Tài liệu Nghiên cứu định lượng kháng sinh erythromycin trong tôm, cá bằng kỹ thuật sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm.

MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................................. i TÓM TẮT LUẬN ÁN......................................................................................................... ii ABSTRACT ....................................................................................................................... iii LỜI CÁM ƠN..................................................................................................................... iv MỤC LỤC .......................................................................................................................... v DANH MỤC CÁC HÌNH ................................................................................................ viii DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................................................. x DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT................................................................................. xi TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI....................................................................................... 1 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU ................................................................................................ 3 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN ......................................................................... 4 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN................................................................................................ 6 1.1. Tồn dư kháng sinh đối với an toàn thực phẩm ............................................................. 6 1.1.1 Thực trạng về tình hình sử dụng kháng sinh trong thú y và chăn nuôi...................... 6 1.1.2 Ảnh hưởng của chất kháng sinh tồn dư đến chất lượng thực phẩm........................... 6 1.1.3 Những qui định về sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi – thú y................................ 7 1.2 Erythromycin và biến đổi của erythromycin trên cơ thể thủy sản ................................ 7 1.2.1 Erythromycin .............................................................................................................. 7 1.2.2 Chuyển hóa sinh học của erythromycin bởi Saccharopolyspora erythraea .............. 9 1.2.3 Chuyển hóa và đào thải erythromycin trên cơ thể thủy sản..................................... 11 1.2.4 Vì sao chọn đối tượng thủy sản trong nghiên cứu này là tôm càng xanh và cá rô phi ........................................................................................................................................... 14 1.3 Các kỹ thuật dùng để phân tích erythromycin............................................................. 15 1.3.1 Phương pháp ELISA ................................................................................................. 15 1.3.2 Phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ.................................................................. 16 1.3.3 Phương pháp Von-ampe ........................................................................................... 22 1.4 Những vấn đề tồn tại cần giải quyết ............................................................................ 28 CHƯƠNG II. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................. 29 v 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị dụng cụ, hóa chất ................................................................. 29 2.1.1 Nguyên vật liệu ......................................................................................................... 29 2.1.2 Thiết bị dụng cụ ........................................................................................................ 29 2.1.3 Hoá chất ................................................................................................................... 29 2.2 Phương pháp nghiên cứu ............................................................................................. 30 2.2.1 Sơ đồ tiến trình nghiên cứu ...................................................................................... 30 2.2.2 Phương pháp thực nghiệm ....................................................................................... 32 2.2.3 Phương pháp xử lý số liệu ........................................................................................ 39 CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ..................................................................... 40 3.1 Các điều kiện phù hợp cho quá trình định lượng erythromycin bằng phương pháp sóng vuông quét nhanh và stripping sóng vuông quét nhanh .................................................... 