt của hạt gel và bên trong của hạt gel; (A2) (B2) và (C2) hình ảnh của nấm men tự do, nấm men cố định trên bề mặt của hạt gel và bên trong của hạt gel sau 30 phút tiếp xúc với dung dịch sorbitol (24oBx); (A3), (B3) and (C3) hình ảnh của nấm men tự do, nấm men cố trên bề mặt của hạt gel và bên trong của hạt gel sau 30 phút tiếp xúc với dung dịch ethanol (10% v/v). Hình 3.11: Tế bào nấm men S. cerevisiae cố định trong gel alginate được chụp bởi 70 SEM. Nồng độ alginate là 2,5% (w/v) và mật độ nấm men ban đầu là 5,0x107 tb/mL gel: (a1) và (a2) bề mặt bên ngoài và mặt cắt bên trong hạt gel trước lên men; (b1) và (b2) bề mặt bên ngoài và mặt cắt bên trong hạt gel sau một chu kỳ lên men; (c1) và (c2) bề mặt bên ngoài và mặt cắt bên trong hạt gel sau 5 tháng lên men (hạt gel được tái sử dụng 30 chu kỳ trong lên men bia nồng độ cao). Hình 3.12: Sự biến đổi mật độ tế bào trong quá trình lên men khi mật độ giống cấy 75 thay đổi từ 1,0 đến 4,0x107 tb/mL (dịch nha 24oBx & được nấu từ malt đại mạch) Hình 3.13: Sự biến đối hàm lượng đường khử trong quá trình lên men chính, sử dụng 78 dịch nha 24oBx và mật độ nấm men thay đổi từ 1,0 x107 tb/mL đến 4,0x107 tb/mL Hình 3.14: Sự biến đối FAN trong quá trình lên men chính, sử dụng dịch nha 24oBx 79 và mật độ nấm men thay đổi từ 1,0 x107 tb/mL đến 4,0x107 tb/mL Hình 3.15: Tốc độ trung bình sử dụng cơ chất của nấm men cố định khi mật độ tế bào 79 gieo cấy thay đổi từ 1,0 x107 tb/mL đến 4,0x107tb/mL Hình 3.16: Sự biến đổi nồng độ ethanol trong quá trình lên men chính khi mật độ 80 giống cấy thay đổi từ 1,0 x107 tb/mL đến 4,0x107 tb/mL Hình 3.17: Tốc độ sinh ethanol và nồng độ ethanol trong bia non khi mật độ tế bào 81 gieo cấy thay đổi từ 1,0 x107 tb/mL đến 4,0x107 tb/mL Hình 3.18: Sự biến đổi nồng độ diacetyl ethanol trong bia non khi mật độ tế bào 83 - xv - gieo cấy thay đổi từ 1,0 x107 tb/mL đến 4,0x107 tb/mL Hình 3.19: Sự biến đổi mật độ tế bào trong quá trình lên men chính khi thời gian 85 sục khí đổi từ 0 đến 20 giờ lên men đầu tiên Hình 3.20: Sự biến đổi hàm lượng đường khử của canh trường trong quá trình lên 86 men chính khi thời gian sục khí thay đổi từ 0 đến 20 giờ lên men đầu tiên Hình 3.21: Tốc độ trung bình sử dụng cơ chất của nấm men trong quá trình lên men 87 chính khi thời gian sục khí thay đổi từ 0 đến 20 giờ lên men đầu tiên Hình 3.22: Sự biến đổi hàm lượng FAN của canh trường trong quá trình lên men 88 chính khi thời gian sục khí thay đổi từ 0 đến 20 giờ lên men đầu tiên Hình 3.23: Sự Sự biến đổi hàm lượng ethanol của canh trường trong quá trình lên men 89 chính khi thời gian sục khí thay đổi từ 0 đến 20 giờ lên men đầu tiên Hình 3.24: Tốc độ sinh ethanol và nồng độ ethanol trong bia non khi thời gian sục 90 khí đổi từ 0 đến 20 giờ lên men đầu tiên Hình 3.25: Sự biến đổi hàm lượng diacetyl của canh trường trong quá trình lên men 91 chính khi thời gian sục khí thay đổi từ 0 đến 20 giờ lên men đầu tiên Hình 3.26: Sự biến đổi hàm lượng đường khử của canh trường trong quá trình lên 95 men chính khi tỷ lệ thế liệu thay đổi 0-45% (w/w) Hình 3.27: Sự biến đổi hàm lượng FAN của canh trường trong quá trình lên men 96 chính khi tỷ lệ thế liệu thay đổi 0-45% (w/w) Hình 3.28: Nồng độ ethanol trong bia non