Tài liệu Nghiên cứu hoàn thiện quy trình ra ngôi cây dược liệu ba kích tím morinda officinalis now

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM =======o0o======= MUA A KHÁ Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU HOÀN THIỆN QUY TRÌNH RA NGÔI CÂY DƢỢC LIỆU BA KÍCH TÍM (MORINDA OFFICINALIS HOW ) GIAI ĐOẠN SAU IN VITRO TẠI TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÁI NGUYÊN” KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Nông Lâm Kết Hợp Khoa: Khoá học: Lâm Nghiệp 2011 – 2015 THÁI NGUYÊN – 2015 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM =======o0o======= MUA A KHÁ Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU HOÀN THIỆN QUY TRÌNH RA NGÔI CÂY DƢỢC LIỆU BA KÍCH TÍM (MORINDA OFFICINALIS HOW ) GIAI ĐOẠN SAU IN VITRO TẠI TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÁI NGUYÊN ” KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Nông Lâm Kết Hợp Khoa : Lâm Nghiệp Khoá học : 2011 - 2015 Giảng viên hướng dẫn:PGS. TS. Trần Thị Thu Hà THÁI NGUYÊN – 2015 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng kết quả và số liệu trong khóa luận là trung thực và chưa từng được công bố. Tôi xin cam đoan rằng các thông tin được trích dẫn trong khóa luận đều rõ nguồn gốc. Thái nguyên, ngày … tháng …năm 2015 NGƢỜI VIẾT CAM ĐOAN XÁC NHẬN CỦA GVHD Đồng ý cho bảo vệ kết quả trước Hội Đồng khoa học TS. Trần Thị Thu Hà Mua A Khá XÁC NHẬN CỦA GIẢNG VIÊN PHẢN BIỆN (ký, họ và tên) ii LỜI NÓI ĐẦU Hiện nay khoa học kỹ thuật ngày một phát triển, việc cần vận dụng các quá trình nghiên cứu về khoa học kỹ thuật ngày càng nhiều. Vậy mỗi sinh viên chúng ta được đào tạo từ trong nhà trường ra cần phải nắm rõ những kiến thức lý thuyết được học ở trên lớp và trong trường để vận dụng vào thực tế. Trong quá trình thực tập tốt nghiệp là một giai đoạn quan trọng cho mỗi sinh viên cần phải trải qua và vận dụng những kiến thức đã học được hoặc làm quen với những cái chưa được học đến để áp dụng vào thực tiễn sản xuất, từ đó tích lũy được nhiều kinh nghiệm, bổ xung thêm nhiều kiến thức nâng cao trình độ chuyên môn cho bản thân để phục vụ cho công việc sau này. Xuất pháp từ những nguyện vọng của bản thân mình, được sự nhất trí của Ban giám hiệu nhà trường và ban chủ nhiệm khoa Lâm nghiệp trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu hoàn thiện quy trình ra ngôi cây dƣợc liệu Ba kích tím (Morinda officinalis How ) giai đoạn sau in vitro” tại Viện nghiên cứu và phát triển Lâm nghiệp Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên. Để có được kết quả như ngày hôm nay tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường và ban chủ nhiệm khoa Lâm nghiệp trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi thực hiện đề tài. Đặc biệt tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và lòng biết ơn sâu sắc nhất cô giáo TS. Trần Thị Thu Hà cùng với sự giúp đỡ của anh KS. Nguyễn Quốc Đông người đã trực tiếp hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Trong quá trình thực tập mặc dù bạn thân tôi đã hết sức cố gắng nhưng do kinh nghiệm cũng như trình độ bạn thân còn hạn chế. Vì vậy đề tài không tránh khỏi những khuyết điểm và thiếu sót. Tôi rất mong được sự đóng góp ý kiến và sự chỉ bảo của các Thầy cô và các bạn để đề tài được hoàn thiện hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày…. Tháng… năm 2015 Sinh viên Mua A Khá iii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1. Kết quả ảnh hưởng của thời gian cảm ứng tới tỷ lệ sống của cây con sau khi 30 ngày ra ngôi............................................................................ 24 Bảng 3.2. kết quả nghiên cứu thành phần giá thể ruột bầu ảnh hưởng tới tỷ lệ sống của cây con ...................................................................................... 25 Bảng 3.3. kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thuốc trị nấm tới tỷ lệ sống cây con .................................................................................................... 