Tài liệu Nghiên cứu một số đặc điểm sinh thái học của rươi (nereidae tylorrhuynchus sp.) ở vùng ven biển thái bình và nam định (lv02345)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 --------------------------------Chuyên ngành: Sinh thái học Mã số: 60 42 01 20 ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC VŨ ĐỨC MẠNH Người hướng dẫn khoa học: GS. Vũ Quang Mạnh NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH THÁI HỌC CỦA RƯƠI (NEREIDAE: TYLORRHYNCHUS SP.) Ở VÙNG VEN BIỂN HÀ NỘI, 2016 THÁI BÌNH VÀ NAM ĐỊNH MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chuyên ngành: Sinh thái học 1. Lý do chọn đề tài Mã số: 60 42 01 20 2. Mục đích nghiên cứu 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 4. Đóng góp mới LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NỘI DUNG Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Người hướng dẫncứu Rươi trên thế giới Vũ Quang Mạnh 1.1. Tình hình nghiên khoa học: GS. TSKH. 1.2. Tình hình nghiên cứu Rươi tại Việt Nam CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG, THỜI GIAN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu 2.2. Phạm vi nghiên cứu HÀ NỘI, 2017 LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tôi xin cảm ơn GS.TSKH. Vũ Quang Mạnh, GVCC Khoa sinh học ĐHSP Hà Nội, thầy giáo hướng dẫn nghiên cứu đã tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành luận văn này. Trân trọng cảm ơn tới Ban chủ nhiệm khoa Sinh-KTNN trường Đại học Sư phạm Hà Nội II; Trung tâm nghiên cứu giáo dục đa dạng sinh học (CEBRED) trường Đại học Sư phạm Hà Nội; NCS. Nguyễn Thị Hà Phòng nghiên cứu Thủy sinh học (NCS). Hồ Thị Loan Phòng nghiên cứu Di truyền phân tử, Viện Sinh thái và TNSV Viện HLKH-CN Việt Nam; và Đề tài KH&CN Bộ GD&ĐT mã số B2016-SPH-24 đã tạo điều kiện và hỗ trợ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài luận văn. Trong quá trình thực hiện đề tài, tôi còn nhận được sự giúp đỡ của nhiều tổ chức và cá nhân trong và ngoài trường. đặc biệt là sự giúp đỡ, động viên, khích lệ của gia đình, bạn bè trong suốt thời gian tôi học tập và nghiên cứu. Tôi xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày 30 tháng 06 năm 2017 Tác giả LỜI CAM ĐOAN Để đảm bảo tính trung thực của Luận văn, tôi xin cam đoan: Luận văn “Nghiên cứu một số đặc điểm sinh thái học của rươi (Nereidae Tylorrhynchus sp.) ở vùng ven biển Nam Định và Thái Bình” là công trình nghiên cứu của cá nhân tôi, được thực hiện dưới sự hướng dẫn của GS. TSKH. Vũ Quang Mạnh. Tôi xin cam đoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và không trùng lặp với các đề tài khác. Tôi cũng xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc. Các kết quả trình bày trong luận văn chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào trước đây. Tác giả MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài……………………………………..………………….. .... 1 2. Mục đích nghiên cứu……………………………………….…………… ..... 2 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn…………………………….…………….. ..... 2 4. Đóng góp mới…………………………………………….……………... ..... 3 NỘI DUNG Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU………………………………………… ....... 4 1.1. Tình hình nghiên cứu Rươi trên thế giới……………………………. 4 1.2. Tình hình nghiên cứu Rươi tại Việt Nam…………………………… 4 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG, THỜI GIAN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………………………………..… …........... 