Tài liệu Nghiên cứu đặc điểm sinh học và khả năng sinh cellulase của một số chủng xạ khuẩn phân lập được từ đất ở vĩnh phúc

TRƯỜNG ĐAỊ HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH-KTNN  TRẦN THỊ LY NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ KHẢ NĂNG SINH CELLULASE CỦA MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ ĐẤT Ở TỈNH VĨNH PHÚC KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: VI SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học Ths. Nguyễn Khắc Thanh Hà Nội, tháng 5 năm 2010 LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ths. Nguyễn Khắc Thanh đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn em trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Em cũng xin chân thành cảm ơn toàn thể các thầy cô trong tổ vi sinh đã chỉ bảo và giúp đỡ, để em có thể hoàn thành được khóa luận tốt nghiệp này. Em xin chân thành cảm ơn ban chủ nhiệm khoa Sinh- KTNN, ban giám hiệu nhà trường đã tạo điều kiện tốt nhất để em có thể hoàn thành được khóa luận tốt nghiệp này. Cuối cùng em cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên giúp đỡ em trong suốt thời gian qua. Em xin chân thành cảm ơn! Xuân Hòa , tháng 05 năm 2010 Sinh viên Trần Thị Ly LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các kết quả nghiên cứu, số liệu được trình bày trong khóa luận là hoàn toàn trung thực và không trùng với kết quả của tác giả khác. Tác giả Trần Thị Ly CÁC TỪ VIẾT TẮT VSV : Vi sinh vật ISP : International Steptomyces Project CFU : Colony Forming Unit HSKS : Hệ sợi khí sinh HSCC : Hệ sợi cơ chất DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH TRONG KHÓA LUẬN BẢNG Bảng Tên bảng Trang 3.1 Các chủng xạ khuẩn sinh cellulase phân lập được từ đất 22 ở tỉnh Vĩnh Phúc. 3.2 Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng sinh cellulase của các chủng xạ khuẩn nghiên cứu. 27 3.3 Ảnh hưởng của nguồn cacbon tự nhiên đến hoạt tính 32 cellulase của các chủng xạ khuẩn nghiên cứu. 3.4 Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh trưởng và 33 hoạt tính cenlulase của các chủng xạ khuẩn nghiên cứu. 3.5 Ảnh hưởng của pH đến khả hoạt tính cellulase của các chủng xạ khuẩn nghiên cứu 34 HÌNH Hình Tên hình Trang 3.1 Một số hình ảnh về xạ khuẩn 24 3.2 Hình ảnh khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của các chủng 26 xạ khuẩn nghiên cứu 3.3 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hoạt tính cellulase 29 của chủng M10 3.4 Hoạt tính cellulase của các chủng xạ khuẩn sinh trưởng 33 trong môi trường cacbon tự nhiên BIỂU ĐỒ Biểu đồ Tên biểu đồ Trang 1 Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng sinh cellulase 28 của các chủng xạ khuẩn nghiên cứu 2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến hoạt tính cellulase của các chủng xạ khuẩn nghiên cứu. 35 3 Ảnh hưởng của nồng độ pH đến hoạt tính cellulase 36 của các chủng xạ khuẩn nghiên cứu. MỤC LỤC Phần mở đầu……………………………………………........................1 Chương 1. Tổng quan tài liệu……………………………………………...4 1.1. Đặc điểm và phân loại xạ khuẩn……………………………...