Tài liệu Nghiên cứu đặc tính sinh dược của dịch chiết từ cây cứt lợn ageratum conyzoides l. được thu tại huyện sóc sơn thành phố hà nội (lv02327)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 ====== PHẠM THỊ THU HUYỀN NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH DƢỢC CỦA DỊCH CHIẾT TỪ CÂY CỨT LỢN Ageratum conyzoides L. ĐƢỢC THU TẠI HUYỆN SÓC SƠN - THÀNH PHỐ HÀ NỘI Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 06 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học : TS. TRẦN THỊ PHƢƠNG LIÊN HÀ NỘI - 2017 LỜI CẢM ƠN Qua thời gian học tập tại Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2, tôi đã học hỏi đƣợc rất nhiều kiến thức chuyên môn và kĩ năng thực hành. Để có đƣợc những kiến thức và kết quả nhƣ ngày hôm nay, trƣớc tiên tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến Ban lãnh đạo khoa Sinh – KTNN, đặc biệt là TS. Trần Thị Phƣơng Liên là ngƣời đã tận tình chỉ bảo cho tôi những kiến thức chuyên môn, kỹ năng thực tế, mở mang và nâng cao kiến thức để tôi hoàn thành luận văn này một cách tốt nhất. Cùng với sự giúp đỡ tận tình của các anh chị em trong nhóm đề tài đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi có môi trƣờng học tập và làm việc tốt. Cuối cùng tôi xin đƣợc gửi lời biết ơn chân thành tới gia đình và bạn bè, những ngƣời đã động viên giúp đỡ cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn vừa qua. Trong quá trình học tập và viết luận văn, do thời gian thực hiện luận văn hạn chế nên không tránh khỏi những sai sót. Vì vậy, tôi rất mong nhận đƣợc sự đóng góp của các thầy cô giáo, bạn bè để giúp tôi hoàn thành tốt luận văn này. Hà Nội, ngày….tháng….năm 2017 Tác giả Phạm Thị Thu Huyền LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, có sự hỗ trợ từ Giáo viên hƣớng dẫn là TS. Trần Thị Phƣơng Liên. Các nội dung nghiên cứu và kết quả trong luận văn này là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất cứ công trình nghiên cứu nào trƣớc đây. Hà Nội, ngày….tháng….năm 2017 Tác giả Phạm Thị Thu Huyền MỤC LỤC MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1 1. Lí do chọn đề tài ........................................................................................ 1 2. Mục đích nghiên cứu .................................................................................. 2 3. Nhiệm vụ nghiên cứu ................................................................................. 2 4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu............................................................... 3 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .................................................... 3 6. Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................ 3 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................... 5 1.1. Vài nét chung về cây Cứt lợn................................................................... 5 1.1.1. Thực vật học, phân bố và sinh thái........................................................ 5 1.1.2. Một số tác dụng Sinh – Dƣợc học và công dụng của cây hoa Cứt lợn ... 5 1.2. Giới thiệu về một số hợp chất tự nhiên ở thực vật.................................... 8 1.2.1. Các hợp chất phenolic từ thực vật ......................................................... 8 1.2.2. Flavonoid ............................................................................................. 8 1.2.3. Tannin thực vật ................................................................................... 11 1.2.4. Hợp chất coumarin ............................................................................. 12 1.2.5. Ankanoid ............................................................................................ 13 1.3. Bệnh béo phì ......................................................................................... 