Tài liệu Nghiên cứu biểu hiện protein miraculin tái tổ hợp trong dòng tế bào thuốc lá by 2 (nicotiana tabacum l.cv bright yellow 2)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 NGUYỄN HOÀI NAM NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN PROTEIN MIRACULIN TÁI TỔ HỢP TRONG DÒNG TẾ BÀO THUỐC LÁ BY-2 (Nicotiana tabacum L.cv Bright Yellow 2) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC HÀ NỘI, 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 NGUYỄN HOÀI NAM NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN PROTEIN MIRACULIN TÁI TỔ HỢP TRONG DÒNG TẾ BÀO THUỐC LÁ BY-2 (Nicotiana tabacum L.cv Bright Yellow 2) Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã ngành : 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS. LÂM ĐẠI NHÂN HÀ NỘI, 2014 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là đề tài nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan, nghiêm túc và không sao chép trong bất kỳ công trình nào khác. Nếu có gì sai sót, tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm. Tác giả Nguyễn Hoài Nam ii LỜI CÁM ƠN Để hoàn thành báo cáo tốt nghiệp này, em Ÿã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ, hướng dẫn tận tình của các thầy, cô, các anh chị công tác trong Viện Công nghệ Sinh học và các bạn đồng nghiệp. Với lòng biết ơn sâu sắc em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. Lâm Đại Nhân và TS. Phạm Bích Ngọc đã dành nhiều thời gian, tận tình chỉ bảo, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực tập thí nghiệm. Em xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS Chu Hoàng Hà, NCS. La Việt Hồng, Th.s Nguyễn Thu Giang, các cán bộ, anh, chị công tác tại Viện Công nghệ Sinh học cũng như thầy giáo, cô giáo và các cán bộ bộ môn Sinh học, phòng Sau đại học - Trường đại học Sư Phạm Hà Nội 2 đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ em hoàn thành khoá luận này. Cuối cùng em xin bày tỏ lòng biết ơn tới những người thân trong gia đình đã luôn ở bên em, động viên em và toàn thể bạn bè đã giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp này. Em xin chân thành cảm ơn. Hà Nội, ngày 15 tháng 6 năm 2014 Học viên Nguyễn Hoài Nam iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN............................................................................................... i LỜI CÁM ƠN ................................................................................................... ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT........................................................................ vi DANH MỤC BẢNG ....................................................................................... vii DANH MỤC HÌNH ....................................................................................... viii PHẦN I. MỞ ĐẦU............................................................................................ 1 PHẦN II. NỘI DUNG ....................................................................................... 4 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 4 1.1. Cây Thần kỳ ............................................................................................... 4 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại........................................................................... 4 1.1.2. Đặc điểm sinh trưởng, sinh thái của cây Thần kỳ ................................... 4 1.2. Miraculin .................................................................................................... 6 1.2.1. Tính chất của miraculin ........................................................................... 6 1.2.2. Cấu tạo của miraculin.............................................................................. 7 1.2.3. Cơ chế tác dụng của miraculin ................................................................ 9 1.2.4. Tình hình nghiên cứu và sản xuất miraculin chuyển gen trên thế giới ...... 10 1.2.5. Tình hình nghiên cứu và sản xuất miraculin chuyển gen ở Việt Nam ... 12 1.2.6. Tính an toàn và ứng dụng sản xuất của protein miraculin .................... 12 1.3. Những ưu điểm của dòng tế bào thuốc lá siêu sinh trưởng BY-2 .......... 14 1.4. Cơ chế chuyển gen vào thực vật nhờ Agrobacterium tumefaciens.......... 15 1.4.1. Giới thiệu về vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ............................... 16 1.4.2. Cấu trúc của Ti-plasmid và T-DNA ....................................................... 17 1.4.3. Cơ chế quá trình chuyển gen ngoài tự nhiên của vi khuẩn........................ Agrobacterium tumefaciens............................................................................. 19 CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............ 22 2.1. Vật liệu, hóa chất, thiết bị nghiên cứu ..................................................... 22 2.1.1. Chủng vi khuẩn sử dụng trong thí nghiệm ............................................ 22 iv 2.1.2. Vật liệu thực vật .................................................................................... 