26 Bảng 3.4. Kết quả cứu ảnh hưởng của chế độ che phủ nilon tới tỷ lệ sống của cây con ..................................................................................................... 26 Bảng 3.5 kết quả ảnh hưởng của các loại phân bón lá tới sự sinh trưởng và phát triển của cây con .............................................................................. 27 Bảng 4.1. Kết quả ảnh hưởng của thời gian cảm ứng tới tỷ lệ sống của cây con sau khi 30 ngày ra ngôi............................................................................ 29 Bảng 4.2. kết quả nghiên cứu thành phần giá thể ruột bầu ảnh hưởng tới tỷ lệ sống của cây con ...................................................................................... 32 Bảng 4.3. kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thuốc trị nấm tới tỷ lệ sống cây con .................................................................................................... 35 Bảng 4.4. Kết quả cứu ảnh hưởng của chế độ che phủ nilon tới tỷ lệ sống của cây con ..................................................................................................... 38 Bảng 4.5 kết quả ảnh hưởng của các loại phân bón lá tới sự sinh trưởng và phát triển của cây con sau 20 ngày phun bón .......................................... 41 iv DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 4.1: Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của thời gian cảm ứng tới tỷ lệ sống của cây Ba kích ...................................................................... 30 Hình 4.2: Hình ảnh các công thức thời gian cảm ứng ............................ 31 Hình 4.3. Biểu đồ biểu diễn mức độ ảnh hưởng của các giá thể đến tỷ lệ sống cây con Ba kích ..................................................................... 33 Hình 4.4. Ảnh hưởng của các giá thể đến tỷ lệ sống cây con Ba kích .... 34 Hình 4.5. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của thuốc trị nấm tới tỷ lệ sống cây con Ba kích .............................................................................. 36 Hình 4.6. Ảnh hưởng của thuốc trị nấm tới tỷ lệ sống cây con Ba kích . 37 Hình 4.7. Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của chế độ che phủ nilon tới tỷ lệ sống của cây con ............................................................................ 39 Hình 4.8. Ảnh hưởng của chế độ che phủ nilon tới tỷ lệ sống cây con .. 40 Hình 4.9. Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của các loại phân bón lá tới sự sinh trưởng và phát triển của cây con sau 20 ngày phun bón .......... 42 Hình 4.10. Ảnh hưởng của các loại phân bón lá tới sự sinh trưởng và phát triển của cây con sau 20 ngày phun bón ................................. 43 v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CT: Công thức. ĐC: Đối chứng. TN: Thí nghiệm. ĐV: Đơn vị. UBND: Ủy ban nhân dân. NAA: Napahlene acetit acid IAA: Acid indol ãetic BIA: Indol -3- butyric acid HSNN: Hệ số nhân nhanh BAP: Bezylamino purin vi MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................. i LỜI NÓI ĐẦU ................................................................................................. ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ................................................................ v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ................................................................ v Phần 1. MỞ ĐẦU ............................................................................................ 1 1.1. Đặt vấn đề................................................................................................... 1 1.2. Mục đích nghiên cứu .................................................................................. 