13 1.3.1. Khái niệm và phân loại béo phì .......................................................... 13 1.3.2. Thực trạng béo phì trên thế giới và trong nƣớc ................................... 14 1.3.3. Nguyên nhân gây ra béo phì ............................................................... 15 1.3.4. Các tác hại và nguy cơ cụ thể của béo phì........................................... 15 1.3.5. Một số chỉ số hoá sinh liên quan đến rối loạn trao đổi lipid máu......... 16 1.3.6. Giải pháp phòng và điều trị................................................................. 17 1.4. Kháng sinh ............................................................................................ 18 1.4.1. Kháng sinh và phân loại kháng sinh.................................................... 18 1.4.2 Thực trạng sử dụng kháng sinh hiện nay trên Thế giới và Việt Nam.... 19 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 21 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu ............................................................................ 21 2.1.1. Mẫu thực vật....................................................................................... 21 2.1.2. Mẫu động vật ...................................................................................... 21 2.1.3. Dụng cụ và hóa chất thí nghiệm.......................................................... 22 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ....................................................................... 22 2.2.1. Phƣơng pháp hóa lý ............................................................................ 22 2.2.2. Phƣơng pháp sắc kí lớp mỏng (TLC) .................................................. 23 2.2.3. Nghiên cứu tác dụng của phân đoạn dịch chiết từ cây Cứt lợn lên trọng lƣợng và một số chỉ số hóa sinh máu của chuột béo phì thực nghiệm. . 23 2.2.3.1. Thử độc tính cấp, xác định LD50 ...................................................... 23 2.2.3.2. Xây dựng mô hình chuột béo phì thực nghiệm................................. 24 2.2.4. Nghiên cứu tác dụng hạ đƣờng huyết của dịch chiết từ cây Cứt lợn lên chuột nhắt gây béo phì ............................................................................ 24 2.2.5. Phƣơng pháp hóa sinh - y dƣợc........................................................... 24 2.2.5.1. Phƣơng pháp định lƣợng glucose huyết ........................................... 25 2.2.5.2. Định lƣợng một số chỉ số lipid trong huyết thanh ............................ 26 2.2.6. Phƣơng pháp xử lý số liệu .................................................................. 27 2.2.7. Phƣơng pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào invitro ....................... 28 2.2.7.1. Nguyên lí ......................................................................................... 28 2.2.7.2. Chuẩn bị thí nghiệm ........................................................................ 28 2.2.8. Phƣơng pháp nghiên cứu hình thái giải phẫu ...................................... 29 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................ 31 3.1. Tách chiết, định tính, định lƣợng hợp chất tự nhiên từ Cây Cứt lợn (Ageratum conyzoides L.) ............................................................................. 31 3.1.1. Kết quả tách chiết phân đoạn cao etanol ............................................. 31 3.1.2. Kết quả sắc ký bản mỏng .................................................................... 31 3.2. Kết quả xác định liều độc cấp ................................................................ 32 3.3. Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định ................................. 33 3.4. Kết quả mô hình chuột béo phì thực nghiệm.......................................... 