40 3.1.1 Nghiên cứu thăm dò định hướng và chọn vùng quét thế .......................................... 40 3.1.2 Nghiên cứu tìm dung dịch nền và pH thích hợp ....................................................... 41 3.1.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ dung dịch nền................................................. 49 3.1.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của dung môi hoà tan erythromycin ................................... 51 3.1.5 Nghiên cứu các điều kiện chạy máy thích hợp ......................................................... 53 3.1.6 Nghiên cứu ảnh hưởng của các ion gây nhiễu ......................................................... 63 3.1.7 Nghiên cứu xây dựng đường chuẩn.......................................................................... 63 3.1.8 Nghiên cứu lựa chọn quy trình trích ly mẫu............................................................. 66 3.2 Các thông số thẩm định phương pháp ......................................................................... 67 3.2.1 Khoảng tuyến tính..................................................................................................... 67 3.2.2 Giới hạn phát hiện.................................................................................................... 67 3.2.3 Độ đúng, độ chính xác, hiệu suất thu hồi ................................................................. 67 3.2.4 Đánh giá khả năng nhận danh erythromycin A với các kháng sinh khác................ 68 3.2.5 So sánh đối chứng kết quả SWV với LC-MS/MS ...................................................... 76 3.2.6 So sánh hiệu quả kinh tế giữa SWV với các phương pháp khác .............................. 78 3.3 Ứng dụng phân tích erythromycin trên các mẫu thực tế tôm, cá tại các địa phương.. 78 3.3.1 Tôm càng xanh ......................................................................................................... 79 3.3.2 Cá rô phi ................................................................................................................... 79 vi 3.4 Xác định quy luật chuyển hóa sinh học và đào thải kháng sinh erythromycin trên cơ thể thủy sản khi nuôi.......................................................................................................... 81 3.4.1 Đào thải erythromycin A trong cơ thịt thuỷ sản....................................................... 81 3.4.2 Chuyển hoá sinh học của kháng sinh gốc ................................................................ 85 KẾT LUẬN ....................................................................................................................... 91 KIẾN NGHỊ....................................................................................................................... 93 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ ......................................................................... 94 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 95 vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Công thức cấu tạo của erythromycin................................................................... 8 Hình 1.2: Chuyển hoá sinh học các dẫn xuất erythromycin.............................................. 10 Hình 1.3: Nguyên lý khái quát của kỹ thuật sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm. 25 Hình 1.4: Nguyên lý khái quát của kỹ thuật Stripping sóng vuông trên cực giọt chậm ... 27 Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu phân tích erythromycin ........................................................ 31 Hình 3.1: Các nhóm chức trong công thức cấu tạo của erythromycin .............................. 40 Hình 3.2: Phổ erythromycin ghi 5 lần trong nền đệm Amoni axetat 0,1 M; pH 8,0......... 41 Hình 3.3: Phổ erythromycin trên nền Natri axetat 0,1M................................................... 43 Hình 3.4: Phổ erythromycin ghi 5 lần trên nền Amoni axetat 0,1M................................. 44 Hình 3.5: Phổ erythromycin ghi 5 lần trên nền Citrat – Phosphat 0,1M........................... 45 Hình 3.6: Phổ erythromycin ghi 5 lần trên nền Borax 0,1M............................................. 46 Hình 3.7: Phổ erythromycin ghi 5 lần trên nền Tris 0,1M ................................................ 46 Hình 3.8: Phổ erythromycin ghi 5 lần trên nền Amoni axetat pH 8,0 .............................. 50 Hình 3.9: Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch nền Amoni axetat đến cường độ dòng của erythromycin A.................................................................................................................. 50 Hình 3.10: Phổ erythromycin ghi 5 lần khi dùng dung môi hòa tan ................................ 