Tài liệu Nghiên cứu khả năng hấp thu và giải phóng thuốc famotidine của màng bacterial cellulose để phục vụ việc sử dụng qua đường uống

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 HOÀNG PHÚC NGÂN NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THU VÀ GIẢI PHÓNG THUỐC FAMOTIDINE CỦA MÀNG BACTERIAL CELLULOSE ĐỂ PHỤC VỤ VIỆC SỬ DỤNG QUA ĐƢỜNG UỐNG Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Xuân Thành HÀ NỘI, 2016 LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Xuân Thành đã tận tình hƣớng dẫn, động viên, giúp đỡ em trong quá trình nghiên cứu. Sự hiểu biết sâu sắc về khoa học cũng nhƣ kinh nghiệm của thầy là tiền đề giúp em đạt đƣợc kết quả này. Em xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Sau đại học, các thầy cô giáo trong khoa Sinh – KTNN, các thầy cô trong Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu khoa học và Chuyển giao công nghệ, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2, đã tận tình giảng dạy, tạo mọi điều kiện thuận lợi trong thời gian em học tập và làm nghiên cứu tại Trƣờng. Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè luôn bên cạnh, động viên, khích lệ, giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Hà nội, ngày 25 tháng 12 năm 2016 Học viên Hoàng Phúc Ngân LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là đề tài do chính tôi thực hiện. Các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực, khách quan và chƣa đƣợc tác giả nào công bố trong bất cứ công trình nào. Hà Nội, ngày 25 tháng 12 năm 2016 Học viên Hoàng Phúc Ngân MỤC LỤC MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1 1. Lý do chọn đề tài ..................................................................................... 1 2. Mục đích nghiên cứu............................................................................... 2 3. Nhiệm vụ nghiên cứu .............................................................................. 2 4. Vật liệu và phạm vi nghiên cứu .............................................................. 2 5. Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................ 3 6. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn ................................................................ 3 7. Đóng góp mới của luận văn .................................................................... 3 NỘI DUNG ....................................................................................................... 4 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 4 1.1. BACTERIAL CELLULOSE (BC) ......................................................... 4 1.1.1. Cấu trúc màng BC ............................................................................ 4 1.1.2. Tính chất lý hóa của màng S – BC ................................................... 7 1.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo màng BC .......................... 7 1.1.4. Ứng dụng của màng BC.................................................................... 9 1.2. THUỐC FAMOTIDINE ....................................................................... 11 1.2.1. Giới thiệu chung về thuốc ............................................................ 11 1.2.2. Chỉ định ........................................................................................ 12 1.2.3. Chống chỉ định ............................................................................. 12 1.2.4. Tác dụng không mong muốn ........................................................ 