7 2.1. Đối tượng nghiên cứu……………………………………….. …….. ......... 7 2.2. Phạm vi nghiên cứu………………………………………..………... ........ 7 2.3. Nội dung nghiên cứu…………………………………….………..….. .... 13 2.4. Vật liệu nghiên cứu………………...………………………..… …… ........ 7 2.5. Cách tiếp cận và phương pháp nghiên cứu……………………..…… ........ 7 CHƯƠNG 3: MỘT SỐ NÉT KHÁI QUÁT VỀ VÙNG NGHIÊN CỨU.….… .... 14 3.1. Vị trí địa lý, địa hình…………………………………………….….… .... 14 3.2. Điều kiện khí hậu……………………………………………….….…. .... 17 3.3. Đất đai thổ nhưỡng…………………………………………….……... .... 20 3.4. Thuỷ văn……………………………………………………………… .... 20 3.5. Đặc điểm kinh tế - xã hội………………………………………….….. .... 21 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN……………..…...... 25 4.1. Đặc điểm phân loại hình thái học của Rươi tại vùng nghiên cứu…..…. ... 25 4.1.1. Đặc điểm phân loại hình thái học của Rươi…………………………25 4.1.2. Kết quả nghiên cứu các chỉ tiêu phân loại hình thái học của Rươi tại vùng nghiên cứu………………………………………………………………...... 30 4.2. Đặc điểm phân loại di truyền học phân tử ADN của Rươi tại vùng nghiên cứu………………………………………………………………………………33 4.2.1. Kết quả PCR………………………………………………………....33 4.2.2. Kết quả giải trình tự mẫu………………………………………….…34 4.2.3. Phân tích kết quả giải trình tự…………………………………….…36 4.3. Đặc điểm sinh thái học môi trường và sinh học phát triển của Rươi tại vùng nghiên cứu………………………………………………………………..41 4.3.1. Đặc điểm sinh thái học môi trường của Rươi tại vùng nghiên cứu….41 4.3.1.1. Đặc điểm sinh thái môi trường nước mặt tại vùng nghiên cứu…….41 4.3.1.2. Đặc điểm sinh thái môi trường nước dưới đất tại vùng nghiên cứu…48 4.3.1.3. Đặc điểm sinh thái môi trường đất tại vùng nghiên cứu…………….49 4.3.2. Đặc điểm sinh học phát triển của Rươi tại vùng nghiên cứu………….51 4.3.3. Vai trò của Rươi tại vùng nghiên cứu……………………………….54 4.3.4. Kết quả khảo sát mô hình chăn nuôi Rươi tại vùng nghiên cứu………55 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……………………………………………………59 KẾT LUẬN…………………………………………………………………..61 KIẾN NGHỊ…………………………………………………………………..62 TÀI LIỆU THAM KHẢO Phụ lục: Bảng Phụ lục: Ảnh DANH MỤC HÌNH, BẢNG, BIỂU Hình 3.1. Bản đồ hành chính tỉnh Nam định Hình 3.2. Bản đồ vệ tinh huyện Nghĩa Hưng, tỉnh Nam Định Hình 3.3. Bản đồ hành chính tỉnh Thái Bình Hình 3.4. Bản đồ vệ tinh huyện Kiến Xương, tỉnh Thái Bình Hình 4.1. Đầu của mẫu Rươi Hình 4.2. Chi bên phần trước của mẫu Rươi (nhìn qua kính lúp) Hình 4.3. Chi bên phần sau của mẫu Rươi (nhìn qua kính lúp) Hình 4.4. Chi bên đốt XXX ở phần trước cơ thể Hình 4.5. Chi bên đốt XXV ở phần sau cơ thể Hình 4.6. Phần đuôi của mẫu Rươi Hình 4.7. Các dạng tơ khác nhau của nhánh bụng chi bên ở phần trước cơ thể Hình 4.8. Tơ bơi ở phần sau cơ thể Hình 4.9. Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR của 5 mẫu trên gel Agarose 1%; M: DNA ladder 1 kb plus (Invitrogen) Hình 4.10. Cây phát sinh chủng loại theo phương pháp Maximum Likelihood hệ số bootstrap 1000 Hình 4.11: Các bãi gây nuôi và thu hoạch Rươi tại Kiến Xương – Thái Bình nhìn từ trên xuống Hình 4.12: Vị trí bãi gây nuôi tại Kiến Xương – Thái Bình Hình 4.13: Mô hình gây nuôi và thu hoạch Rươi của ông Đặng Công Triền (Trà Giang – Kiến Xương – Thái Bình) Hình 4.14: Xâm nhập mặn đầu năm 2012 Hình 4.15. Mô hình nuôi Rươi tại Trà Giang – Kiến Xương – Thái Bình Biểu đồ 3.1. Lượng mưa các tháng năm 2009, tỉnh Nam Định Biểu đồ 3.2. Số giờ nắng các tháng trong năm 2009, tỉnh Nam Định Biểu đồ 3.3. Cơ cấu kinh tế tỉnh Nam Định năm 2009 Biểu