52 Hình 3.11: Phổ erythromycin theo chiều quét................................................................... 53 Hình 3.12: Phổ erythromycin ghi 5 lần ở Vstart ................................................................ 54 Hình 3.13: Ảnh hưởng của Vstart đến cường độ dòng của erythromycin A....................... 55 Hình 3.14: Phổ erythromycin ghi 5 lần ở Vstep ................................................................. 56 Hình 3.15: Ảnh hưởng của Vstep đến cường độ dòng của erythromycin A ....................... 56 Hình 3.16: Phổ erythromycin ghi 5 lần ở Vpulse................................................................. 57 Hình 3.17: Ảnh hưởng của Vpulse đến cường độ dòng của erythromycin A...................... 58 Hình 3.18: Phổ erythromycin ghi 5 lần ở Tdrop= 1.000 ms............................................... 59 Hình 3.19: Ảnh hưởng của Tdrop đến cường độ dòng của erythromycin A ....................... 59 Hình 3.20: Phổ erythromycin ghi 5 lần với Telectrolise ......................................................... 60 Hình 3.21: Ảnh hưởng của Telectrolise đến cường độ dòng của erythromycin A ................. 61 Hình 3.22: Phổ erythromycin ghi 5 lần ở Velectrolise .......................................................... 62 viii Hình 3.23: Ảnh hưởng của Velectrolise đến cường độ dòng của erythromycin A................. 62 Hình 3.24: Đường chuẩn erythromycin A trên dung dịch nền Amoni axetat 0,1 M, pH 8,0 ........................................................................................................................................... 65 Hình 3.25: Hiệu suất trích ly erythromycin trên tôm càng xanh khi so sánh các quy trình ........................................................................................................................................... 66 Hình 3.26: Hiệu suất trích ly erythromycin trên cá rô phi khi so sánh các quy trình ....... 66 Hình 3.27: Nồng độ erythromycin được xác định trên mẫu tôm càng xanh ở các thời điểm và mức nồng độ khác nhau ................................................................................................ 67 Hình 3.28: Nồng độ erythromycin được xác định trên mẫu cá rô phi ở các thời điểm và mức nồng độ khác nhau..................................................................................................... 68 Hình 3.29: Đường chuẩn erythromycin trên nền mẫu tôm càng xanh .............................. 76 Hình 3.30: Đường chuẩn erythromycin trên nền mẫu cá rô phi........................................ 76 Hình 3.31: Thực trạng nhiễm erythromycin ở tôm càng xanh tại các tỉnh ĐBSCL ........ 79 Hình 3.32: Thực trạng nhiễm erythromycin ở cá rô phi tại các tỉnh ĐBSCL ................. 79 Hình 3.33: Đào thải hàm lượng erythromycin A trong cơ thịt tôm càng xanh đã được cho ăn 50 và 100 mg.kg-1 thể trọng.ngày-1 trong 7 ngày ......................................................... 81 Hình 3.34: Đào thải hàm lượng erythromycin A trong cơ thịt cá rô phi đã cho ăn 50 và 100 mg.kg-1 thể trọng.ngày-1 trong 7 ngày ....................................................................... 82 Hình 3.35: Đường hồi quy tuyến tính và giới hạn chấp nhận 1 phía (95%), với độ tin cậy 95%, của nồng độ erythromycin A trong cơ thịt tôm càng xanh đã cho ăn erythromycin trong 7 ngày (100 mg.kg-1 thể trọng.ngày-1)...................................................................... 83 Hình 3.36: Đường hồi quy tuyến tính và giới hạn chấp nhận 1 phía (95%), với độ tin cậy 95%, của nồng độ erythromycin A trong cơ thịt cá rô phi đã cho ăn erythromycin trong 7 ngày (50 mg.kg-1 thể trọng.ngày-1) .................................................................................... 83 Hình 3.37: Đường hồi quy tuyến tính và giới hạn chấp nhận 1 phía (95%), với độ tin cậy 95%, của nồng độ erythromycin A trong cơ thịt cá rô phi đã cho ăn erythromycin trong 7 ngày (100 mg.kg-1 thể trọng.ngày-1). ................................................................................. 84 Hình 3.38: Con đường chuyển hoá sinh học các dạng erythromycin .............................. 89 ix DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Công thức phân tử và nhóm thế của các erythromycin ...................................... 8 Bảng 1.2: Mức dư lượng tối đa cho phép (MRL) của erythromycin trong sản phẩm thực phẩm theo quy định của từng thị trường nhập khẩu............................................................ 9 Bảng 1.3: Diễn biến đào thải erythromycin ra khỏi cơ thể cá hồi ở các thời điểm, đo mẫu cơ thịt + da cá (giá trị trung bình  độ lệch chuẩn, n=10) ................................................. 12 Bảng 1.4: Một số công trình nghiên cứu erythromycin trên thế giới ................................ 21 Bảng 2.1: Xây dựng đường chuẩn trên dung dịch nền ...................................................... 