Tài liệu Nghiên cứu phương pháp bảo quản hỗn hợp caroten protein tận thu từ quá trình sản xuất chitin

iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN...................................................................................................... 1 LỜI CẢM ƠN .......................................................................................................... ii MỤC LỤC............................................................................................................... iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ................................................................................. v DANH MỤC CÁC BẢNG .......................................................................................vi DANH MỤC CÁC HÌNH ...................................................................................... vii LỜI MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN VỀ ĐỀ TÀI ................................................................. 3 1.1. Tổng quan về caroten-protein ......................................................................... 3 1.1.1. Sự tồn tại và bản chất của caroten-ptrotein ............................................... 3 1.1.2. Tính chất của caroten-protein ................................................................... 3 1.1.3. Ứng dụng của caroten-protein................................................................... 4 1.2. Tìm hiểu về astaxanthin .................................................................................. 5 1.2.1. Bản chất của astaxanthin........................................................................... 5 1.2.2. Một số tính chất hóa, lý của astaxanthin ................................................... 7 1.2.3. Ứng dụng của astaxanthin......................................................................... 9 1.3. Các yếu tố ảnh hưởng và sự biến đổi của astaxanthin trong quá trình chế biến, bảo quản ............................................................................................................... 10 1.4. Một số nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến đề tài ........................ 12 1.4.1. Nghiên cứu trong nước ........................................................................... 12 1.4.2. Nghiên cứu ở ngoài nước ........................................................................ 12 1.5. Các phương pháp thu nhận và bảo quản hỗn hợp caroten-protein giàu astaxanthin ........................................................................................................... 13 1.5.1. Các phương pháp thu nhận hỗn hợp caroten-protein .............................. 13 1.5.1.1. Phương pháp lên men ....................................................................... 13 1.5.1.2. Phương pháp xử lí hóa chất, kết hợp với enzyme ............................. 15 1.5.2. Phương pháp bảo quản hỗn hợp caroten-protein ..................................... 17 1.5.2.1. Phương pháp cô đặc ......................................................................... 17 iv 1.5.2.2. Phương pháp bao gói ........................................................................ 20 1.5.2.3. Phương pháp sử dụng phụ gia bảo quản ........................................... 22 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................ 26 2.1. Đối tượng nghiên cứu.................................................................................... 26 2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................... 26 2.2.1. Sơ đồ bí trí thí nghiệm ............................................................................ 26 2.2.2. Hóa chất và các phương pháp phân tích.................................................. 28 2.2.3. Phương pháp xử lí số liệu ....................................................................... 28 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ, THẢO LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................... 29 3.1. Thành phần hóa học cơ bản của hỗn hợp caroten-protein ............................. 29 3.2. Ảnh hưởng của thời gian, nồng độ acid ascorbic, bao bì bao gói đến chất lượng hỗn hợp caroten-protein ............................................................................. 