trong thí nghiệm tối ưu hóa quy hoạch 104 thực nghiệm (Y: nồng độ ethanol (%v/v), X1: hàm lượng Tween 80 (%v/v) bổ sung vào dịch nha và X2: hàm lượng ergosterol (mg/L) bổ sung vào dịch nha. Hình 3.29: Sự biến đổi mật độ tế bào nấm men của canh trường trong quá trình lên 105 men khi dịch nha được bổ sung 0,3%(v/v) Tween 80 và 0,18 (mg/L) ergosterol (Dịch nha 24oBx với tỷ lệ thế liệu syrup maltose 30%w/w, sử dụng nấm men cố định trong gel alginate). Hình 3.30: Sự biến đổi hàm lượng đường khử của canh trường trong quá trình lên 106 men khi dịch nha được bổ sung 0,3%(v/v) Tween 80 và 0,18 (mg/L) ergosterol (Dịch nha 24oPt với tỷ lệ thế liệu syrup maltose 30%w/w, sử dụng nấm men cố định trong gel alginate). Hình 3.31: Sự biến đổi hàm lượng FAN trong quá trình lên men khi dịch nha được bổ 106 sung 0,3%(v/v) Tween 80 và 0,18 (mg/L) ergosterol (Dịch nha 24oBx với tỷ lệ thế liệu syrup maltose 30%w/w, sử dụng nấm men cố định trong gel alginate). - xvi - Hình 3.32: Sự biến đổi nồng độ ethanol của canh trường trong quá trình lên men 107 khi dịch nha được bổ sung 0,3%(v/v) Tween 80 và 0,18 (mg/L) ergosterol (Dịch nha 24oBx với tỷ lệ thế liệu syrup maltose 30%w/w, sử dụng nấm men cố định trong gel alginate) Hình 3.33: Sự biến đổi nồng độ diacetyl của canh trường trong quá trình lên men 107 khi dịch nha được bổ sung 0,3%(v/v) Tween 80 và 0,18 (mg/L) (Dịch nha 24oBx với tỷ lệ thế liệu syrup maltose 30%w/w, sử dụng nấm men cố định trong gel alginate) Hình 3.34: Sự biến đổi nồng độ một số sản phẩm phụ của canh trường trong quá trình 109 lên men khi dịch nha được bổ sung 0,3%(v/v) Tween 80 và 0,18 (mg/L) (Dịch nha 24oBx với tỷ lệ thế liệu syrup maltose 30%w/w, sử dụng nấm men cố định trong gel alginate) Hình 3.35: Sự thay đổi hàm lượng các đường lên men trong quá trình lên men bia 111 nồng độ cao khi sử dụng nấm men tự do (Dịch nha 24oBx, tỷ lệ thế liệu syrup maltose là 30%) Hình 3.36: Sự thay đổi hàm lượng các đường lên men trong quá trình lên men bia 111 nồng độ cao khi sử dụng nấm men cố định trong gel alginate (Dịch nha 24oBx, tỷ lệ thế liệu syrup maltose là 30%) Hình 3.37: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy đến sự biến đổi mật độ tế bào tự do trong 119 dịch lên men trong quá trình lên men liên tục Hình 3.38: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy đến sự biến đổi hàm lượng ethanol trong 122 dịch lên men trong quá trình lên men liên tục Hình 3.39: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy đến sự biến đổi hàm lượng diacetyl trong 123 dịch lên men trong quá trình lên men liên tục Hình 3.40: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy đến sự biến đổi hàm lượng ethyl aceate, 124 rượu cao phân tử và acetaldehyde trong dịch lên men trong quá trình lên men liên tục - xvii - -1- MỞ ĐẦU Bia được con người sản xuất và sử dụng từ 7000 năm trước công nguyên. Thành phần hóa học chính của bia gồm có nước, ethanol và CO2. Ngoài ra, bia còn chứa nhiều loại muối vô cơ và hơn 800 hợp chất hữu cơ khác [1]. Hiện nay, nguyên liệu chính để sản xuất bia là malt đại mạch, thế liệu, hoa houblon và nước [2], [3]. Sản phẩm bia đã trở nên phổ biến trên toàn cầu. Nhu cầu về bia của người tiêu dùng và sự cạnh tranh sản xuất của các