MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ...........................................................................................................i
TÓM TẮT LUẬN ÁN .................................................................................................. ii
ABSTRACT OF THESIS ............................................................................................iv
LỜI CẢM ƠN ...............................................................................................................vi
MỤC LỤC ................................................................................................................... vii
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH...................................................................................ix
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU .................................................................................. x
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT.................................................................................. xii
MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1
1. TỔNG QUAN, HƯỚNG NGHIÊN CỨU VÀ NỘI DUNG CHÍNH ..................... 4
1.1. FOS và prebiotic ................................................................................................... 4
1.2. Các phương pháp tổng hợp FOS từ saccharose .................................................... 8
1.3. Động học phản ứng chuyển hóa saccharose thành FOS bằng enzyme FTS ....... 14
1.4. Các phương pháp nâng cao độ tinh khiết của FOS ............................................. 19
1.5. Ứng dụng phương pháp giải thuật di truyền (GA - Genetic Algorithm) vào bài
toán tìm kiếm và tối ưu .............................................................................................. 30
1.6. Những vấn đề tồn tại trong công nghệ sản xuất FOS ......................................... 32
1.7. Hướng nghiên cứu và nội dung nghiên cứu của luận án .................................... 33
2. NGUYÊN VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU ............................................................................................................. 36
2.1. Nguyên liệu ......................................................................................................... 36
2.2. Hóa chất .............................................................................................................. 36
2.3. Màng lọc nano .................................................................................................... 37
2.4. Thiết bị ................................................................................................................ 39
2.5. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 40
2.6. Phương pháp phân tích ....................................................................................... 41
vii
3. NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG VÀ ĐỘNG HỌC PHẢN ỨNG
CHUYỂN HÓA SACCHAROSE THÀNH FOS BẰNG ENZYME FTS THU
NHẬN TỪ ASPERGILLUS FLAVIPES .................................................................. 43
3.1. Tổng hợp FOS từ saccharose bằng enzyme FTS ................................................ 43
3.2. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp FOS từ saccharose
bằng enzyme FTS ...................................................................................................... 44
3.3. Nghiên cứu động học phản ứng chuyển hóa saccharose thành FOS bằng
enzyme FTS thu nhận từ Aspergillus flavipes ........................................................... 51
3.4. Đánh giá mức độ tương thích của mô hình toán học đã xây dựng với thực
nghiệm........................................................................................................................ 69
3.5. Kết luận ............................................................................................................... 71
4. NGHIÊN CỨU NÂNG CAO ĐỘ TINH KHIẾT CỦA FOS BẰNG PHƯƠNG
PHÁP LỌC NANO ...................................................................................................... 72
4.1. Nghiên cứu lựa chọn màng lọc nano để tinh sạch FOS ...................................... 72
4.2. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng loại bỏ glucose, fructose và
saccharose ra khỏi dung dịch FOS sau tổng hợp bằng phương pháp lọc nano ......... 74
4.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của phương thức pha loãng trong quá trình lọc nano
đến độ tinh khiết và hiệu suất thu hồi FOS ................................................................ 99
4.4. Kiểm tra chất lượng, xác định tổng hiệu suất thu hồi sản phẩm FOS 85% ......111
4.5. Kết luận .............................................................................................................113
5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...............................................................................114
5.1. Kết luận .............................................................................................................114
5.2. Kiến nghị...........................................................................................................115
6. CÁC TÀI LIỆU CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ ......................................................116
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO.....................................................................................117
viii
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Tỷ lệ tiêu thụ các loại prebiotic trên thế giới năm 2008 ................................ 4
Hình 1.2. Cấu trúc của một số phân tử FOS ................................................................... 5
Hình 1.3. Sơ đồ hệ thống sản xuất FOS phổ thông (Neosugar G) và FOS cao độ
(Neosugar P) sử dụng phương pháp lọc gel ................................................................. 13
Hình 1.4. So sánh kết quả giữa dự đoán theo mô hình toán học và thực nghiệm ......... 18
Hình 1.5. So sánh kết quả giữa dự đoán theo mô hình của Lee và thực nghiệm với
nồng độ saccharose ban đầu là 400g/L .......................................................................... 19
Hình 1.6. So sánh kết quả dự đoán theo mô hình của Rocha và thực nghiệm ............. 19
Hình 1.7. Sơ đồ hệ thống phức hợp sản xuất FOS cao độ theo nghiên cứu của
Sheu và cộng sự ............................................................................................................. 24
Hình 1.8. Sơ đồ hệ thống thí nghiệm với bình phản ứng có tích hợp bộ phận
lọc màng trong nghiên cứu của Nishizawa và cộng sự ................................................ 26
Hình 2.1. Hệ thống thiết bị lọc nano sử dụng màng dạng cuộn xoắn ........................... 39
Hình 3.1. Quy trình tổng hợp FOS từ saccharose bằng enzyme FTS ........................... 43
Hình 3.2. Lưu đồ thuật toán xây dựng quần thể bằng phương pháp ngẫu nhiên .......... 59
Hình 3.3. Lưu đồ thuật toán tìm nghiệm tối ưu bằng phương pháp giải thuật
di truyền ......................................................................................................................... 66
Hình 3.4. So sánh giữa mô hình động học phản ứng tổng hợp FOS bằng enzyme
FTS với thực nghiệm ..................................................................................................... 70
Hình 4.1. Sơ đồ hệ thống thiết bị lọc nano .................................................................... 73