2 1.3. Mục tiêu nghiên cứu................................................................................... 2 1.4.Ý nghĩa của đề tài ........................................................................................ 2 Phần 2. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU ......................................................... 4 2.1.Cơ sở khoa học ............................................................................................ 4 2.1.1. Nuôi cấy mô - tế bào thực vật trong in vitro ........................................... 4 2.1.2 Các giai đoạn chính trong nuôi cấy mô tế bào thực vật .......................... 4 2.1.2.1 Giai đoạn chuẩn bị ............................................................................... 5 2.1.2.2 Giai đoạn khử trùng mẫu, cấy khởi động............................................. 5 2.1.2.3 Giai đoạn tạo chồi và nhân nhanh chồi ................................................ 5 2.1.2.4 Giai đoạn tạo cây mô hoàn chỉnh ......................................................... 6 2.1.2.5 Giai đoạn chuyển cây in vitro ra ngoài vườn ươm ............................... 6 2.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả nuôi cấy ........................................... 7 2.1.4 . Các điều kiện vô trùng nuôi cấy mô trong in vitro ................................ 9 2.1.5. Những vấn đề nhân giống trong in vitro ............................................... 10 2.2. Nghiên cứu trồng cây Ba kích trong và ngoài nước ................................ 11 2.2.1. Nghiên cứu trên thế giới...................................................................... 11 2.2.2. Ở trong nước ........................................................................................ 13 2.3. Đặc trưng của cây Ba kích ....................................................................... 15 2.4. Công dụng của cây Ba kích...................................................................... 16 2.5. Điều kiện gây trồng cây dược liệu Ba kích .............................................. 18 2.6. Tổng quan về khu vực nghiên cứu ........................................................... 19 2.6.1. Địa điểm thực hiện đề tài ...................................................................... 19 PHẦN 3. ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 vii 3.1. Đối tượng, địa điểm, thời gian và phạm vi nghiên cứu ........................... 22 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................ 22 3.1.3. Thời gian tiến hành nghiên cứu ............................................................ 22 3.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 22 3.2.1. Nội dung 1. ............................................................................................ 22 3.2.2. Nội dung 2. ............................................................................................ 22 3.3. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 22 3.3.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm.............................................................. 22 3.3.2. Phương pháp theo dõi ........................................................................... 27 3.3.3. Phương pháp xử lý số liệu..................................................................... 28 Phần 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................. 29 4.1. Kết quả ảnh hưởng của thời gian cảm ứng tới tỷ lệ sống của cây con sau khi 30 ngày ra ngôi .................................................................................. 29 4.2. kết quả nghiên cứu thành phần giá thể ruột bầu ảnh hưởng tới tỷ lệ sống của cây con .............................................................................................. 31 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của loại thuốc trị nấm tới tỷ lệ sống của cây con ..................................................................................................... 