12 1.2.5. Liều lượng và cách dùng .............................................................. 13 1.2.6. Tương tác thuốc............................................................................ 13 1.2.7. Bảo quản....................................................................................... 13 1.2.8. Các công trình nghiên cứu về thuốc Famotidine ......................... 13 1.3. QUÁ TRÌNH TIÊU HÓA Ở DẠ DÀY ................................................ 14 1.3.1. Cấu tạo của dạ dày....................................................................... 14 1.3.2. Chức năng tiêu hóa của dạ dày.................................................... 16 1.3.3. Chuyển hóa thức ăn từ dạ dày xuống ruột ................................... 22 1.3.4. Kết quả tiêu hóa ở dạ dày ............................................................ 22 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 23 2.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................... 23 2.1.1. Giống vi khuẩn ................................................................................ 23 2.1.2. Nguyên liệu và hóa chất.................................................................. 23 2.1.3. Thiết bị và dụng cụ sử dụng trong quá trình nghiên cứu ............... 23 2.1.4. Môi trường lên men thu màng BC .................................................. 24 2.1.5. Môi trường pH dùng để xác định lượng thuốc giải phóng thông qua hệ thống được thiết kế.............................................................. 24 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ...................................................................... 25 2.2.1. Lên men thu màng BC từ một số môi trường.................................. 25 2.2.2. Xử lý màng trước khi hấp thu thuốc ............................................... 25 2.2.3. Đánh giá độ tinh khiết của màng .................................................... 26 2.2.4. Đo bề dày màng BC ........................................................................ 27 2.2.5. Xây dựng đường chuẩn của thuốc Famotidine trong dung dịch HCl 0,1N ........................................................................................... 27 2.2.6. Xác định các thông số tối ưu của quá trình hấp thu thuốc Famotidine vào màng BC ......................................................................... 28 2.2.7. Xác định lượng thuốc hấp thu vào màng ........................................ 29 2.2.8. Xác định lượng thuốc giải phóng thông qua hệ thống được thiết kế ....................................................................................................... 30 2.2.9. Đánh giá động học giải phóng của thuốc từ màng BC .................. 30 2.2.10. Xử lý thống kê ............................................................................... 31 Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................................... 33 3.1. Tạo màng BC ........................................................................................ 33 3.1.1. Thu màng BC từ các môi trường lên men ....................................... 33 3.1.2. Quá trình xử lý màng BC trước khi hấp thu thuốc ......................... 34 3.1.3. Xác định điều kiện nuôi cấy để có độ dày màng BC thích hợp ...... 35 3.1.4. Đo bề dày màng BC ........................................................................ 36 3.1.5. Kiểm tra độ tinh khiết của màng BC .............................................. 