doanh nghiệp ngày càng gia tăng. Hiện nay, các nhà sản xuất đã và đang tìm nhiều giải pháp để nâng cao năng suất và chất lượng bia. Trong nhóm kỹ thuật mới được áp dụng để gia tăng năng suất sản xuất bia thì kỹ thuật lên men bia nồng độ cao ngày càng trở nên phổ biến [4], [5]. Thành công của kỹ thuật lên men bia nồng độ cao phụ thuộc vào khả năng của nấm men bia chịu được 2 kiểu stress: stress áp lực thẩm thấu do nồng độ chất khô tăng cao trong dịch nha ban đầu và stress ethanol do nồng độ ethanol tăng cao trong dịch lên men. Hiện nay, việc sản xuất bia nồng độ cao đã được triển khai ứng dụng ở nhiều nơi trên thế giới và hàm lượng chất khô có thể gia tăng đến 18-24oPt [6], [7], [8]. Trong những năm gần đây, có rất nhiều loại vật liệu được sử dụng để cố định nấm men như các polymer (alginate, agar, gelatin, κ-carrageenan, chitosan, pectin, polyacrylamide, epoxy resin, silica sol) và vật liệu xốp (dăm bào, đá núi lửa, vải cotton, mẫu thủy tinh xốp, ceramic, diatomite). Alginate là vật liệu được sử dụng phổ biến nhất để cố định tế bào. Nedovic & cộng sự (2005) cho rằng có hơn 80% các nghiên cứu trên thế giới về cố định tế bào đã sử dụng chất mang alginate [9]. Dựa trên kết quả nghiên cứu của nhiều nhà khoa học, hãng Proenol-Industria Biotechnologica, Ltd (Bồ Đào Nha) đã thương mại hóa các chế phẩm nấm men cố định trong gel alginate để ứng dụng trong sản xuất ethanol, bia và rượu vang với các sản phẩm như ProDessert® QA23 (S. bayanus), ProRestart® QA23 (S. bayanus), ProDessert® BA11 (S. cerevisiae), ProELIF® DV10 (S. bayanus) và ProRestart® DV10 (S. bayanus) [10], [11]. Trong lĩnh vực sản xuất bia, chế phẩm nấm men cố -2- định trong gel alginate được sử dụng chủ yếu trong quá trình lên men bia truyền thống với dịch nha từ malt đại mạch có nồng độ chất khô dao động trong khoảng 10-12oPt [12], [12], [14], [15]. Ở nước ta hiện nay, ngành công nghiệp Bia-Rượu-Nước giải khát đã được quy hoạch phát triển thành một ngành kinh tế mạnh. Các doanh nghiệp sản xuất bia trong nước đã và đang từng bước hiện đại hóa công nghệ để nâng cao sản lượng bia sản xuất. Một số công ty bia ở Việt Nam như Tổng công ty Bia-Rượu-Nước giải khát Sài Gòn và công ty Bia Việt Nam đã áp dụng kỹ thuật sản xuất bia nồng độ cao với hàm lượng chất khô từ 13-16oPt, sử dụng thế liệu gạo chiếm từ 20-30%. Cần lưu ý là các nhà máy sản xuất bia Việt Nam áp dụng kỹ thuật lên men bia nồng độ cao với hàm lượng chất khô thấp hơn nhiều so với thế giới và chưa sử dụng nấm men cố định trong quy trình sản xuất bia nồng độ cao. Dựa trên những phân tích về nhu cầu thị trường, tình hình nghiên cứu và sản xuất bia trong nước, cũng như định hướng phát triển của ngành bia trong những năm tới, chúng tôi thực hiện đề tài nghiên cứu quá trình lên men bia nồng độ cao sử dụng nấm men cố định trong gel alginate nhằm mục đích nâng cao năng suất sản xuất, tiết kiệm nhân công, năng lượng và chi phí đầu tư cho ngành công nghiệp sản xuất bia. -3- CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Tình hình phát triển của ngành công nghiệp sản xuất bia Việt Nam Hiện nay, Việt Nam có khoảng 350 nhà máy sản xuất bia và tiếp tục tăng về số lượng. Trong số này, có hơn 20 nhà máy đạt công suất trên 20 triệu lít/năm; 