30 3.2.1. Ảnh hưởng của thời gian, nồng độ acid ascorbic, bao bì bao gói đến hàm lượng astaxanthin.............................................................................................. 31 3.3.2. Ảnh hưởng của thời gian, nồng độ acid ascorbic, bao bì bao gói đến chỉ số tổng nitơ bazơ bay hơi (TVB-N) .................................................................. 36 3.2.3. Ảnh hưởng của thời gian, nồng độ acid ascorbic, bao bì bao gói đến hàm lượng lipid ........................................................................................................ 39 3.3. Đề xuất phương pháp bảo quản và đánh giá chất lượng hỗn hợp carotenprotein tận thu từ quá trình sản xuất chitin sau thời gian bảo quản ...................... 41 3.3.1. Phương pháp đề xuất .............................................................................. 41 3.3.2. Đánh giá chất lượng hỗn hợp caroten-protein sau 4 tuần bảo quản trong bao bì HDPE ..................................................................................................... 42 3.3.2.1. Mẫu caroten-protein thủy phân bằng acid......................................... 42 3.3.2.2. Mẫu caroten-protein thủy phân bằng enzyme ................................... 42 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................. 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 44 PHỤ LỤC ................................................................................................................ 51 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt HDPE Nội dung Hight Density Poli Etilen (nhựa HDPE) PP Poly Propylen (nhựa PP) TVB-N Total volatile basic nitrogen vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Các ứng dụng chính của hỗn hợp protein và carotenoid ............................ 4 Bảng 1.2. Quan hệ giữa độ chân không và nhiệt độ sôi của nước ........................... 19 Bảng 3.1. Thành phần hóa học của hỗn hợp bột nhão caroten-protein .................... 29 vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cấu tạo của astaxanthin. ............................................................................ 5 Hình 1.4. Astacene. ................................................................................................... 8 Hình 1.5. Crustaxanthin............................................................................................. 9 Hình 1.6. Sự thay đổi của astaxanthin khi tương tác với acid yếu. .......................... 11 Hình 1.7. Vị trí tồn tại của astaxanthin trong hỗn hợp caroten-protein. ................... 23 Hình 1.8. Công thức cấu tạo của acid ascorbic. ....................................................... 24 Hình 1.9. Khử các gốc tự do bởi acid ascorbic. ....................................................... 25 Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ phối trộn acid ascorbic kết hợp bao bì bao gói hỗn hợp caroten-protein. ......................................................................... 27 Hình 3.1. Ảnh hưởng của thời gian, nồng độ acid ascorbic, bao bì bao gói đến hàm lượng astaxanthin trong hỗn hợp caroten-protein. ................................................... 32 Hình 3.2. Ảnh hưởng của thời gian, nồng độ acid ascorbic, bao bì bao gói đến chỉ số TVB-N trong hỗn hợp caroten-protein. ................................................................... 37 Hình 3.3. Ảnh hưởng của thời gian, nồng độ acid ascorbic, bao bì bao gói đến hàm lượng lipid trong hỗn hợp caroten-protein. .............................................................. 39 Hình 3.4. Đề xuất phương pháp bảo quản hỗn hợp caroten-protein. ....................... 