đồ 3.4. Cơ cấu kinh tế theo ngành qua các năm tỉnh Nam Định Biểu đồ 3.5. Biểu đồ tăng trưởng GDP của tỉnh Thái Bình qua các năm Bảng 4.1. Chỉ tiêu hình thái Rươi tại Nam Định Bảng 4.2. Chỉ tiêu hình thái Rươi tại Thái Bình Bảng 4.3. Danh sách các trình tự tham khảo GenBank Bảng 4.4. Thành phần PCR Bảng 4.5. Chu trình PCR Bảng 4.6. Thành phần phản ứng giải trình tự Bảng 4.7. Chu trình phản ứng giải trình tự MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Bao giờ cho đến tháng mười Bát cơm thì trắng bát rươi thì đầy. Từ lâu, rươi đã là một món ăn đặc sản quý hiếm và có giá trị kinh tế cao, không phải vùng nào cũng có và mùa nào cũng có. Rươi còn được dân gian gọi là rồng đất, một phần bởi ngoại hình khá giống rồng nhưng lại sống ở trong lòng đất và còn vì sự bí ẩn của loài rươi. Rươi cho thu hoạch thương phẩm chủ yếu ở một số hệ sinh thái nước lợ hay vùng đồng trũng ở một vài tỉnh đồng bằng Bắc Bộ, Bắc Trung Bộ. Nổi tiếng nhất vẫn là rươi ở xã An Thanh, huyện Tứ Kỳ, tỉnh Hải Dương. Mỗi năm, người dân xã An Thanh thu hoạch tổng cộng khoảng 7-8 tấn đặc sản rươi, trung bình khoảng 300.000-500.000 đồng/kg. Xã An Thanh là một xã nằm ven sông Thái Bình, tập trung chủ yếu ở hai thôn là An Định và An Lao có trên 100 ha đất bãi ven sông có môi trường thích hợp cho rươi sinh trưởng và phát triển. Trong đó, riêng thôn An Lao đã có khoảng 170 mẫu ruộng cho thu hoạch rươi. Từ lâu người dân trong thôn đã biết bắt đầu thu hoạch rươi từ những năm 80 của thế kỉ trước. Khi nhận thấy được những lợi ích mang lại từ việc nuôi rươi, người dân nơi đây chuyển sang chỉ cấy lúa một vụ trong năm, không sử dụng thuốc trừ sâu hay phân bón hóa học, đồng thời cấy các giống lúa truyền thống và chuyển sang sử dụng các loại phân bón hữu cơ như rơm, rạ, phân gia súc để bảo vệ môi trường sinh thái giúp cho loài rươi sinh trưởng tự nhiên. Nhờ mô hình nuôi rươi bán hoang dã đã giúp cho số lượng rươi ở đây sinh trưởng rất thuận lợi. Người dân thu hoạch rươi bằng cách chủ động điều tiết nước. Rươi là sản vật có giá trị kinh tế rất cao, với thị trường tiêu thụ rươi ngày càng mở rộng. Ngoài ra, còn có một số vùng tại Thái Bình (Kiến Xương), Nam Định (Hải Hậu), Hải Phòng (Tiên Lãng), Quảng Ninh (Đông Triều) cũng là những vùng phát triển nuôi trồng rươi, nhưng không bằng Hải Dương về cả số lượng và chất lượng. Trong những năm gần đây, ở Việt Nam chưa có một nghiên cứu cơ bản và chuyên sâu nào khảo sát về sinh thái và sinh thái học phát triển của nhóm giun đốt nhiều tơ trong đó có loài rươi. Mặc dù với chiều dài bờ biển hơn 3.200 km, cùng hệ thống cửa sông dày đặc và khí hậu nhiệt đới gió mùa đã tạo cho Việt Nam nói chung và miền Bắc nói riêng có hệ sinh thái ven biển và cửa sông rất đặc trưng và có năng suất sinh học cao. Vì vậy, để góp phần phát triển, bảo tồn nuôi trồng, phát triển kinh tế về rươi tại các vùng Bắc Bộ, Bắc Trung Bộ cần so sánh hình thái, giải phẫu cũng như sinh thái các vùng miền khác nhau. Chính vì vậy, tôi quyết định chọn đề tài “Nghiên 1 cứu một số đặc điểm sinh thái học của rươi (Nereidae: Tylorrhynchus sp.) ở vùng ven biển Thái Bình và Nam Định”. 2. Mục đích nghiên cứu Xác định được đặc điểm hình thái phân loại, một số đặc điểm sinh thái – sinh học phát triển của rươi (Nereidae: Tylorrhynchus sp.), nhằm góp phần quản lý bền vững nguồn lợi rươi ở hệ sinh thái đất vùng ven biển hai tỉnh Thái Bình và Nam Định. 3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 3.1. Ý nghĩa khoa học Góp phần bổ sung vốn kiến thức cho chuyên ngành Sinh thái học và là cơ sở khoa học cho những nghiên cứu về tài nguyên động vật đất, tài nguyên sinh vật biển và đa dạng sinh học trong nông nghiệp. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả nghiên cứu của đề tài góp phần trực tiếp vào việc phát triển bền vững Rươi (Nereidae: Tylorrhynchus sp.) tại khu vực nghiên cứu. 4. Đóng góp mới của đề tài nghiên cứu khoa học Nghiên cứu đặc điểm hình phân loại hình thái, đặc điểm phân loại di truyền phân tử ADN, đặc điểm sinh thái và sinh học, góp phần bổ sung dữ liệu cho chuyên ngành sinh thái học của loài rươi (Nereidae: Tylorrhynchus.sp) tại 2 vùng Thái Bình, Nam Định. 2 NỘI DUNG CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tình hình nghiên cứu Rươi trên thế giới Nhóm rươi là đối tượng thường được nhiều nhà khoa học khảo sát nghiên cứu về tập tính sinh sản và chuỗi dinh dưỡng (Fidalgoe Costa 1998, Lawrence, Soame 2004). Chúng là nhóm được nghiên cứu nhiều về vai trò như một mắt xích quan trọng trong cấu trúc dinh dưỡng của quần xã sinh vật đáy biển, vùng đất ngập thủy triều và cửa sông khác (Fowler 1999, Nordström et al. 2006, Rosa et al. 2008). Do thuộc nhóm động vật đáy biển và vùng cửa sông, có đời sống di cư và gắn liền với môi trường nước, đất nền và đáy cát nên Rươi là nhóm ưu thế được khảo sát và nghiên cứu như yếu tố chỉ thị sinh học (Bioindicator), góp phần đánh giá chất lượng môi trường nước biển, môi trường vùng đất ngập nước, vùng cửa sông và biến đổi khí hậu (Lawrence ; Soame 2004, Burlinson ; Lawrence 2007, Durou et al. 2007, 2008, Galloway 2008, Lewis et al.2008). Tuy nhiên, chưa có những nghiên cứu đầy đủ và chuyên sâu về nhóm giun đốt nhiều tơ rươi (Nereidae: Tylorrhynchus sp.) như một thành phần quan trọng và không thể thay thế trong cấu trúc quần xã động vật của hệ sinh thái vùng đất ven biển và cửa sông, và đặc biệt như là một đối tượng cần bảo tồn gây nuôi và làm nguồn thực phẩm cho con người (Vũ Quang Mạnh 1995 & 2003, Paramor & Hughes 2007, Marine errant polychaetes in Hongkong 2004, Hughes 2007, Rosa et al. 2008, Vinagre & Cabral 2008). 1. Tình hình nghiên cứu Rươi tại Việt Nam Dawydofd (1929) lần đầu tiên đã phát hiện và mô tả 2 loài mới ở Việt Nam, là Alentia annamita và Nereis tort, thu từ Nha Trang và vùng biển lân cận. Năm 1937, Serene đã mô tả thêm 2 loài rươi mới thuộc họ Nereidae, thu được từ dọc bờ biển Việt Nam. Fauvel (1939) phát hiện thêm 2 loài mới là Syllis aberrans và Glycera albaadspersa. Dawydofd (1952) đã tập hợp và giới thiệu các loài giun nhiều tơ ở biển bao gồm nhóm Rươi, thuộc hai nhóm Errantia và nhóm Sedentaria. Trong các năm 1959-1962, các nhà khoa học Việt Nam và Trung Quốc đã công bố danh mục khoảng 360 loài giun nhiều tơ bao gồm nhóm Rươi, được ghi nhận ngoài biển khơi Việt Nam. Từ năm 1977, Nguyễn Xuân Dục và ctv đã tiến hành khảo sát tại vùng triều Hải Phòng, và đã phát hiện được 110 loài giun nhiều tơ, bao gồm cả nhóm rươi. Tác giả nêu trên đã đề cập ảnh hưởng của yếu tố môi trường khí hậu, đến đặc điểm 3 phân bố của giun nhiều tơ, và cho rằng, nhiệt độ và độ mặn có ảnh hưởng quan trọng đến phân bố của chúng. Phạm Văn Miên (1979) đã khảo sát nhóm rươi, như một chỉ thị sinh học góp phần đánh giá chất lượng lớp nước mặt. Theo Phạm Đình Trọng (1995), thành phần loài giun nhiều tơ gồm rươi thay đổi theo đặc điểm hệ sinh thái vùng ngập nước mặn ven bờ biển như sau: rừng