35 Từ bảng số liệu bảng 3.5 và hình 3.4 cho thấy các chỉ số hóa sinh đã có sự khác biệt rất lớn giữa lô nuôi thƣờng và lô nuôi béo. Cụ thể:........................ 39 3.5. Tác dụng của dịch chiết cao EtOH từ lá cây Cứt lợn lên chuột béo phì thực nghiệm ................................................................................................. 40 3.5.1. Sự thay đổi trọng lƣợng ...................................................................... 40 3.5.2. Sự thay đổi các chỉ số hóa sinh ........................................................... 41 3.6. Kết quả thử hoạt tính độc tế bào invitro ................................................ 43 3.7. Kết quả nghiên cứu hình thái giải phẫu.................................................. 43 3.7.1. Lô chuột đƣợc nuôi bằng thức ăn bình thƣờng, qua nghiên cứu vi thể cho thấy:....................................................................................................... 43 3.7.2. Lô chuột đƣợc nuôi bằng thức ăn giàu lipit qua nghiên cứu vi thể cho thấy .............................................................................................................. 44 3.7.3. Chuột đƣợc nuôi bằng thức ăn giàu lipit rồi điều trị bằng dịch chiết cây Cứt lợn qua nghiên cứu vi thể cho thấy .................................................. 46 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 48 Kết luận ........................................................................................................ 48 Kiến nghị...................................................................................................... 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 49 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Phân loại BMI của ngƣời trƣởng thành châu Âu và châu Á .......... 14 Bảng 3.1. Các hệ dung môi dùng trong thí nghiệm sắc kí bản mỏng............. 31 Bảng 3.2. Kết quả thử độc tính cấp theo đƣờng uống ................................... 33 Bảng 3.3. Kết quả thử hoạt tính kháng sinh của cao phân đoạn EtOH từ cây cứt lợn (đơn vị MIC (µg/ml)......................................................................... 34 Bảng 3.4. Trọng lƣợng trung bình (tính theo gram) của hai nhóm chuột nuôi bằng hai chế độ dinh dƣỡng khác nhau ................................................. 36 Bảng 3.5. So sánh một số chỉ số lipid máu giữa chuột nuôi thƣờng và nuôi béo phì thực nghiệm. .................................................................................... 38 Bảng 3.6. So sánh trọng lƣợng (g) của các lô chuột béo phì trƣớc và sau khi điều trị .......................................................................................................... 40 Bảng 3.7. So sánh chỉ số lipid máu trƣớc và sau điều trị bằng dịch chiết cao EtOH của các lô chuột béo sau 2 tuần .......................................................... 41 Bảng 3.8. Kết quả thử hoạt tính độc tế bào ................................................... 43 DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ VÀ HÌNH VẼ Hình 1.1. Flavan (2-phenyl chroman) ............................................................. 9 Hình 1.2. Cấu tạo một số flavonoid .............................................................. 11 Hình 2.1. Cây Cứt lợn thu tại huyện Sóc Sơn ............................................... 21 Hình 2.2. Chuột nhắt trắng (Mus Musculus) chủng Swiss ............................ 21 Hình 2.3: Phƣơng pháp lấy máu đo glucose huyết ........................................ 25 Hình 3.1. Bản sắc ký chạy ở một số hệ dung môi khác nhau (cột số 1) ......... 32 Hình 3.2. Chuột béo và chuột thƣờng sau 8 tuần nuôi .................................. 