Hình 4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới độ phân riêng và tốc độ dòng qua màng .......... 77
Hình 4.3. Ảnh hưởng của nồng độ tới độ phân riêng và tốc độ dòng qua màng .......... 82
Hình 4.4. Cơ chế quá trình lọc nano .............................................................................. 83
Hình 4.5. Ảnh hưởng của lưu lượng tới tới độ phân riêng,tốc độ dòng qua màng ....... 87
Hình 4.6. Ảnh hưởng của áp suất tới độ phân riêng và tốc độ dòng qua màng ............ 90
Hình 4.7. Ảnh hưởng của nồng độ nhập liệu tới tốc độ dòng (DS-5-DL) .................... 99
Hình 4.8. Sự thay đổi của nồng độ các đường, độ tinh khiết của FOS, hiệu suất
thu hồi FOS theo số bước lặp đối với các phương thức pha loãng khác nhau
(màng DS-5-DL)..........................................................................................................104
Hình 4.9. Sự thay đổi của nồng độ các đường, độ tinh khiết của FOS, hiệu suất
thu hồi FOS theo số bước lặp đối với các phương thức pha loãng khác nhau
(màng G5) ....................................................................................................................108
Hình 4.10. Sắc ký đồ FOS phổ thông và sản phẩm FOS cao độ ................................ 112
ix
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1. Tổng kết thị trường prebiotic trên thế giới giai đoạn 2004-2009 và
dự đoán giai đoạn 2009-2014 .......................................................................................... 4
Bảng 1.2. Tỷ lệ bổ sung FOS vào một số thực phẩm ...................................................... 7
Bảng 1.3. Thông số động học của một số enzyme FTS ................................................ 17
Bảng 1.4. So sánh các phương pháp tinh sạch FOS ...................................................... 28
Bảng 2.1. Chỉ tiêu chất lượng của đường saccharose .................................................... 36
Bảng 2.2. Đặc tính của enzyme FTS ............................................................................. 36
Bảng 2.3. Thông số kỹ thuật của màng M-N2514A5 ................................................... 37
Bảng 2.4. Thông số kỹ thuật của màng DS-5-DK......................................................... 38
Bảng 2.5. Thông số kỹ thuật của màng DS-5-DL ......................................................... 38
Bảng 2.6. Thông số kỹ thuật của màng G5 ................................................................... 38
Bảng 2.7. Thông số kỹ thuật của màng GM .................................................................. 39
Bảng 3.1. Mức và khoảng biến thiên của các yếu tố trong quá trình chuyển hóa
saccharose thành FOS sử dụng enzyme FTS ................................................................ 45
Bảng 3.2. Kết quả thực nghiệm theo ma trận TYT 24 ................................................... 45
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến quá trình tổng hợp FOS bằng
enzyme FTS ................................................................................................................... 50
Bảng 3.4. Quần thể được xây dựng bằng phương pháp ngẫu nhiên trong giai
đoạn 1 ............................................................................................................................ 60
Bảng 3.5. Thông số động học của enzyme FTS thu nhận từ Aspergillus flavipes
xác định bằng phương pháp giải thuật di truyền ........................................................... 67
Bảng 4.1. Khả năng phân riêng monosaccharides, saccharose, FOS của các màng ..... 73
Bảng 4.2. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lọc nano
(Màng DS-5-DL) ........................................................................................................... 74
Bảng 4.3. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lọc nano
(Màng G5) ..................................................................................................................... 75
Bảng 4.4. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lọc nano ................ 76
Bảng 4.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ nhập liệu đến quá trình lọc nano 81
Bảng 4.6. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của lưu lượng nhập liệu đến quá trình
lọc nano.......................................................................................................................... 85
Bảng 4.7. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của áp suất đến quá trình lọc nano .................. 88
Bảng 4.8. Mức và khoảng biến thiên của các yếu tố (màng DS-5-DL) ........................ 93
Bảng 4.9. Ma trận thực nghiệm toàn phần, k=2 và kết quả (màng DS-5-DL) .............. 93
x
Bảng 4.10. Mức và khoảng biến thiên của các yếu tố (màng G5) ................................ 94
Bảng 4.11. Ma trận thực nghiệm toàn phần, k=2 và kết quả (màng G5) ...................... 95
Bảng 4.12. Bố trí thí nghiệm lọc tuần hoàn có pha loãng ...........................................100
Bảng 4.13. Kết quả thí nghiệm lọc tuần hoàn có pha loãng theo phương thức CVD
(Màng DS-5-DL) .........................................................................................................101
Bảng 4.14. Kết quả thí nghiệm lọc tuần hoàn có pha loãng theo phương thức
VVD 0,95:1 (Màng DS-5-DL) ....................................................................................102
Bảng 4.15. Kết quả thí nghiệm lọc tuần hoàn có pha loãng theo phương thức
VVD 0,90:1 (Màng DS-5-DL) ....................................................................................103
Bảng 4.16. Kết quả thí nghiệm lọc tuần hoàn có pha loãng theo phương thức
CVD (Màng G5) ..........................................................................................................105
Bảng 4.17. Kết quả thí nghiệm lọc tuần hoàn có pha loãng theo phương thức
VVD 0,95:1 (Màng G5) ..............................................................................................106
Bảng 4.18. Kết quả thí nghiệm lọc tuần hoàn có pha loãng theo phương thức
VVD 0,9:1 (Màng G5) ................................................................................................ 106
Bảng 4.19. Kết quả thí nghiệm lọc tuần hoàn có pha loãng theo phương thức
VVD 0,85:1 (Màng G5) ..............................................................................................107
Bảng 4.20. Số bước lặp trong các phương thức pha loãng ..........................................110
Bảng 4.21. Hiệu suất thu hồi FOS trong các phương thức pha loãng .........................110
Bảng 4.22. Các phương thức pha loãng có thể áp dụng để tinh sạch FOS .................111
Bảng 4.23. Kết quả kiểm tra chất lượng sản phẩm FOS 85% .....................................111
xi
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt
Thuật ngữ tiếng Việt
CAT
Catalase
CVD
Phương pháp lọc tuần hoàn với thể tích không đổi
F
Fructose
FOS
Fructooligosaccharides
FTS
Fructosyltransferase
G
Glucose
GF
Saccharose
GF2
1-kestose
GF3
Nystose
GF4
1F- Fructosylnystose
GI
Glucose isomerase
GO
Glucose oxidase
MF
Quá trình vi lọc
MWCO
Giới hạn khối lượng phân tử
NF
Quá trình lọc nano
RO
Quá trình lọc thẩm thấu ngược
SCFA
Acid béo mạch ngắn
UF
Quá trình siêu lọc
VVD
Phương pháp lọc tuần hoàn với thể tích thay đổi
w/w
khối lượng/khối lượng
w/v
khối lượng/thể tích
v/v
thể tích/thể tích
xii
MỞ ĐẦU
Fructooligosaccharides (FOS) ngày càng được sử dụng rộng rãi để bổ sung vào
thực phẩm như sữa, bánh kẹo…vì những đặc tính sinh học có lợi cho cơ thể con người.