38 3.2. Khảo sát khả năng hấp thu thuốc của màng BC ................................... 38 3.2.1. Kết quả khảo sát các thông số tối ưu của quá trình hấp thu thuốc Famotidine vào màng BC ............................................................... 38 3.2.2. Xác định lượng thuốc hấp thu vào màng ........................................ 42 3.3. Tỷ lệ thuốc Famotidine giải phóng khỏi màng BC............................... 44 3.3.1. Tỷ lệ giải phóng thuốc từ màng CNM ............................................ 45 3.3.2. Tỷ lệ giải phóng thuôc từ màng Dừa .............................................. 47 3.3.3. Tỷ lệ giải phóng thuốc từ màng Gạo .............................................. 50 3.3.4. So sánh ảnh hưởng của pH đến khả năng giải phóng thuốc của cả 3 loại màng ........................................................................................... 52 3.4. Đánh giá động học giải phóng của thuốc Famotidine từ màng BC ...... 53 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 59 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT A – BC Agitade – Bacterial cellulose BC Bacterial cellulose CCK Cholecystokinin CNM Cao nấm men et al Cộng sự GIP Gastric Inhibitory Peptide MT1 Môi trƣờng 1 MT2 Môi trƣờng 2 MT3 Môi trƣờng 3 S – BC Static – Bacterial celllulose SGF Simulated gastric flulid SIF Simulated intestinal flulid DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon đến năng suất sản xuất màng BC ..................................................................................................... 7 Bảng 2.1. Thành phần của các môi trƣờng lên men thu màng BC ................. 24 Bảng 2.2. Cách bố trí thí nghiệm đo bề dày màng .......................................... 27 Bảng 2.3. Giá trị mật độ quang (OD) của dung dịch Famotidineở các nồng độ khác nhau (n = 3) .............................................................. 27 Bảng 2.4. Các mức biến thiên và các yếu tố ảnh hƣởng trongquá trình hấp thu thuốc Famotidine vào màng BC ........................................ 28 Bảng 3.1. Kết quả thu màng BC tƣơi ở các độ dày khác nhau ....................... 36 Bảng 3.2. Giá trị đo độ dày của màng Gạo ..................................................... 36 Bảng 3.3. Giá trị đo độ dày màng Dừa ........................................................... 37 Bảng 3.4. Giá trị đo độ dày màng CNM ......................................................... 37 Bảng 3.5. Các yếu tố quy hoạch thực nghiệm ................................................ 39 Bảng 3.6. Mô hình quy hoạch thực nghiệm trong quá trình hấp thuthuốc Famotidine vào màng BC ............................................................... 39 Bảng 3.7. Các yếu tố của thí nghiệm đƣờng dốc nhất .................................... 41 Bảng 3.8. Hàm lƣợng thuốc Famotidine hấp thu vào màng BCở thí nghiệm đƣờng dốc nhất................................................................... 41 Bảng 3.9. Khối lƣợng thuốc hấp thu vào các màng BC khác nhauvới độ dày khác nhau tại 2h (n = 3) ........................................................... 42 Bảng 3.10. Hiệu suất thuốc hấp thu vào các màng BC khác nhauvới độ dày màng khác nhau trong 2h ......................................................... 43 Bảng 3.11. Tỷ lệ giải phóng thuốc từ màng CNM dày 0.5cmở các pH khác nhau trong khoảng thời gian khác nhau ................................. 45 Bảng 3.12. Tỷ lệ giải phóng thuốc từ màng CNM dày 1cm ở các pH khác nhau trong khoảng thời gian khác nhau ................................. 