36 Hình 3.3. Biểu đồ biểu diễn sự tặng trọng của các nhóm chuột với 2 chế độ dinh dƣỡng khác nhau trong 8 tuần............................................................... 37 Hình 3.4. Biểu đồ so sánh một số chỉ số lipid máu giữa chuột nuôi thƣờng và nuôi béo phì thực nghiệm. ....................................................................... 38 Hình.3.5. Biểu đồ so sánh một số chỉ số lipid máu giữa chuột trƣớc điều trị và sau điều trị cao EtOH ............................................................................... 41 Hinh 3.6. Ảnh vi thể gan chuột bình thƣờng ................................................ 43 Hình 3.7. Ảnh vi thể thận chuột bình thƣờng ................................................ 44 Hình 3.8. Ảnh vi thể tụy chuột bình thƣờng.................................................. 44 Hình 3.9. Ảnh vi thể gan chuột béo phì ........................................................ 45 Hình 3.10. Ảnh vi thể thận chuột béo phì ..................................................... 45 Hình 3.11. Ảnh vi thể tụy chuột béo phì ...................................................... 46 Hình 3.12. Ảnh vi thể gan chuột béo phì rồi điều trị bằng dịch chiêt cây Cứt lợn ................................................................................................................ 46 Hình 3.13. Ảnh vi thể thận chuột béo phì rồi điều trị bằng dịch chiêt cây Cứt lợn ......................................................................................................... 47 Hình 3.14. Ảnh vi thể tụy chuột béo phì rồi điều trị bằng dịch chiêt cây Cứt lợn ................................................................................................................ 47 DANH MỤC CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT LDL – c : Cholesterol xấu HDL – c : Hight denistylipoprotein Cholesterol TG : Triglyceride Glu : Glucose TC : Cholesterol EtOH : Ethanol EtOAc : Ethyl acetate GOD: glucose oxidase CHO: enzyme cholesterol oxydase ATCC: Bảo tàng giống chuẩn Hoa kỳ CCL -17TM : mô biểu bì miệng KB MTT: (3-(4,5-dimethylthiazol-2 - yl )- 2, 5 - diphenyltetrazolium) IC50: nồng độ chất thử ức chế 50% sự phát triển của tế bào 1 MỞ ĐẦU 1. Lí do chọn đề tài Việt Nam nằm ở trung tâm Đông Nam Á với 3/4 diện tích là đồi núi, thuộc khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa có hai mùa rõ rệt thay đổi theo địa hình. Lƣợng mƣa hằng năm vào khoảng 1200-2800 mm cùng với độ ẩm tƣơng đối cao. Với những đặc thù về khí hậu thiên nhiên nhƣ vậy, Việt Nam có một hệ thực vật phong phú và đa dạng với trên 12.000 loài, trong đó có trên 3.200 loài thực vật đƣợc sử dụng làm thuốc trong Y học dân gian; mở ra tiềm năng nghiên cứu về các hợp chất tự nhiên từ các loài thực vật của Việt Nam [6]. Nhiều loại thuốc chữa trị một số bệnh nan y nhƣ: ung thƣ, tiểu đƣờng… sử dụng các hoạt chất đƣợc phân lập từ tự nhiên nhƣ nhóm các hợp chất vinca alkaloid vinblastine, vincristine đƣợc phân lập từ cây Dừa cạn (Catharanthus roseus, họ trúc đào-apocynaceae), paclitaxel (Taxol) là một diterpenoid đƣợc phân lập từ loài Thông đỏ Taxus brevifolia (Taxaceae) hay một số hợp chất khác podophyllotoxin, camptothecin, berbamine, beta-lapachone, acid betulinic, colchicine, curcumin, daphnoretin, ellipticine, và dẫn xuất bán tổng hợp của chúng vinflunine, docetaxel (Taxotere) [28], [31]. Cùng với sự phát triển của công nghệ tổng hợp hóa dƣợc tạo ra các biệt dƣợc, các nhà khoa học vẫn đang cố gắng tìm hiểu, khám phá tác dụng chống ung thƣ và các hoạt tính sinh học khác của các hợp chất có nguồn gốc từ nhiều loài thực vật khác nhau. Họ Cúc (Asteraceae Dumort.1822) thuộc bộ Cúc (Asterales) là một trong hai họ lớn nhất, với 1000 chi, 23000 loài, phân bố khắp nơi trên thế giới, nhƣng tập chung chủ yếu ở ôn đới. Việt Nam có 125 chi, 347 loài và 4 taxon dƣới loài, phân bố chủ yếu ở ven rừng, bãi đất hoang nhiều ánh sáng [14]. Nhiều loài trong số đó đƣợc sử dụng vào các bài thuốc y học cổ truyền 2 nhƣ: Thanh hao hoa vàng (Artemisia annua L. 1753) đƣợc sử dụng để tách chiết tinh dầu artemisin dùng chữa sốt rét hay đun nƣớc tắm chữa bệnh ngoài da [14]. Cây Ngải cứu (Artemisia vulgaris L. 1753) có tác dụng điều kinh và thông huyết cho phụ nữ, kích thích thần kinh và làm thuốc chữa thần kinh tọa [14]. Cây Xƣơng sông (Blumea lanceolaria (Roxb.) Druce, 1917) có tác dụng kích thích tiêu hóa, lợi tiểu, chữa đổ mồ hôi trộm. Cây Cứt lợn chữa viêm xoang, cây giã nát lấy nƣớc uống chữa rong huyết sau khi đẻ, viêm nhiễm, mụn nhọt ngứa nở [13], [14], [38], [39], [40]. Ngoài những công dụng kể trên, hiện nay, trên một số bài báo có đề cập tới bài thuốc cổ truyền chống và chữa tiểu đƣờng, béo phì từ cây Cứt lợn [38], [40]. Tuy nhiên, bài thuốc trên chƣa có cơ sở khoa học kiểm chứng. Vì vậy, chúng tôi chọn đề tài nghiên cứu“Nghiên cứu đặc tính sinh dược của dịch chiết từ cây Cứt lợn (Ageratum conyzoides L. ) được thu tại huyện Sóc Sơn - thành phố Hà Nội” làm cơ sở đánh giá tính chính xác của các bài thuốc kể trên. 2. Mục đích nghiên cứu Khảo sát một số đặc tính hóa sinh dƣợc của dịch chiết từ cây Cứt lợn. 3. Nhiệm vụ nghiên cứu 3.1. Khảo sát sơ bộ thành phần các hợp chất có trong cây Cứt lợn (Ageratum conyzoides L.). 3.2. Nghiên cứu khả năng hỗ trợ điều trị bệnh béo phì của dịch chiết từ cây Cứt lợn (Ageratum conyzoides L.) 3.3. Nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào của dịch chiết từ cây Cứt lợn (Ageratum conyzoides L.) 3.4. Nghiên cứu khả năng kháng vi sinh vật của dịch chiết cây Cứt lợn (Ageratum conyzoides L.) 3 3.5. Đánh giá tác dụng của dịch chiết từ cây Cứt lợn (Ageratum conyzoides L.) trên sự biến đổi mô bệnh học gan, thận, tụy của chuột ĐTĐ trƣớc và sau điều trị. 4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu 4.1. Mẫu thực vật Cây Cứt lợn (Ageratum conyzoides L.) có tên khoa học là Ageratum conyzoides L., thuộc họ Cúc (Asteraceae Dumort.1822), bộ Cúc (Asterales). Đƣợc thu tại huyện Sóc Sơn, thành phố Hà Nội. 4.2. Mẫu động vật Chuột nhắt trắng (Mus musculus) chủng Swiss 4 tuần tuổi ( 18- 20g) do Viện Dịch tễ Trung ƣơng cung cấp. 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 5.1. Ý nghĩa khoa học Bổ sung thêm dẫn liệu nghiên cứu về cây dịch chiết cây Cứt lợn (Ageratum conyzoides L.) 5.2. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả thu đƣợc sẽ giúp cho sự định hƣớng đúng đắn trong vấn đề qui hoạch trồng trọt và sử dụng cây Cứt lợn làm thuốc trong nhân dân. 6. Phƣơng pháp nghiên cứu 6.1. Phương pháp hóa lý: Sử dụng cồn để tách dịch chiết chứa các hoạt chất thiên nhiên từ cây Cứt lợn. 6.2. Phương pháp hóa sinh: Định tính, định lƣợng, nghiên cứu đặc tính sinh hóa của dịch chiết. 6.3. Xây dựng mô hình chuột BP thực nghiệm: Chuột nhắt trắng chủng Swiss (18- 20g) sau 3-4 ngày thích nghi với điều kiện phòng thí nghiệm, đƣợc chia thành 2 nhóm: nhóm đối chứng và nhóm nuôi béo. 4 6.5. Phương pháp hóa sinh- y dược: Định lƣợng đƣờng huyết và một số chỉ số hóa sinh liên quan đến rối loạn trao đổi lipid máu ở chuột trƣớc và sau điều trị bằng một số phân đoạn dịch chiết từ cây Cứt lợn. 6.6. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học Thử hoạt tính ức chế khuẩn tế bào phƣơng pháp so màu MTT. Thử hoạt tính ức chế khuẩn bằng phƣơng pháp khuếch tán đĩa thạch. 6.7. Phương pháp nghiên cứu hình thái giải phẫu: Nghiên cứu vi thể của một số nội quan ở chuột bình thƣờng, béo phì và đái tháo đƣờng trƣớc và sau điều trị. 6.8. Xử lý số liệu: Các số liệu thu đƣợc đƣợc biểu diễn dƣới dạng giá trị trung bình cộng trừ với sai số. Các số liệu đƣợc xử lý trên phần mềm MS. Excel với các phép thử t-test cho các mẫu độc lập và phân tích Anova một, hai nhân tố với mức ý nghĩa p < 0,05. 