Các nhà khoa học đã chứng minh FOS có khả năng cải thiện hệ vi sinh vật hữu ích
trong đường ruột (Bifidobacteria, Lactobacilli), ít gây sâu răng, giảm lượng
triglycerides trong máu, tăng khả năng hấp thu canxi cho cơ thể… nên có tác dụng tốt
đối với trẻ em, người già, các bệnh nhân tiểu đường, béo phì, mỡ máu…[1], [2], [3],
[4].
Tại Việt Nam, người tiêu dùng đã quen với một số thực phẩm được bổ sung FOS
như sữa bột Ensure, Nestle, Dielac, một số loại bánh (Kinh Đô, Bibica), kẹo… Mặc dù
nhu cầu tiêu thụ FOS tại Việt Nam rất cao nhưng hiện nay thị trường sản xuất FOS
trong nước chưa phát triển, các nhà máy vẫn sử dụng 100% sản phẩm FOS ngoại nhập
từ các hãng Orafti (Bỉ), Meiji Seika Kaisha (Nhật)… Cũng chính vì vậy, nghiên cứu
công nghệ sản xuất FOS từ saccharose và sản xuất ở quy mô pilot đã được chính phủ
quan tâm và đưa vào nội dung chính trong chương trình nghiên cứu trọng điểm quốc
gia phát triển công nghiệp hóa dược đến năm 2020 (quyết định số 61/2007/QĐ-TTg
của Thủ tướng chính phủ ký ngày 7/5/2007). Do đó, việc nghiên cứu quá trình chuyển
hóa saccharose thành FOS và tinh sạch để thu được FOS có độ tinh khiết cao (>75%),
từ nguyên liệu sẵn có trong nước, thay thế FOS nhập ngoại, là vấn đề thực sự cần thiết,
có ý nghĩa khoa học, có giá trị thực tiễn và tính xã hội cao.
Mục tiêu của luận án:
(1) Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng và động học phản ứng chuyển hóa
saccharose thành FOS bằng enzyme fructosyltransferase (FTS) thu nhận từ Aspergillus
flavipes nhằm lựa chọn các thông số công nghệ thích hợp và thông qua mô hình hóa về
động học phản ứng, có thể dự đoán được nồng độ saccharose, glucose, fructose, FOS
theo thời gian phản ứng, tăng khả năng chủ động điều khiển quá trình tổng hợp FOS.
(2) Nghiên cứu nâng cao độ tinh khiết của FOS bằng phương pháp lọc nano,
khẳng định tính ưu việt của phương pháp này so với các phương pháp truyền thống
như lên men, enzyme.
1
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án:
(1) Đã nghiên cứu một cách có hệ thống về công nghệ sản xuất FOS, bao gồm cả
chuyển hóa tạo FOS và tinh sạch đến độ tinh khiết 86%, phù hợp với tiêu chuẩn sử
dụng cho thực phẩm. Đặc biệt, đã chứng minh được cơ chế phản ứng chuyển hóa
saccharose thành FOS bằng enzyme FTS thông qua mô hình động học và dữ liệu thực
nghiệm. Các kết quả thu được có ý nghĩa như những bước khai phá ban đầu để các nhà
khoa học công nghệ khác tham khảo khi nghiên cứu về lĩnh vực này.
(2) Đã xác định được các thông số công nghệ tối ưu và xây dựng mô hình toán
học mô tả động học phản ứng chuyển hóa saccharose thành FOS bằng enzyme FTS
dưới dạng hệ phương trình vi phân. Đây là cơ sở khoa học quan trọng cho việc tiến tới
chủ động điều khiển quá trình tổng hợp FOS, hướng tới quy mô công nghiệp.
(3) Lần đầu tiên đã ứng dụng thành công phương pháp giải thuật di truyền (GA –
Genetic Algorithm) để xác định các thông số động học của enzyme FTS và tối ưu hóa
thông số công nghệ của quá trình lọc nano bằng phương pháp vùng cấm. Thành công
bước đầu này đã chứng minh một cách thuyết phục rằng ứng dụng lý thuyết toán học
vào giải quyết các vấn đề của khoa học công nghệ sẽ mang lại hiệu quả tốt, chính xác,
rút ngắn khoảng cách giữa toán học với các ngành khoa học công nghệ.
(4) Đã xác định được quy luật ảnh hưởng của nhiệt độ, nồng độ, lưu lượng, áp
suất đến khả năng phân riêng monosaccharides, saccharose, FOS bằng màng lọc nano
và xác lập được chế độ lọc nano thích hợp nhằm nâng cao độ tinh khiết của FOS.
(5) Việc ứng dụng thành công màng lọc nano để tách các cấu tử có kích thước
phân tử như glucose, fructose, saccharose… ra khỏi hỗn hợp nhiều cấu tử là gợi ý có
sức thuyết phục các nhà khoa học Việt Nam trong việc nghiên cứu vật liệu nano ứng
dụng vào thực tế sản xuất các quá trình của công nghệ cao như tinh sạch enzyme,
kháng sinh, các hoạt chất sinh học…
Luận án được trình bày trong 115 trang, chia làm 5 chương bao gồm:
Mở đầu (03 trang).
Chương 1: Tổng quan, hướng nghiên cứu và nội dung chính (32 trang).
Chương 2: Nguyên vật liệu, hóa chất, thiết bị và phương pháp nghiên cứu
2
(07 trang).
Chương 3: Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng và động học phản ứng chuyển
hóa saccharose thành FOS bằng enzyme fructosyltransferase (FTS) thu nhận
từ Aspergillus flavipes (29 trang).