ngập mặn có 103 loài, vùng triều có 138 loài, rạn san hô ở Cát Bà có 76 loài, vùng dưới triều Hải Phòng – Quảng Ninh có 119 loài, và Vùng biển Nha Trang có 185 loài. Theo tác giả này, thì loài Nereis capensis cùng một loài thuộc họ Capitellidae sử dụng thảm lá rụng vùng ngập nước biển làm thức ăn, góp phần quan trọng vào chuỗi thức ăn với mắt xích cuối cùng là cá kinh tế. Cho đến các nghiên cứu gần đây của Nguyễn Văn Chung (1994), Bộ thủy sản (1996), Phạm Đình Trọng (1999), Vũ Quang Mạnh et al. (1990, 2000), đã có một số điều tra sơ bộ về nhóm giun đốt nhiều tơ bao gồm Rươi (Polychaeta: Nereidae:). Tuy nhiên, chưa có một nghiên cứu cơ bản và đầy đủ, khảo sát về quần xã động vật Rươi (Nereidae: Tylorrhynchus sp.) ở hệ sinh thái đất ven biển miền Bắc Việt Nam. Số liệu của đề tài nghiên cứu “Thống kê tư liệu sinh vật biển KC 09-01” (20032004)” đã ghi nhận được 475 loài giun nhiều tơ bao gồm nhóm rươi tại vùng biển Việt Nam nói chung. Khu hệ động vật giun nhiều tơ ở vùng biển ngoài khơi và đáy biển sâu rất phong phú, đến nay đã ghi nhận được hơn 700 loài. Có thể kể một nghiên cứu về sinh thái và sinh học phát triển của rươi của Phạm Đình Trọng (2003), nghiên cứu về “Một số đặc trưng phân bố và sinh thái của giun nhiều tơ loài Dendronereis aestuarina ở vùng nước lợ ven biển Việt Nam”, giới thiệu một số kết quả nuôi loài này trong các ao nuôi tôm, cá nước lợ ở Đình Vũ, thành phố Hải Phòng. Năm 2005, việc nhân nuôi thử nghiệm một số loài giun nhiều tơ trong đó có rươi bước đầu đã được thực hiện tại Viện Hải dương học và Đại học Nha Trang, tỉnh Nha Trang. Thử nghiệm nhân nuôi rươi loài Perinereis nuntia brevicirris trong phòng thí nghiệm đã được thử nghiệm và bước đầu cho kết quả đáng khích lệ. Trần Hữu Huy (2005) đã nghiên cứu về thành phần loài và phân bố của giun nhiều tơ (Polychaeta) trong hệ sinh thái rừng ngập mặn Giao Thủy, tỉnh Nam Định. Gần đây nhất, Phan Hồng Dũng (2007) và Nguyễn Quang Chương (2008) có một số nghiên cứu một số đặc điểm sinh học sinh sản và giá trị nguồn lợi của rươi ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam. Như vậy, trong các năm gần đây, ở Việt Nam chưa có một nghiên cứu cơ bản và chuyên sâu nào khảo sát về sinh thái và sinh học phát triển của nhóm giun đốt nhiều tơ Rươi (Polychaeta: Nereidae:) như một nhóm trong cấu trúc quần xã động 4 vật đất cỡ trung bình (Mesofauna), và là cư dân của hệ sinh thái đất vùng ven biển và cửa sông Việt Nam. Ở các tỉnh ven biển vùng đồng bằng Bắc bộ, rươi đã và đang trở thành món đặc sản ngon và nhiều chất dinh dưỡng, chủ yếu được khai thác theo phương thức tự nhiên, và nếu không được quy hoạch khai thác và bảo tồn sẽ có khả năng cạn kiệt trong tương lai không xa. 5 CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Đối tượng nghiên cứu Rươi (Nereidae: Tylorrhynchus sp.), Họ Nereidae, Bộ Nereidimorpha, Phân lớp Errantia, Lớp giun nhiều tơ (Polycheata), thuộc Ngành giun đốt (Annelida). 