5 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Vài nét chung về cây Cứt lợn 1.1.1. Thực vật học, phân bố và sinh thái Cây Cứt lợn hay còn đƣợc gọi là cây Cỏ hôi, Bông thúi, Bù xích; Bù xít, Cỏ cứt heo... có tên khoa học là Ageratum conyzoides L., thuộc họ Cúc (Asteraceae Dumort.1822), bộ Cúc (Asterales). Cứt lợn là cây thảo mọc hằng năm, cao chừng 25 – 50 cm. Lá mọc đối, hình trứng, mép có răng cƣa tròn. Toàn thân và lá đều có lông. Hoa nhỏ, màu tím hay xanh trắng, xếp thành đầu; các đầu này lại tập hợp thành ngù. Quả bé có ba sống dọc, màu đen. Theo trung tâm Dữ liệu thực vật Việt Nam, cỏ Cứt lợn phân bố ở các nƣớc nhiệt đới châu Mỹ (Mêhicô), phát tán tự nhiên vào nhiều nƣớc nhƣ Ấn Độ, Trung Quốc, Việt Nam, Lào, Campuchia, Inđônêxia… Ở Việt Nam, cây mọc phổ biến ở nhiều nơi từ Lào Cai, Ninh Bình đến các tỉnh đồng bằng khắp cả nƣớc. Cây mọc ven đồi, ven rừng, ven đƣờng, các bãi hoang, bờ ruộng ẩm ƣớt. Ra hoa kết quả tháng 4 - 7 và hầu nhƣ quanh năm. 1.1.2. Một số tác dụng Sinh – Dược học và công dụng của cây hoa Cứt lợn Ageratum conyzoides L. đƣợc sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền của các nền văn hóa khác nhau trên toàn thế giới, mặc dù các ứng dụng khác nhau theo vùng. Ở Trung Phi, nó đƣợc sử dụng để điều trị viêm phổi, nhƣng việc sử dụng phổ biến nhất là để chữa trị vết thƣơng và vết bỏng (Durodola 1977). Cộng đồng truyền thống ở Ấn Độ sử dụng loài này nhƣ một bacteriocide, antidysenteric, và antilithic (Borthakur và Baruah 1987), và ở châu Á, Nam Mỹ và châu Phi, dịch chiết từ cây Cứt lợn đƣợc sử dụng nhƣ một bacteriocide (Almagboul 1985; Ekundayo et al. 1988). Ở Cameroon và Congo, sử dụng truyền thống là để điều trị sốt, bệnh thấp khớp, nhức đầu, đau bụng (Menut et al 1993;. Bioka et al 1993.). Việc sử dụng các loài này trong y học cổ truyền là rộng lớn ở Brazil. Dịch chiết của lá hoặc toàn bộ cơ thể cây 6 Cứt lợn đã đƣợc sử dụng để điều trị đau bụng, cảm lạnh và sốt, tiêu chảy, bệnh thấp khớp, co thắt, hoặc nhƣ là một loại thuốc bổ (Penna 1921; Jaccoud 1961; Correa 1984; Cruz 1985; Marques et al 1988;. Negrelle et al . 1988; Oliveira et A. al 1993). Ageratum conyzoides có tác động nhanh chóng và hiệu quả trong những vết thƣơng bỏng là khuyến cáo của Brazil Thuốc Central là một antirheumatic (Brasil 1989) [41]. Một số điều tra dƣợc phẩm đã đƣợc tiến hành để xác định hiệu quả. Duradola (1977) đã xác nhận hoạt động ức chế của chiết ether và chloroform chống lại sự phát triển in vitro của Staphylococus aureus. Almagboul et al. (1985), sử dụng methanol từ toàn bộ nhà máy, xác nhận hành động ức chế sự phát triển của Staphylococus aureus, Bacillus subtilis, Eschericichia coli và Pseudomonas aeruginosa. Bioka et al. (1993) báo cáo hành động giảm đau hiệu quả ở chuột sử dụng dịch chiết của lá Ageratum conyzoides L.(100-400 mg/kg). Xét nghiệm đƣợc thực hiện trong Kenia, với dịch chiết xuất từ cây Ageratum conyzoides L. chứng minh hoạt động cơ bắp thƣ giãn, xác nhận sử dụng phổ biến của nó nhƣ là một antispasmotic (Achola et al., 1994) [41]. Tại Brazil, xét nghiệm đƣợc tiến hành bởi Đại học Bang Campinas và Đại học Liên bang Paraiba) cho thấy kết quả đầy hứa hẹn. Marques Neto et al. (1988) trong các thử nghiệm phòng khám với bệnh nhân khớp, tiêm dịch chiết của cây Ageratum conyzoides L. và báo cáo tác dụng giảm đau trong 66% bệnh nhân và cải thiện tính di động khớp ở 24%, không có tác dụng phụ. Mattos (1988), sử dụng dịch chiết Ageratum conyzoides L. kiểm soát lâm sàng hiệu quả của khớp, báo cáo giảm đau và viêm hoặc cải thiện tính di động khớp, sau một tuần điều trị [41]. Theo Trung tâm dữ liệu thực vật Việt Nam, lá và ngọn cây Cứt lợn non vò kỹ, rửa sạch tới khi hết bọt, luộc bỏ nƣớc, vắt kiệt nƣớc, xào hoặc nấu canh 7 với mắm tôm, cá. Phần cây trên mặt đất có tinh dầu chứa phenol, đƣợc sử dụng làm thuốc. Thƣờng đƣợc chỉ định làm thuốc chống viêm, chống phù nề, chống dị ứng trong các trƣờng hợp: 1. Sổ mũi, viêm xoang