…...…....4 1.1.1. Một số phương pháp trong phân loại xạ khuẩn………………..….….5 1.1.2. Vai trò của xạ khuẩn……………………………………………...…..7 1.2. Nhu cầu dinh dưỡng của xạ khuẩn……………………………………...8 1.2.1. Nhu cầu cacbon...……………………………………………………..9 1.2.2. Nhu cầu nitơ...………………………………………………………..9 1.2.3. Nhu cầu vitamin và khoáng…………………….............…………....10 1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến đời sống của xạ khuẩn…………………….10 1.4. Cellulase và cellulose…………...……………………………………..12 1.4.1. Cellulose..……………………………………………………….…..13 1.4.1. Cellulase..……………………………………………………….…..14 1.5. Triển vọng, ứng dụng của cellulase……………………..…………….14 Chương 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu………………………..17 2.1. Vật liệu………………………………...………………………………17 2.1.1. Nguyên liệu…………………………..……………………………..17 2.1.2. Hóa chất…………………………………..…………………………17 2.1.3. Dụng cụ và thiết bị……………………..…………………………...17 2.1.4. Môi trường phân lập xạ khuẩn……………………..……………….17 2.1.5. Môi trường thử hoạt tính cellulase của xạ khuẩn……………………19 2.2. Phương pháp nghiên cứu……………………..……………………….20 2.2.1. Phương pháp lấy mẫu………..………………..…………………….20 2.2.2. Phương pháp phân lập xạ khuẩn từ mẫu đất…….....…..…………...20 2.2.3. Phương pháp bảo quản giống…………….………………………….21 2.2.4. Phương pháp xác định khả năng sinh cellulase của xạ khuẩn…..…..21 Chương 3. Kết quả và thảo luận…………………………………………22 3.1. Phân lập, tuyển chọn xạ khuẩn sinh cellulase từ đất……………….....22 3.2. Đặc điểm hình thái của các chủng xạ khuẩn nghiên cứu…………..…25 3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của các các yếu tố môi trường và điều kiện nuôi cấy đến hoạt tính cellulase của một số chủng xạ khuẩn ………….……….27 3.3.1. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy…………………………..……...27 3.3.2. Ảnh hưởng của nguồn cacbon…………………..…………………..31 3.3.3. Ảnh hưởng của nguồn nitơ……………………..…………………...34 3.3.4. Ảnh hưởng của pH………………………..………………………...35 Kết luận và đề nghị………………………………………………………..37 Tài liệu tham khảo………………………………………………………...38 Khãa luËn tèt nghiÖp Tr-êng §HSP Hµ Néi 2 MỞ ĐẦU Cellulose là loại hợp chất hữu cơ dồi dào trong tự nhiên, chiếm tới 4050 % hydratcacbon. Cellulose là thành phần chủ yếu tạo lên bộ khung xương tế bào thực vật. Trung bình mỗi năm ước tính có khoảng 30 tỉ tấn chất hữu cơ được cây sinh tổng hợp trên trái đất trong đó có 30 % là thành tế bào thực vật, thành phần chủ yếu của thành tế bào thực vật là cellulose. Hàng năm trái đất phải nhận về một lượng chất thải khổng lồ (chất thải sinh hoạt, chất thải thực vật như lá, cành …chất thải công nghiệp). Để phân giải lượng lớn cellulose này khu hệ vi sinh vật (VSV) trong đất đóng vai trò không nhỏ. Muốn làm được điều đó các vi sinh vật phải sản sinh ra cellulase, enzyme cellulase này đóng vai trò phân giải cellulose. Trong đất có rất nhiều loài VSV có khả năng sinh tổng hợp cellulase, xạ khuẩn là một trong những loài ấy. Xạ khuẩn đóng vai trò quan trọng trong quá trình hình thành đất, quá trình mùn hóa, tham gia vào vòng tuần hoàn chuyển hóa các hợp chất hữu cơ. Mặc dù xạ khuẩn không có khả năng sinh trưởng nhanh bằng nấm mốc tuy nhiên hoạt tính cellulase của xạ khuẩn mạnh hơn rất nhiều, bên cạnh đó xạ khuẩn có khả năng thích ứng tốt với môi trường đất, nước và ngay cả môi trường không khí. Nếu nấm mốc cần điều kiện độ ẩm cao mới có thể phát triển thì xạ khuẩn sinh trưởng ngay ở điều kiện độ ẩm thấp, nhưng mặc dù vậy các nghiên cứu cho thấy rằng trong môi trường độ ẩm thấp xạ khuẩn sinh trưởng kém hơn rất nhiều so với môi trường lỏng, ở một số loài hoạt tính enzyme còn kém đi. Ngày nay với sự phát triển của công nghệ sinh học, ngày càng nhiều enzyme được ứng dụng trong đời sống như: proteinase ứng dụng trong công nghiệp chế biến sữa, amylase trong công nghiệp rượu, cellulase ứng dụng TrÇn ThÞ Ly 1 K32D – Sinh Khãa luËn tèt nghiÖp Tr-êng §HSP Hµ Néi 2 trong sản xuất giấy, công nghiệp may, sợi, sản xuất thức ăn cho gia súc, xử lý chất thải nông nghiệp, sản xuất các loại đường probiotin… Như vậy cellulase và xạ khuẩn đều có vai trò quan trọng trong đời sống con người. Đó cũng là lý do tôi chọn và nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm sinh học và khả năng sinh cellulase của một số chủng xạ khuẩn phân lập được từ đất ở tỉnh Vĩnh Phúc” nhằm hiểu rõ hơn về khả năng sinh cellulase của một số chủng xạ khuẩn, các yếu tố môi trường và điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng như thế nào đến khả năng sinh cellulase và hoạt tính cellulase từ đó đưa ra hướng phù hợp nhằm thu được sản lượng cellulase cao nhất từ các chủng xạ khuẩn được chọn, phục vụ cho các ứng dụng tiếp theo. 1. Mục tiêu đề tài Phân lập, tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính cellulase cao từ đất ở tỉnh vĩnh phúc Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường và điều kiện (thời gian, pH, nguồn cacbon, nguồn nitơ) đến hoạt tính cellulase của các chủng xạ khuẩn. 2. Nội dung của đề tài - Phân lập, tuyển chọn xạ khuẩn có hoạt tính cellulase cao từ đất tại Xuân Hòa – Phúc Yên – Vĩnh Phúc. - Nghiên cứu đặc điểm hình thái của một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính cellulase cao. - Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường và điều kiện nuôi cấy đến hoạt tính cellulase của các chủng xạ khuẩn được chọn. + Ảnh hưởng của thời gian + Ảnh hưởng của nguồn cacbon TrÇn ThÞ Ly 2 K32D – Sinh Khãa luËn tèt nghiÖp Tr-êng §HSP Hµ Néi 2 + Ảnh hưởng của nguồn nitơ + Ảnh hưởng của pH 3. Ý nghĩa của đề tài Đề tài góp phần đem lại cho con người những hiểu biết về đời sống tự nhiên của VSV nói chung và của xạ khuẩn nói riêng, tạo cơ sở khoa học cho các phương thức canh tác (cày xới, cải tạo đất, bón phân…) theo hướng lợi dụng VSV phân giải cellulose, tăng cường các quá trình phân giải hợp chất hữu cơ để làm giàu dinh dưỡng cho đất, tăng