15 nhà máy có công suất lớn hơn 15 triệu lít/năm và có tới 268 cơ sở có năng lực sản xuất dưới 1 triệu lít/năm. Lượng bia Việt Nam sản xuất tăng dần trong những năm qua: từ 1,29 tỷ lít trong năm 2003 tăng đến 2,7 tỷ lít trong năm 2010 (Hình 1.1). Mức tiêu thụ bia bình quân đầu người của Việt Nam vào năm 2010 là 28 lít/năm, tương đối thấp so với Hàn Quốc, Nhật Bản (43 lít/năm) và Ireland, Đức, Séc (88 lít/năm). Mức tiêu thụ bia ở nước ta dự kiến sẽ gia tăng trong thời gian tới nhờ vào mức thu nhập của người dân tăng lên và sự thay đổi tập quán uống (chuyển từ uống rượu sang uống bia) của người dân ở nhiều vùng nông thôn… [16] 3.0 2.70 Sản lượng (Tỷ lít/năm) 2.40 1.90 2.0 2.00 1.70 1.29 1.37 2003 2004 1.50 1.0 0.0 2005 2006 2007 2008 2009 2010 Năm sản xuất Hình 1.1: Sản lượng bia của Việt Nam từ năm 2003 đến năm 2010 [16] Ở nước ta hiện nay, ngành Bia-Rượu-Nước giải khát đã được quy hoạch phát triển thành một ngành kinh tế quan trọng. Bộ trưởng Bộ Công thương đã ra quyết định số 2435 vào năm 2009, theo đó đến năm 2015 sản lượng bia đạt khoảng 4,0 tỷ lít với lượng vốn đầu tư dự kiến cho ngành khoảng 18.042 tỷ đồng và đến năm 2025 sản lượng sản xuất đạt 6,0 tỷ lít với lượng vốn đầu tư dự kiến khoảng 24.056 tỷ đồng [17]. -4- 1.2. Nấm men bia cố định 1.2.1. Định nghĩa Nấm men cố định là nấm men được gắn trên chất mang hoặc được nhốt trong chất mang hoặc có vị trí hoạt động bị giới hạn trong một vùng không gian nhất định của bình lên men nhưng vẫn có khả năng duy trì được hoạt tính trao đổi chất [18]. Cố định nấm men là sự mô phỏng những gì xảy ra trong tự nhiên khi nấm men phát triển trên bề mặt hoặc bên trong cấu trúc vật liệu tự nhiên [19]. Nấm men cố định có thể được sử dụng với những mục đích khác nhau trong quá trình lên men bia như lên men chính hoặc lên men phụ trong phương pháp lên men bia truyền thống, lên men bia không cồn hoặc bia có độ cồn thấp, lên men bia nồng độ cao [9], [19], [20]. Trong quá trình lên men bia, việc sử dụng nấm men cố định có những thuận lợi như: Ổn định hoạt tính lên men của nấm men trong một khoảng thời gian dài [21], [22], [23]; tăng mật độ tế bào trong một đơn vị thể tích dịch lên men [24], [25]; sử dụng phương pháp lên men liên tục [24], [25]; tăng số lần tái sử dụng nấm men trong phương pháp lên men chu kỳ [26]; giảm khả năng tạp nhiễm của vi sinh vật [27]; tăng năng suất của thiết bị lên men [24]. Tuy nhiên, sử dụng nấm men cố định có một số nhược điểm như: Một số loại chất mang có thể giới hạn sự truyền khối của cơ chất và sản phẩm trao đổi chất [24]; cấu trúc của chất mang có thể bị thay đổi và/hoặc phá vỡ trong quá trình lên men [24]. 1.2.2. Yêu cầu đối với chất mang và phương pháp cố định nấm men bia Chất mang cố định nấm men bia phải thỏa mãn một số yêu cầu như: Có diện tích bề mặt lớn và có khả năng kết dính tế bào; có khả năng chứa lượng sinh khối nấm men càng cao càng tốt; có độ bền cao về vật lý (cơ học, áp lực thẩm thấu, nhiệt độ), hóa học và sinh học; độ xốp của chất mang tương đối đồng nhất và cho phép cơ chất, sản phẩm trao đổi chất và khí di chuyển dễ dàng trong quá trình lên men; chất mang dễ bảo quản và tái sinh, không ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm và được người tiêu dùng dễ dàng chấp nhận [9], [18], [24], [28]. -5- Yêu cầu chung của phương pháp cố định nấm men bia là phải đơn giản, chi phí thấp và phù hợp với quy mô sản xuất, không gây tạp nhiễm vi sinh vật có hại; nấm men có khả năng phát triển tốt và hoạt động ổn định trên hoặc trong chất mang trong thời gian dài; dễ dàng tách chất mang với nấm men cố định ra khỏi dịch lên men [9], [18], [24], [28]. 