35 4.4. Kết quả cứu ảnh hưởng của chế độ che phủ nilon tới tỷ lệ sống của cây con .. 38 4.5. Kết quả ảnh hưởng của các loại phân bón lá tới sự sinh trưởng và phát triển của cây con ...................................................................................... 40 Phần 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................ 44 5.1. Kết luận .................................................................................................... 44 5.1.1. Ảnh hưởng của thời gian cảm ứng đến đến tỷ lệ sống của cây con sau khi ra ngôi được 30 ngày ......................................................................... 44 5.1.2. Ảnh hưởng của thành phần giá thể ruột bầu đến tỷ lệ sống của cây con Ba kích ..................................................................................................... 44 5.1.3. Ảnh hưởng của loại thuốc trị nấm tới tỷ lệ sống của cây con............... 44 5.1.4. Ảnh hưởng của chế độ chăm sóc tới tỷ lệ sống của cây con ................ 44 5.1.5. Ảnh hưởng của các loại phân bón lá tới sự sinh trưởng và phát triển của cây con sau 20 ngày phun phân bón ........................................................ 45 5.2. Kiến nghị .................................................................................................. 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................... 466 1 Phần 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Cây Ba Kích Tím (Morinda officianalis How) là cây thuốc quý được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền và được tìm thấy ở một số tỉnh vùng núi phía Bắc như: Lạng sơn , Quảng Ninh và một số vùng khác… Ba kích là cây thân thảo, sống lâu năm, leo bằng thân quấn, tất cả các bộ phận của cây Ba kích điều được sử dụng làm thuốc chữa bệnh: Bổ thận âm, bổ thận dương, tăng cường gân cốt, khử phong thấp, tăng sức dẻo dai, tăng sức đề kháng, chống viêm. Dịch chiết cồn từ củ Ba kích có tác dụng giảm huyết áp, tác dụng nhanh đối với các tuyến cơ năng, bổ trí não, giúp ăn ngon, ngủ ngon [2]. Vì vậy trong những năm gần đây nhu cầu sử dụng loài cây dược liệu này ngày càng tăng nên nó bị khai thác kiệt quệ. Mặc khác, vùng phân bố của Ba kích bị tàn phá nghiêm trọng khiến loài cây này lâm vào tình trạng gần như bị tuyệt chủng và được đưa vào sách đỏ Việt Nam để được bảo vệ. Ngày nay cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật việc ứng dụng nuôi cấy mô tế bào trong nhân giống đã trở nên phổ biến. Nuôi cấy mô tế bào sẽ tạo ra hàng loạt cây giống sạch bệnh, chất lượng tốt, độ đồng đều cao, hệ số nhân lớn và giữ được đặc tính di truyền của cây mẹ. Góp phần bảo vệ các loại cây quý hiếm cũng như cung cấp đủ nguồn giống cây cho thị trường. Đây cũng chính là giải pháp để bảo tồn và phát triển giống cây quý hiếm này. Trong nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thì quy trình ra ngôi giai đoạn sau in vitrro là một giai đoạn rất quan trọng. Đây là giai đoạn để đưa cây con đã đủ điều kiện xuống nhà lưới để cảm ứng với môi trường ở bên ngoài và cấy vào giá thể đất. Vậy đưa ra được một quy trình kỹ thuật phù hợp cho cây ba kích để đảm bảo được số lượng và chất lượng từ khâu tạo giống đến trồng đại trà là 2 điều cần thiết, quy trình ra ngôi cho cây Ba kích tím ở giai đoạn sau in vitro là động tác kỹ thuật cần và quan trọng ảnh hưởng trực tiếp đến số lượng cây con Ba kích, làm tốt quy trình ra ngôi cho cây con Ba kích sẽ hạn chế được sự thất thoát cây con trong giai đoạn ra ngôi. Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn sản xuất cây Ba kích tím, việc thực hiện đề tài “Nghiên cứu hoàn thiện quy trình ra ngôi cây dƣợc liệu Ba kích tím (Morinda officinalis How) giai đoạn sau in vitro” là cần thiết. 1.2. Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình ra ngôi giai đoạn sau in vitro tạo cây Ba Kích tím hoàn chỉnh. 