năng suất cây trồng. Tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính cellulase cao ứng dụng các chủng xạ khuẩn này vào đời sống (ứng dụng trong chăn nuôi, bảo vệ môi trường…). Việc nghiên cứu các yếu tố môi trường và điều kiện nuôi cấy góp phần vào tìm ra môi trường thích hợp nhất cho xạ khuẩn phát triển. Từ đó tối ưu hóa môi trường, ứng dụng sản xuất một lượng lớn cellulase trên quy mô thương mại. TrÇn ThÞ Ly 3 K32D – Sinh Khãa luËn tèt nghiÖp Tr-êng §HSP Hµ Néi 2 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đặc điểm và phân loại xạ khuẩn Krainki lần đầu tiên đề ra các chỉ tiêu mới trong việc phân biệt các loài khác nhau và đã sơ bộ phân loại 17 chủng thuộc chi Actinomyces. Ông coi các đặc điểm sinh lý, sinh hóa là mấu chốt trong nguyên tắc phân loại xạ khuẩn [8]. Waksman và Curtis tìm ra 17 loại, Jensen tìm ra hai loại mới, Dutche tìm ra 13 loại mới [8] Baldaci và cộng sự đã nghiên cứu xạ khuẩn đưa ra khóa phân loại chi Streptomyces dựa trên hệ sợi khí sinh (HSKS), hệ sợi cơ chất (HSCC) và một số đặc điểm trung gian khác [8]. Waksman và Henrici đã đưa ra hệ thống phân loại và đế 1961 được sửa đổi lại. Trong hệ thống phân loại này xạ khuẩn được xếp thành 3 nhóm gồm 3 họ, 10 chi và đã mô tả hơn 250 loài thuộc Streptomyces [8]. Krassilnicov công bố hệ thống phân loại nấm tia mới dựa trên hệ thống đã công bố năm 1949, trong đó xạ khuẩn được chia thành 6 họ với 26 chi [8]. Gause và cộng sự đã công bố hệ thống phân loại mới dựa trên màu sắc HSKS, và HSCC, hình dạng bào tử và chuỗi bào tử, hệ thống này được hỉnh lí và tái bản 1983 [8]. Những năm gần đây các hệ thống phân loại này ngày càng nhiều, để thống nhất trong cách mô tả, ISP đã nêu ra các phương pháp và môi trường mô tả [8]. 1.1.1. Một số phƣơng pháp trong phân loại xạ khuẩn Nhờ vào sự phát triển của khoa học kĩ thuật số lượng xạ khuẩn được miêu tả ngày càng nhiều và chính xác dựa trên cơ sở phát triển sinh học phân TrÇn ThÞ Ly 4 K32D – Sinh Khãa luËn tèt nghiÖp Tr-êng §HSP Hµ Néi 2 tử, hóa sinh học, lí sinh học. Để phân loại nhanh chóng và chính xác người ta sử dụng phân loại số, nghiên cứu các chủng loại phát sinh. Tuy nhiên hiện nay trong thực nghiệm người ta vẫn chủ yếu dựa vào đặc điểm hình thái, tính chất nuôi cấy, đặc điểm sinh lí - sinh hóa, miễn dịch và sinh học phân tử. Hiện nay có rất nhiều khóa phân loại xạ khuẩn nhưng có thể gộp vào 2 hệ thống sau đây: + Hệ thống phân loại chủ yếu dựa vào đặc điểm hình thái để phân loại các nhóm lớn họ, giống. Các phân loại thấp hơn như loài thì dùng đặc điểm nuôi cấy, sinh lí, sinh hóa để phân loại. + Hệ thống phân loại dựa vào đặc điểm sinh lý như màu sắc hệ sợi để phân nhóm, sau đó dùng đặc điểm nuôi cấy để phân loại đến loài, nhóm hệ thống này của Waksman, Gause Flaig... các tác giả đều thống nhất lấy đặc điểm sử dụng nguồn nitơ, cacbon làm yếu tố bổ sung cho phân loại đến loài. Phân loại xạ khuẩn dựa vào đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy Dựa vào đặc điểm hình thái người ta chia xạ khuẩn thành 4 nhóm chính. Nhóm 1: Gồm các xạ khuẩn mang bào tử rõ rệt, sinh sản bằng bào tử và phân hóa thành HSKS và HSCC. Nhóm 2: Gồm các xạ khuẩn có bào tử nang, hệ sợi phân chia theo hướng vuông góc với nhau tạo thành các cấu trúc tương tự nang bào tử. Nhóm 3: Gồm các xạ khuẩn có dạng Nocardia, sinh sản bằng phân đốt hệ sợi. Nhóm 4: Gồm các xạ khuẩn có dạng Corynebacter và dạng cầu, tế bào có hình chữ V,T thường không có hệ sợi. Dựa vào nghiên cứu các xạ khuẩn trên các môi trường khác nhau, người ta chia dạng chuỗi bào tử xạ khuẩn thành 6 kiểu chính. TrÇn ThÞ Ly 5 K32D – Sinh Khãa luËn tèt nghiÖp Tr-êng §HSP Hµ Néi 2 + Kiểu S: Type Spiria (chuỗi bào tử xoắn). + Kiểu SRA: Type Spiria-Rectinaculum-Apertum (chuỗi bào tử có xuắn, móc câu, xoắn không hoàn toàn) + Kiểu SRF: Type Spiria-Rectus-Flexibilis (chuỗi bào tử xoắn, cong đến thẳng). + Kiểu RA: Type Rectinaculum- Apertum (chuỗi bào tử móc, có khóa) + Kiểu RA-RF: Type Rectinaculum Apertum- Rectus Fleixbilis (chuỗi bào tử dạng móc hay xoắn không hoàn toàn.) + Kiểu RF: Rectus-Fleixbilis (chuỗi bào tử thẳng đến lượn sóng) Hóa phân loại Dựa vào các dữ liệu về định tính định lượng các thành phần hóa học trong thành phần hóa học trong tế bào VSV để phân loại chủ yếu là các đặc điểm sau: + Type thành tế bào + Type peptidoglucan + Axit mycolic + Axit béo + Menaquinon + Type photpholipid Trong các đặc điểm đó thì tpye thành tế bào là đặc điểm quan trọng nhất để phân loại xạ khuẩn. Người ta chia thành tế bào ra làm 4 dạng chính: + Type 1: Thành tế bào có L-ADP và Glixin. + Type 2: Thành tế bào có mDAP và Glixin. TrÇn ThÞ Ly 6 K32D – Sinh Khãa luËn tèt nghiÖp Tr-êng §HSP Hµ Néi 2 + Type 3: Thành tế bào có mDAP. + Type 4: Thành tế bào có mDAP, đường arabinose, galactose. Phân loại số Dựa trên sựa đánh giá về mức độ giống nhau giữa các VSV trong một số lớn các đặc điểm chủ yếu là các đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa để so sánh các chủng giống nhau từng đôi một theo công thức: SAB = nS*100/ (nS+nd) Trong đó: SAB: Mức độ giống nhau giữa 2 cá thể. nS: Tổng số các đặc điểm dương tính của 2 chủng so sánh. nd: Tổng số các đặc điểm dương tính với chủng này mà âm tính với chủng kia. Kết quả của sự so sánh này được biểu hiện trên sơ đồ nhánh và tùy thuộc vào mức độ giống nhau mà các VSV được xếp vào các nhóm . Nghiên cứu về phát sinh chủng loại Nhờ sự sắp xếp phát sinh chủng loại mà các sinh vật được xếp vào hệ thống phân loại gần tự nhiên hơn. Các nghiên cứu về di truyền phần tử nhằm xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng cách tiến hành các so sánh các cao phân tử ADN, ARN, protein, mà quan trọng hơn cả là sự sắp xếp các nucleotit của rARN 16S. Mức độ giống nhau giữa 2 cá thể so sánh thể hiện mối quan hệ giữa chúng. 