Tài liệu Nghiên cứu công nghệ sản xuất collagen từ phụ phế phẩm da cá tra để ứng dụng vào công nghệ thực phẩm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT COLLAGEN TỪ PHỤ PHẾ PHẨM DA CÁ TRA ĐỂ ỨNG DỤNG VÀO CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM S K C 0 0 3 9 5 9 MÃ SỐ: T2014 - 54TĐ S KC 0 0 4 7 9 0 Tp. Hồ Chí Minh, 2014 TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM KỸ THUẬT TP.HCM KHOA CÔNG NGHỆ HÓA VÀ THỰC PHẨM BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KH&CN CẤP TRƢỜNG TRỌNG ĐIỂM ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT COLLAGEN TỪ PHỤ PHẾ PHẨM DA CÁ TRA ĐỂ ỨNG DỤNG VÀO CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Mã số: T2014 - 54TĐ CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: TS.NGUYỄN TIẾN LỰC TP. HỒ CHÍ MINH, THÁNG 12 NĂM 2014 MỤC LỤC Trang bìa .......................................................................................................................... i Mục lục ............................................................................................................................ ii Danh mục bảng .............................................................................................................. iii Danh mục hình ............................................................................................................... iii Thông tin kết quả nghiên cứu.......................................................................................... 1 MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 5 CHƢƠNG I. TỖNG QUAN…………………………………………………………...9 1.1. Giới thiệu về collagen ...................................................................................... ….9 1.1.1. Collagen ................................................................................................................ 9 1.1.2. Cấu tạo phân tử .................................................................................................. 10 1.1.3. Thành phần hóa học của collagen ...................................................................... 16 1.1.4. Phân loại collagen ............................................................................................... 17 1.1.5. Tính chất hóa lý ................................................................................................... 17 1.1.6. Các yếu tố ảnh hưởng đến collagen .................................................................... 18 1.1.7.Ứng dụng của collagen…………………………………………..……………….20 1.2. Giới thiệu về cá tra ............................................................................................. .24 1.2.1. Cá tra ................................................................................................................... 24 1.2.2. Thành phần khối lượng và dinh dưỡng cá tra ..................................................... 26 1.2.3. Tình hình chế biến và xuất khẩu cá tra ............................................................... 29 1.3. Nguồn nguyên liệu collagen................................................................................... 31 1.3.1. Nguồn nguyên liệu da cá tra................................................................................ 31 1.3.2. Cấu tạo của da cá................................................................................................. 31 1.3.3. Thành phần hóa học ............................................................................................ 32 1.3.4. Ưu điểm và đặc tính của collagen trích ly từ da cá ............................................. 33 1.4. Các vấn đề trong quá trình tách chiết collagen ................................................... 34 1.4.1. Sự phá vỡ tế bào .................................................................................................. 34 1.4.2. Phương pháp tinh sạch collagen.......................................................................... 35 1.4.3. Làm khô và bảo quản chế phẩm collagen ........................................................... 36 1.5. Tình hình nghiên cứu về collagen ....................................................................... 37 1.5.1. Tình hình nghiên cứu trong nước ........................................................................ 37 1.5.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước ....................................................................... 38 CHƢƠNG 2.NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 41 2.1. Nguyên liệu ......................................................................................................... 41 2.1.1. Da cá .................................................................................................................... 41 2.1.2. Các hóa chất và dụng cụ thí nghiệm ................................................................... 