46 Bảng 3.13. Tỷ lệ giải phóng thuốc từ màng Dừa dày 0.5cm ở các pH khác nhau trong khoảng thời gian khác nhau ................................. 48 Bảng 3.14. Tỷ lệ giải phóng thuốc từ màng Dừa dày 1cm ở các pHkhác nhau trong khoảng thời gian khác nhau .......................................... 49 Bảng3.15. Tỷ lệ giải phóng thuốc từ màng Gạo dày 0.5cm ở các pH khác nhau trong khoảng thời gian khác nhau .......................................... 50 Bảng 3.16. Tỷ lệ giải phóng thuốc từ màng Gạo dày 1cm ở các pH khác nhau trong khoảng thời gian khác nhau .......................................... 51 Bảng 3.17. Các tham số của quá trình giải phóng thuốc từ màng CNM theo mô hình động học tại các pH khác nhau ................................. 54 Bảng 3.18. Các tham số của quá trình giải phóng thuốc từ màng Dừatheo mô hình động học tại các pH khác nhau ......................................... 55 Bảng 3.19. Các tham số của quá trình giải phóng thuốc từ màng Gạotheo mô hình động học tại các pH khác nhau ......................................... 56 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc của màng BC [12], [21] ...................................................... 4 Hình 1.2. Cellulose thực vật và BC [28] ........................................................... 5 Hình 1.3. Cấu trúc A – BC (a) và S – BC (b) [40]............................................ 6 Hình 1.4. Cấu tạo của dạ dày .......................................................................... 15 Hình 1.5. Cử động co bóp của dạ dày ............................................................. 17 Hình 1.6. Sơ đồ cấu tạo tuyến vị của dạ dày ................................................... 18 Hình 1.7. Sơ đồ giai đoạn đầu của sự bài tiết dịch vị ..................................... 20 Hình 1.8. Sơ đồ giai đoạn dạ dày của sự bài tiết dịch vị................................. 20 Hình 1.9. Sơ đồ giai đoạn ruột của sự bài tiết dịch vị ..................................... 21 Hình 2.1.Sơ đồ quá trình xử lý màng BC ....................................................... 26 Hình 2.2. Phƣơng trình đƣờng chuẩn của thuốc Famotidine .......................... 28 Hình 3.1. Môi trƣờng dinh dƣỡng lên men thu màng CNM ........................... 33 Hình 3.2. Môi trƣờng dinh dƣỡng lên men thu màng Dừa ............................. 33 Hình 3.3. Môi trƣờng dinh dƣỡng lên men thu màng Gạo ............................. 34 Hình 3.4. Màng BC thô đƣợc ngâm trong NaOH 3%..................................... 34 Hình 3.5. Màng BC ngâm trong HCl 3%........................................................ 34 Hình 3.6. Màng BC đƣợc rửa dƣới vòi nƣớc .................................................. 35 Hình 3.7. Màng BC tinh khiết ......................................................................... 35 Hình 3.8. Kết quả thử sự hiện diện của đƣờng glucose .................................. 38 Hình 3.9. Biểu đồ biểu diễn khối lƣợng hấp thu thuốc vào các màng BC khác nhau tại 2h .......................................................................... 42 Hình 3.10. Biểu đồ thể hiện hiệu suất thuốc nạpvào các màng BC khác nhau tại 2h ................................................................................... 44 Hình 3.11. Quá trình giải phóng thuốc Famotidine từ màng BC.................... 45 Hình 3.12. Đồ thị giải phóng thuốc Famotidine từ màng CNM dày 0,5cm ở các pH khác nhau ..................................................................... 