1.1.2. Vai trò của xạ khuẩn. Xạ khuẩn có vai trò quan trọng trong quá trình hình thành đất và tạo độ phì nhiêu cho đất. Chúng đảm nhiệm nhiều chức năng khác nhau trong việc TrÇn ThÞ Ly 7 K32D – Sinh Khãa luËn tèt nghiÖp Tr-êng §HSP Hµ Néi 2 làm mầu mỡ cho đất bằng cách tham gia tích cực vào các quá trình chuyển hóa và phân giải nhiều hợp chất hữu cơ phức tạp và bền vững như cellulose, mùn, kitin, keratin, lignin…[6] Hầu hết xạ khuẩn thuộc giống Actinomyces có khả năng hình thành chất kháng sinh như streptomycine, oreomixine, tetraxicline… Đây là một trong những đặc điểm quan trọng nhất của xạ khuẩn được sử dụng rộng rãi trong y học, thú y học, bảo vệ thực vật. Bên cạnh đó trong quá trình trao đổi chất xạ khuẩn có thể sản sinh ra nhiều hợp chất hữu cơ. Trong đó điển hình là các enzym ngoại bào (cellulase…), vitamin nhóm B (B1, B2…B12), một số acid hữa cơ (acid lactat, acid axetat…)[6]. Ngày nay xạ khuẩn còn được ứng dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp lên men, chế tạo các chế phẩm enzyme, ứng dụng các chế phẩm này vào đời sống do một số xạ khuẩn có khả năng sinh ra nhiều như: proteinase, amylase, cellulase, kitinnase. Một số khác còn có khả năng tạo thành chất kích thích sinh trưởng của thực vật. 1.2. Nhu cầu dinh dƣỡng của xạ khuẩn Theo Nguyễn Thành Đạt trong quá trình tiến hóa các VSV có quan hệ mật thiết đối với các yếu tố của điều kiện sống. VSV cần ở tự nhiên hay môi trường nuôi cấy nhân tạo chất dinh dưỡng để xây dựng nên các hợp chất của tế bào và những hợp chất dùng để trao đổi năng lượng[3]. Nhu cầu dinh dưỡng ở các loài VSV rất khác nhau. Ngay trong cùng một loài VSV nhu cầu này cũng không có sự thống nhất. Giống như các loài VSV khác nhu cầu dinh dưỡng ở các loài xạ khuẩn cũng khác nhau. Trong công nghiệp tùy thuộc vào mục đích mà người ta sử dụng các nguồn dinh dưỡng thích hợp nhằm thu được năng suất cao nhất. Ví dụ nuôi cấy thu enzyme cellulase người ta quan tâm đến nguồn cacbon. Nhưng nếu mục đích TrÇn ThÞ Ly 8 K32D – Sinh Khãa luËn tèt nghiÖp Tr-êng §HSP Hµ Néi 2 sản xuất là làm thế nào để thu được một lượng lớn chất kháng sinh nào đó thì người ta lại quan tâm đến nguồn nitơ. 1.2.1. Nhu cầu cacbon Cacbon chiếm 50% vật chất khô của vi sinh vật, là yếu tố quan trọng trong tất cả các hợp chất hữu cơ có mặt trong tế bào. Các hợp chất cacbon là nguồn nguyên liệu cho cho hoạt động sống [6]. Trong tự nhiên có 2 dạng hợp chất cacbon cơ bản là cacbon vô cơ và cacbon hữu cơ, mỗi sinh vật khác nhau sử dụng nguồn cacbon khác nhau. Dựa vào nguồn dinh dưỡng cacbon mà người ta chia VSV thành hai nhóm chính: + Dị dưỡng cacbon + Tự dưỡng cacbon Xạ khuẩn là VSV dị dưỡng cacbon, xạ khuẩn có khả năng phân giải các hợp chất hydratcacbon khác nhau từ dạng đơn giản (acetat, lactat, các loại đường đơn) đến các dạng phức tạp (oligosaccharid, polisaccharid). Các hợp chất hữu cơ này ngoài việc cung cấp nguồn cacbon còn cung cấp nguồn năng lượng cho các hoạt động sống. Phần lớn xạ khuẩn có đời sống dị dưỡng hiếu khí, quá trình oxi hóa thu năng lượng xảy ra kèm theo việc liên kết với oxi không khí. Xạ khuẩn