Chương 4: Nghiên cứu nâng cao độ tinh khiết của FOS bằng phương pháp
lọc nano (42 trang).
Chương 5: Kết luận và kiến nghị (02 trang)
3
1. TỔNG QUAN, HƯỚNG NGHIÊN CỨU VÀ NỘI DUNG CHÍNH
1.1. FOS và prebiotic
Prebiotic là nguồn thức ăn cho các vi sinh vật sống hữu ích trong đường ruột vật
chủ. Nhờ có prebiotic mà vi sinh vật hữu ích có điều kiện phát triển mạnh mẽ hơn, do
đó cải thiện hệ tiêu hóa cho vật chủ.
Trên thế giới có trên 400 sản phẩm prebiotic từ hơn 20 công ty sản xuất. Ở châu
Âu, tổng doanh thu của thực phẩm chức năng vào năm 2005 là khoảng 8 tỷ euro, trong
đó phân đoạn prebiotic khoảng 87 triệu euro. Khả năng sản xuất prebiotic ở châu Âu
ước tính khoảng 30.000 tấn/năm, bao gồm Inulin, Oligofructose, Fructooligosaccharides (FOS), Galacto-oligosaccharides (GOS) và Lactulose, trong đó FOS
chiếm 19,7%. Thị trường oligosaccharides tăng trưởng khoảng 15% mỗi năm [5], [6].
Bảng 1.1. Tổng kết thị trường prebiotic trên thế giới giai đoạn 2004-2009 và dự
đoán giai đoạn 2009-2014 [7]
Năm
2004
2005
2006
2007
2008
2009
Tổng doanh thu (triệu USD)
Năm
Tổng doanh thu (triệu USD)
268,13
291,72
317,50
349,42
406,03
466,59
2010
2011
2012
2013
2014
526,41
585,84
645,29
705,08
765,85
Hình 1.1. Tỷ lệ tiêu thụ các loại prebiotic trên thế giới năm 2008 [6]
Các prebiotic được bổ sung nhiều vào thực phẩm là fructo-oligosaccharides
(FOS), galacto-oligosaccharides (GOS), isomalto-oligosaccharides (IMO), inulin và
oligosaccharides đậu nành [8]. Trong số đó, FOS được các nhà nghiên cứu đặc biệt
quan tâm bởi chúng có nhiều hoạt tính sinh học tốt cho cơ thể của người, dễ thu nhận
4
và phạm vi ứng dụng rộng rãi.
Meiji Seika Co. là công ty đầu tiên sản xuất FOS thương mại từ saccharose với
tác nhân là Aspergillus niger vào năm 1984. Sản phẩm được đưa ra thị trường Nhật
Bản với tên gọi Meioligo (Neosugar). Công ty này sau đó thiết lập một liên doanh với
Beghin-Say của Pháp và sản xuất FOS với tên thương mại Actilight. Ngoài ra, công ty
Cheil Foods & Chemical của Hàn Quốc cũng đã sản xuất FOS ở quy mô công nghiệp
với tác nhân là các tế bào Aureobasidum pullulans cố định [5], [9], [10].
1.1.1. Định nghĩa, cấu tạo, nguồn gốc của FOS
FOS là các oligomer fructose với các nhóm fructosyl được gắn với saccharose ở
vị trí β-2.1, thường được mô tả bằng công thức GFn, trong đó G chỉ nhóm glucosyl và
F chỉ nhóm fructosyl, n là số nhóm fructosyl [11]. Các dạng phổ biến nhất của FOS là
1-kestose (GF2), nystose (GF3) và 1F-fructofuranosyl nystose (GF4) [12].
FOS có nhiều trong các loại thực vật như hành, măng tây, lúa mì, lúa mạch,
artichoke Jerusalem [13], chuối, mận, hành, hẹ tây, củ chicory [14]. Quá trình trích ly
FOS từ những nguồn này ở quy mô công nghiệp không có tính kinh tế do nồng độ
FOS trong nguyên liệu rất thấp. Vì lý do đó, FOS thương mại được sản xuất bằng
phương pháp tổng hợp từ sacharose hoặc thủy phân từ inulin [15].
Hình 1.2. Cấu trúc của một số phân tử FOS [16]
5
1.1.2. Vai trò và ứng dụng của FOS
Một số tác giả khi nghiên cứu về tính chất hóa lý của FOS đều đưa ra kết luận
chung là FOS có nhiều tính chất hóa lý tương tự saccharose như độ hòa tan, độ đông
đặc, nhiệt độ sôi và các thông số về quá trình kết tinh [9], [17]. Tuy vậy, khác với
saccharose, FOS mang nhiều đặc tính sinh học ưu việt hơn. Đây chính là đặc điểm
khiến các nhà thực phẩm chú ý và tập trung khai thác loại đường này.
FOS có khả năng gây sâu răng thấp hơn so với saccharose, do vi khuẩn
Streptococcus mutans trong khoang miệng gây sâu răng không sử dụng được FOS
[18]. Ngoài ra Ikeda T. (1990) [2] còn nghiên cứu cho thấy FOS không chỉ có khả
năng phòng mà còn có khả năng chữa bệnh sâu răng. Vì thế ngày nay nhiều nơi trên
thế giới dùng FOS thay thế cho đường saccharose trong thành phần thức ăn hoặc trong
chế biến bánh kẹo, đặc biệt là bánh kẹo cho trẻ em để phòng bệnh sâu răng.
FOS không bị tiêu hóa ở ruột non nên đến được ruột già một cách nguyên vẹn.
Tại đây FOS bị lên men bởi hệ vi sinh vật trong ruột tạo thành những acid béo mạch
ngắn (SCFA) như acid acetic, acid propionic, acid butyric... làm cho FOS có tác dụng
giống chất xơ: giảm táo bón, cải thiện tính chất của phân, cải thiện mỡ máu và ngăn
chặn sự tổng hợp các chất thối rữa trong ruột. Mặt khác, việc sử dụng FOS còn thúc
đẩy quá trình hấp thu Ca, Mg, không làm tăng lượng đường trong máu do FOS không
hoặc rất ít bị thủy phân bởi hệ enzyme đường ruột. Vì vậy FOS thích hợp cho người
già, phụ nữ và người bị bệnh tiểu đường [3], [4].