46 Hình 3.13. Đồ thị giải phóng thuốc Famotidine từ màng CNM dày 1cm ở các pH khác nhau ........................................................................ 47 Hình 3.14. Đồ thị giải phóng thuốc Famotidine từ màng Dừa dày 0,5cm ở các pH khác nhau ..................................................................... 48 Hình 3.15. Đồ thị giải phóng thuốc Famotidine từ màng Dừa dày 1cm ở các pH khác nhau ........................................................................ 49 Hình 3.16. Đồ thị giải phóng thuốc Famotidine từ màng Gạo dày 0,5cm ở các pH khác nhau ..................................................................... 51 Hình 3.17. Đồ thị giải phóng thuốc Famotidine từ màng Gạo dày 1cm ở các pH khác nhau ........................................................................ 52 1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Famotidine là một trong số các loại thuốc đƣờng tiêu hóa dùng qua đƣờng tiêm hoặc uống, hòa tan đƣợc trong axit, rất ít tan trong nƣớc [42]. Nó có tác dụng làm giảm tiết dịch vị bằng cách đối kháng với histamin tại thụ thể H2 ở các vách tế bào niêm mạc dạ dày, làm giảm tiết cả số lƣợng và nồng độ HCl của dịch vị, làm lành các vết loét dạ dày, tá tràng, giảm đau do loét. Tuy nhiên, sinh khả dụng của Famotidine thấp là khoảng 40 – 45% đã làm cản trở các ứng dụng điều trị của nó trong một thời gian dài [42]. Do đó, cần thiết kế một hệ thống để giúp thuốc hấp thu và giải phóng một cách từ từ đồng thời tăng khả dụng sinh học của thuốc. Uống là một trong những đƣờng ƣa thích nhất và truyền thống để phân phối thuốc. So với đƣờng tiêm, hệ thống phân phối thuốc qua đƣờng miệng nó có nhiều lợi thế chính bao gồm an toàn nhất, đơn giản, tiện lợi, bệnh nhân dễ dàng tuân thủ, làm tăng hiệu quả của thuốc uống. Nó cũng ngăn chặn nguy cơ lây truyền bệnh, giảm chi phí và áp lực cho bệnh nhân [37]. Bacterial cellulose (BC) đƣợc tạo thành từ Acetobacter xylinum có cấu trúc hóa học rất giống của cellulose thực vật nhƣng có một số tính chất hóa lý đặc biệt nhƣ: độ bền cơ học, khả năng thấm hút nƣớc cao, đƣờng kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, độ polymer hóa lớn, có khả năng phục hồi độ ẩm ban đầu,... Vì vậy, BC đƣợc ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực nhƣ: thực phẩm, công nghiệp dệt, công nghiệp giấy, mỹ phẩm, y học,... đáng chú ý nhất là trong sự kiểm soát các hệ thống vận chuyển thuốc. BC đã đƣợc sử dụng trong một vài hệ thống để phân phối thuốc ví dụ nhƣ: Amin et al. [7] đã báo cáo việc sử dụng màng BC làm màng bọc cho Paracetamol bằng cách sử dụng kĩ thuật phun phủ. Kết quả cho thấy, màng BC giúp cho thuốc đƣợc giải phóng một cách kéo dài làm tăng hiệu quả sử dụng của thuốc, Huang et al. [16] 2 nghiên cứu việc sử dụng màng BC cho việc kiểm soát in vitro của Berberine. Ngoài thẩm thấu qua da, thí nghiệm kiểm soát sự giải phóng thuốc Berberine qua màng BC còn đƣợc thử nghiệm mô phỏng trong dạ dày, ruột. Các kết quả thu đƣợc cho thấy, thuốc đã đƣợc giải phóng với một tốc độ chậm. Việc thiết kế hệ thống hấp thu và giải phóng thuốc dựa trên màng BC giúp thuốc đƣợc hấp thu vào màng BC tốt và đƣợc giải phóng một cách kéo dài, điều này có thể giúp tăng khả dụng sinh học của thuốc Famotidine trong điều trị bệnh nên chúng tôi đã chọn đề tài: “Nghiên cứu khả năng hấp thu và giải phóng thuốc Famotidine của màng Bacterial cellulose để phục vụ việc sử dụng qua đường uống”. 