có khả năng phát triển được trong những môi trường chứa một nguồn cacbon duy nhất. 1.2.2. Nhu cầu nitơ Nitơ có ý nghĩa quan trọng đối với sự phát triển của VSV. Trong đó nguồn nitơ dễ hấp thụ nhất là nguồn NO 3- và NH4+. Chúng thâm nhập vào tế bào dễ dàng ở đó chúng tạo nên các nhóm imin và amin. Các muối amôn hữu cơ thích hợp đối với dinh dưỡng VSV hơn là các muối amôn vô cơ. Các muối NO 3- không có độ chua sinh lí nên sau khi sử dụng dạng này dễ còn lại các ion K+, Na+, Mg+ các ion này làm kiềm hóa môi trường. TrÇn ThÞ Ly 9 K32D – Sinh Khãa luËn tèt nghiÖp Tr-êng §HSP Hµ Néi 2 Nguồn nitơ khó hấp thụ hơn cả là nitơ khí trời. Một số loài VSV có thể sự dụng nguồn này nhờ khả năng cố đinh nitơ (chuyển hóa N--->NH3). Phần lớn các loài xạ khuẩn đều có đời sống dị dưỡng nitơ. Chỉ một số loài thuộc chi Frankraceae có khả năng cố định nitơ nhờ cộng sinh với rễ cây họ đậu. 1.2.3. Nhu cầu vitamine và chất khoáng Vitamine và chất khoáng đóng vai trò không nhỏ trong quá trình sống của VSV. Trong tế bào VSV ngoài nước, các chất hữu cơ còn có một lượng lớn các vitamine và chất khoáng. Lượng chất này trong tế bào thay đổi theo tùy loài. Tùy giai đoạn, điều kiện sinh trưởng mỗi yếu tố đều có tác động nhất định đối với sự phát triển của tế bào VSV mà các nhân tố khác không thể thay thế được. Nguyên tố khoáng được chia làm hai loại: - Nguyên tố đa lượng: P, K, Ca, Mg, Fe, Na, Cl - Nguyên tố vi lượng: Mn, Cu, Co, B … 1.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt tính cellulase của xạ khuẩn Khả năng sinh tổng hợp cellulase của các loài VSV là rất khác nhau. Muốn có được chủng VSV có khả năng tổng hợp một vài loại enzyme nào đó cần phải phân lập từ đất, nước, không khí hay từ một số bộ phận của động thực vật hoặc lấy từ một bộ sưu tập giống vi sinh vật có sẵn. Tuyển chọn chủng VSV có khả năng sinh trưởng, phát triển nhanh, sinh tổng hợp enzyme cao, ổn định… Cấu trúc của mỗi protein enzyme được tạo thành trong tế bào đều được xác định bởi tính chất di truyền của tế bào, do đó có thể dùng tác nhân đột biến tác động lên bộ máy di truyền của VSV nhằm tạo ra các dạng đột biến có khả năng sinh tổng hợp đặc biệt cao một loại enzyme nào đó. TrÇn ThÞ Ly 10 K32D – Sinh Khãa luËn tèt nghiÖp Tr-êng §HSP Hµ Néi 2 Sau khi đã chọn được một giống VSV có khả năng đáp ứng đầy đủ nhu cầu thì người ta bắt đầu tiến hành nuôi VSV trên quy mô lớn thu enzyme. Về nguyên tắc có 2 phương pháp nuôi VSV để thu chế phẩm enzyme. + Phương pháp nuôi cấy bề mặt (phương pháp rắn, phương pháp nổi)[7]. Vi sinh vật phát triển ở bề mặt môi trường dinh dưỡng ở thể rắn đã được làm ẩm và vô trùng. Môi trường dinh dưỡng này thường gồm các nguyên liệu tự nhiên như cám, gạo, ngô bổ sung thêm trấu nhỏ hoặc mùn cưa để giúp làm xốp môi trường khiến oxi không khí dễ xâm nhập tạo điều kiện cho VSV phát triển tốt. về cơ bản các nguyên liệu trên cung cấp đủ dinh dưỡng như: nitơ, cacbon, vitamine, muối khoáng cho VSV phát triển. Nếu