2. Phạm vi nghiên cứu Hệ sinh thái đất đại diện vùng ven biển miền bắc Việt Nam thuộc 2 tỉnh: Thái Bình và Nam Định. 3. Nội dung nghiên cứu 3.1. Đặc điểm phân loại học của Rươi (Nereidae: Tylorrhynchus.sp) ở hệ sinh thái đất của vùng ven biển hai tỉnh Thái Bình và Nam Định - Đặc điểm phân loại và hình thái học của rươi ở vùng nghiên cứu: (1) cá thể Đực, (2) cá thể Cái và con non/ ấu trùng. - Bước đầu áp dụng di truyền phân tử ADN trong phân loại rươi ở vùng nghiên cứu 3.2. Bước đầu nghiên cứu đặc điểm sinh thái môi trường và sinh học phát triển của rươi tại mô hình khảo sát - Một số điều kiện sinh thái môi trường sống của Rươi tại mô hình khảo sát - Một số đặc điểm phát triển của Rươi tại mô hình khảo sát 4. Vật liệu nghiên cứu Dụng cụ thu mẫu ngoài thực địa: Túi nilong đựng mẫu, bút dạ không xóa, dụng cụ đào đất, hộp nhựa chứa mẫu đất và mẫu nước, sổ ghi chép,… máy xác định tọa độ địa lí GPS là thiết bị thu và xử lí tín hiệu từ các vệ tinh địa tĩnh để xác định tọa độ địa lí của bất kì địa điểm nào trên trái đất. Dụng cụ nghiên cứu trong phòng thí nghiệm: đĩa petri, lam kính, lamen, bút tách mẫu, giấy thâm, bông, kính lúp, cân, thước,… 5. Phương pháp nghiên cứu 5.1.Phương pháp thực địa: Tìm hiểu khu vực, địa điểm mà người dân gây nuôi Rươi tại Thái Bình và Nam Định. Đến địa điểm gây nuôi, khảo sát các phương pháp thu mẫu từ người dân, thu mua mẫu từ người dân địa phương, khảo sát mô hình gây nuôi và một số đặc điểm sinh học phát triển. 5.2. Nhóm phương pháp phân loại học hình thái nhóm Rươi: Rươi là nhóm động vật đơn tính có kích thước vừa và nhỏ, cơ quan chuyển vận là chi bên (Parapoda), phát triển qua ấu trùng Trochophora. Cơ thể có nhiều đốt, bao gồm phần như sau: (1) Thùy đầu (Prostomium), (2) Thân (Metastomium) gồm tất cả các 6 đốt tiếp theo, và (3) Đuôi (Pygidium) là đốt cuối cùng. Phân tích định loại hình thái thực hiện qua cá thể trưởng thành. 5.3. Nhóm phương pháp phân tích và định loại theo đặc điểm hình thái được sử dụng trong định loại Rươi. Mẫu Rươi được làm sạch và định hình trong cồn 70 0 sẽ đem tiến hành phân tích, định loại theo Pierre Fauvel 1953, Norse 1993, Uschakov 1995, Wu Baoling 2003. - Sau khi thu mẫu thực địa tại 2 vùng nghiên cứu Nam Định và Thái Bình, Rươi được ngâm trong dung dịch cồn 90 để bảo tồn nguyên vẹn mẫu trong 10 ngày. Quá trình ngâm cồn, để Rươi không bị vỡ, đầu tiên ngâm Rươi trong nước hòa với cồn, với tỉ lệ khoảng 10 % cồn. Qua 1 tiếng đầu tiên, tăng tỉ lệ cồn lên 20 %. Qua 2 tiếng, tăng tỉ lệ cồn lên 40 %. Qua 4 tiếng, tăng tỉ lệ cồn lên 60%. Qua 6 tiếng, tăng tỉ lệ cồn lên 80%. Qua 8 tiếng, ngâm Rươi trong dung dịch cồn 90 độ. - Rươi được mang về bảo quản trong phòng nghiên cứu 10 ngày trước khi được sử dụng để đo đạc tính toán các chỉ tiêu hình thái. - Trước khi đo đạc tính toán các chỉ tiêu hình thái, Rươi được vớt từ dung dịch cồn ra và để trên giấy thấm 30 phút. - Chiều dài Rươi được tính từ đỉnh phần đầu (tính cả hàm kitin) đến hết phần lông của đốt cuối cùng. - Chiều rộng Rươi được tính là chiều rộng phần cơ thể lớn nhất. - Cân nặng Rươi được tính sau khi Rươi được để trên giấy thấm 30 phút trong môi trường phòng thí nghiệm. - Số đốt Rươi được tính bắt đầu từ đốt nối đến đốt cuối cùng. - Giới tính đực hoặc cái được xét bằng cách lấy một phần trong cơ thể soi trên kính hiển vi để xem xét trứng hoặc tinh trùng. 5.4. Nhóm phương pháp phân loại học di truyền phân tử ADN nhóm rươi * Nguyên liệu 2 mẫu rươi gồm: STT 01 02 Ký hiệu mẫu gửi Rươi 3 NĐ Rươi 4 TB Ký hiệu mẫu di truyền R3 R4 7 Bảng 4.3: Danh sách các trình tự tham khảo GenBank STT 01 02 03 Loài Tylorrhynchus heterochaetus Tylorrhynchus heterochaetus Arenicola defodiens Genbank Code KM111507.1 NC 025561.1 KM042101.1 * Phương pháp nghiên cứu AND - Lựa chọn locus, thiết kế mồi và điều kiện thí nghiệm Qua tổng hợp các kết quả nghiên cứu đã công bố về rươi, khảo sát dữ liệu trình tự DNA của các loài thuộc giống Tylorrhynchus và giống có