41 1 LỜI MỞ ĐẦU Astaxanthin là một chất chống oxi hóa, ngăn ngừa một số bệnh ung thư, chống lại tác hại của tia tử ngoại đồng thời có hoạt tính của một tiền vitamin, Astaxanthin còn tạo nên màu sắc đặc trưng ở một số loài thủy sản như tôm, cua [34]. Sự hiện diện của gốc hydroxyl (OH) và gốc xeton (C = O) cùng với hệ thống liên kết đôi liên hợp trong cấu trúc phân tử giải thích vì sao astaxanthin có hoạt tính chống oxy hóa cao [39] được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực y học, thực phẩm, nuôi trồng thủy sản, mỹ phẩm [27, 30]. Vì vậy, trong những năm gần đây astaxanthin được nghiên cứu rất nhiều, đặc biệt trong việc việc thu hồi bột đạm thủy phân giàu astaxanthin từ phế liệu đầu tôm, là một sản phẩm có giá trị kinh tế cao. Ở Việt Nam, với nguồn lợi thủy sản dồi dào thì việc khai thác, chế biến, xuất khẩu các mặt hàng thủy sản được nâng cao và không ngừng phát triển. Theo tổng cục thống kê, ước tính phế liệu tôm khoảng hơn 200.000 tấn/năm, trong đó có khoảng 120.000 tấn đầu tôm [7]. Đây là nguồn nguyên liệu dồi dào cho sản xuất chitin, hỗn hợp caroten-protein. Hỗn hợp này sẽ có ý nghĩa để bổ sung vào làm thức ăn gia súc, nuôi trồng thủy sản, làm tăng màu sắc cho cá hồi, các loài giáp xác, tăng hệ miễn dịch cho vật nuôi. Quá trình tách chiết hỗn hợp đầu tôm đòi hỏi phải có phương pháp tối ưu để ngoài đạt được năng xuất cao còn phải quan tâm đến chất lượng hỗn hợp carotenprotein là tốt nhất. Nhưng với tính chất dễ bị biến đổi trong quá trình chế biến, bảo quản như bị ảnh hưởng bởi oxi không khí, ánh sáng, nhiệt độ,.... làm nhạt màu astaxanthin, mất đi các đặc tính quan trọng vốn có của astaxanthin thì việc nghiên cứu để chọn ra phương pháp và điều kiện bảo quản nhằm mang lại giá trị cao nhất cho sản phẩm chứa astaxanthin là vấn đề cần thiết. Cũng có nhiều nghiên cứu liên quan đến phương pháp bảo quản hỗn hợp caroten-protein trong quá trình bảo quản ở các điều kiện khác nhau như sử dụng màng chitosan để bao bọc caroten-protein ở dạng viên, sử dụng phương pháp bao gói hút chân không để hạn chế quá trình oxi hóa do oxi gây ra, bảo quản ở điều kiện nhiệt độ thấp, bảo quản trong bống tối [1, 11, 15, 17, 34] nhưng ở mỗi phương pháp bảo quản trên còn tồn tại một vài khuyết điểm như: 2 phải mất chi phí cao trong việc bao gói hút chân không, tạo màng chitosan chỉ ứng dụng ở dạng viên, tốn chi phí trong việc xây dựng hệ thống lạnh, buồng tối để bảo quản hỗn hợp caroten-protein không thuận lợi cho việc phân phối, vận chuyển. Do vậy, việc thực hiện đề tài “Nghiên cứu phương pháp bảo quản hỗn hợp carotenprotein tận thu từ quá trình sản xuất chitin” là cấp thiết. Mục tiêu nghiên cứu: Nghiên cứu bổ sung acid ascorbic vào hỗn hợp caroten protein kết hợp với sử dụng loại bao bì bao gói để hạn chế sự hư hỏng hỗn hợp carotenprotein trong quá trình bảo quản. Nội dung nghiên cứu: 1. Xác định thành phần hóa học cơ bản của hỗn hợp caroten- protein. 2. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian và các điều kiện bảo quản (nồng độ acid ascorbic bổ sung vào hỗn hợp caroten- protein kết hợp sử dụng bao bì PP hay bao bì HDPE) đến chất lượng hỗn hợp caroten-protein (hàm lượng astaxanthin, chỉ số TVB-N, hàm lượng lipid). 3. Đề xuất phương pháp bảo quản và đánh giá chất lượng hỗn hợp carotenprotein tận thu từ quá trình sản xuất chitin. Ý nghĩa khoa học: Bảo quản được hỗn hợp caroten-protein tránh được sự hư hỏng của astaxanthin-là một hoạt chất sinh học quan trọng và giảm hư hỏng chất lượng của hỗn hợp caroten-protein gồm lipid, chỉ số TVB-N. Ý nghĩa thực tiễn: Sự thành công của đề tài dưới quy mô phòng thí nghiệm sẽ tạo nên bước phát triển mới cho việc sản xuất quy mô công nghiệp hỗn hợp carotenprotein chứa astaxanthin, tận thu tối đa nguồn phế liệu từ sản xuất mặt hàng tôm thẻ chân trắng, hạn chế ô nhiễm môi trường và mang lại hiệu quả kinh tế cao đối với việc tách chiết được hầu hết lượng astaxanthin có trong hỗn hợp caroten- protein. 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN VỀ ĐỀ TÀI 1.1. Tổng quan về caroten-protein 1.1.1. Sự tồn tại và bản chất của caroten-ptrotein Trong lớp vỏ động vật giáp xác (tôm, cua, ghẹ), protein liên kết với carotenoid (astaxanthin) để hình thành nên phức caroten-protein hay carotenoprotein [5]. Phức caroten-protein có vai trò rất quan trọng và là một trong những đặc điểm sinh lí của một số loài sinh vật sống. Ngoài ra, sự phân bố của caroten-protein trong tự nhiên cũng khá đa dạng. Ở thực vật, carotenoid thường định vị trên một số lượng lớn các grama của lục lạp và chúng thường tồn tại ở dạng carotenoprotein. Động vật không xương sống ở biển như da gai, động vật thân mềm nhìn chung là các nhóm sinh vật chứa nhiều carotenoprotein trong cơ thể. Carotenoid ở dạng tự do thường có màu vàng, cam hoặc đỏ. Tuy nhiên, trong cơ thể của loài động vật biển không xương sống, các phức hợp carotenoid tồn tại ở nhiều màu sắc khác nhau như lá cây, xanh dương và tía. Một ví d ụ điển hình là phức hợp astaxanthin-protein trong vỏ tôm hùm có màu xanh dương được tạo ra do quá trình biến tính phức hợp astaxanthin-protein bởi nhiệt. 