41 2.2. Phương pháp nghiên cứu..................................................................................... 42 2.2.1. Phương pháp xử lý da cá .................................................................................... 42 i 2.2.2. Khảo sát quá trình tách chiết collagen ............................................................... 45 2.2.3. Tối ưu hóa quá trình tách chiết collagen ............................................................ 47 2.3. Phương pháp phân tích ....................................................................................... 49 2.3.1. Phương pháp lấy mẫu…………………………………………………………....49 2.3.2. Phương pháp phân tích ....................................................................................... 49 2.3.3. Phân tích hàm lượng lipid của da ........................................................................ 49 2.4. Phương pháp định lượng collagen ...................................................................... 50 2.5. Phương pháp xử lý số liệu ..................................................................................... 53 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 54 3.1. Thành phần hóa học và tính chất nguyên liệu da cá tra ...................................... 54 3.2. Nghiên cứu xử lý làm tinh sạch da cá ................................................................. 55 3.2.1. Xử lý da cá bằng NaOH ...................................................................................... 55 3.2.2. Xử lý da cá bằng LasNa trong NaOH 1% ........................................................... 57 3.2.3. Xử lý da cá bằng H2O2 ........................................................................................ 59 3.3. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất tách chiết collagen ................. 61 3.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ acid acetic ...................................................... 61 3.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung dịch acid acetic/da cá.................................. 61 3.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian tách chiết collagen ........................................ 62 3.4. Tối ưu hóa quá trình tách chiết collagen ............................................................. 64 3.5. Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất collagen………………………………..68 3.5.1. Quy trình công nghệ………………………………………………………..……68 3.5.2. Giải thích quy trình…………………………………………………...……...…..69 3.6. Đánh giá chất lượng collagen…………………………………………………….70 3.6.1. Kết quả collagen sau tinh sạch ............................................................................ 70 3.6.2. Sản phẩm collagen sau tủa muối ......................................................................... 71 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................................... 73 TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................... 74 PHỤ LỤC ..................................................................................................................... 78 ii DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1. Sự phân bố các acid amin trong chuỗi polypeptide.............................. ..10 Bảng 1.2. Thành phần hóa học của thịt cá tra. ........................................................ 26 Bảng 1.3. Thành phần acid amin của thịt cá tra. .................................................... .27 Bảng 1.4. Thành phần hóa học của mỡ cá tra……………………………………..28 Bảng 1.5. Thành phần acid béo của mỡ cá tra so với mỡ heo…………………….28 Bảng 1.6. Thống kê sản lượng cá tra giai đoạn 2000- 2010……………………....30 Bảng 2.1. Danh mục hóa chất sử dụng. .................................................................. 41 Bảng 2.2. Thời gian lấy mẫu và xử lý da cá .......................................................... .43 Bảng 2.3. Thời gian lấy mẫu và tẩy màu da cá . ..................................................... 44 Bảng 2.4. Các mức và khoảng biến thiên của các yếu tố........................................ 47 Bảng 2.5. Số liệu để xây dựng đường chuẩn hydroxyproline................................. 51 Bảng 3.1. Thành phần và tính chất da cá tra. .......................................................... 54 Bảng 3.2. So sánh thành phần hóa học của các loại da cá………………………...55 Bảng 3.3. Kết quả xử lý da cá bằng H2O2. .............................................................. 60 Bảng 3.4. Các mức và khảng biến thiên các yếu tố ............................................... 64 Bảng 3.5. Ma trận qui hoạch thực nghiệm yếu tố toàn phần .................................. 65 Bảng 3.6. Thành phần collagen thành phẩm. .......................................................... 70 Bảng 3.7.Một số tiêu chuẩn collagen ứng dụng trong thực phẩm và mỹ phẩm ..... 