mũi, dị ứng cấp và mạn; 2. Chảy máu ngoài do chấn thƣơng, bị thƣơng sƣng đau; 3. Mụn nhọt, ngứa lở, eczema. Liều dùng 15 – 30 g cây sắc nƣớc uống, hoặc dùng cây tƣơi giã lấy nƣớc nhỏ. Cũng dùng cây tƣơi giã đắp vết thƣơng chảy máu, mụn nhọt, eczema, hoặc nấu nƣớc tắm chữa ghẻ, chốc đầu của trẻ em. Ngƣời ta cũng dùng cỏ Cứt lợn chữa rong huyết sau khi sinh đẻ, dùng phối hợp với bồ kết nấu nƣớc gội đầu cho thơm và sạch gầu, trơn tóc. Nhiều bệnh viện đã sử dụng các chế phẩm của cỏ Cứt lợn để trị các chứng viêm xoang mũi mạn tính và dị ứng, có kết quả tốt, không gây tác dụng phụ gì đối với cơ thể ngƣời bệnh. Ở Ấn Độ, ngƣời ta dùng nƣớc ép rễ cây để chữa bệnh sỏi thận. Lá làm thuốc săn da, dùng chữa các vết đứt, vết thƣơng và dùng đắp chữa sốt rét [39]. Theo Nghiên cứu của Đoàn thị Nhu và cộng sự 1986, cây Cứt lợn làm giảm phù thực nghiệm chân chuột biểu thị bằng tỉ lệ phần trăm giảm thể tích chân chuột thử thuốc so với chuột đối chứng bằng kaolin. Với liều 6.0 g/kg (tính theo dƣợc liệu khô) tác dụng ức chế phù bắt đầu thể hiện rõ, và tác dụng tăng khi tăng liều. Nó có tác dụng mạnh đối với giai đoạn viêm nhiễm cấp tính và mãn tính và có tác dụng chống choáng phản vệ rõ rệt, động thời có tác dụng gây teo tuyến ức chuột cống non, cây cứt lợn có những đặc điểm tác dụng tƣơng tự với nhóm thuốc chống viêm steroit. Cây cứt lợn có thể dùng làm thuốc chống viêm để góp phần điều trị viêm xoang mũi dị ứng, viêm xoang mũi cấp và mãn tính, các bệnh viêm nhiễm và dị ứng khác. Có thể dùng riêng rẽ hoặc dùng trong công thức phối hợp, dùng uống phối hợp với dùng điều trị tại chỗ [13]. 8 1.2. Giới thiệu về một số hợp chất tự nhiên ở thực vật 1.2.1. Các hợp chất phenolic từ thực vật Hợp chất phenolic là nhóm các chất khác nhau rất phổ biến trong thực vật. Đặc điểm chung của chúng là trong phân tử có vòng thơm (benzene) mang một, hai hay ba nhóm hydroxyl (-OH) gắn trực tiếp vào vòng benzene. Dựa vào thành phần và cấu trúc ngƣời ta chia hợp chất phenolic thành 3 nhóm nhỏ: Nhóm hợp chất phenolic đơn giản, nhóm hợp chất phenolic phức tạp, nhóm hợp chất phenolic đa vòng [21]. Hợp chất phenolic đƣợc hình thành từ những sản phẩm của quá trình đƣờng phân và con đƣờng pentose qua acid cynamic hay theo con đƣờng acetate malonate qua Acetyl- CoA. Nhóm hợp chất này có một số chức năng trong đời sống thực vật nhƣ sau [6], [12] [22], [33], [36]: - Tham gia vào quá trình hô hấp nhƣ là một chất vận chuyển hydro. - Các polyphenol có thể hình thành liên kết hydro với các protein và enzyme làm thay đổi hoạt động của các enzyme này tƣơng tự nhƣ hiệu ứng điều hòa dị lập thể. - Tác dụng mạnh lên quá trình sinh trƣởng, đóng vai trò là chất hoạt hoá IAA- oxydase và tham gia vào quá trình sinh tổng hợp enzyme này. Hợp chất phenol tác dụng nhƣ chất điều hoà các chất điều khiển sinh trƣởng ở thực vật. - Ngoài ra hợp chất phenol còn có tính chất kháng khuẩn. Chúng có tác dụng rất lớn trong quá trình liền sẹo các vết thƣơng cơ học của thực vật, đẩy quá trình tái sinh, chống bức xạ, tác nhân gây đột biến và chất chống oxi hóa. 1.2.2. Flavonoid Trong số các polymenol tự nhiên, favonoid là nhóm chất quan trọng vì chúng phổ biến ở hầu hết các loài thực vật có nhiều hoạt tính sinh – dƣợc học 9 có giá trị [7]. Flavonoid là những sắc tố, phần lớn có màu vàng (flavus – nghĩa là màu vàng). Tuy nhiên một số sắc tố khác nhƣ xanh, đỏ, tím,... hoặc không màu cũng xếp vào nhóm flavonoid vì chúng có chung đặc điểm cấu tạo. Về cấu tạo hóa học, khung cacbon của flavonoid là C6 – C3 – C6, gồm 15 nguyên tử cacbon, hai vòng benzene A và B nối với nhau qua dị vòng C, trong đó A kết hợp với C tạo khung chroman. 