1.1.2. Tính chất của caroten-protein Caroten-protein là phức hợp của carotenoid và protein. Tuy nhiên, đối với đối tượng loài giáp xác thì thành phần carotenoid này chủ yếu là astaxanthin. Carotenoid được cho là nằm sâu trong phức hợp, bị cách li gần như hoàn toàn với môi trường nước, với nhóm 4 và 4' -keto của nó được định vị gần bề mặt phân tử protein. Phức hợp carotenoprotein hòa tan trong nước và có tính bền vững, trong một số trường hợp, màu sắc của nó bền đến vài năm trong không khí ở nhiệt độ phòng. Ngoài ra sự tương tác giữa astaxanthin và protein dẫn đến sự thay đổi lớn về bước sóng của bức xạ hấp thụ cực đại từ đó dẫn đến sự thay đổi về màu sắc của nó. Chẳng hạn trong cơ thể động vật giáp xác, astaxanthin thường liên kết với các phân tử protein tạo thành phức hợp α-crustacyanin hấp thụ cực đại bức xạ ở bước sóng 628nm tạo 4 nên màu xanh đen đặc trưng thường thấy ở các loài thủy sản sống. Dưới tác dụng của nhiệt độ liên kết trên bị phá hủy và giải phóng astaxanthin màu đỏ cam. 1.1.3. Ứng dụng của caroten-protein Chế phẩm caroten-protein ngày càng được sử dụng phổ biến trong thực phẩm, đặc biệt sử dụng trong chế biến thực phẩm chức năng, vì ngoài tính dinh dưỡng do protein mang lại thì nó còn có tính chức năng của carotenoid và protein mạch ngắn (peptide) mang lại như tính chống oxi hóa, bên cạnh đó các acid amin còn góp phần tạo màu và mùi trong công nghệ chế biến thực phẩm [30]. Ngoài ra, carotenoprotein còn được ứng dụng trong ngành y dược và mỹ phẩm. Một số ứng dụng chính của hỗn hợp carotenoprotein được trình bày ở Bảng 1.1. Bảng 1.1. Các ứng dụng chính của hỗn hợp protein và carotenoid [27, 30] Lĩnh vực Công nghệ thực phẩm Tính chất Chất tạo mùi, chất tạo màu, thực phẩm chức năng. Nuôi trồng thủy sản Tạo màu cho cá, tăng hệ miễn dịch, giảm stress cho vật nuôi. Y dược Điều trị ung thư, tiểu đường, tăng cường hệ miễn dịch, chống viêm. Mỹ phẩm Hạn chế và giảm nếp nhăn, chống lão hóa Với hàm lượng astaxanthin cao trong chế phẩm người ta sử dụng làm thức ăn cho đối tượng nuôi trồng thủy sản. Trong kỹ thuật nuôi cá hồi: chất lượng của cá hồi không chỉ được đánh giá qua hàm lượng protein, lipid, axit amin mà còn được đánh giá qua chất lượng màu sắc cơ thịt của chúng. Trong khi đó, cá hồi nuôi không đáp ứng được các chỉ tiêu chất lượng về màu sắc của chúng và yêu cầu của khách hàng, vì vậy việc bổ sung astaxanthin vào thức ăn cho cá hồi là điều cần thiết để tăng màu sắc hồng cho cơ thịt cá hồi [23]. Trong bột đầu tôm có hàm lượng đạm cao 60% và có khả năng làm tăng hàm lượng astaxanthin trong da và cơ cá hồi [3]. 5 Trong nuôi cá cảnh, thức ăn có hàm lượng astaxanthin cao sẽ góp phần tạo màu sắc cho cá. Nếu cho cá ăn thích hợp thì cá sẽ sinh trưởng và phát triển tốt, màu sắc đẹp. 1.2. Tìm hiểu về astaxanthin 1.2.1. Bản chất của astaxanthin Trong các loài giáp xác thủy sản, astaxanthin chủ yếu tập trung ở phần vỏ ngoài (chiếm 58-87% tổng hàm lượng carotenoid). Astaxanthin thường tồn tại ở dạng tự do, dạng mono- hay di-este với các axit béo không no mạch dài hoặc dưới dạng phức của carotenoprotein của đồng phân quang học. Hàm lượng astaxanthin của tôm, cua thay đổi đáng kể tùy theo loài (từ 10-140mg/kg trọng lượng ướt hoặc khoảng 50700mg/kg trọng lượng khô) [3]. Như vậy vỏ tôm, cua được coi là một nguồn astaxanthin tự nhiên đáng kể. Astaxanthin là một carotenoid, thuộc nhóm phycochemical tecpen, là chất sắc tố màu vàng đỏ. Giống như nhiều carotenoid, astaxanthin là một chất màu hòa tan trong mỡ hoặc dầu. Astaxanthin là một dẫn xuất của caroten và có tên gọi: 3, 3'- diydroxy-4, 4'diketo của β, β' caroten có công thức phân tử C40H52O4 (M=596) và có công thức cấu tạo sau: Hình 1.1. Cấu tạo của astaxanthin [18]. Astaxanthin có thể được tìm thấy trong vi tảo, men bia, cá hồi, cá, nhuyễn thể, giáp xác như tôm, cua và lông của một số loài chim. Astaxanthin có khả năng chống oxi hóa cao hơn β-carotene 40 lần, cao hơn tocopherol 100 lần [34]. Hai tác nhân oxi hóa mà astaxanthin có tác dụng mạnh nhất về mặt chống oxi hóa là các gốc tự do và lipid peroxy [25]. 