70 iii DANH SÁCH HÌNH VẼ Hình 1.1. Cấu trúc da của collagen. ........................................................................10 Hình 1.2. Trật tự sắp xếp các acid amin trong collagen. ........................................11 Hình 1.3. Cấu trúc của phân tử collagen (triple helix)............................................11 Hình 1.4. Cấu trúc của procollagen . ......................................................................12 Hình 1.5. Sự hình thành các liên kết ngang. ...........................................................12 Hình 1.6. Cấu trúc sợi của collagen. .......................................................................13 Hình 1.7. Quá trình tổ hợp tạo sợi của các phân tử collagen. .................................14 Hình 1.8. Sự sắp xếp của phân tử collagen trong một sợi. .....................................14 Hình 1.9. Hình (a) bó sợi và hình (b) sợi collagen. ................................................15 Hình 1.10. Cấu trúc bó sợi collagen........................................................................16 Hình 1.1. Sản phẩm phomat có chứa collagen hydrolysate . ..................................20 Hình 1.12. Sản phẩm kẹo dẻo có vỏ màng là collagen hydrolysate. ......................21 Hình 1.13. Collagen hydrolysate làm chất kết dính trong thanh kẹo......................21 Hình 1.14. Sản phẩm thịt nguội, nước uống có chứa collagen hydrolysate. ..........22 Hình 1.15. Cá tra (Pangasius hypophthalmus). ......................................................24 Hình 1.16. Cấu tạo da cá..........................................................................................31 Hình 1.17. Khả năng hấp thụ collagen trích ly từ cá và lợn. ..................................34 Hình 1.18. Giai đoạn đầu và cuối của quá trình thẩm tích. ....................................36 Hình 2.1. Da cá sau khi rã đông. .............................................................................42 Hình 2.2. Da cá được đông lạnh……………………………………...……………42 Hình 2.3. Quy trình tiền xử lý da cá nguyên liệu. ...................................................42 Hình 2.4. Ngâm da cá trong dung dịch tẩy tạp chất. ...............................................43 Hình 3.5. Thí nghiệm chọn nồng độ H2O2………………………………………..44 Hình 2.6. Quy trình tách chiết collagen bằng acid acetic. ......................................45 Hình 2.7. Phân tích đối tượng công nghệ................................................................48 Hình 2.8. Đồ thị đường chuẩn hydroxyproline. ......................................................51 Hình 3.1. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ NaOH theo thời gian . ..............................56 Hình 3.2. Ảnh hưởng của NaOH đến xử lý non-collagen da cá. ............................57 Hình 3.3. Khảo sát ảnh hưởng của LasNa theo thời gian.………………………...58 Hình 3.4. Ảnh hưởng của LasNa đến xử lý non-collagen da cá……………….…59 Hình 3.5. Da cá ban đầu (trái) và sau tách béo (phải). ............................................60 Hình 3.6. Da sau tách béo (trái) và sau tẩy màu (phải). ..........................................61 Hình 3.7. Ảnh hưởng nồng độ acid acetic đến hiệu suất tách chiết collagen .........61 Hình 3.8. Ảnh hưởng tỷ lệ acid acetic/da cá đến hiệu suất tách chiết collagen ......62 Hình 3.9. Ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất tách chiết collagen ..........................63 Hình 3.10. Bề mặt đáp ứng hiệu suất collagen .......................................................67 Hình 3.11. Quy trình công nghệ sản xuất collagen từ da cá……………………....68 Hình 3.12. Dung dịch collagen trước (trái) và sau (phải) khi kết tủa… .................71 iv TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự do - Hạnh phúc KHOA CN HOÁ VÀ THỰC PHẨM Tp. Hồ Chí Minh, Ngày 05 tháng 11 năm 2014 THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1. Thông tin chung - Tên đề tài: Nghiên cứu công nghệ sản xuất collagen từ phụ phế phẩm da cá tra để ứng dụng vào công nghệ thực phẩm - Mã số: T2014 - 54TĐ - Chủ nhiệm: TS. NGUYỄN TIẾN LỰC - Cơ quan chủ trì: Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật thành phố Hồ Chí Minh - Thời gian thực hiện: Từ tháng 2/2014 đến 12/2014 2. Mục tiêu Tận dụng được da cá tra vốn là phụ phẩm của ngành chế biến cá tra fillet, nâng cao giá trị kinh tế, giảm thiểu lượng thải bỏ, giảm ô nhiễm môi trường. Collagen là một loại protein có nhiều chức năng, nhằm ứng dụng vào công nghệ thực phẩm, nâng cao giá trị của cá tra ở Đồng bằng sông Cửu Long. 3. Tính mới và sáng tạo - Tối ưu hoá quá trình tách chiết collgen đã xác lập mối quan hệ mật thiết giữa toán học và công nghệ làm giàu collagen, đây là cơ sở khoa học để lựa chọn chế độ công nghệ cho quá trình chế biến collagen từ da cá tra. - Xác định được thành phần và tính chất của da cá tra, đặc biệt là thành phần của collagen, kết quả nghiên cứu là cơ sở cho việc xây dựng công nghệ sản xuất collagen từ da cá. 4. Kết quả nghiên cứu - Đã xác định được chế độ tinh sạch da cá, bằng LasNa 0,5% trong NaOH 1%, với thời gian 8 giờ, tỉ lệ v/w là 10/1 ở điều kiện nhiệt độ 60C cho kết quả khá tốt, hàm lượng tạp chất và non-collagen giảm còn 2,31%. Thành phần da cá sau xử lý có hàm lượng hydroxyproline là 7,2 %, chất hữu cơ là 19,33% và khoáng là 0,14%. - Sử dụng H2O2 1% trong môi trường NaOH 0,5N để tẩy sắc tố da cá và khử mùi thời gian 2 giờ ở nhiệt độ 60C cho khả năng tẩy mùi tốt nhất. - Khi tách chiết collagen trong môi trường acid acetic ở các nồng độ khác nhau, thì hiệu suất tách chiết collagen có mối quan hệ mật thiết và ảnh hưởng bởi các yếu tố là nồng độ acid acetic, thời gian tách chiết và tỷ lệ dung dịch axid acetic/da cá. - Tối ưu hóa quá trình tách chiết collagen cho thấy mô hình toán đã biểu đạt khá rõ quá trình tách chiết collagen. Để hiệu suất tách chiết collagen đạt giá trị cao nhất, với tỷ lệ dung dịch acid acetic/da cá là 13/1; nồng độ acid acetic là 0,58M và thời 1 gian tách chiết 26 giờ thì hiệu suất tách chiết collagen đạt giá trị cực đại là 72,9%. Kết quả này là cơ sở lựa chọn các điều kiện tối ưu để sản xuất collagen từ phụ phẩm da cá tra với chất lượng tốt nhất, tạo ra sản phẩm collagen có màu sắc trắng ngà, cấu trúc sợi mềm mại đáp ứng chất lượng collagen thực phẩm. - Đã tạo ra được Collagen từ da cá tra sản phẩm có màu sắc trắng ngà, hàm lượng hữu cơ là 92,07%, Hàm lượng protein là 89,42% hàm lượng lipid là 1,89% hàm lượng ẩm 6,9% hàm lượng khoáng 0,14% và pH là 6,5 – 6,7 sản phẩm đạt tiêu chuẩn chất lượng collagen thực phẩm. 5. Sản phẩm  Một bài báo khoa học đăng tạp chí: Khoa học và công nghệ, Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn “Nghiên cứu các yếu tố nâng cao hiệu suất tách chiết colagen từ da cá tra”  Công nghệ sản xuất collagen từ da cá tra  Sản phẩm collagen  Báo cáo khoa học 6. Hiệu quả, phƣơng thức chuyển giao kết quả nghiên cứu và khả năng áp dụng Ý nghĩa khoa học - Gắn đào tạo giữa lý thuyết giảng dạy và thực tế sản xuất. - Nâng cao trình độ của các cán bộ tham gia nghiên cứu. - Xác định được thành phần, tính chất của collagen. - Tối ưu hóa quá trình tách chiết collagen cho thấy mô hình toán đã biểu đạt khá rõ quá trình tách chiết collagen. Kết quả này là cơ sở lựa chọn các điều kiện tối ưu để sản xuất collagen từ phụ phẩm da cá tra với chất lượng tốt nhất, tạo ra sản phẩm collagen có màu sắc trắng ngà, cấu trúc sợi mềm mại đáp ứng chất lượng collagen thực phẩm. Ý nghĩa Kinh tế, xã hội - Xây dựng dây chuyền công nghệ chế biến các sản phẩm mới từ cá tra. - Đa dạng hóa sản phẩm, tạo sản phẩm có giá trị gia tăng. - Tạo mặt hàng mới nâng cao giá trị hàng chế biến xuất khẩu. Phương thức chuyển giao. Chuyển giao công nghệ và thiết bị, hướng dẫn vận hành và tạo sản phẩm collagen từ da cá. Khả năng áp dụng. Khả năng áp dụng và chuyển giao công nghệ cho các tổ chức và cá nhân có yêu cầu. Trƣởng Đơn vị (ký, họ và tên) Chủ nhiệm đề tài (ký, họ và tên) NGUYỄN TIẾN LỰC 2 UNIVERSITY OF TECHNICAL EDUCATION HO CHI MINH CITY SOCIALIST OF REPUBLIC OF VIETNAM Independence – Freedom – Happiness DEPARTMENT OF FOOD AND CHEMISTRY TECHNOLOGY Ho Chi Minh City, 05th of November 2014 INFORMATION ON RESEARCH RESULTS 1. General Information - Project title: Research of collagen production technology from Pangasius fish skin to apply in food technology - Code Number: T2014 - 54TĐ - Coordinator: Dr. NGUYEN TIEN LUC - Implementing Institution: HCMC University of Technology and Education - Duration: From February 2014 to December 2014 2. Objective(s): Utilized the Pangasius fish skin, which is used to be byproduct from manufacture process of Pangasius fillet in order to increase the economic, reduce the waste and environment protection. Collagen from fish skin is the particular protein, which contents many functions and is applied to food technology to enhance the value of Pangasius in the Mekong Delta. 3. Creativeness and innovativeness: - The optimization of the extracting process of collagen has established the close relationship between mathematics and enriching technology of collagen. This is a scientific basic to select the technology mode for the manufacturing process of collagen from Pangansius fish skin. - Determined the compositions and properties of Pangasius fish skin, particularly in compositions of collagen. The research result is the standard to create the production technology of collagen from pangasius fish skin. 4. Research Result - Determined the purification mode of fish skin by using 0.5% LasNa in 1% NaOH, in 8 hours, the v/w ratio of 10/1 under 60C. The result was good that reduce the amount of impurities and non-collagen to 2.31%. The content of fish