Tài liệu Nghiên cứu phương pháp định lượng một số glycoside tim trong dược phẩm và dược liệu

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- BÙI THỊ TÂM NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ GLYCOSIDE TIM TRONG DƯỢC PHẨM VÀ DƯỢC LIỆU LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- BÙI THỊ TÂM NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ GLYCOSIDE TIM TRONG DƯỢC PHẨM VÀ DƯỢC LIỆU Chuyên ngành : Hoá Phân Tích Mã số : 60440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. NGUYỄN VĂN RI Hà Nội – Năm 2015 Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm LỜI CẢM ƠN! Sau một thời gian học tập và nghiên cứu tôi đã hoàn thành luận văn cao học của mình với đề tài: “Nghiên cứu phương pháp định lượng một số glycoside tim trong dược phẩm và dược liệu” dƣới sự hƣớng dẫn, chỉ bảo của PGS.TS Nguyễn Văn Ri và các thầy cô, anh chị em, các bạn trong bộ môn Hóa phân tích. Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Văn Ri, ngƣời đã giao đề tài và tận tình chỉ dẫn tôi trong quá trình hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả quý Thầy Cô trong bộ môn hóa Phân tích và khoa Hóa học trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình làm luận văn. Tôi cũng xin chân thành gửi lời cảm ơn đến ThS. Nguyễn Công Tuấn – phòng máy HPLC đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành luận văn. Cuối cùng tôi cũng xin chân thành cảm ơn toàn thể các anh chị, các bạn trong phòng thí nghiệm Hoá phân tích, các bạn cao học K23 đã giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện đề tài. Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN! ............................................................................................................1 MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ..................................... Error! Bookmark not defined. 1.1. Khái quát chung về các hợp chất glycoside tim. .......... Error! Bookmark not defined. 1.1.1. Cấu tạo, tên gọi. ..................................................... Error! Bookmark not defined. 1.1.2. Tác dụng của các hợp chất glycoside tim ....... Error! Bookmark not defined. 1.1.3. Liên quan giữa cấu trúc và tác dụng ................ Error! Bookmark not defined. 1.1.4. Tính chất của glycoside tim................................ Error! Bookmark not defined. 1.1.5. Phân bố trong tự nhiên ......................................... Error! Bookmark not defined. 1.1.6. Một số loại thuốc chứa glycoside tim. ............. Error! Bookmark not defined. 1.2. Khái quát về digoxin và digitoxin .................. Error! Bookmark not defined. 1.2.1. Digoxin .................................................................... Error! Bookmark not defined. 1.2.2. Digitoxin .................................................................. Error! Bookmark not defined. 1.3. Các phƣơng pháp xác định glycoside tim ...... Error! Bookmark not defined. 1.3.1. Phƣơng pháp sắc kí xác định glycoside tim ... Error! Bookmark not defined. 1.3.2. Phƣơng pháp khác xác định glycoside tim ..... Error! Bookmark not defined. 1.3.3. Phƣơng pháp chiết tách các glycoside tim ra khỏi nền mẫu thựcError! Bookmark not 1.3.4. Phƣơng pháp định tính và định lƣợng. ............ Error! Bookmark not defined. CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM ................................ Error! Bookmark not defined. 2.1. Mục tiêu và đối tƣợng nghiên cứu ................ Error! Bookmark not defined. 2.1.1. Mục tiêu nghiên cứu ............................................. Error! Bookmark not defined. 2.1.2. Đối tƣợng nghiên cứu .......................................... Error! Bookmark not defined. 2.2. Chất chuẩn, hoá chất, thiết bị ......................... Error! Bookmark not defined. 2.2.1. Chất chuẩn............................................................... Error! Bookmark not defined. 2.2.2. Hoá chất ................................................................... Error! Bookmark not defined. 2.2.3. Thiết bị, dụng cụ .................................................... Error! Bookmark not defined. 2.3. Phƣơng pháp phân tích ................................... Error! Bookmark not defined. Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm 2.3.1. Phƣơng pháp xử lý mẫu....................................... Error! Bookmark not defined. 2.3.2. Phƣơng pháp phân tích. ....................................... Error! Bookmark not defined. 