6 Hình 1.2. Một số cấu trúc dạng đồng phân của astaxanthin [26]. 7 Hình 1.3.Các liên kết hóa học có thể có của astaxanthin với các phân tử khác trong tôm [18]. 1.2.2. Một số tính chất hóa, lý của astaxanthin Tính chất vật lý Sự hấp thụ ánh sáng và màu sắc của astaxanthin: Astaxanthin hấp thụ rất mạnh bức xạ trong vùng λ=470-510nm (cực đại hấp thụ tùy theo dung môi sử dụng với hệ số tắt phân tử Ԑmaxkhoảng = 105), tạo nên màu đỏ cam rất đẹp. Dưới tác dụng nhiệt liên kết trên bị phá hủy và giải phóng trở lại astaxanthin tự do màu đỏ cam. Astaxanthin bị oxi hóa dưới tác dụng của ánh sáng, nhiệt độ, oxi không khí, chất oxi hóa, môi trường acid…và mức độ ảnh hưởng đến tính chất của astaxanthin còn tùy thuộc vào vật liệu bao bì, thời gian lưu trữ trong quá trình bảo quản [15, 46, 50]. Tính tan: Astaxanthin là hợp chất ít phân cực nên kém tan trong nước, dễ tan trong các dung môi hữu cơ, có độ phân cực thấp hay trung bình như pyridin, diclorometan, clorofofm, acetone, metanol, etyl acetate, etanol, dietyl ether, hexan, ether dầu mỏ, isopropanol... Tính chất hóa học Do phân tử chứa chuỗi polyene với nhóm keto, hydroxyl gắn với vòng đầu mạch, cùng với hệ thống liên kết nối đôi liên tục trong mạch nên astaxanthin rất nhạy cảm với các tác nhân chất oxi hóa, axit, bazo,…[25] Sự oxi hóa: Astaxanthin dạng tự do rất dễ bị oxi hóa bởi các tác nhân electrophin như oxi phân tử hay các gốc tự do (như gốc hydroxyl, gốc peroxyde) nhưng khi tạo phức với protein hay dạng ete hóa thì bền vững hơn. 8 Hoạt tính chống oxi hóa của astaxanthin (kí hiệu là ast) trong cơ thể được giải thích bởi khả năng bắt giữ các gốc tự do (ví dụ với gốc peroxyde) tạo thành gốc cacbon trung tâm bền vững nhờ hiệu ứng cộng hưởng ROO + Ast RCOO-Ast Phản ứng oxi xảy ra càng nhanh khi astaxanthin tiếp xúc nhiệt độ cao, oxi và ánh sáng [31]. Phản ứng với acid: Astaxanthin phản ứng với các axit yếu đạt đến trạng thái cân bằng thuận nghịch, tạo ra một phức của các dạng cấu trúc (II) và (III), gây ra sự dịch chuyển cực đại của nó về phía sóng dài, khi trung hòa bằng bazơ yếu như dioxan cấu trúc phân tử astaxanthin ban đầu lại được phục hồi. Tuy nhiên, khi phản ứng các axit mạnh (như HCl, H2SO4,..) có thể sự phân hủy chuỗi polyene của astaxanthin, làm nhạt màu đỏ cam. Phản ứng bazơ: Trong môi trường kiềm, khi có mặt không khí thì astaxanthin bị oxi hóa nhanh chóng thành astacene có màu đỏ sẫm. Hình 1.4. Astacene. Phản ứng với khử: Khi xử lí bằng tác nhân khử NaBH4/EtOH, các nhóm keto trong phân tử astaxanthin sẽ chuyển thành nhóm hydroxyl, tạo thành crusraxanthin, làm chuyển dịch cực đại hấp thụ của astaxanthin khoảng 20-30nm về phía sóng ngắn [3]. 9 Hình 1.5. Crustaxanthin. 1.2.3. Ứng dụng của astaxanthin Cùng với sự xuất hiện và phát triển nhiều công trình nghiên cứu khẳng định ứng dụng rộng rãi, mạnh mẽ của astaxanthin đối với con người, động vật. Trong ngành thực phẩm và dinh dưỡng, astaxanthin được quan tâm nhiều vì được xem như là chất màu tự nhiên (thành phần hoặc là phụ gia) có vai trò quan trọng trong quá trình oxi hóa chất béo tạo nên màu sắc hương vị cho từng loại thực phẩm. Astaxanthin có thể được bổ sung vào bơ thực vật, nước sốt bơ, mì ống, salad trộn, salad dầu, phomat, kem, sữa chua, sản phẩm thịt và cá, gelatin và món tráng miệng. Chức năng sinh học mới bao gồm kích hoạt gen mã hóa để sản xuất protein và điều chế hoạt động của enzyme lipoxygenases. Astaxanthin cũng được xem là một chất màu thực phẩm. Một lượng rất nhỏ astaxanthin có thể làm tăng màu sắc cho cá hồi khi được phối trộn một cách phù hợp. Astaxanthin được sử dụng rộng rãi cho cá do khả năng tạo màu sắc, tăng tốc thành thục sinh dục, tăng khả năng thụ tinh và khả năng sống sót, phát triển của phôi. Một nghiên cứu về ảnh hưởng của astaxanthin về sự sống còn và tăng trưởng của cá hồi Đại Tây Dương cho thấy rằng khi không bổ sung astaxanthin vào thưc ăn cho cá thì chỉ có 17% con cá nhỏ sống sót đến khi trưởng thành. Khi tăng số lượng astaxanthin trong chế độ ăn uống cho cá từ 0,4ppm, đến 1ppm và cuối cùng lên đến 13,7ppm mà tỷ lệ phần trăm sống