22 2.1.3. Sơ đồ cấu trúc vector pBI121/35S/Mir và cấu trúc vector…………….. pBI121/HSP/Mir mang gen miraculin…………………………………… 22 2.1.4. Hóa chất................................................................................................. 23 2.1.5. Môi trường nuôi cấy .............................................................................. 24 2.1.6. Máy móc và thiết bị nghiên cứu ............................................................. 25 2.2. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 26 2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu ................................................................................... 26 2.2.2. Chuyển gen vào dòng tế bào thuốc lá BY-2 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Cv58 mang vector chuyển gen pBI121/35S/Mir và pBI121/HSP/Mir .............................................................................................. 26 2.2.3. Đánh giá các dòng tế bào BY-2 chuyển gen miraculin bằng kỹ thuật PCR. ..... 29 2.2.4. Phương pháp đánh giá sinh trưởng của dòng tế bào BY-2 đã được chuyển gen ................................................................................................................... 33 2.2.5. Đánh giá sự biểu hiện protein trong dòng tế bào BY-2 bằng kỹ thuật Dot Blot. .......................................................................................................... 34 CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................ 39 3.1. Kết quả chuyển gen mã hóa miraculin vào tế bào BY-2 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens .................................................................. 39 3.1.1. Kiểm tra sự có mặt của cấu trúc mang gen mã hoá protein miraculin trong vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens................................................................ 39 3.1.2. Sự hình thành và phát triển của mô sẹo ................................................ 40 3.1.3. Tỷ lệ các dòng tế bào sống sót và hình thành mô sẹo sau các lần chọn lọc .................................................................................................................... 42 3.2. Đánh giá các dòng tế bào BY-2 chuyển gen bằng kỹ thuật PCR ............ 44 3.3. Đánh giá sinh trưởng của một số dòng tế bào BY-2 chuyển gen ............ 48 3.4. Đánh giá biểu hiện protein miraculin tái tổ hợp bằng kỹ thuật Dot Blot ..... 53 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 57 v 1. Kết luận ....................................................................................................... 57 2. Kiến nghị ..................................................................................................... 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 58 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ADN Deoxyribonucleic acid BY-2 Bright Yellow No. 2 CTAB Cetyl trimetyl amoni bromua LB Môi trường theo Luria và Bertani PCR Polymerase Chain Reaction Taq Thermus aquaticus MS Môi trường cơ bản theo Murashige và Skoog (1962) bp Base pair kb Kilo base kDa Kilo Dalton OD Optical density Ti-plasmid Tumor inducing plasmid EDTA Ethylene diamine tetra- acetate acid GB Glycine betaine Mir Miraculin vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Các chỉ tiêu sinh trưởng . .................................................................. 4 Bảng 1.2. Đặc điểm sinh học cây Thần kỳ........................................................ 5 Bảng 1.3. Chuỗi phân tử đường của miraculin ................................................. 7 Bảng 2.1. Danh mục hóa chất ......................................................................... 23 Bảng 2.2. Môi trường nuôi cấy vi khuẩn ........................................................ 24 Bảng 2.3. Môi trường nuôi cấy tế bào BY-2................................................... 24 Bảng 2.4. Thiết bị thí nghiệm.......................................................................... 25 Bảng 2.5. Thành phần phản ứng PCR ............................................................. 31 Bảng 2.6. Chu kì nhiệt ..................................................................................... 31 Bảng 2.7. Hóa chất chạy điện di SDS-PAGE ................................................. 36 Bảng 3.1. Thống kê các dòng tế bào mô sẹo thuốc lá BY-2 chuyển gen ....... 44 Bảng 3.2. Kết quả đo ADN tổng số bằng máy đo quang phổ ......................... 45 Bảng 3.3. Tổng hợp đánh giá sinh trưởng các dòng tế bào huyền phù BY-2..... 50 Bảng 3.4. Kết quả đo protein tổng số ............................................................. 54 viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Các amino acid của miraculin ......................................................... 8 Hình 1.2. Trình tự nucleotide của miraculin và trình tự amino acid suy luận ........... 9 Hình 1.3. Dược phẩm miraculin tại Nhật Bản ............................................... 14 Hình 1.4. Sản phẩm chứa miraculin sản xuất tại Hoa Kỳ .............................. 14 Hình 1.5. Sơ đồ cấu trúc Ti-plasmid ............................................................... 