33 Bảng 3.1: Sự biến đổi cường độ dòng của erythromycin A theo loại dung dịch nền, và pH ........................................................................................................................................... 47 Bảng 3.2: Giá trị thế bán sóng E1/2 và cường độ dòng của erythromycin trong dung dịch đệm Amoni axetat pH 8,0.................................................................................................. 47 Bảng 3.3: Thế bán sóng đặc trưng của một số kháng sinh ................................................ 69 Bảng 3.4: So sánh kết quả phân tích mẫu tôm càng xanh bởi 2 phương pháp.................. 77 Bảng 3.5: So sánh kết quả phân tích mẫu cá rô phi bởi 2 phương pháp ........................... 77 Bảng 3.6: So sánh hiệu quả kinh tế giữa phương pháp SWV với một số phương pháp khác khi định lượng erythromycin ............................................................................................. 78 Bảng 3.7: Các dạng chuyển hóa sinh học của erythromycin theo thời gian trên cơ thịt tôm càng xanh đã được cho ăn ở liều 50 &100 mg.kg-1 thể trọng.ngày-1 trong 7 ngày......... 87 Bảng 3.8: Các dạng chuyển hóa sinh học của erythromycin theo thời gian trên cơ thịt cá rô phi đã được cho ăn ở liều 50 & 100 mg.kg-1 thể trọng.ngày-1 trong 7 ngày ................ 88 x DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AdSV: Adsorptive Stripping Voltammetry (Von-ampe stripping hấp phụ) APCI: Atmospheric Pressure Chemical Ionization (Ion hóa bằng hóa học ở áp suất khí quyển) APPI: Atmospheric Pressure Photoionization (Ion hóa quang ở áp suất không khí) ASC: Aquaculture Stewardship Council (Hội đồng quản lý nuôi trồng thuỷ sản) ASV: Anodic Stripping Voltammetry (Von-ampe stripping anod) ASV-PGCE: Adsorptive Stripping Voltammetric - Pretreated Glassy Carbon Electrode (Von-ampe stripping hấp phụ - điện cực tiền xử lý thuỷ tinh carbon) BAP: Best Aquaculture Practices (Thực hành thuỷ sản tốt nhất) CSV: Cathodic Stripping Voltammetry (Von-ampe stripping cathod) CV: Cyclic Voltammetry (Von-ampe tuần hoàn) DME: Dropping Mercury Electrode (Cực giọt thủy ngân rơi) DPV: Differential Pulse Voltammetry (Von-ampe xung vi phân) ECL: Capillary Electrophoresis Coupled With End-Column Electrochemiluminescence (ECL) (Điện di mao quản - đầu dò quang điện hóa) EIA: Enzyme ImmunoAssay (Phân tích miễn dịch enzyme) ESI: Electrospray Ionization (Ion hóa phun điện tử) EI-GC-MS: Electron Impact – Gas chromatography – Mass spectrometry (Sắc ký khí – Khối phổ sử dụng ion hóa điện tử) ELISA: Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (Phân tích miễn dịch hấp phụ enzyme) GC: Gas Chromatography (Sắc ký khí) GC-MS: Gas Chromatography – Mass Spectrometry (Sắc ký khí ghép khối phổ) Global GAP: Global Good Agriculture Practice (Thực hành nông nghiệp tốt toàn cầu) HLB: Hydrophilic-Lipophilic Balanced (Cân bằng dầu nước) HPLC: High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao) HPLC-ICPMS: High Performance Liquid Chromatography - Inductively Coupled Plasma Mass Spectroscopy (Sắc ký lỏng hiệu năng cao – ghép khối phổ cảm ứng plasma) xi KPH: Không phát hiện LC: Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng) LC-ESI/MS: Liquid Chromatography – Electrospray Ionisation-Mass Spectrometry (Sắc ký lỏng ghép khối phổ nguồn ion hóa phun điện tử) LC-MS/MS: Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng ghép khối phổ - Khối phổ) LLE: Liquid–Liquid Extraction (Chiết lỏng – lỏng) LoD: Limit Of Detection (Giới hạn phát hiện) LoQ: Limit Of Quantification (Giới hạn định lượng) MDL: Method Detection Limit (Giới hạn phát hiện của phương pháp) MSPD: Matrix Solid-Phase Dispersion (Phân tán nền phase rắn) PLE: Pressure Liquid Extraction (Chiết lỏng áp suất) RE: Relevant Error (Sai số liên quan) RSD: Relative Standard Deviation (Độ lệch chuẩn tương đối) = CV (Coefficient of Variation) SD: Standard Deviation (Độ lệch chuẩn) SPME: Solid-Phase Micro-Extraction (Vi chiết phase rắn) SPE: Solid-Phase Extraction (Chiết phase rắn) SWV: Square Wave Voltammetry (Von-ampe sóng vuông) UPLC: Ultra Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng siêu năng) UV/VIS: Ultra Violet / Visible (Tử ngoại / khả kiến) Viet GAP: Viet Nam Good Agriculture Practice (Thực hành nông nghiệp tốt Việt Nam) xii TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Một trong những vấn đề bức xúc về vệ sinh an toàn thực phẩm ở nước ta hiện nay là dư lượng kháng sinh trong vật nuôi, dư lượng kháng sinh trong thực phẩm vượt quá mức cho phép ảnh hưởng tới sức khỏe của người tiêu dùng và uy tín hàng xuất khẩu của chúng ta. Tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii), cá rô phi (Oreochromis niloticus) được xem là 2 trong số các loài thủy sản nước ngọt có giá trị kinh tế cao và quan trọng ở Việt Nam, đặc biệt là ở Đồng Bằng Sông Cửu