quan hệ gần gũi như giống Arenicola đã được công bố trên Genbank chúng tôi nhận thấy trình tự gen cytochrome oxidase subunit I (COI), thuộc hệ gen ty thể mang thông tin thích hợp để giải quyết mục tiêu nghiên cứu. Đoạn gen đích được lựa chọn là một phần trình tự gen cytochrome oxidase subunit I có chiều dài gần 700bp. + Tách chiết DNA tổng số từ lông của các mẫu vật, sử dụng Dneasy blood and tissue kit (Qiagen, Đức) theo quy trình được đưa ra bởi nhà sản xuất. + Nhân bản đoạn trình tự đích bằng kỹ thuật PCR với thành phần chuẩn bị cho một ống phản ứng thể hiện trong bảng 1.1 và chu trình phản ứng thể hiện trong bảng 1.2 Bảng 4.4: Thành phần PCR TT 01 02 03 04 05 Tổng Thành phần Taq PCR Mastermix Mồi xuôi F Mồi ngược R DNA tổng số Nước tinh khiết Nồng độ 2X 5 mM 5 mM 10 ng/µl - 8 Thể tích (µl) 10 1 1 1 7 20 Bảng 4.5. Chu trình PCR Bước Biến tính ban đầu Biến tính Bắt cặp mồi Kéo dài Hoàn thiện Giữ mẫu Nhiệt độ ( ᵒC) 95 95 56 72 72 4 Thời gian (giây) 120 25 25 60 180 Đến khi lấy mẫu Số chu kì 1 35 1 + Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1,5% trong đệm TBE 1x, nhuộm EtBr và hiện kết quả trên đèn tử ngoại (ở bước sóng 302 nm). Vạch sản phẩm DNA nhân bản được (có kích thước như thiết kế) được cắt, tinh sạch bằng Qiaquick gel extraction kit (Qiagen, Đức) theo quy trình được đưa ra bởi nhà sản xuất kit. + Thực hiện phản ứng giải trình tự DNA với thành phần chuẩn bị cho một ống phản ứng thể hiện trong bảng 1.3 và chu trình phản ứng thể hiện trong bảng 1.4. Bảng 4.6. Thành phần phản ứng giải trình tự TT 01 02 03 04 Tổng Thành phần Sản phẩm PCR Mồi xuôi F BigDye Nước tinh khiết Nồng độ 20 ng/µl 3 mM 2,5X - Thể tích (µl) 1 1 4 4 10 Bảng 4.7. Chu trình phản ứng giải trình tự Bước Nhiệt độ (ᵒC) Biến tính ban đầu Biến tính Gắn mồi Kéo dài Giữ mẫu Thời gian Số chu kì (giây) 60 1 10 25 05 90 Đến khi lấy mẫu 96 96 50 60 04 9 + Tinh sạch sản phẩm phản ứng giải trình tự bằng sắc kí lọc gel (cột Sephadex G50) theo quy trình: 1. Hydrat hóa gel sephadex trong 2 – 4 giờ. 2. Ly tâm 2000 x g trong 1 phút, bỏ dịch qua. 3. Cho toàn bộ sản phẩm phản ứng giải trình tự DNA lên cột, ly tâm 2000 x g trong 1 phút. 4. Làm khô sản phẩm sau lọc gel bằng thiết bị cô quay chân không. 5. Đọc trình tự trên máy ABI 3100 – Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Mỹ). *Phân tích kết quả Trình tự DNA thu được sẽ được hiệu chỉnh, đối chiếu với các trình tự tương đồng trên ngân hàng trình tự DNA (Genbbank) bằng công cụ trực tuyến là BLAST. Các trình tự DNA chính xác được so sánh bằng phần mềm BioEdit 7.0.0 Thompson et al. (1997) Các trình tự DNA sẽ được khảo sát phân bố nucleotide, kiểm tra các giả thuyết và thử mô hình tiến hóa. Kết quả khảo sát sẽ được sử dụng làm tham số đầu vào để tính toán ma trận khoảng cách di truyền và xây dựng cây phát sinh chủng loại theo các phương pháp: Tiến hóa tối thiểu (ME), Tiết kiệm tối đa (MP), Xác suất tối đa (ML) bằng các phần mềm MEGA 6.0.6 (Tamura et al.,2007). 