skin after treatment has 7.2% of hydroxyproline, 19.33% of organs and 0.14% of minerals. - Using 1% H2O2 in 0.5N NaOH to remove the color and smell of fish skin. The best result of experiment is in 2 hours and under temperature of 60C. - When extracting collagen in acid acetic under different of concentration, the efficiency of extraction process of collagen has a close relationship and is affected by three elements. They are the concentration of acid acetic, extraction time and the ratio of acetic acid liquid to fish skin. - The optimization of the extraction process of collagen showed that the mathematical models described clearly the extracting process of collagen. The efficiency of extracting collagen reached maximum of 72.9% under these conditions: the ratio of acetic acid liquid to fish skin of 13/1; concentration of 3 acetic acid of 0.58 M; extraction time of 26 hours. This result is the basic to select the optimal conditions to manufacturing collagen from Pangasius fish skin in best quality. The collagen final product has white color, gentle fiber structure that satisfies the quality of collagen in food. - Created the Collagen from pangasius fish skin consisting of 92.07% organs; 89.42% protein; 1.89% lipid; 6.9% moisture; 0.14 minerals and pH of 6.5- 6.7. The product meets the high standard of quality. 5. Products - Scientific paper published in magazine: Science and Technology - Ministry of Agriculture and Rural Development: “Research the factors to enhance the efficiency of extracting collagen from pangasius fish skin” - Extracting technology of collagen from pangasius fish kin - Collagen product - Scientific report 6. Effects, transfer alternatives of research results and applicability The scientific meaning: - Training combination of teaching theory and productive practice. Raising the level of the staff involved in the research. Determined the components and properties of Collagen. The optimization of the extraction process of collagen showed that the mathematical models described clearly the extracting process of collagen. This result is the basic to select the optimal conditions to manufacturing collagen from Pangasius fish skin in best quality. The collagen final product has white color, gentle fiber structure that satisfies the quality of collagen in food. Significance of Economic and Social: - Setting up processing line of new products from Pangasius fish. - Diversifying and creating value-added products. - Creating new products and enhancing the value of export processing Transfer method: Transfer of technology and equipment, operating instructions and creating Collagen products from Pangasius fish skin. The applicability: The ability to apply and technology transfer to requested organizations and individuals requested. Head of Department (signature, full name) Coordinator (signature, full name) NGUYEN TIEN LUC 4 MỞ ĐẦU Collagen là một loại protein, là thành phần cơ bản của mô liên kết, chiếm hơn 70% trọng lượng khô của da, gân và sụn. Collagen và collagen thủy phân gọi là collagen hydrolysate được sử dụng trong thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm và công nghiệp nhiếp ảnh. Chúng được sử dụng như chất đông, chất gây lắng trong thực phẩm. Collagen được dùng để làm vỏ bao xúc xích, màng bọc kẹo, làm nguyên liệu sản xuất một số loại thực phẩm dinh dưỡng, thực phẩm chức năng. Do collagen có tính tan chảy ở nhiệt độ cao và đông đặc ở nhiệt độ thấp, nên collagen đóng vai trò một chất keo bảo vệ ngăn chặn sự kết tinh của đường. Trong các sản phẩm thực phẩm, người ta thêm vào một hàm lượng collagen hydrolysate nhằm ngăn chặn sự mất nước. Ngoài ra, trong sản phẩm bơ sữa, collagen đóng vai trò quan trọng trong việc tạo độ mịn, độ sánh cho sản phẩm, cũng như thay thế hàm lượng chất béo trong các loại thực phẩm này. Trong công nghiệp sản xuất kẹo mứt, collagen hydrolysate được sử dụng làm chất tạo gel, chất kết dính, tạo xốp, làm chậm quá trình tan kẹo, trong các sản phẩm như thịt hộp, thịt nguội… collagen hydrolysate chiếm từ 1-5% giúp giữ hương vị tự nhiên của sản phẩm, đồng thời cũng là một chất kết dính giúp cho việc tạo hình sản phẩm dễ dàng hơn, trong công nghiệp sản xuất rượu bia và nước hoa quả, collagen hydrolysate sử dụng làm chất “làm trong” với tỉ lệ 0,002-0,15%. Đối với da cá tra có chứa một hàm lượng lớn protein, trong đó chủ yếu là là collagen, ngoài ra, da cá tra sau khi được xử lý loại màu, mùi và protein phi collagen cho thấy có chất lượng tốt: không còn mùi tanh, màu trắng và bảo nguyên được hàm lượng collagen. Collagen từ da cá có nhiều đặc điểm tốt hơn collagen từ da động vật nên việc sử dụng collagen da cá vào thực phẩm, y học và mỹ phẩm ngày càng được ứng dụng rộng rãi. Trên thế giới, phần lớn các công trình đều tập trung vào nghiên cứu tách chiết collagen từ gia súc như