1.3. Mục tiêu nghiên cứu - Tối ưu hóa quá trình ra ngôi Ba kích tím. - Nghiên cứu sự ảnh hưởng của phân bón tới sinh trưởng và phát triển của cây con. 1.4.Ý nghĩa của đề tài * Trong học tập và nghiên cứu khoa học - Giúp sinh viên củng cố và hoàn thiện kiến thức cơ bản và những kiến thức đào tạo chuyên môn trong quá trình học tập trong nhà trường, đồng thời tạo điều kiện cho sinh viên có cơ hội tiếp cận với những kiến thức ở ngoài thực tế. - Giúp cho sinh viên vận dụng sáng tạo những kiến thức đã học vào thực tiễn và là tiền đề quan trọng để sinh viên thấy được những kiến thức cơ bản được bổ xung để phù hợp với thực tế hơn - Làm cơ sở khoa học để hoàn thiện quy trình ra ngôi sản xuất cây giống dược liệu Ba kích tím. 3 - Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ góp phần bổ xung thêm các thông tin, các dữ liệu khoa học về kỹ thuật ra ngôi sau in vitro làm tài liệu tham khảo cho công tác giảng dậy, nghiên cứu khoa học. - Đề tài giúp cho sinh viên có thêm nhiều kinh nghiện kiến thức bổ ích và tiếp cận với công tác nghiên cứu khoa học để phục vụ cho nghiên cứu và công tác sau này. * Trong thực tiễn sản xuất - Kết quả nghiên cứu đã góp phần hoàn thiện quy trình ra ngôi Ba kích tím. - Đề tài giúp tìm ra những biện pháp tối ưu giúp giảm thất thoát một tỷ lệ lớn cây giống trong giai đoạn ra ngôi. 4 Phần 2 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 2.1.Cơ sở khoa học 2.1.1. Nuôi cấy mô - tế bào thực vật trong in vitro Nhân giống vô tính in vitro là phương pháp sản xuất hàng loạt cây con từ các bộ phận của cây mẹ (các cơ quan, mô, tế bào), bằng cách nuôi cấy chúng trong ống nghiệm ở điều kiện vô trùng tuyệt đối có môi trường nước thích hợp và được kiểm soát Nuôi cấy mô - tế bào thực vật là kĩ thuật cho phép nuôi cấy dễ dàng những tế bào thực vật hay mô phân sinh sạch bệnh trong môi trường nhân tạo thích hợp để tạo ra những khối tế bào hay những cây hoàn chỉnh trong ống nghiệm. Nuôi cấy mô tế bào và bộ phận cơ quan thực vật trong môi trường dinh dưỡng vô trùng nhằm tạo cây hoàn chỉnh là một hướng nghiên cứu cơ bản và đang được ứng dụng rộng rãi trong chọn tạo giống cây trồng. Mặt khác nhân giống bằng kĩ thuật nuôi cấy in vitro (tiến hành trong điều kiện ổn định điều kiện dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ) nên chủ động được việc sản xuất cây giống không phụ thuộc vào mùa vụ, thời tiết và các điều kiện bất lợi khác. Song ưu thế nổi bật của kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào là có khả năng tạo giống cây khoẻ mạnh, sạch virus, có thể phục tráng các giống cây trồng quý hiếm. Hiện nay kĩ thuật này đã được ứng dụng trong nhiều giống cây trồng như cây nông nghiệp, cây công nghiệp, cây lâm nghiệp, cây dược liệu, cây hoa và cây cảnh [11]. 2.1.2 Các giai đoạn chính trong nuôi cấy mô tế bào thực vật Mẫu nuôi cấy có nhiều loại, nhưng thường dùng là đỉnh sinh trưởng (meristem). Công việc tiến hành theo trình tự: Mẫu cây (meristem) - Khử 5 trùng bề mặt - Rửa mẫu nhiều lần cho sạch chất sát trùng - Môi trường nuôi Tạo chồi - Tạo cụm chồi - Nhân giống - Ra rễ - Đưa ra vườn ươm. 2.1.2.1 Giai đoạn chuẩn bị Giai đoạn này được xem như là một bước thuần hoá vật liệu nuôi cấy. Vật liệu nuôi cấy (cây giống) được đưa ra khỏi nơi phân bố tự nhiên hoặc ra khỏi khu khảo nghiệm để chúng thích ứng với môi trường mới, giảm bớt nguồn bệnh và tạo điều kiện chủ động về nguồn mẫu vật cho công tác nuôi cấy. Trong điều kiện cần thiết có thể tác động các biện pháp trẻ hoá vật liệu nhân giống hoặc thụ phấn nhân tạo cho những loài rất khó thụ phấn trong điều kiện tự nhiên. 