2.5.5. Nhóm phương pháp toán học phân tích số liệu, áp dụng các phương pháp nghiên cứu điều tra cơ bản và thực nghiệm tương ứng và phù hợp với điều kiền nghiên cứu: Sinh thái học và sinh học phát triển nhóm Rươi, nhằm đề xuất cơ sở khoa học và xây dựng bước đầu mô hình bảo tồn và gây nuôi Rươi. Áp dụng các phương pháp nghiên phân tích số liệu: Đánh giá vai trò chỉ thị sinh học của Rươi ở hệ sinh thái đất vùng ven biển. 10 CHƯƠNG III: MỘT SỐ NÉT KHÁI QUÁT VỀ VÙNG NGHIÊN CỨU 1. Vị trí địa lý, địa hình Nam Định và Thái Bình là hai tỉnh đồng bằng châu thổ sông Hồng, có vị trí địa lí thuận lợi cho sự phát triển kinh tế, xã hội. 1.1. Vị trí địa lý, địa hình tỉnh Nam Định Nam Định có tọa độ địa lý từ 19̊ 52’ đến 20̊ 30’ vĩ độ Bắc và từ 105̊ 55’ đến 106̊ 35’ kinh đô Đông. Tổng diện tích của tỉnh là 1.652,29 km². Phía Bắc giáp với tỉnh Hà Nam. Phía Đông giáp tỉnh Thái Bình. Phía Tây giáp tỉnh Ninh Bình. Phía Nam giáp với biển Đông. Hình 3.1: Bản đồ hành chính tỉnh Nam Định Nam Định nằm trong vùng ảnh hưởng của tam giác tăng trưởng kinh tế Hà Nội – Hải Phòng – Quảng Ninh, cách thủ đô Hà Nội và thành phố cảng Hải Phòng khoảng 90 km. Vị trí địa lý tỉnh Nam Định có điều kiện thuận lợi cho việc phát triển kinh tế, xã hội. Đường sắt xuyên Việt đi qua tỉnh dài 41,2 km với 6 ga, rất thuận lợi cho việc vận chuyển hành khách và hàng hóa. Quốc lộ 10, quốc lộ 21 qua tỉnh dài 108 km đã và đang tiếp tục được đầu tư cải tạo nâng cấp. 11 Hệ thống sông Hồng, sông Đào, sông Ninh cơ chảy qua địa phận tỉnh với chiều dài trên 251 km, cùng hệ thống cảng sông Nam Định và cảng biển Thịnh Long thuận tiện cho việc phát triển kinh tế, vận tải thủy. Ngoài ra, với 72 km đường bờ biển, Nam Định có điều kiện thuận lợi cho khai thác , nuôi trồng thủy, hải sản và phát triển dịch vụ du lịch. Địa hình Nam Định khá bằng phẳng, có xu hướng thấp dần từ Tây Bắc xuống Đông Nam, có thể chia thành vùng chính là vùng đồng bằng và vùng ven biển. Vùng đồng bằng gồm các huyện Ý Yên, Mỹ Lộc, Vụ Bản, thành phố Nam Định, Nam Trực, Trực Ninh, Xuân Trường. Vùng đồng bằng chiếm phần lớn diện tích đất tự nhiên của tỉnh, với điều kiện thổ nhưỡng thuận lợi cho phát triển kinh tế nông nghiệp, công nghiệp và các ngành nghề truyền thống. Vùng ven biển gồm các huyện Nghĩa Hưng, Hải Hậu, Giao Thuỷ có địa hình tương đối bằng phẳng, với bờ biển dài 72 km song bị chia cắt khá mạnh mẽ bởi các cửa sông lớn là cửa Ba Lạt (sông Hồng), cửa Đáy (sông Đáy), cửa Lạch Giang (sông Ninh Cơ) và cửa Hà Lạn (sông Sò). Vùng đồng bằng ven biển đất đai phì nhiêu, có nhiều tiềm năng phát triển kinh tế tổng hợp ven biển như nuôi trồng, đánh bắt hải sản, đóng tàu, du lịch biển... (theo “Báo cáo hiện trạng môi trường tỉnh Nam Định năm 2010” ) Hình 3.2. Bản đồ vệ tinh huyện Nghĩa Hưng, tỉnh Nam Định Trong đó, huyện Nghĩa Hưng có diện tích 250,27 km². Địa hình đồng bằng, đất phù sa màu mỡ. Sông Ninh cơ, sông Đáy chảy qua. Có chiều dài bờ biển 12 km ở phía Nam huyện. 12 1.2. Vị trí địa lý, địa hình tỉnh Thái Bình Thái Bình là tỉnh đồng bằng ven biển, nằm ở phía Nam châu thổ sông Hồng, có ba mặt giáp sông và một mặt giáp biển, vị trí tọa độ 20̊ 17’ đến 20̊44’ vĩ độ Bắc và 106 ̊ 06’ đến 106̊ 39’ kinh độ Đông. Từ Tây sang Đông dài 54 km, từ Bắc xuống Nam dài 49 km. Phía Đông giáp Vinh Bắc Bộ Phía Tây giáp tỉnh Hà Nam Phía Nam giáp tỉnh Nam Định Phía Bắc giáp tỉnh Hưng Yên, Hải Dương và thành phố Hải Phòng. Hình 3.3. Bản đồ hành chính tỉnh Thái Bình Thái Bình nằm trong vùng ảnh hưởng của tam giác tăng trưởng kinh tế Hà Nội – Hải Phòng – Quảng Ninh; hành lang Hải Phòng – Hà Nội – Lang Sơn – Nam Ninh và vành đai kinh tế ven vịnh Bắc Bộ, có đường bờ biển và hệ thống sống ngòi thuận lợi cho giao lưu kinh tế, cách thủ đô Hà Nội 100 km, cách thành phố cảng Hải Phòng 70 km là hai thị trường lớn để giao lưu. Địa hình tương đối bằng phẳng, thấp dần từ Bắc xuống Nam. Độ cao trung bình so với mặt nước biển từ 1 - 2 m. 13