2.4. Thực nghiệm................................................... Error! Bookmark not defined. 2.4.1. Khảo sát điều kiện tối ƣu .................................... Error! Bookmark not defined. 2.4.2. Xây dựng đƣờng chuẩn........................................ Error! Bookmark not defined. 2.4.3. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng. .... Error! Bookmark not defined. 2.4.4. Đánh giá phƣơng pháp phân tích ..................... Error! Bookmark not defined. CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............ Error! Bookmark not defined. 3.1. Tối ƣu hoá các điều kiện chạy sắc ký............. Error! Bookmark not defined. 3.1.1. Van bơm mẫu ......................................................... Error! Bookmark not defined. 3.1.2. Cột tách .................................................................... Error! Bookmark not defined. 3.1.3. Detector .................................................................... Error! Bookmark not defined. 3.1.4. Bƣớc sóng hấp thụ cực đại của các glycoside timError! Bookmark not defined. 1.1.5. Khảo sát và chọn thành phần pha động và tốc độ dòng.Error! Bookmark not defined. 3.1.6. Khảo sát độ lặp lại của thiết bị .......................... Error! Bookmark not defined. 3.1.7. Điều kiện tối ƣu cho quá trình phân tích các glycoside timError! Bookmark not define 3.2. Đƣờng chuẩn các glycoside tim .................... Error! Bookmark not defined. 3.2.1. Khảo sát sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ chấtError! Bookmark not defined. 3.2.2. Dựng đƣờng chuẩn................................................. Error! Bookmark not defined. 3.2.3 . Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng ..... Error! Bookmark not defined. 3.3. Đánh giá phƣơng pháp phân tích .................. Error! Bookmark not defined. 3.3.1. Đánh giá độ lặp lại của phƣơng pháp phân tíchError! Bookmark not defined. 3.3.2. Đánh giá hiệu suất thu hồi của phƣơng pháp Error! Bookmark not defined. 3.4. Phân tích mẫu thực tế ..................................... Error! Bookmark not defined. KẾT LUẬN ............................................................... Error! Bookmark not defined. TÀI LIỆU THAM KHẢO ..........................................................................................3 Tiếng Việt:...................................................................................................................3 Tiếng Anh:...................................................................................................................3 Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 3.1: Phổ UV của 2 glycoside tim ..................... Error! Bookmark not defined. Hình 3.2: Sắc đồ tách các glycoside tim ở các tỉ lệ dung môi pha động khác nhau ................................................................................... Error! Bookmark not defined. Hình 3.3: Sắc đồ tách các glycoside tim ở các tốc độ dòng pha động khác nhau ................................................................................... Error! Bookmark not defined. Hình 3.4: sắc đồ của digoxin ở điều kiện tối ƣu. ...... Error! Bookmark not defined. Hình 3.5: Sắc đồ của digitoxin ở điều kiện tối ƣu. ... Error! Bookmark not defined. Hình 3.6: Sắc đồ tách các chất glycoside tim ở ở điều kiện tối ƣu.Error! Bookmark not defined. Hình 3.8: Đƣờng chuẩn của 02 glycoside tim nghiên cứu trong luận văn........ Error! Bookmark not defined. Hình 3.9: Sắc đồ của mẫu thực ................................. Error! Bookmark not defined. Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1: Tên gọi, công thức cấu tạo của một số glycoside tim [21] ............... Error! Bookmark not defined. Bảng 2.2: Nồng độ các dung dịch chuẩn glycoside tim .......... Error! Bookmark not defined. Bảng 3.1: Khảo sát tỉ lệ pha động của digoxin ......... Error! Bookmark not defined. Bảng 3.2: Khảo sát tốc độ pha động của digoxin...... Error! Bookmark not defined. Bảng 3.3: Khảo sát tỉ lệ pha động của digitoxin ....... Error! Bookmark not defined. Bảng 3.4: Khảo sát tốc độ pha động của digitoxin ... Error! Bookmark not defined. Bảng 3.5: Độ lặp lại thời gian lƣu của các Glycoside tim. ..... Error! Bookmark not defined. Bảng 3.6: Độ lặp lại diện tích píc của các Glycoside tim ....... Error! Bookmark not defined. Bảng 3.7: Các dung dịch đƣờng chuẩn ..................... Error! Bookmark not defined. Bảng 3.8: Diện tích pic trung bình thu đƣợc của các glycoside tim ................. Error! Bookmark not defined. Bảng 3.9: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của các Glycoside tim .. Error! Bookmark not defined. Bảng 3.10: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp ........ Error! Bookmark not defined. Bảng 3.12: Hiệu suất thu hồi của các glycoside tim . Error! Bookmark not defined. Bảng 3.13: Kết quả thu đƣợc của mẫu 1 ................... Error! Bookmark not defined. Bảng 3.14: Kết quả thu đƣợc của mẫu 2 ................... Error! Bookmark not defined. Bảng 3.15: Kết quả thu đƣợc của mẫu 3 ................... Error! Bookmark not defined. Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT ACN: Acetonitrin DD: dung dịch HPLC: High performance liquid chromatography LC-MS: liquid chromatography – spectrometry LOD: Limit of detection LOQ: Limit of quantity RP-HPLC: Reversed-phase performance liquid chromatography RSD: Relative standard deviation PDA: Photo-diode – array SD: Standard deviation UV: Ultraviolet UV- VIS: Ultraviolet visible Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm MỞ ĐẦU Ra đời từ rất sớm phƣơng pháp sắc kí lỏng – lỏng đƣợc phát triển mạnh vào cuối thế kỉ 20. Vào những năm 1970, sắc kí đƣợc phát triển mạnh và đã đạt đƣợc những thành tựu đáng kể nhƣ tách đƣợc các hỗn hợp các chất cực kì giống nhau nhƣ các nguyên tố đất hiếm, các ankaloid, các hydrocacbon trong các mẫu dầu. Ngày nay rất nhiều cải tiến đã đƣợc thực hiện để nâng cao độ nhạy của phƣơng pháp, nhƣ sử dụng pha tĩnh mới, detector có độ nhạy cao. HPLC (sắc kí lỏng hiệu năng cao) là một kỹ thuật không thể thiếu trong phân tích để quản lí một mảng các chất phân tích mà phƣơng pháp khác không thể đáp ứng đƣợc. Với việc áp dụng đƣợc cho nhiều loại đối tƣợng chất phân tích, từ không phân cực nhƣ: các chất thơm PAHs, các axit béo, các dƣợc phẩm (digoxin, gitoxin, diginatin,…), các mẫu sinh học trong phân tích lâm sàng (theobromine, theophilline,..) đến phân cực nhƣ: axit amin, phenol,…, phƣơng pháp RP – HPLC – UV ( RP – HPLC: sắc kí lỏng hấp phụ pha ngƣợc - Reversed-phase performance liquid chromatography) có độ nhạy tốt, độ chọn lọc cao và hiệu quả tách cao, pic cân đối. Thêm vào đó pha động thƣờng là hỗn hợp của nƣớc và các dung môi phân cực nên rẻ tiền, kinh tế. Đây là một phƣơng pháp rất thành công [6,7]. Glycoside tim là một nhóm chất bắt đầu đƣợc sử dụng trong y học bởi bác sĩ ngƣời Anh - Withering vào năm 1985, và hiện nay glycoside tim có một vị trí quan trọng trong thuốc điều trị bệnh tim. Trong số rất nhiều loại glycoside tim có trong tự nhiên thì digoxin và digitoxin đƣợc sử dụng rộng rãi nhất trong điều trị suy tim sung huyết, loạn nhịp tim và đƣợc nghiên cứu nhiều nhất hiện nay. Tuy nhiên các các chất glycoside tim thƣờng rất độc, nếu sử dụng quá hàm lƣợng cho phép dẫn đến ngộ độc, thậm chí dẫn tử vong cho con ngƣời [18]. Chính vì thế cần xác định chính xác hàm lƣợng của các glycoside tim trong các loại thuốc để đƣa vào điều trị đạt hiệu quả cao không sử dụng quá liều ảnh hƣởng tới sức khỏe ngƣời tiêu dùng đang rất đƣợc chú trọng. 1 Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm Yêu cầu đặt ra là phải có phƣơng pháp phù hợp định lƣợng các glycoside tim trong dƣợc liệu, dƣợc phẩm một cách nhanh chóng và chính xác nhất. Việc ứng dụng phân tích HPLC vào phân tích thuốc và dƣợc phẩm đã đƣợc làm nhiều trên thế giới nhƣng ở Việt Nam vẫn còn tƣơng đối mới mẻ và chƣa có nhiều công trình về lĩnh vực này. Chính vì lí do trên chúng tôi xin lựa chọn và thực hiện đề tài “Nghiên cứu phương pháp định lượng một số glycoside tim trong dược phẩm và dược liệu”. Trong đề tài này tôi sử dụng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ghép nối detector PDA để định lƣợng một số glycoside tim trong dƣợc phẩm và dƣợc liệu. 2 Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: 1. Bộ y tế (2010), Dược điển Việt Nam, NXB y học, Hà Nội. 2. Bộ y tế (2012), Dược thư quốc gia Việt Nam, NXB y học, Hà Nội. 3. Phạm Luận (2000), Cơ sở lý thuyết sắc ký lỏng hiệu năng cao, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội. 4. Lê Đức Ngọc (2011), Bài giảng nhập môn xử lý số liệu và kế hoạch hoá thực nghiệm, Hà Nội. 5. Nguyễn Đình Thành (2011), Cơ sở các phƣơng pháp phổ ứng dụng trong hóa học, NXB khoa học và kỹ thuật, Hà