Tính an toàn của FOS đã được chứng minh trong nhiều nghiên cứu khác nhau
(Hidaka và cộng sự, 1986; Clevenger và cộng sự, 1988; Tokunaga và cộng sự, 1989;
Kolbye, 1992; Coussement, 1999) với kết quả là FOS không có nguy cơ gây ung thư.
Nhiều nghiên cứu tiến hành trên động vật và người cho thấy có rất ít tác dụng phụ liên
quan tới việc sử dụng FOS [19]. Các kết quả nghiên cứu độc tính đã chứng tỏ FOS
không gây đột biến hoặc sinh quái thai và không tạo ra tác dụng phụ nghiêm trọng
hoặc khả năng gây ung thư ở động vật sau khi hấp thu với liều lượng lên tới 15% trong
chế độ ăn [20].
6
Bảng 1.2. Tỷ lệ bổ sung FOS vào một số thực phẩm [20]
Loại thực phẩm
Tỷ lệ bổ sung (%w/w)
Thức ăn trẻ em
1,2
Nước giải khát
1,2
Bánh quy
3,6
Bánh ngọt
1,6 - 3,6
Kẹo
5,0
Bánh cookie
2,5 – 3,3
Bánh quy giòn
1,7 – 3,3
Sữa không bổ sung và có bổ sung mùi
0,4
Kẹo cứng
6,7
Kem
1,5
Mứt và thạch
0,9
Bánh nướng xốp
3,6
Bột ngũ cốc ăn liền
3,3 – 15,4
Kem trái cây và nước quả
1,4
Súp
0,4
Sữa chua
1,3
FOS được bổ sung vào các loại thực phẩm như nước giải khát, các sản phẩm sữa,
bánh kẹo, mứt, thức ăn gia súc [16]. Trong mứt, FOS có thể được dùng làm chất tạo
ngọt, sản phẩm có mức năng lượng thấp hơn khi so sánh với dùng saccharose. Mặc dù
các đặc điểm cảm quan tương tự nhau, sản phẩm bổ sung FOS có độ ngọt thấp hơn và
cấu trúc mềm hơn. Trong kem, FOS có thể được dùng với inulin để thay thế đường,
tạo cảm giác ngon miệng [21].
Ở Nhật Bản, FOS được dùng phổ biến như chất tạo ngọt, chất điều vị, chất độn
và chất giữ ẩm, bổ sung vào các sản phẩm thực phẩm như bánh quy, bánh ngọt, bánh
mì, kẹo, các sản phẩm sữa và một số loại nước giải khát thay thế saccharose. Ngoài ra,
FOS còn đuợc bổ sung vào một số loại thực phẩm chức năng để tăng cường sự phát
triển của vi khuẩn có ích trong tuyến tiêu hóa [17].
7
1.2. Các phương pháp tổng hợp FOS từ saccharose
FOS được tổng hợp từ saccharose bằng phương pháp lên men với tác nhân là vi
sinh vật hoặc enzyme theo phương thức liên tục hoặc không liên tục. Trong phương
pháp lên men không liên tục, người ta thường sử dụng tế bào vi sinh vật và enzyme tự
do, còn công nghệ cố định enzyme hoặc cố định tế bào được sử dụng đối với phương
pháp liên tục [22], [23], [24].
Giải pháp cố định enzyme và cố định tế bào trong sản xuất FOS cho hiệu quả cao
hơn vì sản xuất được liên tục, tiêu hao năng lượng ít, nhà xưởng nhỏ v.v… nhưng tính
ổn định kém và cần máy móc, thiết bị hiện đại, nhà xưởng tiêu chuẩn. Mặc dù vậy, đây
lại là phương pháp có khả năng công nghiệp hóa cao và được tập trung nghiên cứu
nhiều ở các nước có nền công nghiệp phát triển như Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn
Quốc. Phương pháp không liên tục có kỹ thuật sản xuất đơn giản, thiết bị rẻ tiền hơn
phương pháp liên tục. Vì vậy, phương pháp này được sử dụng nhiều ở các qui mô nhỏ,
đầu tư thấp [25].
1.2.1. Sử dụng tác nhân là tế bào vi sinh vật
Vi sinh vật thường được sử dụng để chuyển hóa saccharose thành FOS là các
chủng có hoạt tính fructosyltransferase như: Aspergillus [26], [27], [28],
Aureobasidum [24], Fusarium [29] và Penicillium [30], trong đó Aspergillus được sử
dụng phổ biến nhất.
1.2.1.1. Sử dụng tế bào vi sinh vật tự do
Sangeetha và cộng sự [28] dùng tế bào Aspergillus oryzae CFR 202 để tổng hợp
FOS với cơ chất là dung dịch saccharose 60% trong điều kiện nhiệt độ 55 0C và pH
5,15. Hiệu suất thu nhận FOS đạt 53% (g FOS/g saccharose).
Trong một nghiên cứu khác, Aspergillus sp. N74 có hoạt tính fructosyltransferase
đã được Oscar và các cộng sự [27] dùng để tổng hợp FOS trong thiết bị phản ứng có
khuấy trộn cơ học với hai nồng độ sinh khối của Aspergillus sp. N74 là 6 và 9,5g/L.
Các điều kiện phản ứng là nhiệt độ 600C, pH 5,5, nồng độ saccharose ban đầu là 70%
(w/v) và thời gian phản ứng 26 giờ. Kết quả thu nhận được cho thấy hiệu suất tổng hợp
FOS cũng như thành phần của sản phẩm FOS phụ thuộc vào nồng độ sinh khối và thời
8
gian phản ứng. Thời gian phản ứng tối ưu cho quá trình tổng hợp FOS ứng với nồng
độ sinh khối 6 và 9,5g/L lần lượt là 24 giờ và 4 giờ (nồng độ FOS tương ứng là 378 và
427g/L). Nồng độ sinh khối 9,5g/L tổng hợp được 1-β-fructofuranosylnystose, trong
khi đó sản phẩm FOS tổng hợp với nồng độ cơ chất 6g/L không có thành phần này.