2.1.2.2 Giai đoạn khử trùng mẫu, cấy khởi động Giai đoạn này nhằm tạo ra mẫu sạch và non trẻ cho các giai đoạn nuôi cấy tiếp theo nên cần đảm bảo tỷ lệ mẫu nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt. Bộ phận của cây được chọn làm mô cấy phụ thuộc vào hình thức nhân giống thích hợp cho từng loài cây và đặc biệt đúng giai đoạn phát triển. Đỉnh sinh trưởng và chồi bên được sử dụng ở hầu hết các loại cây trồng. Ngoài ra chóp đỉnh và chồi non nảy mầm từ hạt cũng được sử dụng. Mẫu trước khi cấy vào môi trường cơ bản được làm sạch nguồn bệnh bằng cách rửa nhiều lần bằng nước sạch, sau đó ngâm trong dung dịch khử trùng ở nồng độ và thời gian thích hợp để làm sạch nguồn bệnh. Tuỳ thuộc vào từng vật liệu mà chọn hoá chất khử trùng khác nhau. Trong quá trình khử trùng mẫu phải đảm bảo không làm ảnh hưởng đến sức sống của mẫu cấy. Sau đó đặt mẫu vào môi trường tuỳ từng cây như MS, B5, NN… Khi nuôi cấy cần chú ý điều kiện ánh sáng, nhiêt độ, ẩm độ và có thể cả nồng độ CO2 thích hợp. 2.1.2.3 Giai đoạn tạo chồi và nhân nhanh chồi Đây là giai đoạn cực kỳ quan trọng và quyết định sự thành công của toàn bộ quá trình nhân giống. Trong giai đoạn này vai trò của chất điều hoà 6 sinh trưởng có đóng góp rất lớn kích thích tạo cụm chồi mà vẫn đảm bảo sức sống và bản chất di truyền của vật liệu nuôi cấy. 2.1.2.4 Giai đoạn tạo cây mô hoàn chỉnh Kích thích chồi ra rễ là giai đoạn quan trọng để có được cây hoàn chỉnh. Chồi hữu hiệu được chọn lựa đưa vào môi trường ra rễ. Môi trường tạo rễ thường giảm đi một nửa nồng độ các chất môi trường cơ bản nhằm hạn chế quá trình sinh trưởng, tập chung cho ra rễ, loại bỏ các chất kích thích tạo chồi, phân chia chồi và thay vào đó là một số Auxin kích thích tạo rễ. Tuỳ theo loại cây mà sử dụng các nồng độ Auxin cho phù hợp. Thông thường các chất NAA, IBA, IAA được sử dụng với hàm lượng từ 1,0-5,0mg/l để kích thích chồi ra rễ đối với một số cây thân gỗ. Một số trường hợp đặc biệt nếu chồi tạo ra quá nhỏ và ngắn, có thể sử dụng GA3 và một số hợp chất như nước dừa non, nước chiết khoai tây… bổ sung vào môi trường để đạt tiêu chuẩn cây con chuyển sang khu huấn luyện. 2.1.2.5 Giai đoạn chuyển cây in vitro ra ngoài vườn ươm Cây con đạt những tiêu chuẩn về hình thái nhất định (số lá, số rễ, chiều cao cây) sẽ được đưa ra ngoài huấn luyện một thời gian để thích ứng với điều kiện môi trường bên ngoài, sau đó chuyển từ ống nghiệm ra nhà kính hay nhà lưới, sau đó chuyển ra ngoài vườn ươm. Cây in vitro được nuôi cấy trong điều kiện ổn định về dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm, điều kiện vô trùng tốt nên khi chuyển ra ngoài với điều kiện tự nhiên hoàn toàn khác hẳn như dinh dưỡng thấp, ánh sáng có cường độ mạnh, nhiệt độ cao, ẩm độ thấp, cây con dễ bị stress, dễ mất nước và mau héo. Để tránh tình trạng này, vườn ươm cây cấy mô phải mát, cường độ chiếu sáng thấp, ẩm độ cao… Cây con thường được cấy trong luống ươm có cơ chế dễ thoát nước, tơi xốp, giữ được ẩm. Trong những ngày đầu cần phải phủ nilon để giảm thiểu quá trình thoát hơi nước của lá (thường 7-10 ngày kể 7 từ ngày cấy). Rễ tạo ra trong quá trình nuôi cấy mô sẽ dần bị lụi đi và rễ mới xuất hiện, cây con thường được xử lý thêm với các chất kích thích ra rễ bằng cách ngâm hoặc phun lên để rút ngắn thời gian ra rễ [11]. 2.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả nuôi cấy - Nhiệt độ: Là yếu tố quan trọng ảnh hưởng rõ rệt đến sự phân chia tế bào và các quá trình trao đổi chất trong nuôi cấy mô, nhiệt độ nuôi cấy thường được giữ ổn định ở 25± 20C; nhiệt độ nó còn ảnh hưởng tới hoạt động của Auxin. - Ánh sáng: Các nghiên cứu đã cho thấy ánh sáng rất cần thiết cho sự phát sinh phát triển hình thái của mẫu cấy. Các loại mẫu cấy khác nhau có nhu cầu về thời gian chiếu sáng, cường độ và ánh sáng khác nhau. Thời gian chiếu sáng với đa số các loài cây thích hợp là 12-18h/ngày. - Cường độ ánh sáng: Là yếu tố quan trọng tác động đến quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi cấy, với những cường độ ánh sáng khác nhau. Để kích thích mô nuôi cấy tạo mô sẹo có thể chiếu sáng hoặc không cần chiếu sáng (để trong tối), để mô sẹo sinh trưởng mạnh có thể chiếu sáng thấp - Độ ẩm: Trong các bình nuôi cấy thì độ ẩm tương đối luôn 100% nên ta không cần phải quan tâm nhiều