2. Mục đích nghiên cứu Thiết kế hệ thống hấp thu và giải phóng thuốc Famotidine dựa trên màng BC nhằm giúp thuốc đƣợc hấp thu vào màng BC tốt và đƣơc giải phóng một cách kéo dài, điều này có thể giúp tăng sinh khả dụng của thuốc. 3. Nhiệm vụ nghiên cứu  Thu sản phẩm BC từ môi trƣờng nuôi cấy và xử lý.  Thiết kế hệ thống hấp thu và giải phóng thuốc qua màng BC.  Đánh giá khả năng hấp thu và giải phóng thuốc thông qua hệ thống đƣợc thiết kế. 4. Vật liệu và phạm vi nghiên cứu  Vật liệu nghiên cứu: màng BC đƣợc thu từ các môi trƣờng lên men khác nhau, thuốc Famotidine dạng tinh khiết.  Phạm vi nghiên cứu: khả năng hấp thu và giải phóng thuốc Famotidine của màng BC để phục vụ việc sử dụng qua đƣờng uống in vitro.  Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu khoa học và Chuyển giao công nghệ, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2. 3 5. Phƣơng pháp nghiên cứu  Lên men thu màng BC từ một số môi trƣờng.  Xử lý màng BC trƣớc khi hấp thu thuốc.  Đánh giá độ tinh khiết của màng BC.  Đo bề dày màng.  Xác định các thông số tối ƣu của quá trình hấp thu thuốc Famotidine vào màng BC.  Xác định lƣợng thuốc hấp thu vào màng BC.  Xác định lƣợng thuốc giải phóng thông qua hệ thống đƣợc thiết kế.  Đánh giá động học giải phóng của thuốc qua màng BC.  Xử lý thống kê. 6. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn  Ý nghĩa khoa học: Tăng thêm hiểu biết về ứng dụng của màng BC; kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở để thực hiện các nghiên cứu sâu hơn về khả năng hấp thu cũng nhƣ giải phóng thuốc của màng BC trên nhiều loại thuốc khác nhau. Điều này có thể giúp làm tăng khả dụng sinh học, tăng hiệu quả điều trị của các loại thuốc đó.  Ý nghĩa thực tiễn: Việc sử dụng màng BC làm vật liệu để hấp thu và giúp giải phóng thuốc Famotidine từ từ, có thể làm tăng khả dụng sinh học của thuốc. 7. Đóng góp mới của luận văn  Đây là đề tài đầu tiên sử dụng màng BC làm hệ thống hấp thu, giải phóng thuốc Famotidine.  Kết quả nghiên cứu của đề tài có thể định hƣớng tạo hệ thống hấp thu thuốc, giải phóng thuốc với tốc độ chậm để tăng khả dụng sinh học của thuốc. 4 NỘI DUNG Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. BACTERIAL CELLULOSE (BC) 1.1.1. Cấu trúc màng BC Bacterial cellulose (BC) là sản phẩm trao đổi chất sơ cấp và chủ yếu tạo màng bảo vệ. BC là một chuỗi polymer không phân nhánh do các glucopyranose nối với nhau bằng liên kết β – 1,4 glucan (Hình 1.1). Những nghiên cứu đã cho thấy cấu trúc hóa học cơ bản của BC giống cellulose của thực vật (plant cellulose – PC), tuy nhiên chúng khác nhau về cấu trúc đại thể [9]. Hình 1.1. Cấu trúc của màng BC [12], [21] BC có đƣờng kính sợi nhỏ hơn 100A0 [17], nhỏ hơn rất nhiều so với các sợi cellulose thực vật (1/100) [11], [17]. BC có cấu trúc siêu mịn và độ chịu lực của nó gần bằng nhôm. Khi đem so sánh đƣờng kính của BC với đƣờng kính của các sợi nhân tạo cho thấy: kích thƣớc của BC còn nhỏ hơn cả kích thƣớc của sợi tổng hợp hóa học có đƣờng kính nhỏ nhất [15] (Hình 1.2). 5 Cellulose thực vật (x200) Bacterial cellulose (x20000) Hình 1.2. Cellulose thực vật và BC [28] Các chuỗi mới sinh của BC tập hợp lại hình thành nên các siêu sợi có độ rộng khoảng 1,5nm. Các siêu sợi này lại hình thành nên các vi sợi (Jonas and Farab, 1998), sau đó chúng đƣợc bó lại và hình thành nên các ribbon (Yamanaka và cộng sự, 2000). Kích thƣớc của các ribbon là 3 – 4 x 70 – 80nm [39]. Các BC khác nhau thƣờng có độ polymer hóa khác nhau thƣờng nằm trong khoảng 2000 đến 6000, trong một số trƣờng hợp lên đến 16000 – 20000. Trong khi