muốn có môi trường dinh dưỡng tốt hơn có thể bổ sung nitơ vô cơ hoặc hữu cơ và các cảm ứng tùy từng loại enzyme. Phương pháp nuôi cấy này cho nồng độ enzyme cao hơn phương pháp chìm, môi trường sau khi sấy khô vận chuyển dễ dàng, tránh nhiễm trùng toàn bộ môi trường nuôi cấy, ít tốn điện năng tuy nhiên có tính gián đoạn, chiếm nhiều diện tích nuôi cấy, khó cơ giới hóa và tự động hóa vì thế năng suất thấp tốn nhiều lao động thủ công. Tuy nhiên phương pháp này chỉ áp dụng được với những VSV có khả năng sinh trưởng và phát triển mạnh, thích nghi với môi trường rắn thường được ứng dụng cho các giống nấm mốc, hầu như không áp dụng đối với xạ khuẩn. + Phương pháp nuôi chìm [7] Ở phương pháp này người ta cho VSV sinh trưởng ở trong môi trường dinh dưỡng lỏng có sục khí liên tục. Ở phương pháp nuôi chìm sự tiết enzyme vào môi trường diễn ra trong suốt quá trình sinh trưởng. Đa số các enzyme thủy phân của nấm mốc, xạ khuẩn, vi khuẩn là những enzyme ngoại bào do đó sau khi kết thúc quá trình lên men có thể lọc bỏ sinh khối thu lấy dịch enzyme đem cô đặc được chế phẩm thô hoặc tinh sạch tiếp theo. Tuy nhiên TrÇn ThÞ Ly 11 K32D – Sinh Khãa luËn tèt nghiÖp Tr-êng §HSP Hµ Néi 2 đối với enzyme ngoại bào muốn thu sinh khối cần phải phá vỡ tế bào để tách enzyme ra khỏi phần sinh khối tế bào. Phương pháp này tiết kiệm diện tích sản xuất, dễ cơ giới hóa và tự động hóa, năng suất cao, sử dụng hợp lý các nguồn dinh dưỡng có trong môi trường nuôi cấy, enzyme thu được ít nhiễm tạp chất. Tuy nhiên tốn điện năng, nồng độ enzyme trong canh trường thấp phải cô đặc nên giá thành cao. Môi trường này rất thích hợp với các giống xạ khuẩn. Nhu vậy thành phần dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng sinh trưởng, khả năng sinh tổng hợp enzyme của VSV. Ngoài các yếu tố về dinh dưỡng thì nhiệt độ, độ ẩm, pH cũng là những yếu tố quan trọng có khả năng tác động đến quá trình sinh tổng hợp enzyme của các chủng xạ khuẩn. Độ pH được đo bằng nồng độ các ion H+ và OH-. Khi sử dụng một số chất dinh dưỡng có bị thay đổi do sự cân bằng ion, sự tổng hợp ATP phụ thuộc nhiều vào dòng ion. Quá trình sinh trưởng của VSV cũng ảnh hưởng đến pH của môi trường nuôi cấy. Các nghiên cứu cho thấy rằng hoạt tính enzyme rất nhạy cảm với sự thay đổi của pH. Như vậy, môi trường dinh dưỡng bao giờ cũng phải đủ các thành phần chính sau: nguồn nitơ, cacbon, vitamine, muối khoáng, các thông số vật lý, thông số sinh lý (cân bằng năng lượng, áp suất CO 2, O2…). Các yếu tố này ảnh hưởng trược tiếp đến khả năng sinh tổng hợp enzyme của chủng nuôi cấy. 1.4. Cellulase và cellulose Enzyme là chất xúc tác sinh học, có bản chất protein, hòa tan trong nước và trong dung dịch muối loãng. Enzyme có phân tử lượng lớn từ 200001000000 dalton nên không qua được màng bán thấm. Tất cả các yếu tốt làm biến tính protein như acid đặc, kiềm đặc, muối kim loại đặc…đều có thể làm enzyme bị biến tính và mất hoạt tính xúc tác. TrÇn ThÞ Ly 12 K32D – Sinh