Long. Chúng được nuôi ở dạng thâm canh, luân canh, xen canh trong ruộng lúa, trong mương vườn, kênh rạch ven sông, nuôi bán công nghiệp hoặc công nghiệp. Nhu cầu tiêu thụ nội địa và xuất khẩu ngày càng cao đã thúc đẩy người nuôi nuôi với quy mô lớn, mật độ dày và thức ăn công nghiệp được tăng cường sử dụng. Vì lẽ đó mà dịch bệnh là điều không thể tránh khỏi ở những mô hình không được kiểm soát như thế. Do tính chất kháng khuẩn mạnh của erythromycin từ lâu nó đã được dùng để phòng và trị bệnh trên tôm cá. Do nông dân trong quá trình nuôi tôm càng xanh và cá rô phi có sử dụng erythromycin và không tuân thủ thời gian ngưng thuốc trước thu hoạch nên để lại sản phẩm có dư lượng vượt mức cho phép. Theo quy định của Codex, WHO/FAO, EU, Mỹ, Canada, Australia, v.v thì dư lượng erythromycin trong sản phẩm thủy sản nhìn chung phải nhỏ hơn 30 ppb. Theo thông tư số 15/2009/TT-BNN ngày 15/03/2009 của Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn Việt Nam, erythromycin thuộc nhóm kháng sinh hạn chế sử dụng, với mức dư lượng tối đa cho phép là 200 ppb. Hiện đã có nhiều phương pháp xác định dư lượng kháng sinh erythromycin trong các sản phẩm thủy sản như ELISA, LC-MS/MS. Tuy nhiên các phương pháp này đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền, thời gian phân tích kéo dài, chi phí hóa chất dùng trong chuẩn bị mẫu đo khá tốn kém…Mục tiêu và nội dung thứ nhất đặt ra là phải tìm được phương pháp phân tích dư lượng kháng sinh trong sản phẩm thủy sản với chi phí thấp, nhanh, độ tin cậy và tính chính xác cao, có khả năng tái khẳng định erythromycin. 1 Việc lấy mẫu phân tích dư lượng xem có đạt hay không đạt giới hạn cho phép chỉ là giải pháp tình thế (bị động). Việc hướng đến một nguồn nguyên liệu thực phẩm an toàn là phải chủ động kiểm soát ngay từ đầu trong khi nuôi, cụ thể là sử dụng kháng sinh mức liều lượng nào và thời gian ngưng thuốc trước thu hoạch bao lâu là phù hợp. Xét thấy chưa có bất kỳ nghiên cứu nào được công bố về quá trình đào thải, chuyển hóa, thời gian ngưng kháng sinh erythromycin trước thu hoạch trên đối tượng tôm càng xanh, cá rô phi. Vậy nên mục tiêu và nội dung thứ hai trong đề tài này sẽ tiến hành là nghiên cứu thời gian đào thải, chuyển hóa của erythromycin trong cơ thịt tôm càng xanh và cá rô phi nhằm rút ra được quy luật và ước lượng được thời gian ngưng thuốc trước thu hoạch an toàn. Từ hai yêu cầu trên, chúng tôi đã chọn đề tài “Nghiên cứu định lượng kháng sinh Erythromycin trong tôm, cá bằng kỹ thuật sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm và khả năng đào thải” nhằm tìm 1 hướng đi mới trong kiểm soát dư lượng kháng sinh góp phần đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm. 2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Một là, trên thiết bị ANALYZER SQF 505 do Việt Nam sản xuất xây dựng được phương pháp phân tích erythromycin bằng kỹ thuật sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm đáp ứng tiêu chuẩn an toàn thực phẩm quốc tế đồng thời đạt yêu cầu phân tích nhanh, đơn giản và giảm chi phí phân tích. Hai là, nghiên cứu đào thải, chuyển hóa của erythromycin trong cơ thịt thủy sản (tôm càng xanh, cá rô phi), từ đó xác định được quy luật về thời gian thu hoạch an toàn khi sử dụng erythromycin. 3 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN  Ý nghĩa khoa học: 1. Lần đầu tiên ở Việt nam và trên thế giới tiến hành nghiên cứu khả năng sử dụng kỹ thuật sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm để phân tích định tính và định lượng kháng sinh eythromycin trong các đối tượng mẫu thủy sản là cá rô phi và tôm càng xanh. 2. Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng trong dung dịch đệm vùng kiềm nhẹ, erythromycin cho một sóng khử rõ và ổn định ở vùng thế khoảng -1,4 V. Có thể dùng sóng này cho mục đích phân tích định tính và định lượng erythromycin trong các đối tượng mẫu khác nhau. Sự xuất hiện của sóng này là do sự khử của nhóm C = O thứ hai trong phân tử erythromycin liên kết với nhóm ái điện tử chứa nguyên tử oxi bên cạnh. Quá trình khử là không hoàn toàn thuận nghịch với sự trao đổi hai điện tử. 3. Phát hiện trong điều kiện thích hợp có sự hấp phụ của erythromycin trên bề mặt giọt thủy ngân. Có thể dùng hiệu ứng này để tiến hành phân tích erythromycin ở các nồng độ rất thấp bằng kỹ thuật stripping hấp phụ trên cực giọt chậm hay cực ngồi, cực treo. 4. Đã nghiên cứu và chọn được dung dịch nền thích hợp, các thông số chạy máy tối ưu, quy trình chuẩn bị mẫu đo hợp lý để phân tích erythromycin trong các mẫu tôm càng xanh, cá rô phi có kết quả tin cậy. Các số liệu đã được so sánh với kỹ thuật phân tích truyền thống LC-MS là có sự tương đồng. 5. Erythromycin A khi vào cơ thể tôm cá có sự chuyển hoá sinh học sang các dẫn xuất khác như erythromycin C, E, F. Từ đây đưa ra được giả thuyết giải thích cơ chế chuyển hoá sinh học erythromycin trong tôm càng xanh, cá rô phi khi nuôi.  