Các tác giả cũng khẳng định rằng thiết bị phản ứng thiết kế trong đề tài và enzym
fructosyltransferase được sản xuất từ Aspergillus sp. N74 nguyên bản có thể là phương
án sản xuất FOS ở quy mô công nghiệp.
Ngoài Aspergillus, một số loại tế bào vi sinh vật tự do khác cũng được sử dụng
để tổng hợp FOS. Prata và cộng sự (2010) [30] đã nghiên cứu tổng hợp FOS từ
Penicillium expansum ở nhiệt độ 22 – 25°C, sau 12 giờ thu được 0,58g FOS/g
saccharose. Kết quả này đã khẳng định tiềm năng của chủng Penicillium expansum
trong sản xuất FOS.
1.2.1.2. Sử dụng tế bào vi sinh vật cố định
Đối với công nghệ cố định tế bào, một số chất mang có hiệu quả cao đã được
nghiên cứu là calcium-alginate [31], [32], gluten [33], lõi bắp [34].
Nhiều nhà khoa học đã cố định tế bào vi sinh vật trên gel calcium alginate để
tổng hợp liên tục FOS như Feng, Bo với Aspergillus niger AS0023 [31] và Sanchez
với Aspergillus sp. N74 [32]. Bằng khảo sát thực nghiệm và tối ưu hóa các thông số
nhiệt độ, pH, nồng độ saccharose ban đầu, kết quả cho thấy có thể đạt hiệu suất tổng
hợp FOS lên đến 53% w/w (Aspergillus niger AS0023) và 50% w/w (Aspergillus sp.
N74).
Việc tổng hợp FOS từ saccharose sử dụng công nghệ cố định tế bào Aspergillus
japonicus (có hoạt tính β-D-fructofuranosidase) đã được nghiên cứu với chất mang là
gluten (Chien, 2001) và lõi bắp (Mussatto, 2009). Chien và cộng sự chứng minh rằng
tốc độ phản ứng tăng theo nồng độ tế bào trong mạng gluten và giá trị tối ưu đạt được
khi nồng độ tế bào là 20% (w/w), nồng độ ban đầu của dung dịch saccharose là
400g/L, thời gian phản ứng 5 giờ, hiệu suất tổng hợp FOS đạt 61% [21], [35]. Kết quả
thực nghiệm khi cố định Aspergillus japonicus ATCC 20236 trên lõi bắp cho thấy với
nồng độ saccharose ban đầu là 200g/L, hiệu suất tổng hợp FOS cao hơn so với khi
dùng tế bào tự do, đạt 0,66g/g dựa trên tổng cơ chất, 0,73g/g dựa trên cơ chất tiêu thụ
[34].
9
1.2.2. Sử dụng xúc tác là enzyme
Ngoài tác nhân tế bào vi sinh vật tự do hoặc cố định, để chuyển hóa saccharose
thành FOS, có thể dùng xúc tác enzyme β-fructofuranosidase, còn gọi là invertase (EC
3.2.1.26) hoặc fructosyltransferase (E.2.4.1.9) có ở thực vật và vi sinh vật [36]. Việc
sử dụng enzyme của thực vật không hiệu quả khi sản xuất ở quy mô lớn, do đó hiện
nay chủ yếu dùng enzyme của vi sinh vật.
Enzyme fructosyltransferase (EC 2.4.1.9) được thu nhận từ nhiều loại vi sinh vật
như Aspergillus foetidus [37], Bacillus subtilis [38], Bacillus macerans [39], [40],
Streptococcus salivarius [41], Aureobasidium pullulans [42], [43], Aspergillus niger
[1], [44], Aspergillus japonicus [45],
Aureobasidium sp. [46],
Aureobasidium
pullulans [47], Fusarium oxysporum [29] và các chủng Penicillium [8], [48].
Những thông số quan trọng ảnh hưởng đến quá trình chuyển hóa saccharose
thành FOS là nhiệt độ, pH, nồng độ saccharose ban đầu, tỷ lệ enzyme xúc tác và thời
gian lên men.
Việc lựa chọn nhiệt độ và pH thích hợp cho phản ứng phụ thuộc vào nguồn gốc
enzyme. Các điều kiện tối ưu được khuyến cáo cho quá trình tổng hợp FOS là nhiệt độ
55°C, pH 5,5 với enzyme từ Aureobasodium pullulans; nhiệt độ 60°C, pH 5 với
enzyme từ Aspergillus niger; nhiệt độ 55 – 65°C, pH 5,0 – 6,0 với enzyme từ
Aspergillus japonicus [49]; nhiệt độ 40 – 50°C, pH 4 – 6 với enzyme từ Aspergillus
flavipes [25]. Hiệu suất lý thuyết của quá trình tổng hợp là 75% nếu chỉ tạo thành FOS.
Tuy nhiên, do enzyme xúc tác bị ức chế bởi glucose được giải phóng ra nên hiệu suất
thực tế thấp hơn nhiều [50], chỉ đạt khoảng 60% khi dùng enzyme từ Aspergillus niger
ATCC 20611 [1], [44] từ 53 đến 59% với enzyme từ Aureobasidium sp. [46] và 54,3%
với enzyme từ Aspergillus flavipes [25].
Bên cạnh đó, có nhiều nghiên cứu cho rằng nên chọn nồng độ saccharose ban đầu
cao để giảm hoạt độ nước, vì vậy làm giảm nguy cơ nhiễm vi sinh trong quá trình tổng
hợp và làm giảm chi phí cô đặc sản phẩm sau này [9], [49].