1.2.3. Chất mang cố định nấm men bia Chất mang cố định nấm men bia thường là những polymer tự nhiên, polymer tổng hợp hoặc các vật liệu vô cơ có trong tự nhiên [18]. 1.2.3.1. Chất mang vô cơ Chất mang vô cơ có ưu điểm là chi phí thấp và đa dạng về chủng loại. Vật liệu vô cơ được sử dụng để cố định nấm men là polygorskite, montmorilonite, hydromica, porcelain xốp, đá bọt [18], hạt γ-alumina [29], [30], [31], ceramic [32] và hạt thủy tinh xốp [5], [26], [33], [34], [35]. 1.2.3.2. Chất mang hữu cơ Chất mang tổng hợp Chất mang hữu cơ tổng hợp có thành phần hóa học ổn định, phổ biến nhất là màng hoặc vòng polyethylene, hạt gel polyvinyl alcohol, polyacrilamide, polyurethane và polyethylenimine [18], [36], [37]. Chất mang tự nhiên Chất mang hữu cơ tự nhiên đa dạng về cấu trúc, chi phí thấp, an toàn và được người tiêu dùng chấp nhận làm vật liệu cố định tế bào [18], [20]. Các loại chất mang tự nhiên để cố định nấm men bia được phân thành 3 nhóm: • Nhóm chất mang giàu cellulose gồm có vỏ trấu, than từ thân cây bắp, thân tre, thân cây cọ [38], [39]; xơ mướp [40]; dăm bào [41]; mẫu táo [42], [43], [44], [45]; mẫu quince (Cotoneum malum) [44], [46]; mẫu lê [46], [47], vỏ nho [48], [49]; vỏ cam [50], mẫu sung [51]; bã mía [39], [52]; bã malt [20], [42], [53], [54], [55], [56]; DEAE cellulose và cellulose đã tách lignin DCM [18], [22], [43], [57], [58], [59], [60], [61], [62], [63], [64]. -6- • Nhóm chất mang giàu các thành phần polysaccharides khác là agar [13], [65]; alginate [13], [15], [66], [67], [68]; chitosan [69], [70]; pectin [66], [68], [71] và κ-carrageenan [13], [19], [66], [68], [72], [73], [74]. • Chất mang tự nhiên giàu protein gồm có hạt gluten [59], [75] và gelatin [76]. 1.2.4. Phương pháp cố định nấm men bia Phương pháp cố định nấm men có thể được chia thành bốn nhóm chính [25]: • Cố định nấm men trên bề mặt chất mang rắn Nấm men được gắn trên bề mặt vật liệu rắn là nhờ vào các tương tác vật lý như liên kết tĩnh điện, liên kết ion, liên kết kỵ nước [77] hoặc liên kết cộng hóa trị giữa tế bào và bề mặt chất mang [18], [78], [79], [80]. Chất mang rắn sử dụng trong cố định tế bào bằng phương pháp hấp phụ có thể là vật liệu bản chất là cellulose [49], [54], [55], [56], [81], [82], [83], [84], [85], [86]; vật liệu bản chất là protein [59] và vật liệu là dẫn xuất silicat [18], [35], [83], [87]. • Nhốt nấm men bên trong vật liệu xốp Nấm men được nhốt bên trong cấu trúc mạng lưới nhằm ngăn cản sự khuếch tán tế bào ra môi trường xung quanh nhưng vẫn cho phép chúng phát triển sinh khối và trao đổi chất [18], [78]. Sự phát triển của tế bào trong chất mang phụ thuộc vào độ xốp của vật liệu và khả năng khuếch tán của các chất dinh dưỡng có trong môi trường [18], [88]. Để cố định nấm men bia, người ta thường sử dụng gel polysaccharides như