Ý nghĩa thực tiễn: 1. Đã nghiên cứu xây dựng thành công quy trình phân tích định tính và định lượng erythromycin trong tôm càng xanh và cá rô phi bằng kỹ thuật sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm với máy ANALYZER SQF-505 do Việt Nam sản xuất với chi phí phân tích rẻ hơn, thao tác dễ dàng hơn các kỹ thuật khác của nước 4 ngoài. Các số liệu đã được kiểm chứng với các kết quả phân tích bằng các phương pháp hiện đại khác. 2. Kết quả này có thể giúp các nhà sản xuất kinh doanh ở các địa phương có phương tiện để kiểm soát kháng sinh từ gốc (thức ăn, môi trường, hóa chất, tôm cá trong quá trình thu mua, chế biến,…) nhằm tạo ra các sản phẩm có uy tín quốc tế. 3. Sự thành công bước đầu này có thể mở ra một hướng nghiên cứu mới sử dụng kỹ thuật sóng vuông quét nhanh đơn giản, không quá tốn kém để phân tích nhiều kháng sinh khác trong các đối tượng thủy sản khác nhau nhằm giúp các địa phương tự giám sát tốt vấn đề này. 4. Cũng nhờ kỹ thuật này chúng tôi có thể nghiên cứu được quá trình đào thải của erythromycin của tôm càng xanh và cá rô phi, từ đó rút ra thời gian ngưng thuốc thích hợp trước khi thu hoạch để bảo đảm có được sản phẩm an toàn. 5 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN 1.1 Tồn dư kháng sinh đối với an toàn thực phẩm 1.1.1 Thực trạng tình hình sử dụng kháng sinh trong thú y, chăn nuôi, thuỷ sản a) Dùng kháng sinh để điều trị và phòng bệnh cho gia súc, gia cầm và thuỷ sản. b) Những kháng sinh được bán trên thị trường không ít loại không đảm bảo hàm lượng và chất lượng cho nên việc điều trị và phòng bệnh ít hiệu quả. Người chăn nuôi phải dùng nhiều loại kháng sinh khác nhau để phòng và chữa bệnh. Phần lớn phác đồ trị liệu là do kinh nghiệm hoặc do sự quảng cáo của các nhà sản xuất và nhà phân phối. Người nuôi đã biết cách chuyển hướng sử dụng kháng sinh, từ kháng sinh cấm sử dụng sang kháng sinh hạn chế sử dụng. Vì vậy đã gây nên sự lạm dụng kháng sinh và do đó dễ dẫn đến sự kháng thuốc của một số vi khuẩn gây bệnh . Trên thị trường thuốc thú y, thuỷ sản hiện nay đang lưu hành rất nhiều loại kháng sinh được bào chế dưới nhiều dạng khác nhau như thuốc tiêm, thuốc uống, thuốc bột bổ sung vào thức ăn và nước uống. Phần lớn các cơ sở chăn nuôi đều sử dụng kháng sinh trong một thời gian tương đối ngắn trong một liệu trình từ 2-5 ngày, nhưng cũng có cơ sở sử dụng kháng sinh liên tục trong một thời gian khá dài. Điều này do ý thức tự phát, hoàn toàn không có những qui định ràng buộc nào về thời gian sử dụng và loại kháng sinh sử dụng . 1.1.2 Ảnh hưởng của kháng sinh tồn dư đến chất lượng thực phẩm Do việc sử dụng kháng sinh một cách bừa bãi, bản thân một số loại kháng sinh có thể gây những hậu quả xấu cho năng suất chăn nuôi trong việc sử dụng kháng sinh lâu dài hoặc sử dụng quá liều lượng qui định có thể gây ra cho vật nuôi những ảnh hưởng như sau: - Gây kháng thuốc đối với một số loài vi khuẩn gây bệnh. Những nghiên cứu gần đây cho thấy hầu hết các vi khuẩn như E.coli, Staphylococcus, Salmonella đều đề kháng với các loại kháng sinh thông thường với mức độ khác nhau. - Sự tồn dư kháng sinh trong các sản phẩm chăn nuôi ảnh hưởng đến sức khỏe người dân. Ở các nước tiên tiến người ta nghiêm cấm sử dụng một số loại kháng sinh dùng 6 để trị bệnh cho người để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi. Lý do nếu cho phép sử dụng các loại kháng sinh này và nếu nó còn tồn dư trong thực phẩm nó dễ gây kháng thuốc nếu dùng các loại kháng sinh này trong trị liệu cho con người. Giới hạn tối đa cho phép dư lượng kháng sinh (MRL, Maximum Residue Limit) được áp dụng nhằm không gây ảnh hưởng lên người sử dụng. 1.1.3 Những qui định về sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi – thú y - Ở nước ta có qui định có tính chất pháp lý đối với việc sử dụng kháng sinh nhằm mục đích như: kích thích sinh trưởng vật nuôi, tăng hiệu quả sử dụng thức ăn cũng như sử dụng kháng sinh nhằm phòng và chống một số bệnh trên gia súc, gia cầm, thuỷ sản theo các chương trình quản lý chất lượng thực hành nông nghiệp tốt toàn cầu (Global GAP) và thực hành nông nghiệp tốt Việt Nam (Viet GAP). Tuy nhiên việc giám sát còn thiếu kiên quyết nên việc sử dụng kháng sinh để phòng và chữa bệnh cho thuỷ sản còn có nơi, có lúc rất tuỳ tiện làm cho dư lượng vượt mức cho phép. - Ở nước ngoài: Tổ chức FAO, WHO thường xuyên tư vấn và khuyến cáo các nước về hàm lượng kháng sinh cho phép tồn dư trong thịt, sữa và các sản phẩm có nguồn gốc động vật. Khối Cộng Đồng Châu Âu cũng có những qui định về các loại thuốc kháng sinh được phép sử dụng và không được phép sử dụng. Tóm lại, việc sử dụng thuốc kháng sinh trong chăn nuôi là khó tránh khỏi và cần thiết trong phòng, trị bệnh cho vật nuôi. Tuy nhiên, phải sử dụng những kháng sinh được phép và phải