heo, bò, gà, nghiên cứu về các loài cá năm 2000 Nagai, Suzuki, đã nghiên cứu quá trình tách chiết collagen từ phụ phẩm da, xương, vây của các loài cá ngừ (Katsuwonus pelamis), cá pecca Nhật Bản (Lateolabrax japonicus), về hiệu suất tách chiết đạt được hiệu suất tương đối cao 51,4%. Sử dụng phương pháp điện di SDS-PAGE theo phương pháp của Weber và Osborn (1969) để xác định các chuỗi collagen gồm 2 chuỗi α khác nhau, đó là α1, α2 và sự tồn tại của chuỗi β ở cả hai loài cá. Năm 2002, Nagai, Araki, Suzuki tiếp tục phát triển các phương pháp tách chiết collagen trên da của loài cá nóc (Takifugu rubripes) bằng enzyme pepsin, hiệu suất 5 chiết bằng enzyme (44,7%) cao hơn chiết bằng acid acetic (10,7%). Phân tích chuỗi collagen: collagen da cá nóc cũng gồm các chuỗi α, β, γ. Năm 2004 Chin Ying Hiao đã đưa ra quy trình chiết collagen trong đó có sử dụng quá trình lên men vi khuẩn Bacillus. Năm 2005 Kittiphattanabawon, Benjakul, tách chiết collagen trên da và xương của loài cá chỉ vàng (Priacanthus tayenus). Năm 2007 Hwang, Mizuta, Yokoyama, Yoshinaka có nghiên cứu tách chiết collagen trên da của loài cá đuối (Raja kenojei) cũng bằng acid acetic và enzyme pepsin, đồng thời đã sử dụng sắc kí cột phosphocellulose column chromatoghraphy. Năm 2009 Zhang, Liu, Li, đã có các nghiên cứu trên loài cá da trơn largefin longbarbel (Mystus macropterus). Ở Việt Nam, nghiên cứu về collagen còn ít nhất là nghiên cứu collagen từ cá da trơn nước ngọt. Một số công trình nghiên cứu gần dây có năm 2008, tác giả Lê Thị Hồng Nhạn có những nghiên cứu trên loài cá basa trong quá trình tách chiết collagen, phương pháp được áp dụng là chiết bằng acid citric nhưng hiệu suất thấp khoảng 5,76%. Năm 2010 Ngô Hồng Bảo Châu và cộng sự nghiên cứu chiết tách collagen từ da cá tra bằng acid acetic có bổ sung enzym pepsin, bước đầu ứng dụng phương pháp tách béo bằng dung môi CO2 siêu tới hạn. Kết quả tách béo được trên 70% (tính trên trọng lượng khô) và xác định được collagen trong da cá tra có khối lượng phân tử trong khoảng từ 50÷200 kDa, gồm các chuỗi α, β, γ… Cá tra (Pangasius hypophthalmus) là một trong những loài cá nuôi có quy mô lớn ở Đồng bằng sông Cửu Long, cá tra được nhiều thị trường ưa chuộng vì màu sắc cơ thịt trắng, thịt cá thơm ngon hơn so với các loài cá nước ngọt khác. Trong thành phần dinh dưỡng, hàm lượng protein trong cá tra là từ 16 - 21%, hàm lượng lipid từ 1,5-2,5% và giàu chất khoáng. Da cá tra có hàm lượng collagen cao với nhiều đặc điểm tốt hơn động vật trên cạn,... Theo kết quả điều tra tại các nhà máy chế biến, tỷ lệ cá tra fillet chiếm khoảng 30% còn lại 70% là phế phẩm gồm đầu, xương, da, thịt vụn, nội tạng, mỡ trong đó da cá chiếm từ 5 - 7%. Hàng năm Việt Nam xuất khẩu trên 600.000 tấn thịt cá tra fillet thì sẽ có khoảng 80.000 tấn da cá được thải ra là phế phẩm, dễ gây ô nhiễm và lãng phí. Có một nghịch lý là trong khi nước ta phải nhập khẩu collagen thì nguồn nguyên liệu chính để sản xuất collagen là da cá tra lại được các doanh nghiệp xử lý phế phẩm và bán với giá rẻ,… Hiện nay, những đơn vị muốn sử dụng collagen đều phải nhập khẩu với giá cao (khoảng 25-30 USD/kg). Đối với ngành thực phẩm và dược collagen rất quan trọng, là nguyên liệu chính để sản xuất nước 6 uống collagen, các loại thuốc chống lão hóa, tăng sự đàn hồi của da, xương… collagen/gelatin còn được dùng làm vỏ bao thuốc “con nhộng” v.v… Việc không sử dụng da cá tra chế biến làm collagen tại Việt Nam đã gây lãng phí, vừa làm ô nhiễm môi trường, vừa làm giảm giá trị của cá tra Việt Nam bởi giá xuất khẩu thịt cá fillet chưa bằng 1/10 so với giá nhập khẩu collagen. Từ những phân tích trên cho thấy việc “Nghiên cứu công nghệ sản xuất collagen từ phụ phế phẩm da cá tra để ứng dụng vào công nghệ thực phẩm” là cần thiết và cấp bách. 1. Mục tiêu đề tài Tận dụng được da cá tra vốn là phụ phẩm của ngành chế biến cá tra fillet đông lạnh, nâng cao giá trị kinh tế, giảm thiểu lượng thải bỏ, giảm ô nhiễm môi trường. Collagen là một loại protein có nhiều chức năng, nhằm ứng dụng vào công nghệ thực phẩm, nâng cao giá trị của cá tra ở Đồng bằng sông Cửu Long. 2. Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu thành phần da cá, phương pháp xử lý nguyên liệu. Phân tích thành phần da cá, khảo sát quá trình loại béo, tạp chất và non-collagen bằng NaOH và LasNa để chọn ra phương pháp và chế độ khử tạp chất tốt nhất. - Nghiên cứu phương pháp tách chiết collagen. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất thu nhận collagen: khảo sát ảnh hưởng của thời gian, nồng độ acid acetic và tỉ lệ dung dịch/da ca đến hiệu suất tách chiết collagen. - Tối ưu hóa hiệu suất collagen. Sử dụng thuật toán tối ưu xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình hiệu suất collagen. Từ đó tìm các thông số tối ưu để hiệu suất thu nhận collagen đạt hiệu suất thu hồi cao nhất, làm cơ sở khoa học chọn chế độ công nghệ sản xuất collagen. - Xây dựng quy trình công nghệ và tiêu chuẩn chất lượng sản phẩm. Xây dựng các thông số kỹ thuật cho từng công đoạn, đánh giá chất lượng sản phẩm bằng cảm quan, thành phần hoá học và xây dựng tiêu chuẩn chất lượng collagen 3. Phƣơng pháp nghiên cứu Sử dụng phương pháp nghiên cứu thực nghiệm, kết hợp nghiên cứu hóa sinh có sự hỗ trợ của công cụ toán học và thuật toán tối ưu để phát hiện các tính chất mới và mối quan hệ giữa các đại lượng, xử lý thống kê với sự hỗ trợ của phần mềm Microsoft Excel, lập trình Matlab V.7.01 và được kiểm chứng bằng thực tế. 7 4. Kết quả nghiên cứu - Thành phần hóa học của da cá tra có hàm lượng protein là 30,14% hàm lượng lipid là 5,4% hàm lượng ẩm 65,82% Hydroxyproline là 34,64% chất vô cơ là 0,42% - Để tinh sạch da cá cần xử lý bằng LasNa 0,5% trong NaOH 1% với thời gian 8 giờ, tỷ lệ dung dịch/da cá là 10/1 ở điều kiện nhiệt độ 60C cho kết quả khá tốt, hàm lượng tạp chất và non-collagen giảm còn 2,31%. Sử dụng H2O2 1% trong môi trường NaOH 0,05M để tẩy sắc tố da cá và khử mùi tanh của da cá là tốt nhất. - Tách chiết collagen trong môi trường acid acetic ở các nồng độ khác nhau, thì hiệu suất tách chiết collagen có mối quan hệ mật thiết và ảnh hưởng bởi các yếu tố là nồng độ acid acetic, thời gian tách chiết và tỷ lệ dung dịch axid acetic/da cá. - Tối ưu hóa quá trình tách chiết collagen cho thấy mô hình toán đã biểu đạt khá rõ quá trình tách chiết collagen. Với tỷ lệ dung dịch acid acetic/da cá là 13/1; nồng độ acid acetic là 0,58M và thời gian tách chiết 26 giờ thì hiệu suất tách chiết collagen đạt giá trị cực đại là 72,9%. - Đã xây dựng được quy trình công nghệ sản xuất collagen từ da cá tra, tạo ra được collagen từ da cá tra sản phẩm có màu sắc trắng ngà, hàm lượng hữu cơ là 92,07%, protein là 89,42% lipid là 1,89% độ ẩm 6,9% khoáng 0,14% và pH là 6,5 – 6,7 sản phẩm đạt tiêu chuẩn chất lượng collagen thực phẩm. 5. Sản phẩm  Một bài báo khoa học đăng tạp chí tính điểm từ 0-1 điểm: Khoa học và công nghệ, Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn “Nghiên cứu các yếu tố nâng cao hiệu suất tách chiết colagen từ da cá tra”  Công nghệ sản xuất collagen từ da cá tra  Sản phẩm collagen 6. Tính mới và sáng tạo - Tối ưu hoá quá trình tách chiết collgen đã xác lập mối quan hệ mật thiết giữa toán học và công nghệ làm giàu collagen, đây là cơ sở khoa học để lựa chọn chế độ công nghệ cho quá trình chế biến collagen từ da cá tra. - Xác định được thành phần và tính chất của da cá tra, đặc biệt là thành phần của collagen, kết quả nghiên cứu là cơ sở cho việc xây dựng công nghệ sản xuất collagen từ da cá tra. 8 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN 1.1. GIỚI THIỆU VỀ COLLAGEN 1.1.1. Collagen Collagen là một loại protein, là thành phần cơ bản của mô liên kết, chúng là thành phần chính chiếm tỷ trọng cao của da, gân và sụn. Collagen và collagen thủy phân gọi là collagen hydrolysate được sử dụng trong thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm và công nghiệp nhiếp ảnh. Chúng được sử dụng như chất đông, chất gây lắng trong thực phẩm. Collagen được dùng để làm vỏ bao xúc xích, màng bọc kẹo, làm nguyên liệu sản xuất một số loại thực phẩm dinh dưỡng, thực phẩm chức năng. Do collagen có tính tan chảy ở nhiệt độ cao và đông đặc ở nhiệt độ thấp, nên collagen đóng vai trò một chất keo bảo vệ ngăn chặn sự kết tinh của đường. Trong các sản phẩm thực phẩm, người ta thêm vào một hàm lượng collagen hydrolysate nhằm ngăn chặn sự mất nước, đồng thời tạo độ mịn, độ sánh cho sản phẩm, cũng như thay thế hàm lượng chất béo trong các loại thực phẩm. Trong công nghiệp sản xuất kẹo mứt, collagen hydrolysate được sử dụng làm chất tạo gel, chất kết dính, tạo xốp, làm chậm quá trình tan kẹo, trong các sản phẩm như thịt hộp, thịt nguội collagen hydrolysate chiếm từ 1-5% giúp giữ hương vị tự nhiên của sản phẩm, đồng thời cũng là một chất kết dính giúp cho việc tạo hình sản phẩm dễ dàng hơn…. Như vậy collagen là một thành phần cơ bản của mô liên kết, chiếm hơn 70% trọng lượng khô của da, gân và sụn. Collagen là một loại protein bao gồm có ba chuỗi polypeptide (α- peptide) riêng biệt xoắn lại với nhau giống như một sợi dây thừng. Mỗi sợi collagen gồm có hàng nghìn phân tử amino acid, chủ yếu gồm có glycine, proline và hydroxyproline. Mỗi phân tử collagen có khối lượng trung bình khoảng 100÷300 kDa, chiều dài khoảng 300nm, đường kính 1,5nm. Phần lớn collagen trong mạng lưới ngoại bào được tìm thấy ở dạng sợi, bao gồm những sợi mảnh, nhỏ, thông qua quá trình tạo sợi, các phân tử collagen tổ hợp với nhau hình thành nên các vi sợi (microfibril) bao gồm từ 4÷8 phân tử collagen hoặc với số lượng nhiều hơn sẽ tạo thành các sợi (fibril). Collagen là một loại protein vì vậy chúng cũng có đầy đủ các tính chất lý hóa của một protein như sự biến tính, tính