sót tăng lên từ 17% đến 87%. Và khi đạt đến mức tối đa được sử dụng trong nghiên cứu này 13,7ppm, tỷ lệ sống tăng lên đến 98% [24]. Astaxanthin làm tăng khả năng sống sót cho cá con, khả năng phát triển của cá tăng lên nhiều, giúp nâng cao chất lượng của trứng, cải thiện khả năng miễn dịch 10 bệnh của cá, astaxanthin giảm tỷ lệ đục thủy tinh thể trong cá hồi (Waggbo và cộng sự, 2003) [52]. Astaxanthin có thể lưu trong cơ bắp, da nhờ được hấp thụ tốt trong đường tiêu hóa (Torrisen và cộng sự, 1989) [49], vì vậy thịt cá hồi và vỏ giáp xác có màu đỏ hồng. Màu hồng này là một thuộc tính cảm quan có liên quan đến chất lượng và giá trị của sản phẩm. Bên cạnh việc tạo màu sắc, astaxanthin còn bảo quản chất béo của cá hồi tránh sự oxi hóa trong suốt quá trình bảo quản đông. Bổ sung astaxanthin vào trong thức ăn chăn nuôi để điều trị các bệnh về cơ bắp hay tăng khả năng phát triển của vật nuôi (Lignell và cộng sự, 2001) [36]. Chế độ ăn có astaxanthin làm tăng khả năng sinh sản, cải thiện tình trạng sức khỏe tổng thể của các loài động vật, giảm tỷ lệ tử vong gà sau khi nở, màu vàng của lòng đỏ cũng tăng lên, trong khi việc giảm salmonella giảm đáng để (Lignell và cộng sự, 1998; Lignell và Inborr, 2000) [37], [35]. Astaxanthin cũng tạo màu sắc tốt hơn cho cơ thịt gà, một thuộc tính mong muốn cho một số người tiêu dùng (Akiba và cộng sự, 2001) [13]. 1.3. Các yếu tố ảnh hưởng và sự biến đổi của astaxanthin trong quá trình chế biến, bảo quản Các hợp chất caroten thuộc nhóm chất chống oxi hóa có khả năng loại gốc tự do. Khả năng chống oxi hóa của caroten dựa trên khả năng liên kết với oxi nguyên tử và gốc peroxid bằng cách tạo ra sản phẩm giữa β-caroten và gốc peroxid [22, 44]. Dưới một số điều kiện, caroten hoạt động như một chất tiền oxi hóa, dưới những điều kiện khác lại hoạt động như một chất chống oxi hóa, có chức năng như một chất chống oxi hóa chuỗi ngăn ngừa sự lan truyền của các phản ứng gốc tự do. Vì vậy, caroten mà đặc biệt là astaxanthin rất dễ bị biến đổi trong quá trình chế biến và bảo quản vì astaxanthin rất nhạy cảm với oxy, ánh sáng và nhiệt độ. Trong tôm nguyên liệu, astaxanthin được tìm thấy ở 3 dạng chính: astaxanthin tạo phức với protein (caroten-protein), astaxanthin liên kết với lipid, protein và astaxanthin tự do [49]. Astaxanthin ở dạng tự do dễ bị oxi hóa nhất. Phân tử của astaxanthin có nhiều nối đôi nên kém bền dễ tạo liên kết với các chất khác như hydro, gốc tự do, peroxid,... làm mất đi hoạt tính vốn có của nó. 11 Nhiệt độ: nhiệt độ càng cao thì càng làm oxi hóa astaxanthin dẫn đến làm giảm hoạt tính vốn có của nó, khi bảo quản ở nhiệt độ thấp thì quá trình oxi hóa astaxanthin giảm, hoạt tính vốn có của nó được đảm bảo. Màu đỏ của astaxanthin là do sự liên kết đôi liên hợp tại trung tâm của hợp chất [14]. Nhiệt độ cao làm cho các lien kết đôi này bị cắt đứt dẫn đến làm nhạt màu astaxanthin. Ánh sáng: ánh sáng là tác nhân gây oxi hóa astaxanthin nên khi bảo quản cần tránh ánh sáng tiếp xúc với hỗn hợp caroten-protein. Ánh sáng mang theo năng lượng làm phá vỡ cấu trúc hệ thống các nối đôi của astaxanthin. Ánh sáng làm thay đổi đồng phân quang học của astaxanthin chuyển từ dạng trans thành dạng cis, mà ở dạng cis khả năng hoạt động của astaxanthin thấp hơn dạng trans [28]. Oxi nguyên tử: oxi là yếu tố có ảnh hưởng lớn đến quá trình oxi hóa lipid, làm sản sinh ra các gốc tự do, peroxyde,.., bản thân là một chất chống oxi hóa, astaxanthin sẽ quyên góp các electron và phản ứng với các gốc tự do để chuyển đổi chúng thành các chất ổn định hơn, chấm dứt phản ứng dây chuyền của của các gốc tự do [26]. Vì vậy khi có mặt oxi sẽ làm suy giảm hàm lượng astaxanthin, đặc biệt là khi có thêm ánh sáng và nhiệt độ. Vì vậy khi bảo quản nên bao gói hút chân không hoặc rót đầy sản phẩm. Acid: acid được sử dụng trong quá trình thu nhận hỗn hợp caroten-protein sẽ ảnh hưởng đến hoạt tính của astaxanthin bằng cách tạo liên kết với nó, nên sử dụng acid ở nồng độ thấp để hạn chế sự suy giảm chất lượng của astaxanthin. Hình 1.6. Sự thay đổi của astaxanthin khi tương tác với acid yếu. Theo Armenta, E. R. và Legarreta, G. I. (2009), không khí và ánh sáng là hai yếu tố ảnh hưởng lớn đến quá trình oxi hóa của astaxanthin. 