đó mức polymer hóa trung bình của thực vật thƣờng nằm trong khoảng 13000 – 14000 [9]. Cấu trúc của BC phụ thuộc chặt chẽ vào điều kiện nuôi cấy. Khi nuôi cấy theo phƣơng pháp tĩnh, vi khuẩn tổng hợp những miếng cellulose trên bề mặt nuôi cấy tĩnh, tại ranh giới giữa bề mặt dịch lỏng và không khí giàu oxy. Màng BC thu đƣợc dẻo dai, dày, có màu trắng trong hơi ngả màu vàng. BC đƣợc tạo ra từ phƣơng pháp nuôi cấy tĩnh gọi là S – BC (Static – Bacterial cellulose) trong đó chuỗi xếp song song quanh trục. Các sợi cellulose liên tục đƣợc tạo ra từ những lỗ đƣợc xếp dọc trên bề mặt của tế bào vi khuẩn, kết lại thành các vi sợi và bị đẩy xuống sâu hơn trong môi trƣờng dinh dƣỡng. Các dải cellulose từ môi trƣờng tĩnh tạo nên các mặt phẳng song song, sợi S – BC kéo dài và chồng lên các sợi khác theo chiều đan chéo nhau không có tổ chức, 6 có vai trò chống đỡ cho quần thể tế bào A. xylinum. Khi nuôi cấy động, một lƣợng nhỏ cellulose đƣợc hình thành dƣới dạng huyền phù phân tán trong đó chuỗi β – 1,4 glucan xếp một cách ngẫu nhiên. BC đƣợc tạo ra bằng phƣơng pháp động dƣới dạng các hạt nhỏ, các sợi rối rắm, cong và không trật tự do sự dao động của môi trƣờng nuôi cấy, hoặc các hạt bông hình sao phân tán trong môi trƣờng gọi là A – BC (Agitade – Bacterial cellulose) [41]. Sự khác nhau về cấu trúc không gian ba chiều của hai dạng S – BC và A – BC đƣợc quan sát rõ ràng dƣới kính hiển vi điện tử quét (Hình 1.3). Ngoài ra, bề mặt cắt ngang của sợi A – BC (100 – 200nm) lớn hơn sợi S – BC (50 – 100nm). Sự khác nhau về hình thái giữa hai loại BC này làm mức độ kết tinh, kích cỡ kết tinh của chúng khác nhau [15]. Hình 1.3. Cấu trúc A – BC (a) và S – BC (b) [40] 7 1.1.2. Tính chất lý hóa của màng S – BC Hình dạng, kích thƣớc của sản phẩm BC rất đa dạng và có thể chủ động tạo ra kích thƣớc mong muốn. S – BC có tính chất cơ lý bền và ổn định nó giúp cho BC có thể chịu đƣợc sự tác động của môi trƣờng nhƣ khuấy trộn hoặc các áp lực. BC không tan trong môi trƣờng phản ứng. Giá thể BC có độ trƣơng nở tốt. Độ trƣơng nở giúp cho sự khuếch tán của cơ chất và sản phẩm. Môi trƣờng trong và ngoài chất mang không có sự khác biệt. BC đã qua xử lý không gây tác động đến chất đƣợc hấp thu. Sau giai đoạn xử lý, BC chỉ là giá thể trơ về mặt hóa học, có độ trƣơng nở tốt. Màng BC có thể tái sử dụng nhiều lần trong ứng dụng làm chất mang, an toàn cho môi trƣờng sống [35]. 1.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo màng BC Nguồn cacbon: Cacbon có trong tế bào chất, thành tế bào, trong tất cả các phân tử enzyme, acid nucleic, và các sản phẩm trao đổi chất. Chính vì vậy, các nguồn hữu cơ có chứa cacbon có ý nghĩa hàng đầu trong đời sống vi sinh vật. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon đến năng suất sản xuất BC đƣợc thể hiện ở Bảng 1.1. Bảng 1.1. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon đến năng suất sản xuất màng BC Nguồn cacbon Năng suất tổng Nguồn cacbon Năng suất tổng monosaccharide hợp BC disaccharide hợp BC D – Glucose 100 Lactose 16 D – Fructose 92 Maltose 7 D – Galactose 15 Surcrose 33 D – Xylose 11 Cellobiose 7 – 11 D – Arabinose 14 D – Sorbose 11 8 Nguồn nitơ: Ý nghĩa chủ yếu của nguồn nitơ là cung cấp nguyên liệu cho cơ thể sinh vật để hình thành nhóm amin (-NH2 và -NH-) trong các phân tử aminoacid, nucleotit, các bazơ dị vòng [27]. Nguồn nitơ dễ hấp thu nhất với vi sinh vật là NH3 và NH4+. Vi sinh vật có khả năng đồng hóa rất tốt nitơ chứa trong các thức ăn hữu cơ. Nguồn nitơ vô cơ là (NH4)2SO4, NH4NO3, nguồn nitơ hữu cơ là pepton, cao nấm men [27]. Nguồn dinh dưỡng khoáng: Phospho bao giờ cũng chiếm tỉ lệ cao nhất trong số các nguyên tố khoáng của tế bào vi sinh vật. Phospho có mặt trong hầu hết các thành phần của tế bào. Để đảm bảo nguồn dinh dƣỡng phopho, ngƣời ta sử dụng các nguồn dinh dƣỡng phospho vô cơ nhƣ K2HPO4, KH2PO4, KNO3,... [27]. Ngoài ra còn nhiều nguyên tố vi lƣợng cũng ảnh hƣởng đến quá trình tạo màng BC nhƣ Mg, Fe, S, Na, Ca, Mn, Cl,... Một trong số nguyên liệu chủ yếu ngày nay đƣợc sử dụng để tạo màng BC là nƣớc dừa già, nƣớc vo gạo, dịch hoa quả, rỉ đƣờng,... nên khi nuôi cấy không cần phải bổ sung nguyên tố vi lƣợng nữa [27]. Các chất kích thích sinh trưởng: Các vitamin nhƣ pyrodoxine, acid nicotinic, p – aminobenzoic acid, biotin đƣợc xác định là cần thiết cho sự tăng trƣởng tế bào và tổng hợp cellulose, trong khi pantothenate và riboflavin cho kết quả ngƣợc lại [33]. Nƣớc dừa già là nguồn nguyên liệu chủ yếu đƣợc sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn thu màng BC. Tùy theo giống dừa, tuổi của quả dừa mà các thành phần hóa học trong nƣớc dừa có khác nhau. Lƣợng đƣờng khử tổng và protein trong nƣớc dừa tăng lên khi dừa càng chín. Đƣờng ở đây có thể là glucose, fructose, sucrose hay sirbitol. Ngoài ra, nƣớc dừa còn nhiều khoáng chất, vitamin, acid amin,... phù hợp cho quá trình hình thành màng BC [27]. Nƣớc gạo cũng là một trong những thành phần thích hợp để tạo màng BC vì trong nƣớc gạo chứa nhiều cacbonhydrat, các vitamin nhóm B, các nguyên tố vi lƣợng nhƣ Fe, Zn,... và acid amin. 9 Ngoài ra các điều kiện nuôi cấy nhƣ độ pH, nhiệt độ, độ thông khí, thời gian nuôi cấy,... cũng ảnh hƣởng đến quá trình hình thành màng BC. - Vi khuẩn A. xylinum phát triển thuận lợi trên môi trƣờng có pH thấp. Do đó môi trƣờng nuôi cấy thu màng BC cần đƣợc bổ sung thêm acid acetic nhằm acid hóa môi trƣờng, đồng thời nó có tác dụng sát khuẩn, giúp ngăn chặn sự phát triển của vi sinh vật có hại [22], [27], [38]. - Nhiệt độ thích hợp để nuôi cấy vi sinh vật tạo màng BC là từ khoảng 250C đến 300C. Ở nhiệt độ thấp quá, quá trình lên men xảy ra chậm. Nếu nhiệt độ quá cao sẽ ức chế hoạt động và đến mức nào đó sẽ đình chỉ sự sinh sản của tế bào và hiệu suất lên men sẽ giảm [18], [19], [21], [23]. - Vi khuẩn A. xylinum là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc nên điều kiện tiên quyết, quyết định đến năng suất tạo màng BC là độ thông khí. Lên men tĩnh cần sử dụng dụng cụ có bề mặt thoáng và lớp môi trƣờng mỏng [41]. - Tùy vào thời gian nuôi cấy để ngƣời ta thu đƣợc màng với độ dày mong muốn. Thƣờng 24h sau khi nuôi cấy sẽ xuất hiện lớp đục trên bề mặt, phía dƣới có những sợi tơ nhỏ hƣớng lên. Sau 36 – 48h sẽ hình thành lớp màng mỏng và ngày càng dày lên. 1.1.4. Ứng dụng của màng BC BC có độ tinh khiết cao, độ bền dai cơ học lớn, khả năng thấm hút nƣớc cao, có thể bị thủy phân bởi enzyme,... Vì vậy, BC đƣợc ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực công nghệ khác nhau nhƣ: thực phẩm, công nghiệp dệt, mỹ phẩm, công nghệ giấy, công nghệ pin,... đặc biệt trong lĩnh vực y học. Trong y học, màng BC thu đƣợc từ quá trình nuôi cấy tĩnh đƣợc nghiên cứu và sử dụng làm da nhân tạo. Ở Brazil, màng BC ƣớt tinh sạch đƣợc sản xuất và bán ra thị trƣờng nhƣ một loại da nhân tạo dùng đắp vết thƣơng [3]. Trƣờng Đại học Y dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh cũng nghiên cứu sử dụng màng BC có tẩm dầu mù u làm màng trị bỏng đƣợc thực nghiệm ở thỏ. Kết quả cho thấy