kỵ nước, khả năng kết tủa thuận nghịch, không thuận nghịch, tính hydrat hóa, tính chất của dung dịch keo... Theo đánh 9 giá của Hulmes [50] Wolfgang [75] đều cho rằng những cấu trúc đại phân tử khác nhau được hình thành từ các kiểu collagen xác định có tính di truyền riêng biệt. Quá trình tiến hóa đã làm gia tăng nhiều kiểu collagen qua sự thay đổi trình tự các acid amin nhưng vẫn bảo tồn các cấu trúc đặc trưng chung cũng như những chức năng sinh hóa khác trong cơ thể và cấu trúc da của collagen được biểu diễn hình 1.1 như sau Hình 1.1. Cấu trúc da của collagen 1.1.2. Cấu tạo phân tử [64] Collagen là một loại protein tương đối đơn giản gồm có ba chuỗi acid amin riêng biệt xoắn lại với nhau giống như một sợi dây thừng. Mỗi sợi collagen gồm có hàng nghìn phân tử amino acid, chủ yếu gồm có glycine, proline và hydroxyproline. Các acid amin sắp xếp trong chuỗi xoắn ốc theo các dãy với sự phân bố trong chuỗi polypeptide [64] bảng 1.1 sau: Bảng 1.1. Sự phân bố các acid amin trong chuỗi polypeptide STT Triplet Tỉ lệ 1 Gly-X-X 0.44 2 Gly-X-Y 0.2 3 Gly-Y-X 0.27 4 Gly-Y-Y 0.09 Trong đó, Y là acid amin (proline và hydroxyproline), X là các acid amin khác. Glycine chiếm gần 1/3 trong tổng số các acid amin và nó được phân bố một cách đều 10 đặn tại vị trí mỗi 1/3 xuyên suốt trong phân tử collagen. Do glycine có các nhánh phụ nhỏ nhất nên sự lặp lại của nó cho phép các chuỗi polypeptide kết hợp chặt chẽ với nhau hình thành nên một đường xoắn ốc với khoảng trống nhỏ ở phần lõi và trật tự sắp xếp các acid amin trong collagen [55] hình 1.2. Hình 1.2. Trật tự sắp xếp các acid amin trong collagen Cấu trúc phân tử [28,33,36] Hình 1.3. Cấu trúc của phân tử collagen (triple helix) Phân tử collagen (hình 1.3) hay còn gọi là tropocollagen là những phần tử nhỏ, chúng sẽ tập hợp thành những phần tử lớn hơn là các sợi, rồi sau đó hình thành các bó collagen. Mỗi phân tử collagen có khối lượng trung bình khoảng 100÷300 kDa, chiều dài khoảng 300 nm, đường kính 1,5 nm, được tạo thành bởi 3 chuỗi polypeptide (αpeptide) và do đó collagen có cấu trúc bậc 4. Mỗi chuỗi có hình dạng đường xoắn ốc 11 theo hướng từ phải sang trái. Ba chuỗi này xoắn lại với nhau hình thành một cuộn có hướng từ trái sang phải, gọi là triple helix hay super helix [66]. Chuỗi α- peptide gồm có 3 vùng: Vùng lớn nhất là vùng xoắn ốc nằm ở giữa: chuỗi acid amin Gly – X – Y, Gly – pro – Ohpro. 2 vùng telopeptide ở 2 đầu (gồm 1625 acid amin): phần lysine (các liên kết đồng hóa trị) [72]. Hình 1.4. Cấu trúc của procollagen và sự chuyển từ procollagen sang tropocollagen Hình 1.5. Sự hình thành các liên kết ngang Đầu tiên ba sợi của collagen này xoắn lại theo kiểu xoắn ốc xung quanh một sợi hình thành nên một bộ ba. Sau đó ba của những bộ ba này bắt với nhau và xoắn chung quanh mỗi bộ ba để hình thành nên một sợi siêu cáp. Mỗi sợi này cũng liên kết với nhau để tiến lại gần nhau bằng các liên kết ngang. Sự kết hợp này được gọi là một 12 collagen siêu xoắn. Cấu trúc ba chiều phức tạp này quyết định chức năng sinh học của collagen [72, 75]. Collagen có 4 bậc cấu trúc trong đó: - Bậc 1: là chuỗi polypeptide được tạo ra từ khoảng 1050 acid amin khác nhau (có khoảng 20 loại), cấu trúc phổ biến là glycine -X-Y. Trong đó X, Y thường là proline, hydroxyproline. - Bậc 2: là sự hình thành nên các chuỗi xoắn α nhờ các liên kết hydro với nguyên tắc là cứ 4 amino acid sẽ có 1 liên kết hydro. Ngoài ra, còn có loại cấu trúc bậc 2 dạng tấm. - Bậc 3: là cấu trúc dựa trên cơ sở cấu trúc bậc 2 nhưng có thêm một số liên kết ngay trên chuỗi polypeptide của nó như liến kết hydro, liên kết ion, liên kết disulfide, liên kết vander Waals. - Bậc 4: là cấu trúc của các phân từ collagen (còn gọi là tropocollagen). Tạo nên từ 3 chuỗi xoắn ốc α. Cấu trúc sợi của collagen Phần lớn collagen trong mạng lưới ngoại bào được tìm thấy ở dạng sợi, bao gồm những sợi mảnh, nhỏ. Thông qua quá trình tạo sợi, các phân tử collagen tổ hợp với nhau hình thành nên các vi sợi (microfibril) bao gồm từ 4÷8 phân tử collagen hoặc với số lượng nhiều hơn sẽ tạo thành các sợi (fibril). Những sợi này có đường kính từ 10÷500 nm tùy thuộc vào loại mô và giai đoạn phát triển. Các sợi collagen sẽ thiết lập nên các sợi lớn hơn (fiber) và cao hơn nữa là các bó sợi (fiber bundle) [42, 44, 64] (hình 2.7) Hình 1.6. Cấu trúc sợi của collagen 13 Hình 1.7. Quá trình tổ hợp tạo sợi của các phân tử collagen Các chuỗi collagen sắp xếp song song theo chiều dọc tạo thành các sợi với tính chu kỳ nhất định. Chúng được sắp xếp so le nhau một khoảng 67 nm và có một khoảng trống khoảng 40 nm giữa những phân tử liền kề nhau (hình 1.7). Nhờ vào cấu trúc có thứ bậc, độ bền vốn có của các chuỗi xoắn ốc được chuyển sang các sợi collagen, cung cấp cho các mô độ cứng, độ đàn hồi và những đặc tính cơ học đặc biệt. Hình 1.8. Sự sắp xếp của phân tử collagen trong một sợi 14