đến vấn đề độ ẩm khi nuôi cấy. * Các chất điều tiết sinh trƣởng + Nhóm auxin: Được đưa vào môi trường nuôi cấy nhằm thúc đẩy sự sinh trưởng và giãn nở của tế bào, tăng cường các quá trình sinh tổng hợp và trao đổi chất, kích thích hình thành rễ và tham gia vào cảm ứng phát sinh phôi vô tính.... Các loại auxin thường sử dụng cho nuôi cấy: IAA (indol acid axetic), NAA (Naphthyl acid axetic), 2,4D (2,4-Dicloro phenoxy acid axetic) và IBA (Indol acid butyric). Các auxin khác có hàm lượng sử dụng từ 0,001 – 10mg/l. Chúng có hiệu quả sinh lý ở nồng độ thấp. Tùy theo loại auxin, hàm lượng sử dụng và đối tượng nuôi cấy... mà tác động sinh lý của auxin là kích 8 thích sinh trưởng của mô, hoạt hóa sự hình thành rễ hay thúc đẩy sự phân chia mạnh mẽ của tế bào dẫn đến hình thành mô sẹo (callus). Trong cây auxin được tổng hợp ở các mô non đặc biệt là lá đang phát triển và vùng đỉnh chồi . Từ những vùng này auxin được chuyển xuống các phần dưới của cây (Nguyễn Đức Thành và cs, 2000) [12]. + Cytokinin: Kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và sinh trưởng của hóa chồi bất định từ mô sẹo và cơ quan. Các Cytokinin thường được sử dụng trong nuôi cấy bao gồm: Zeatin [6-(4-hydroxy-3-metyl-but-2enylamino) purine]; Kinetin (6-furfurylamino purine); BAP (Bezylamino purine); TDZ (Thidiazuron); 2-ip (isopentenyl adenine). Hàm lượng Cytokinin sử dụng thường dao động từ 0,5-5,0mg/l. Ở những nồng độ cao hơn Cytokinin có tác dụng kích thích rõ rệt đến sự hình thành chồi bất định, đồng thời ức chế mạnh sự tạo rễ của chồi nuôi cấy. Trong các loại Cytokinin trên thì Kinetin và BAP được sử dụng rộng rãi nhất. Việc sử dụng tỷ lệ Auxin/ Cytokinin trong môi trường nuôi cấy quyết định sự phân hóa của mô theo hướng tạo rễ, tạo chồi hay mô sẹo (Nguyễn Đức Thành và cs, 2000) [2]. + Gibberellin: Vào thời điểm năm 2003, đã có 126 chất Gibberellin được biết đến thuộc nhóm Gibberellic acid thông dụng nhất trong nuôi cấy mô là GA3. Hợp chất này có tác dụng kích thích sự giãn tế bào theo chiều dọc, giúp kéo dài lóng đốt thân cây, phá ngủ của phôi, ức chế tạo rễ phụ cũng như tạo chồi phụ. Ngoài ra GA3 còn ảnh hưởng đến sự ra hoa của một số thực vật và rút ngắn thời gian sinh trưởng của cây. Tuy nhiên GA3 rất mẫn cảm với nhiệt độ, nó bị mất hoạt tính sinh lý tới 90% sau khi hấp vô trùng. Ngoài các chất có tác dụng kích thích trên còn có các chất có tác dụng ức chế sinh trưởng, phát triển khác như ABA, Etylen cũng gây ảnh hưởng khá rõ tới sự phát sinh hình thái của một số cây trồng trong nuôi cấy in vitro. Tuy nhiên 9 GA3 rất mẫn cảm với nhiệt độ, nó bị mất hoạt tính sinh lý tới 90% sau khi hấp vô trùng. Vì vậy muốn sử dụng GA3 thường phải đem lọc qua màng lọc vô trùng, sau đó đưa vào môi trường nuôi cấy. 2.1.4 . Các điều kiện vô trùng nuôi cấy mô trong in vitro * Vô trùng dụng cụ - Nồi hấp tiệt trùng: Dựa trên nguyên lý sức nóng của hơi nước ở áp suất và nhiệt độ cao (1,2-1,5 atm; 120-130oC). Phương pháp khử trùng ướt sử dụng thiết bị nồi hấp vô trùng là phương pháp hiệu quả và phổ biến trong khử trùng môi trường nuôi cấy và dụng cụ nuôi cấy, nhiệt độ thường dùng cho việc khử trùng là 121oC. - Tủ sấy (60-600oC): Dùng trong khử trùng khô cho các dụng cụ bằng kim loại, thuỷ tinh và các dụng cụ khác có tính chịu nhiệt (không bị cháy, nóng chảy…). Các dụng cụ trước khi đem sấy phải gói bằng giấy nhôm và chỉ được mở trong tủ cấy vô trùng. Ngoài ra tủ sấy còn được sử dụng để làm khô các dụng cụ thuỷ tinh hay dụng cụ cấy sau khi khử trùng ướt. - Dung dịch khử trùng: Để khử trùng vật liệu đưa vào nuôi cấy người ta thường sử dụng các dung dịch như: HgCl2, NaClO, Ca(OCl)2, H2O¬2, ... cồn được sử dụng để khử trùng mẫu sơ bộ và đốt các dụng cụ khi nuôi cấy (Nguyễn Đức Thành, 2000) [2]. - Buồng cấy vô trùng : Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, các thao tác với mẫu cấy được thực hiện trong buồng cấy vô trùng. Thiết bị này sẽ loại trừ một cách hiệu quả nguồn vi sinh vật lây nhiễm theo không khí và tạo điều kiên thoải mái cho người sử dụng. Buồng này làm việc theo nguyên tắc lọc không khí vô trùng qua màng và thổi không khí vô trùng về phía người ngồi thao tác. - Buồng nuôi cây : Yêu cầu chính của buông nuôi cây là phải đảm bảo nhiệt độ ổn định trong khoảng 250C (250 ± 2). Tùy theo loại cây mà yêu cầu 10 nhiệt độ khác nhau cho thích hợp, ánh sáng trên dàn nuôi phải là loại ánh sáng có phổ gần như ánh sáng tự nhiên (230-780nm). Cường độ chiếu sáng trên dàn nuôi tối thiểu phải đạt 2000-3000 lux. Trong buồng nuôi phải sạch sẽ, tránh tiếp xúc với bên ngoài. * Vô trùng mẫu cấy Phương pháp phổ biến hiện nay là sử dụng hóa chất có khả năng tiêu diệt vi sinh vật. Hiệu quả diệt nấm khuẩn của các chất này phụ thuộc vào thời gian, nồng độ xử lý và khả năng xâm nhập của chúng vào các ngõ ngách trên bề mặt mẫu cấy. Để tăng tính linh động của hóa chất diệt khuẩn, người ta thường sử dụng thêm các chất làm giảm sức căng bề mặt như tween 20, tween 80, fotoflo, teepol… có thể xử lý phối hợp với cồn 70%. Một hóa chất được lựa chọn cho quá trình vô trùng mẫu cấy phải đảm bảo 2 thuộc tính : Có khả năng diệt vi sinh vật tốt và không hoặc mức độ độc thấp đối với mẫu thực vật. 2.1.5. Những vấn đề nhân giống trong in vitro * Tính bất định về mặt di truyền Tính bất định về mặt di truyền là do tác động của một số chất kích thích sinh trưởng, tầm số biến dị là khác nhau và không lặp lại. Việc nuôi cấy mô sẹo, tế bào đơn thường có tần số biến dị cao hơn so với nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Tần số biến dị xảy ra còn phụ thuộc vào các yếu tố: - Kiểu di truyền hay giống cây nuôi cấy - Loại mô nuôi cấy - Số lần cấy chuyển nhiều hay ít, trong đó loại biến dị về nhiễm sắc thể sẽ cao khi thời gian nuôi cấy kéo dài, số lần cấy chuyển thấp và thời gian cấy chuyển giữa hai lần ngắn sẽ làm giảm khả năng gây biến dị. * Sự nhiễm mẫu Môi trường hoá học nuôi cấy mẫu rất giàu các chất hữu cơ và vô cơ nên cũng rất thuận lợi cho nấm bệnh phát triển, nếu không được vô trùng hoặc 11 môi trường nuôi cấy bị nhiễm mầm bệnh, vi sinh vật sinh trưởng nhanh hơn mẫu nuôi cấy, sử dụng các chất của môi trường đồng thời tiết ra các chất làm chết mẫu cấy Mẫu cấy được sống trong điều kiện môi trường tự nhiên nên có rất nhiều mầm bệnh, nguồn bệnh có thể tiềm ẩn ngay trong mẫu cấy, trong bình cấy, ống nghiệm, môi trường nuôi cấy và dụng cụ nuôi cấy. Mặc dù trước khi cấy mẫu được khử trùng nhưng chỉ tiêu diệt được vi sinh vật nấm, còn mẫu cấy bị nhiễm virut thì rất khó loại trừ. Vì vậy khi sử dụng mô phân sinh đỉnh sinh trưởng để nuôi cấy do vùng này chưa bị virut xâm nhiễm cũng như chưa phân hoá mô dẫn truyền nên mẫu cấy vừa sạch virut, vi khuẩn. * Sự thuỷ tinh thể Hiện tượng thuỷ tinh thể là một bệnh lý của cây, cây sẽ bị mất nước khi chuyển cây từ môi trường in vitro ra ngoài môi trường ngoài. Nguyên nhân là do cây in vitro có lớp sáp bên ngoài biểu bì mỏng, tế bào chứa nhiều phân tử có cực dễ dàng nhận các phân tử nước. Về cấu tạo khí khổng của cây thường có hình tròn thay vì hình elip như trong tự nhiên, khí khổng mở suốt trong quá trình nuôi cấy và mật độ khí khổng cao. Ngoài ra, nhu mô thịt lá và lớp mô bảo vệ mặt ngoài của lá kém phát triển, tế bào chất kém đậm đặc, diệp lục ít so với cây bình thường. Nên khi đưa cây ra môi trường bên ngoài với điều kiện tự nhiên hoàn toàn khác cây không thể thích nghi dẫn đến stress và chết có một số biện pháp hạn chế thuỷ tinh thể như sau: 2.2. Nghiên cứu trồng cây Ba kích trong và ngoài nƣớc 2.2.1. Nghiên cứu trên thế giới Ba kích là loài lâm sản ngoài gỗ có giá trị dược liệu và giá trị kinh tế cao đã được con người biết đến từ lâu. Ở Trung quốc, Ba kích được gây trồng và sử dụng cách đây hàng trăm năm. Nhưng những nghiên cứu về Ba kích còn rất hạn chế. Kết quả nghiên cứu Ba kích ban đầu được trình bày trong cuốn sách