Nội. 6. Nguyễn Văn Ri (2006), Chuyên đề các phương pháp tách chất, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội. 7. Nguyễn Văn Ri (2013), Các phương pháp tách, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG Hà Nội, Hà Nội. 8. Tạ Thị Thảo (2006), Bài giảng thống kê trong hoá phân tích, Trƣờng Đại học Khoa học Tự Nhiên, Hà Nội. 9. Ngô Văn Thu (2004), Bài giảng dược liệu tập 1, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, Hà Nội. Tiếng Anh: 10. A. Jedlicka, T. Grafnetterova´, V. Miller (2003), “HPLC method with UV detection for evaluation of digoxin tablet dissolution in acidic medium after solid-phase extraction”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,33, pp. 109 – 115. 11. Belachew Desta, E. Kwong and K. M. Mcerlane (1981), “ Sepration of digoxin, digitoxin and their potential metabolites, impurities or 3 Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm degradation products by High – performance liquid choramatography”, Journal of Chromatography, 240, pp. 137-143. 12. Federica Pellati, Renato Bruni, Maria Grazia Bellardi, Assunta Bertaccini, Stefania Benvenuti (2009), “Optimization and validation of a high- performance liquid chromatography method for the analysis of cardiac glycosides in Digitalis lanata”, Journal of Chromatography A, 1216, pp. 3260–3269. 13. Ferenc Orosz, Mimi Nuridsa’ny and Judid Ova’di (1986), “Isolation and Quantitative Determination of Some Cardioactive Glycosides from Digitalis lanata by High-Performance Liquid Chromatography”, Analytical biochemistry, 156, pp. 171 – 175. 14. F. Erni and R W. Frei (1976), “A Comoarision of reversed – phase and partiion High performance liquid chromatography of some digitalis glycoside”, Journal of Chromarography, 130 , pp. 169-180. 15. Kevin L. Kelly, Bruce A. Kimball, John J. Johnston (1995), Quantitation of digitoxin, digoxin, and their metabolites by high-performance liquid chromatography using pulsed amperometric detection”, Journal of Chromatography A, 711, pp. 289-295. 16. L.K. Hearn, P.P. Subedi (2009), “ Determining levels of steviol glycosides in the leaves of Stevia rebaudiana by near infrared reflectance spectroscopy”, Journal of Food Composition and Analysis, 22, pp. 165–168. 17. Ralf Dieter Josephs, Adeline Daireaux, Steven Westwood, Robert Ian Wielgosz (2010), “Simultaneous determination of various cardiac glycosides by liquid chromatography -hybrid mass spectrometry for the purity assessment of the therapeutic monitored drug digoxin”, Journal of Chromatography A, 1217, pp. 4535–4543. 18. Santosh J. Vetticaden (1990), “ Review Chromatography of cardiac glycosides”, Journal of Chromatography,531, pp. 215 - 234. 4 Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm 19. Sarah Kohls, Barbara M. Scholz-Bottcher, Jorg Teske, Patrick Zark, Jurgen Rullkotter (2012), “Cardiac glycosides from Yellow Oleander (Thevetia peruviana) seed”, Phytochemistry, 75, pp. 114-127. 20. V. Ya. Davydov, M. Elizalde Gonzalez and A. V. Kiselev (1981), “ High performance liquid choramatography of cardiac glycosides”, Journal of Chromatography, 204, pp. 293 – 301. 21. V. Ya. Davydov, M. Elizalde Gonzalez and A. V. Kiselev (1982), “Correlation between the retention of cardiac glicosides in reversed – phase High – performance liquid choramatography with a diphenylsil stationary phase, the strucure of their molecules and their biological activitty”, Journal of Chromatography,248, pp. 49 -62. 22. Youichi Fujii, Hitoml Fukuda, Yumko Saito and Mitsuru Yamazaki (1980), “Separation of digitalis glycosides by micro high-performance liquid chromatography”, Journal of Chromatography, 202 , pp. 139- 143. 23. Youichi Fujii, Hitoml Fukuda, Yumko Saito and Mitsuru Yamazaki (1989), “High – performance liquid choramatography determination of secondary cardiac glycosides in digitalis purpurea leaves”, Journal of Chromatography, 419, pp. 319-325. 24. Youichi Fujii, Yukari và Mitsuru Yamazaki (1988), “Micro High – performance liquid choramatographic determination of cardiac glycosides in -methydioxin and digoxin tablets”, Journal of Chromatography, 448, pp. 157-l64. 25. Zozan B. Todorovic’, Miodrag L. Lazic’, Vlada B. Veljkovic’ (2009), “Validation of an HPLC–UV method for the determination of digoxin residues on the surface of manufacturing equipment”, Joural of Serbian Chemical Societyl, 74 (10), pp. 1143–1153. 5