tuân thủ liều lượng, thời gian ngưng thuốc trước thu hoạch nhằm bảo đảm an toàn vệ sinh thực phẩm cho người tiêu dùng trong nước và đáp ứng tiêu chuẩn xuất khẩu. 1.2 Erythromycin và biến đổi của erythromycin trên cơ thể thuỷ sản 1.2.1 Erythromycin Erythromycin là nhóm kháng sinh macrolide gồm erythromycin A, B, C, D, E, F. Tất cả được tạo ra từ Sacchropolyspora erythraea bằng con đường lên men. Sản phẩm chính của quá trình lên men này là erythromycin A, còn lại là các erythromycin khác (≤ 5%). Cấu tạo của erythromycin chứa 2 phân tử đường là desosamin và 7 cladinose gắn vào erythronolide. Nó dễ dàng hút ẩm và tan ít trong nước (0,2%). Erythromycin hoạt hóa ở pH kiềm hơn là pH trung tính và không bền ở pH acid. Bảng 1.1: Công thức phân tử và nhóm thế của các erythromycin Erythromycin A B C D E F Công thức phân tử C37H57NO13 C37H57NO12 C38H55NO13 C36H65NO12 C37H67NO13 C37H67NO14 Phân tử lượng 734 718 720 704 748 750 R1 R2 R3 R4 R5 OH H OH H OH OH H H H H H H H H OCH3 OCH3 OH OH OCH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 OH -O- H Hình 1.1: Công thức cấu tạo của erythromycin Erythromycin còn tồn tại ở các dẫn xuất dạng muối và ester như: erythromycin stearate (ES), erythromycin ethylsuccinate (EESC), propionyl erythromycin (PE), erythromycin estolate (EES), erythromycin lactobionate (EL), erythromycin glucoheptonate (EG), erythromycin ethyl carbonate (EEC) và erythromycin acistrate. Erythromycin có tác dụng diệt khuẩn bởi quá trình ức chế tổng hợp protein. Nó tác động lên quá trình dịch mã bằng cách dính kết với tiểu đơn vị ribosom 50S. Erythromycin có thể dẫn đến xuất hiện các vi khuẩn đề kháng thông qua quá trình methyl hóa hoặc đột biến ở tiểu đơn vị 23S của RNA ribosom, hoặc protein của ribosom hoặc thông qua quá trình làm sai lệch các gen mef ở các loài vi khuẩn Gram [+] [1]. Theo nghiên cứu của Tardre và cộng sự (1969) thì erythromycin có tác dụng diệt khuẩn tốt ở các loài vi khuẩn Gram [+] và hiệu quả trong việc chữa trị nhiễm khuẩn Staphylococcus mà đã kháng lại Penicillin. Mycoplasma, Staphylococcus, Streptococcus, Neisseria, Haemophylus, Corynebacterium, Listeria, Pasteurella multocida, Brucella, Rickettsia, Treponema rất nhạy cảm với erythromycin [2]. Erythromycin được sử dụng rộng rãi để chữa nhiễm khuẩn ở người và động vật. 8 Erythromycin thường dùng ở dạng estolate, ethylsuccinate, gluceptate, lactobionate và stearate. Trong thú y, erythromycin được dùng chữa lâm sàng và cận lâm sàng cho chứng viêm vú bò; chữa các bệnh liên quan đến tiêu hóa và hô hấp ở trâu bò, gia cầm. Erythromycin có thể được sử dụng riêng lẻ, hoặc kết hợp với các kháng sinh khác như penicillin, colistin sulfate, sulfonamides và tylosin. Erythromycin được đưa vào cơ thể qua nước uống, thức ăn, tiêm vào cơ thịt. Liều sử dụng tối đa trong thú y là 100 mg/kg thể trọng/ngày [3]. Bảng 1.2: Mức dư lượng tối đa cho phép (MRL) của erythromycin trong sản phẩm thực phẩm theo quy định của từng thị trường nhập khẩu Mẫu MRL (ppb) Codex FAO/WHO EU US Canada Australia (2008) (2006) (2008) (2005) (2009) (2009) * ** *** **** ***** ****** Cơ thịt 100 100 200 100 30 300 Gan 100 100 200 100 30 300 Thận 100 100 200 100 30 300 Mỡ 100 100 200 100 30 300 Trứng 50 50 150 25 30 300 * http://www.codexalimentarius.net/vetdrugs/data/vetdrugs/details.html?id=85&print=true ** http://apps.who.int/ipsc/database/evaluations/chemical.aspx?chemID=3938 ***http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2010/11/WC500099151.pdf **** http://www.fda.gov/downloads/Drugs/DrugSafety/DrugShortages/UCM180747.pdf ***** Fish products standards and methods manual, amended No.14, 17/11/2009, Canadian Food Inspection Agency. ****** www.foodstandards.gov.au/foodstandard Năm 1985 Kibwage đã nghiên cứu đánh giá khả năng ức chế trên vi khuẩn gram [+] và gram [-] của erythromycins A, B, C, và D. Thí nghiệm được tiến hành trên 21 loài vi khuẩn gram [+] và 15 loài vi khuẩn gram [-]. Kết quả thấy erythromycin B có khả năng ức chế vi khuẩn kém hơn so với erythromycin A, khả năng ức chế vi khuẩn của erythromycin C và D chỉ bằng 50% erythromycin A [4]. 1.2.2 Chuyển hóa sinh học của erythromycin bởi Saccharopolyspora erythraea Mironov và cộng sự (2004) có nghiên cứu cơ chế chuyển hoá sinh học erythromycin bởi Saccharopolyspora erythraea. Erythromycin A (ErA) trong thành phần cấu trúc gồm có 3 phần: 1 vòng lactone và 2 phân tử đường deoxy là D- 9 desosamine và L-cladinose (CH3-O-3-mycarose), bám vào vòng lactone. Con đường chuyển hoá sinh học erythromycin A qua 2 giai đoạn (hình 1.2). Hình 1.2: Chuyển hoá sinh học các dẫn xuất erythromycin EryA, EryF, EryB, EryC, EryG, và EryK là các protein (enzymes) Giai đoạn thứ nhất, polyketide synthase (PKS) xúc tác quá trình trùng ngưng phần đoạn khởi đầu propionyl-CoA, với [S]-methylmalonyl-CoA, để tạo nên βketoester. 