62% astaxanthin bị oxi 12 hóa khi tiếp xúc với không khí ở 8 tuần bảo quản, 35% astaxanthin bị oxi hóa khi tiếp xúc với ánh sáng trong 8 tuần bảo quản và có 97% astaxanthin bị oxi hóa khi tiếp xúc cả không khí và ánh sáng trong 8 tuần bảo quản [17]. 1.4. Một số nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến đề tài 1.4.1. Nghiên cứu trong nước Các nghiên cứu trong nước chủ yếu tập trung vào việc thu hồi caroten-protein có hàm lượng astaxanthin cao cùng với ứng dụng của hỗn hợp caroten-protein trong thực phẩm, nghiên cứu bảo quản hỗn hợp caroten-protein sau thu hồi. Phạm Thị Đan Phượng (2012) đã nghiên cứu thu nhận bột đạm carotenoid từ đầu tôm thẻ chân trắng bằng phương pháp xử lí kết hợp hai enzyme protease. Bột đạm được tiến hành sấy chân không ở nhiệt độ 500C và bổ sung dextrin, kết quả cho thấy bổ sung dextrin ở tỷ lệ 6% thì tỷ lệ tổn thất astaxanthin trong quá trình sấy là thấp nhất [6]. Lê Thị Thu Thủy (2015) đã nghiên cứu bổ sung chitosan vào hỗn hợp caroten-protein để hạn chế sự hư hỏng astaxanthin trong quá trình sấy kết quả cho thấy bổ sung chitosan ở nồng độ chitosan 125 ppm cho tỷ lệ tổn thất astxanthin là thấp nhất sau 8 tuần bảo quản [9]. Hoàng Thị Huệ An (2005) đã nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện bảo quản đến sự suy giảm hàm lượng astaxanthin trong phế liệu đầu tôm [1]. 1.4.2. Nghiên cứu ở ngoài nước Armenta, E. R. and Legarreta, G. I. (2009) đã nghiên cứu bảo quản astaxanthin ở các điều kiện khác nhau (ánh sáng, nhiệt độ và chân không) [17]. Kết quả cho thấy bảo quản astaxanthin ở điều kiện bao gói hút chân không, bảo quản trong bóng tối, nhiệt độ bảo quản 250C thì chỉ có 1% astaxanthin bị oxi hóa sau 8 tuần bảo quản. Anarjajn và cộng sự (2013) đã nghiên cứu sử dụng kết hợp hai chất chống oxi hóa là acid ascorbic và α-tocopherol để chống sự oxi hóa astaxanthin bằng phương pháp bề mặt đáp ứng Response Surface Method (RSM) [15]. Kết quả cho thấy việc bổ sung acid ascorbic (Acid ascorbic/astaxanthin w/w) và α- tocopherol (α- tocopherol/astaxanthin) lần lượt theo tỷ lệ 0,4 và 0,6 cho độ ổn định của astaxanthin cao nhất trong quá trình sản xuất astxanthin. Kittikaiwan, P. và cộng sự (2007) đã sử dụng chitosan để bao gói astaxanthin chiết xuất từ vi tảo Haematococcus pluvialis ở 13 các điều kiện sáng, tối khác nhau. Kết quả cho thấy khi bảo quản astaxanthin bằng màng bọc chitosan dưới điều kiện tiếp xúc với ánh sáng, 300C thì có 11% hàm lượng astaxanthin bị oxi hóa so với bảo quản astxanthin tránh ánh sáng, 300C thì có 8,6% astaxanthin bị oxi hóa sau 24 tuần bảo quản [34]. Ahmed, F. và cộng sự (2015) đã nghiên cứu sự ổn định của astaxanthin trong các điều kiện nhiệt độ khác nhau, độ chân không khác nhau trong quá trình bảo quản. Kết quả cho thấy bảo quản astxanthin ở điều kiện đông khô hàm lượng astxanthin cao hơn 41% khi sấy phun. Ở điều kiện nhiệt độ thấp (40C và -200C) cũng cho hàm lượng astxanthin cao hơn khi bảo quản ở nhiệt độ thường sau 20 tuần bảo quản [11]. 1.5. Các phương pháp thu nhận và bảo quản hỗn hợp caroten-protein giàu astaxanthin 1.5.1. Các phương pháp thu nhận hỗn hợp caroten-protein Phức hợp caroten-protein tồn tại trong lớp vỏ động vật giáp xác (tôm) và một phần trong cơ thịt tôm do đó để tận dụng các ưu điểm của hỗn hợp caroten-protein cần phải thực hiện các phương pháp tách chiết để thu nhận hỗn hợp. Hiện nay, có một số phương pháp thường được dùng để thu nhận hỗn hợp caroten-protein: 1.5.1.1. Phương pháp lên men Lên men lactic là sự chuyển hóa kỵ khí các chất glucid thành acid lactic nhờ hoạt động sống của vi sinh vật. Lên men lactic là một trong những quá trình chuyển hóa phát triển nhất trong tự nhiên. Có 2 dạng lên men lactic: lên men đồng hình và lên men dị hình. Lên men đồng hình (lên men điển hình) cho sản phẩm chủ yếu là acid lactic (80-90%). Chỉ một lượng nhỏ pyruvat bị khử cacbon tạo thành acid acetic, ethanol, CO2 và aceton. Lượng sản phẩm tạo thành phụ thuộc vào sự có mặt của oxy. Lên men dị hình (lên men không điển hình): nhóm vi khuẩn này quá trình lên men phức tạp hơn. Sản phẩm chính là acid lactic cùng số lượng khá lớn những sản phẩm phụ khác như rượu etylic, CO2, axetone (CH3CHOHCOCH3), diacetyl (CH3COCOCH3). Diacetyl có mùi dễ chịu làm cho sản phẩm có mùi