alginate, κ-carrageenan, agar, chitosan, polygalacturonic; gel protein như gelatin, collagen hoặc gel polymer tổng hợp như polyvinyl alcohol [13], [15], [18], [66], [79], [89], [90], [91]. • Hai phương pháp: kết bông tế bào [18], [77], [92] và giữ tế bào trong màng bán thấm [18], [80] rất ít được sử dụng để lên men bia. -7- Bảng 1.1: Các phương pháp và chất mang cố định nấm men ứng dụng trong lên men bia • Phương pháp hấp phụ nấm men trên bề mặt chất mang rắn Chất mang Bã malt Lượng nấm men cố định 0,43 gam tb/gam bã malt Thông số kỹ thuật/phương pháp lên men Bã malt đã được xử lý loại bỏ phần tinh bột; lên men liên tục Tài liệu tham khảo [54] 0,55 gam tb khô/gam bã malt khô nt [55] 0,65 gam tb khô/gam bã malt khô nt [1] 0,4 gam tb/gam bã malt nt [81] 0,63gam tb khô/gam bã malt khô nt [11] 0,33 gam tb/gam bã malt nt [21] DEAE-cellulose 28 gam tb/L cellulose Lên men tĩnh, lên men liên tục [68] Hạt gluten 0,42gam tb ướt/10 hạt gluten Hạt gluten (Ø 1.5-2 mm) lên men liên tục [59] Sponge 1,0x109 tb/gam chất mang ướt Khối sponge (0,8x0,8x0,8cm); lên men tĩnh [93] Hạt thủy tinh xốp 5,0x106 tb/hạt Hạt thủy tinh (Ø 3 mm, Ø lỗ xốp 10-20 µm; lên men tĩnh [35] Hạt ceramic 1,0x108 tb/gam chất mang Hạt ceramic (Ø 8 mm, tính chất xốp 58%, d=0,8g/cm3; lên men tĩnh có tuần hoàn dịch nha [94] 1,0x109 tb/mL gel Hạt gel (Ø3mm, 25g/L Na-alginate, 0.1 M CaCl2); lên men tĩnh [95] 1,0x109 tb/mL gel Hạt gel (Ø3mm, 25g/L Na-alginate, 0.1 M CaCl2); lên men liên tục [66] 2,0x107 tb/mL gel Hạt gel (Ø0,3-0,6mm, 2% Na-alginate); lên men tĩnh [37] 0,16 gam tb/mL gel Hạt gel (Ø3mm, 1% Na-alginate, 0.05 M CaCl2); lên men liên tục [96] 1,0x109 tb/mL gel Hạt gel (Ø2mm, 25g/L Na-alginate, 0,1% CaCl2); lên men tĩnh [15] • Phương pháp nhốt tế bào trong chất mang xốp Ca-alginate -8- • Phương pháp nhốt tế bào trong chất mang xốp (tt) Chất mang Ca-alginate Ca-pectate k-carrageenan Lượng nấm men cố định Thông số kỹ thuật/phương pháp lên men Tài liệu tham khảo 0,65x10 tb/mg gel Hạt gel (Ø3mm, 4% Na-alginate, 04% CaCl2); lên men tĩnh và lên men liên tục [97] 1,0x109 tb/mL gel Hạt gel (2% Na-alginate, 0,1M CaCl2); lên men liên tục [98] 1,0x109 tb/mL gel Hạt gel (2,5% Na-alginate, 0,1M CaCl2); lên men liên tục [99] 1,0x107 tb/hạt Hạt gel (Ø3mm, 1% Na-alginate, 0.1 M CaCl2); lên men tĩnh [35] 1,0x108 tb/mL gel Hạt gel (3% Na-alginate, 1% w/v CaCl2); lên men tĩnh có tuần hoàn dịch nha [94] 1,0x109 tb/mL gel Hạt gel (Ø2mm, 50g/L K-pectate, 0.1M CaCl2); lên men tĩnh [95] 1,0x109 tb/mL gel Hạt gel (Ø2mm, 50g/L K-pectate, 0.1M CaCl2); lên men liên tục [66] 1,0x109 tb/mL gel Hạt gel (50g/L k-pectate, 0.1 M CaCl2); lên men liên tục [98] 1,0x109 tb/mL gel Hạt gel (Ø2mm, 50g/L K-pectate, 0.1M CaCl2); lên men tĩnh, lên men liên tục [68] 1,0x109 tb/mL gel Hạt gel (Ø2mm, 40g/L k-carrageenan, 0.1M NaCl); lên men tĩnh [95] 1,0x10 tb/mL gel Hạt gel (Ø2mm, 40g/L k-carrageenan, 0.1M NaCl); lên men liên tục [66] 1,0x109 tb/mL gel Hạt gel (Ø2-4mm, 3%w/v k-carrageenan, 1,5g/L KCl); lên men tĩnh [73] 1,0x109 tb/mL gel Hạt gel (Ø2mm, 40g/L k-carrageenan, 0.1M NaCl); lên men tĩnh, lên men liên tục [68] 1,0x107 tb/mL gel Hạt gel (Ø3,5mm dày 0,3mm); lên men tĩnh [36] 1,0x107 tb/mL gel Hạt gel (Ø3,5mm dày 0,3mm); lên men tĩnh [100] 6 9 PVA