2' 8 7 9 1 10 5 2 B 1' 4' C A 6 3' O 3 6' 5' 4 Hình 1.1. Flavan (2-phenyl chroman) Tùy theo mức độ oxy hóa vòng pyran, sự có mặt hay không có mặt của nối đôi giữa C2 với C3 và nhóm cacbonyl ở C4 mà có thể phân biệt flavonoid thành các nhóm phụ sau: Flavon và flavonol, flavanol (đihidro flavon), chalcol, aurol, leucoantoxianidin, catechin, isoflavonoid, rotenoid và neoflavonoid. Flavonoid tồn tại ở hai dạng: Dạng tự do gọi là aglycon và dạng liên kết với đƣờng là glycoside. Các glycoside khi bị thủy phân bằng acid hoặc enzyme sẽ giải phóng ra đƣờng và aglycon tƣơng ứng. + Tác dụng chống oxy hóa (antioxidant) của flavonoid: Flavonoid có khả năng kìm hãm các quá trình oxy hóa dây truyền gây ra bởi các gốc tự do hoạt động. Tuy nhiên hoạt tính này mạnh hay yếu còn phụ thuộc vào đặc điểm của từng flavonoid cụ thể. Gốc tự do sinh ra trong quá trình sinh lý bình thƣờng của cơ thể hay do 10 tác động bên ngoài là nguyên nhân gây phá hủy ADN, protein, lipid làm phát sinh nhiều bệnh tật nguy hiểm và sự lão hóa cho cơ thể. Flavonoid có bản chất polyphenol nên dễ dàng biến đổi dƣới tác động của các enzyme có trong tế bào động, thực vật. Đặc biệt flavonoid có nhóm hydroxyl ở vị trí ortho dễ dàng bị oxy hóa bởi xúc tác của enzyme polyphenoloxydase và peroxydase tạo semiquynol hoặc quynol [30], [32]. Đây là các gốc tự do bền vững chúng có thể nhận điện tử và trở thành dạng hidroquynol. Bởi vậy các chất này có khả năng phản ứng với các gốc tự do hoạt động và loại chúng ra khỏi cơ thể. Ngoài ra flavonoid còn có tác dụng bảo vệ các hệ thống sinh học nhờ khả năng tạo phức với các kim loại chuyển tiếp nhƣ Fe+2, Cu+2 … hoạt hóa enzyme chống oxy hóa và ức chế sự oxy hóa [25]. + Tác dụng kháng khuẩn Nhiều công trình nghiên cứu trong nƣớc và thế giới đã chứng tỏ tác dụng chống viêm nhiễm (anti-inflamatory) chống vi khuẩn (anti-bacterial) và virut (antiviral) [2], [5]. + Tác dụng làm bền thành mạch máu: Các dẫn xuất đƣờng của flavonoid có hoạt tính của vitamin P nhƣ rutin, hesperidin ... có tác dụng làm tăng sức bền và tính đàn hồi của thành mao mạch, giảm sức thẩm thấu của hồng cầu qua thành mao mạch. Hoạt tính này đƣợc ứng dụng trong chữa trị các rối loạn chức năng tĩnh mạch, giãn hay suy yếu tĩnh mạch, trĩ , rối loạn tuần hoàn tĩnh mạch [12]. + Tác dụng giảm béo phì và lipid máu: Theo kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học Nhật cho thấy khi chuột béo phì đƣợc điều trị bằng dịch chiết giàu flavonoid từ lá Bằng lăng (Lagerstroemia specciosa L.) thì có trọng lƣợng giảm đáng kể (~ 10%) [34]. Thí nghiệm tƣơng tự với flavonoid từ lá Kim ngân (Lonicera japonica Thunb.) đối với chuột cống trắng uống cholesterol cũng cho thấy có tác dụng làm giảm các chỉ số cholesterol; 11 triglycerid, LDL-c đồng thời tăng HDL-c [16]. Naringin (C17H32O4 ) và hesperidin (C28H34O15) là những flavonoid có hàm lƣợng cao trên họ cam chanh (Rutaceae) đã đƣợc nhiều nhà nghiên cứu chiết xuất và thử tác dụng trên mô hình chuột béo phì cho kết quả tốt trong việc làm hạ các chỉ số lipid máu [17],[18]. Tác dụng hạ glucose huyết O OH OH OH OH H 3OC O HO HO HO O OH O CH3 HO OH Quercetin O O O HO OH OH O O OH Hesperidin OH OH HO OH Epicatechin Hình 1.2. Cấu tạo một số flavonoid Một số flavonoid đƣợc tách chiết từ nguyên liệu thực vật đã đƣợc chứng minh là có tách dụng điều hòa glucose huyết nhƣ: Quercetin có trong Đỗ trọng (Eucommia ulmoides Oliver.) [29] , Hesperidin và Naringin có trong các cây thuộc họ Rutaceae [19], Genistein và Daidzein có trong Đậu nành (Glycine max L.) [8], Myricetin có trong cây Vông vang (Abelmoschus moschatus) [8]. 1.2.3. Tannin thực vật Tannin là các hợp chất phenolic có trọng lƣợng phân tử cao có chứa các nhóm hyđroxyl và các nhóm chức khác nhƣ có khả năng tạo phức với protein và các phần tử lớn khác trong điều kiện môi trƣờng đặc biệt. Tannin thƣờng là các hợp chất vô định hình, có màu trắng, màu vàng nhạt hoặc gần nhƣ không màu, có hoạt tính quang học, vị chát, dễ bị oxy hóa khi đun nóng hay khi để ngoài ánh sáng.