thơm đặc trưng. Acid lactic mới tạo thành phải được trung hòa liên tục, để lên men nhanh, phạm vi 14 pH tối ưu phải nằm giữa pH 5,5 và 6,0. Lên men bị ức chế mạnh ở pH=5 và dừng lại ở pH<4,5 [4]. Quá trình lên men phế liệu tôm bằng vi sinh vật là một phương pháp sinh học, sản phẩm tạo ra dựa trên quá trình lên men tự nhiên của vi khuẩn lactic, sản phẩm tạo ra trong điều kiện yếm khí chủ yếu là acid lactic kết quả làm cho pH trong mẻ ủ giảm xuống so với pH ban đầu, pH giảm làm ức chế vi khuẩn yếm khí có hại do đó sản phẩm lên men phế liệu tôm có thể làm thức ăn cho gia xúc và bảo quản lâu dài. Ủ chua hay còn gọi là lên men thức ăn cho gia súc, động vật nuôi là phương pháp để bảo quản nguyên liệu có từ lâu đời trong nhân gian. Quá trình ủ chua được thực hiện nhờ chủng vi khuẩn lactic có sẵn trong môi trường tự nhiên hoặc được cung cấp từ ngoài vào giúp cho sản phẩm ủ chua đạt chất lượng mong muốn từ đó cung cấp nguồn dinh dưỡng cho động vật. Trong quá trình lên men người ta thường bổ sung muối, rỉ đường thích hợp, nồng độ acid để ức chế vi sinh vật gây thối, gây hư hỏng nguyên liệu. Trong quá trình lên men, vi sinh vật gây thối chuyển đổi cacbonhydrat thành acid lactic và giảm độ pH. Hỗn hợp lên men sẽ được bảo vệ nhờ pH giảm xuống thấp, tạo điều kiện cho các enzyme phân giải protein (protease) có sẵn trong phế liệu tôm, làm phá vỡ các mô protein tạo ra sản phẩm có dạng lỏng. Hầu hết protein được thủy phân thành các peptide ngắn, một số trong đó có thể tiếp tục chuyển hóa tạo các axit amin tự do [38]. Khi ủ phế liệu tôm, có thể sử dụng hỗn hợp acid hữu cơ và vô cơ như là acid formic, acid chlohydric, hoặc acid sunfuric, acid propionic và hydrochloric hoặc acid sunfuric với các nồng độ khác nhau [2] nhằm mục đích hạ thấp pH ban đầu để khống chế quá trình gây thối do vi sinh vật gây thối, bảo quản nguyên liệu đồng thời tạo điều kiện thuận lợi cho chủng vi khuẩn lactic được bổ sung và thực hiện quá trình lên men hiệu quả, đồng thời enzyme nội tại hoạt động. Sự hiện diện của acid hữu cơ do chủng vi khuẩn lactic tạo ra và acid vô cơ hoặc hữu cơ bổ sung vào trong quá trình lên men lactic sẽ làm giảm pH của môi trường, ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây thối rửa, do đó kéo dài thơi gian bảo 15 quản cho nguyên liệu. Việc hạ pH môi trường bằng acid vô cơ hoặc acid hữu cơ và lên men bằng chủng vi khuẩn lactic trong quá trình ủ có những tác dụng sau: Khi hạ pH bằng acid vô cơ ở giai đoạn đầu tiên trong quá trình lên men có tác dụng thủy phân đường thành những đường đơn nhằm cung cấp nguồn cacbon dồi dào cho sự phát triển của vi khuẩn lactic. Đồng thời ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây thối rửa, tạo môi trường thích hợp cho vi khuẩn lactic phát triển. Tác dụng thủy phân protein trong phế liệu tôm do hoạt động của enzyme protease trong bản thân nguyên liệu, hạ pH thúc đẩy lên men lactic nhờ quá trình ủ có bổ sung rỉ đường. Ức chế hoạt động, sự phát triển của vi sinh vật gây thối, nấm mốc, bảo quản cho vỏ tôm không bị hư hỏng, đảm bảo chất lượng của chitin sau này. Với acid hữu cơ do vi khuẩn lactic tạo ra có tác dụng kháng khuẩn, decanxi hóa, tách khoáng ra khỏi vỏ tôm tạo điều kiện thuận lợi khi sản xuất chitin. Mặt khác còn tạo thành dịch chứa protein, astaxanthin lỏng có giá trị về mặt dinh dưỡng, khi thu hồi tận dụng làm thức ăn cho gia súc động vật nuôi, có tác dụng ngăn chặn sự oxi hóa astaxanthin, ổn định hàm lượng để có thể tận thu dịch. 1.5.1.2. Phương pháp xử lí hóa chất, kết hợp với enzyme Xử dụng các acid như HCl, H2SO4, để thủy phân mẫu ban đầu. Các ion âm của acid hay kiềm sẽ gắn trên liên kết nhị dương của nút mang điện phù hợp, còn các ion dương sẽ gắn vào nút có độ âm điện phù hợp. Vì thế sẽ làm thay đổi mật độ điện tử xung quanh liên kết nhị dương, làm cho liên kết căng ra hơn trước và dễ bị cắt đứt khi có nước tham gia [12]. Trong sản xuất thường dùng HCl, ngoài ra thường dùng H2SO4. Acid HNO3 có năng lực hoạt hóa cao nhưng lại có tác dụng oxi hóa quá mạnh do đó không nên dùng. Ngoài tác dụng thủy phân, sử dụng acid để tách khoáng như CaCO3, có trong đầu tôm, tạo ra các lỗ rỗng nhằm tăng diện tích tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất khi xử lí với enzyme.