6 phân tử methyl-malonyl-CoA sẽ thêm vào phân tử ketoester. Trong suốt quá trình thiết lập mạch polyketide, các nhóm carboxyl tự do của methylmalonyl-CoA sẽ trải qua quá trình khử carboxyl; kết quả là chỉ có các phân tử propionate được tạo ra ở mạch cuối cùng. Tại cuối mỗi chu kỳ bổ sung methylmalonyl-CoA, nhóm keto sẽ bị khử thành 1 nhóm hydroxy (ngoại trừ nhóm keto của nhóm propionate thứ 3). Khung carbon của đơn vị propionate thứ 4 sẽ trải qua quá trình khử triệt để, với sự tham gia của 3 enzyme khác nhau để cấu thành PKS module 4, hoạt động theo thứ tự (dehydratase, enoyl reductase, và ketoreductase). Việc hình thành mạch polyketide được kết thúc bằng quá trình khép vòng (được xúc tác bởi thioesterase), với việc tạo 10 nên 6-deoxyerythronolide B (dE-B), sản phẩm trung gian này sẽ không bám vào phức đa enzyme của PKS. Giai đoạn thứ hai, dE-B được chuyển hoá theo 1 loạt các phản ứng được xúc tác bởi stereospecific hydroxylases, glycosyltransferases và methyltransferases. Quá trình hydroxyl hoá các tiền chất ErA bị tác động bởi 2 hệ enzyme cytochrome P-450 monooxigenase, đó là P450 eryF và P450 eryK. P450 eryF là 1 protein hoà tan xúc tác đặc hiệu 6-[S]-hydroxylation của dE-B thành erythronolide B (E-B). Hai phân tử đường được thêm vào E-B: thêm vào L-mycarose để hình thành 3α-mycarosylerythronolide B (ME-B), và việc thêm vào D-desosamine để thành ME-B tham gia sản sinh sinh ra erythromycin D (ErD). ErD chuyển hoá thành ErA bởi 2 đường hướng. Đường hướng đầu tiên bao gồm quá trình O-methylation ở C-3 của mycarose, hình thành nên erythromycin B (ErB), sau đó là quá trình hydroxyl hoá ở C-12 của vòng lactone, tạo thành ErA. Đường hướng thứ hai, ErD được hydroxyl hoá đầu tiên thành erythromycin C (ErC), sau đó là methyl hoá thành ErA. Cả 2 phản ứng methyl hoá được xúc tác bởi cùng enzyme, Omethyltransferase. Các phản ứng hydroxyl hoá được xúc tác bởi protein EryK [5]. 1.2.3 Chuyển hóa và đào thải erythromycin trên thủy sản 1.2.3.1 Ở loài cá hồi vân (Trout) - Oncorhynchus mykiss Nhóm nghiên cứu của Esposito (2006) đã đánh giá quá trình đào thải erythromycin trên cá hồi vân dòng Oncorhynchus mykiss sau khi ăn thức ăn có chứa 100 mg erythromycin/kg trọng lượng/ ngày trong vòng 21 ngày, ở nhiệt độ 11,5 oC. Dư lượng erythromycin trong cơ thịt và da cá được phân tích bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ LC-ESI-MS/MS. Kết quả cho thấy động học đào thải erythromycin ra khỏi cơ thể cá hồi Oncorhynchus mykiss ở các thời điểm khác nhau (bảng 1.3). Trên cơ sở đó các tác giả đã rút ra được thời gian ngưng thuốc là 255 °C_ngày sau khi được cho ăn 21 ngày với liều 100 mg erythromycin/ kg trọng lượng/ngày [6]. 11 Bảng 1.3: Diễn biến đào thải erythromycin ra khỏi cơ thể cá hồi Đo mẫu cơ thịt + da cá (giá trị trung bình  độ lệch chuẩn, n=10) Thời gian o Ngày C_ngày 0,13 1,44 0,50 5,75 1,00 11,50 2,00 23,00 4,00 46,00 7,00 80,50 10,00 115,00 20,00 230,00 30,00 345,00 Hàm lượng erythromycin trong phần cơ thịt + da cá hồi (mg/kg) 45,37 ± 6,46 50,00 ± 21,56 34,96 ± 10,50 17,50 ± 9,56 7,14 ± 6,68 0,56 ± 2,25 0,33 ± 1,16 0,10 ± 0,10 0,07 ± 0,03 1.2.3.2 Ở loài cá hồi (Salmon) - Oncorhynchus tshawytscha Nhóm nghiên cứu của Moffitt (1988) đã nghiên cứu sự tích lũy và đào thải của erythromycin thiocyanate trên cá hồi Oncorhynchus tshawytscha. Các con cá hồi non được ăn thức ăn có erythromycin thiocyanate trong 21 ngày với liều 0,05 hoặc 0,1 g erythromycin/kg thể trọng. Sau đó tiến hành xác định dư lượng erythromycin trong gan, lá lách, thận, cơ thịt đỏ, cơ thịt trắng, huyết tương theo định kỳ, trong suốt thời gian dùng thuốc và sau ngưng thuốc. Xét trong cùng 1 ngày kiểm tra, dư lượng trong thận là cao nhất so với các mẫu khác. Dùng erythromycin 0,05 g/kg thì tích tụ trong các mô và huyết tương là không đáng kể. Trong khi dùng 0,1 g/kg thì erythromycin tích lũy theo thời gian ở trong gan, thận, cơ thịt đỏ, cơ thịt trắng; vì vậy peak nồng độ cực đại ở ngày cuối dùng thuốc. Việc tăng đôi liều lượng erythromycin từ 0,05 lên 0,1 g/kg dẫn đến làm tăng 4–10 lần nồng độ erythromycin trong các mô, và gấp 2 lần trong huyết tương ở ngày cuối xử lý. Nhưng sau khi dừng thuốc 19 ngày dư lượng chỉ còn không đáng kể ở gan và thận, trong khi ở cơ thịt thì không phát hiện [7]. Một nghiên cứu khác của Moffitt và cộng sự (1999) đã tiến hành nghiên cứu độc tính, khả năng gây đột biến và hiệu quả của việc tiêm 10, 20, hoặc 40 mg erythromycin/kg thể trọng cá hồi Oncorhynchus tshawytscha, cách 20 ngày tiêm 1 lần và tiêm 6 lần, trước khi cá hồi phát dục. Khi đối chứng là cá không được tiêm, kết quả thấy rằng: hàm lượng bilirubin tổng trong huyết tương của cả các nhóm xử lý và không xử lý đều không tăng, mặc dù 70% nhóm cá được tiêm erythromycin có gan bị vàng. Erythromycin rất hiệu quả trong việc giảm thiểu tỉ lệ chết của cá hồi do 2 loài vi khuẩn 12