Quá trình tổng hợp FOS từ saccharose có thể được thực hiện theo phương thức
liên tục bằng enzyme cố định hoặc phương thức không liên tục bằng enzyme tự do
(enzyme hòa tan). Việc sử dụng enzyme tự do có một số nhược điểm như bị tổn thất
hoạt tính enzyme trong quá trình vận hành, phải bất hoạt enzyme sau khi chuyển hóa,
10
hoạt tính thủy phân cao dẫn đến tạo nhiều fructose, giảm độ tinh khiết của FOS. Điều
này làm tăng chi phí sản xuất FOS [10], [21]. Tuy nhiên, hiện nay sử dụng enzyme tự
do để tổng hợp FOS vẫn là phương pháp phổ biến nhất.
1.2.2.1. Sử dụng enzyme tự do
Enzyme tự do β-fructofuranosidase (EC 3.2.1.26) của Aspergillus sp. 27H phân
lập từ đất đã được Fernandez và cộng sự (2004) [51] sử dụng để tổng hợp FOS. Điều
kiện tối ưu cho hoạt tính chuyển fructose là pH 5,5 – 6,0 và 60°C, trong khi hoạt tính
thủy phân cao nhất tại pH 4,0 và 55°C. Ở nồng độ saccharose thấp (10g/L), có sự
chuyển hóa nhanh saccharose thành glucose và fructose, nồng độ FOS thu được rất
thấp. Ở điều kiện nồng độ saccharose 615g/L, tỷ lệ enzyme 20 U/g saccharose, nhiệt
độ 40°C, pH 5,5, nồng độ FOS đạt giá trị tối đa 376g/L (234g/L 1-kestose và 142g/L
nystose).
Enzyme -D-fructofuranosidase (EC 3.2.1.26) dưới dạng chế phẩm enzyme
thương mại Pectinex Ultra SP-L của hãng Novozymes mang hoạt tính
fructosyltransferase đã được nghiên cứu để tổng hợp FOS từ saccharose [52] và từ
dịch mía [53]. Từ saccharose (nồng độ 450g/L), sau 14 giờ phản ứng ở 65°C trong
đệm natri acetate 0,05mol/L (pH 5,6), Hang Y.D. [52] đã thu được FOS có nồng độ
272g/L (224g/L kestose và 48g/L nystose) với hiệu suất chuyển hóa hơn 70% dựa trên
lượng saccharose tiêu thụ. Trong đó, FOS, saccharose, glucose và frucrose chiếm
56,5%, 19,4%, 23,4% và 0,7% tổng lượng đường có trong sản phẩm. Còn với cơ chất
là saccharose từ dịch mía, hoạt lực chuyển hóa của chế phẩm enzyme Pectinex Ultra
SP-L là 58,1U/ml, nhiệt độ 40C, pH 5,6 và tỷ lệ enzyme/dịch đường mía là 2:100
(v/v), dung dịch FOS sau tổng hợp có thành phần gồm: FOS 50,4%; saccharose
10,4%; fructose 3,9% và glucose 35,3% [53].
Năm 2007, Yoshikawa và cộng sự [50] sử dụng chế phẩm enzyme thô βfructofuranosidase thu nhận từ Aureobasidium pullulans DSM 2404 trong các nghiên
cứu chuyển hóa saccharose thành FOS và đã đạt hiệu suất tổng hợp FOS 62%. Giá trị
này cao hơn so với khi dùng các chủng Aureobasidium sp. khác (53 – 59%).
Ngoài ra, xúc tác là inulinase từ Kluyveromyces marxianus cũng đã được Risso
(2009) [54] và Santos (2007) [55] nghiên cứu thông qua việc xác định các điều kiện tối
11
ưu của quá trình tổng hợp FOS từ saccharose (nhiệt độ, pH, nồng độ saccharose, hoạt
tính inulinase, tỷ lệ dung môi hữu cơ) bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm. Hiệu
suất chuyển hóa FOS tối đa đạt 16,7±1,1% (w/w) đối với hệ nước – dung môi hữu cơ
(ở nhiệt độ 40°C; pH 6,0; nồng độ saccharose 55%; hoạt lực enzyme inulinase 4U/ml;
tỷ lệ dung môi hữu cơ/tổng hệ thống là 25/100), đạt 12,8±1,0% (w/w) đối với hệ nước
(ở nhiệt độ 40°C; pH 5,0; nồng độ saccharose 55%; hoạt lực enzyme inulinase 4U/ml)
[54]. Trong thiết bị phản ứng có cánh khuấy của Santos và cộng sự (2007), ở điều kiện
tối ưu (nhiệt độ 50°C; pH 6,0; nồng độ saccharose 450g/L; hoạt lực enzyme inulinase
4U/ml) thu được sản phẩm cuối cùng bao gồm fructose (155g/L), glucose (155g/L),
saccharose (132g/L) và FOS (50g/L) [55].
Tại Viện Công nghiệp thực phẩm, enzyme fructosyltranferase đã được Trịnh Thị
Kim Vân và cộng sự [25] nghiên cứu sinh tổng hợp từ nấm mốc Aspergillus flavipes
VVTP84 và ứng dụng trong sản xuất FOS. Tác giả đã tối ưu hóa các thông số công
nghệ theo mô hình bậc 1 với các biến là nồng độ saccharose, tỷ lệ enzyme, thời gian
phản ứng (cố định nhiệt độ 50C, pH5) và hàm mục tiêu là nồng độ FOS tạo thành.
Kết quả thu được sản phẩm FOS phổ thông có độ tinh khiết cao nhất 54,3% khi dùng
cơ chất là saccharose 54%, tỷ lệ enzyme 8U/g saccharose, thời gian phản ứng 12 giờ.
Dựa trên phương pháp khảo sát từng yếu tố, Nguyễn Hoàng Anh (2008) [56]
cũng đã xác định điều kiện tối thích cho quá trình sản xuất FOS từ dịch mía bằng
enzyme FTS của Viện Công nghiệp thực phẩm là thời gian 15 giờ, tỷ lệ enzyme 0,02,
nhiệt độ 500C, pH 5,0. Sản phẩm FOS thu được gồm: FOS (61,48%), saccharose
(10,10%), glucose (26,29%), fructose (2,13%).
Ở quy mô công nghiệp, FOS được tổng hợp từ saccharose dưới tác dụng xúc tác
của enzyme fructosyltransferase (EC 2.4.1.9) hoặc β-fructofuranosidase (EC 3.2.1.26)
thu nhận từ các loại vi sinh vật như Aspergillus niger, Aureobasidium pullulans, ….
(Hình 1.3). Enzyme được thêm vào dung dịch saccharose 50 – 60% (w/v) ở pH 5,5 –
6. Sau phản ứng từ 4 – 20 giờ ở nhiệt độ 50 – 600C, hỗn hợp đường chứa FOS, glucose
và saccharose dư được gia nhiệt tới 900C trong 30 phút để bất hoạt enzyme; làm nguội
xuống dưới 500C; lọc; khử màu, mùi bằng than hoạt tính; khử muối bằng cột nhựa trao
đổi ion và cô đặc chân không tới 75% chất khô. FOS phổ thông thu được là Neosugar
G có độ tinh khiết 60% (w/w) [3].
12
Sơ đồ hình 1.3 là quy trình sản xuất FOS phổ thông (sản phẩm Neosugar G có độ
tinh khiết của FOS đạt 60% w/w) và FOS cao độ (sản phẩm Neosugar P có độ tinh
khiết của FOS đạt 95% w/w).
Hình 1.3. Sơ đồ hệ thống sản xuất FOS phổ thông (Neosugar G) và FOS cao độ
(Neosugar P) sử dụng phương pháp lọc gel [3]
1.2.2.2. Sử dụng enzyme cố định
Các nghiên cứu về cố định enzyme và ứng dụng trong tổng hợp FOS đã được
thực hiện với nhiều loại enzyme từ nguồn vi sinh vật khác nhau như Pectinex Ultra
SP-L (từ Aspergillus aculeatus) [36], enzyme fructosyltransferase (từ Aureobasidium
pullulans) [57], enzyme β-fructofuranosidase (từ Aspergillus oryzae) [58]. Kết quả cho
thấy các điều kiện tối ưu như pH, nhiệt độ không bị ảnh hưởng do việc cố định enzyme
và sản phẩm FOS thu được khi dùng enzyme cố định giống như khi dùng enzyme hòa
tan. Mặt khác, enzyme cố định ổn định hơn ở pH, nhiệt độ cao [57], [59].
Một số nhà nghiên cứu đã chứng minh enzyme -D-fructofuranosidase (EC
3.2.1.26) dưới dạng chế phẩm enzyme thương mại Pectinex Ultra SP-L của hãng
Novozymes có thể được cố định hiệu quả trên các chất mang như Sepabeads EC-EP3,
Sepabeads EC-EP5 [36] và Eupergit C [59] mà không cần thêm muối hoặc dung dịch
đệm. Khi cố định trên polymer polymethacrylate (Sepabeads-EC) hoạt hóa với nhóm
epoxy như Sepabeads EC-EP3,
Sepabeads EC-EP5, với cơ chất là dung dịch
13
saccharose nồng độ 630g/L, nồng độ FOS đạt giá trị tối đa 387g/L sau 36 giờ (240g/L
1-kestose, 144g/L nystose và 3g/L 1F- fructofuranosyl nystose) [36]. Nghiên cứu về
chất mang Eupergit C của Tanriseven và Aslan (2005) [59] cho thấy sau khi cố định,
hoạt tính tương đối của enzyme đạt 96%, các điều kiện tối ưu như pH 5,5 – 6,5, nhiệt
độ 650C không bị ảnh hưởng do việc cố định enzyme. Enzyme cố định không giảm
hoạt tính sau 20 lần phản ứng gián đoạn. Nồng độ FOS tổng hợp được trong nghiên
cứu này đạt khoảng 57% (w/w) với nồng độ dung dịch saccharose ban đầu là 60%
(w/v), tương đương với việc sử dụng enzyme Pectinex Ultra SP-L ở dạng tự do.
Yun và cộng sự (1996) [57] đã tổng hợp FOS liên tục từ saccharose với xúc tác là
enzyme FTS từ Aureobasidium pullulans cố định trên nhựa có tính xốp cao, Diaion
HPA 25. Ở các điều kiện tối ưu tương tự như khi sử dụng enzyme tự do (nhiệt độ
55°C, pH 5,5, nồng độ saccharose ban đầu là 600g/L), sản phẩm thu được khi dùng
enzyme cố định giống như khi dùng enzyme tự do. Khoảng 8% hoạt tính của enzyme
cố định bị tổn thất sau 30 ngày vận hành liên tục, năng suất đạt được là 1174g/L.h.
Trong một nghiên cứu khác của Kurakake và cộng sự (2010) [58], enzyme βfructofuranosidase (sinh tổng hợp từ Aspergillus oryzae) được cố định trên nhựa trao
đổi anion (WA-30; polystyrene với amine bậc ba). Từ dung dịch saccharose 60%,
nhiệt độ phản ứng 550C, thu được FOS có độ tinh khiết 51,9%. Hoạt tính enzyme cố
định duy trì được trong 984 giờ.
1.3. Động học phản ứng chuyển hóa saccharose thành FOS bằng enzyme FTS
1.3.1. Cơ chế phản ứng chuyển hóa saccharose thành FOS bằng enzyme FTS
Phản ứng chuyển hóa saccharose thành FOS bằng enzyme FTS rất phức tạp.
Nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu về cơ chế của phản ứng chuyển hóa này nhưng cho
đến nay vẫn chưa có kết quả thống nhất.
Hầu như các cơ chế phản ứng đã công bố đều dựa trên 3 phản ứng chuyển hóa
(1.1), (1.2), (1.3) do Jung và cộng sự [60] công bố vào năm 1989 thông qua quá trình
nghiên cứu phản ứng tổng hợp FOS bằng enzyme FTS với nhiều cơ chất khác nhau.
2GF GF2 + G
(1.1)
2GF2 GF3 + GF
(1.2)
2GF3 GF4 + GF2
(1.3)
14
- Xem thêm -