18 Hình 1.6. Quy trình chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens ....... 21 Hình 2.1. Sơ đồ cấu trúc vector biểu hiện gen nhân tạo miraculin…………22 Hình 3.1. Kết quả colony-PCR khuẩn lạc ....................................................... 39 Hình 3.2. Kết quả chuyển gen vào tế bào BY-2 ............................................. 41 Hình 3.3. Chọn lọc mô sẹo chuyển gen qua 2 lần nuôi cấy chuyển ............... 42 Hình 3.4. Chọn lọc các dòng tế bào mô sẹo chuyển gen ổn định ................... 43 Hình 3.5. Kết quả tách chiết ADN tổng số ..................................................... 46 Hình 3.6. Điện di sản phẩm PCR các dòng tế bào BY-2 chuyển gen với cặp mồi mir đặc hiệu gen mir ................................................................................ 47 Hình 3.7. Điện di sản phẩm PCR các dòng tế bào BY-2 chuyển gen với cặp mồi đặc hiệu gen vir ....................................................................................... 48 Hình 3.8. Các dòng tế bào huyền phù sau 14 ngày nuôi cấy .......................... 49 Hình 3.9. Sinh trưởng của một số dòng tế bào huyền phù thuốc lá BY-2 chuyển gen (khối lượng tươi thu được)........................................................... 51 Hình 3.10. Sinh trưởng của một số dòng tế bào huyền phù thuốc lá BY-2 chuyển gen (khối lượng khô thu được) ........................................................... 51 Hình 3.11. Kết quả điện di protein tổng số ..................................................... 55 1 PHẦN I. MỞ ĐẦU 1. Lí do chọn đề tài Hiện nay tình trạng béo phì đã tăng lên đáng báo động và nó trở thành một vấn đề sức khỏe của thế giới, đặc biệt là các nước đang phát triển. Tổ chức Y tế thế giới định nghĩa: “Béo phì là tình trạng tích lũy mỡ quá mức và không bình thường tại một vùng cơ thể hay toàn thân đến mức ảnh hưởng tới sức khỏe. Béo phì là tình trạng sức khỏe có nguyên nhân dinh dưỡng.” Hiện nay, tổ chức Y tế thế giới thường dùng chỉ số khối cơ thể (Body Mass Index BMI) để nhận định tình trạng gầy béo [30]. Ở Việt Nam, trong gần hai thập niên qua, tình trạng thừa cân và béo phì đang có xu hướng tăng lên cùng với sự phát triển kinh tế nhất là các thành phố lớn và các đô thị. Trong vòng 3 năm (2007-2010), số người thừa cân béo phì tại Việt Nam đã tăng khoảng 10%, theo số liệu điều tra của Viện dinh dưỡng quốc gia Việt Nam. Cứ 100 người trong độ tuổi 25-74 thì đến 26 người bị béo phì. Viện Dinh dưỡng quốc gia cho biết, tình trạng thừa cân, béo phì tăng nhanh qua mỗi năm. Khoảng 20 năm trước, 5% người Việt Nam bị thừa cân, béo phì. Năm 2007, hơn 16% người Việt Nam trưởng thành gặp tình trạng này, 40% bị béo bụng. Chỉ trong vòng 3 năm sau, đến 2010, tỷ lệ này đã tăng thêm gần 10%, ở mức xấp xỉ 26%. Tình trạng thừa cân béo phì chủ yếu tập trung ở các thành phố lớn. Điều tra của Viện Dinh dưỡng năm 2010, tình trạng thừa cân, béo phì tại các thành phố lớn chiếm tỷ lệ khoảng 40,4%, còn ở vùng nông thôn là 25,2% [29]. Béo phì không chỉ đơn giản là ảnh hưởng đến thẩm mỹ mà còn có nhiều ảnh hưởng đến sức khỏe, bệnh tật của con người. Nó là nguyên nhân của hàng loạt bệnh như tim mạch, đái tháo đường, rối loạn hô hấp, viêm xương khớp, sỏi đường mật, ung thư. Béo phì có liên quan mật thiết với bệnh đái tháo đường không phụ thuộc vào insullin. Một trong những nguyên nhân gây nên bệnh béo phì đó là do chế độ ăn uống liên quan đến 2 những loại thức ăn chứa nhiều calo trong đó có đường. Sử dụng đường đã trở thành một thói quen, sở thích của hầu hết mọi người và vị giác mỗi người đều chấp nhận vị ngọt như một phần tất yếu của thực đơn hàng ngày [2]. Vấn đề được đặt ra là việc tìm kiếm một loại thực phẩm tạo ngọt an toàn mà không chứa nhiều calo để đáp ứng được thói quen sử dụng đồ ngọt trong khẩu phần ăn của những người béo phì và mắc bệnh tiểu đường và cải thiện vị giác của những bệnh nhân điều trị ung thư. Ở Nhật, người ta đã sử dụng miraculin một loại glycoprotein đánh lừa vị giác để tạo cảm giác ngọt thay thế đường dành cho người béo phì và mắc bệnh tiểu đường [9]. Với công dụng của miraculin và đứng trước thực trạng khó khăn của những bệnh nhân béo phì và tiểu đường về chế độ khẩu phần ăn chúng tôi quyết định lựa chọn đề tài “Nghiên cứu biểu hiện protein miraculin tái tổ hợp trong dòng tế bào thuốc lá BY-2”. Tính mới của đề tài chúng tôi thực hiện đó là việc nghiên cứu về miraculin một chất tạo ngọt an toàn thay thế đường mà ở Việt Nam nó hoàn toàn mới, chưa có một công trình nghiên cứu khoa học nào ở Việt Nam công bố về chuyển gen miraculin. 2. Mục đích nghiên cứu Tạo dòng tế bào thuốc lá BY-2 biểu hiện protein tái tổ hợp miraculin. 3. Nhiệm vụ nghiên cứu 3.1. Chuyển gen vào dòng tế bào thuốc lá siêu sinh trưởng BY-2 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. 3.2. Chọn lọc các dòng tế bào chuyển gen. 3.3. Đánh giá các dòng tế bào chuyển gen ở mức độ ADN và protein . 4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 4.1. Đối tượng nghiên cứu 3 - Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Cv58 mang vector chuyển gen pBI121/35S/Mir hoặc pBI121/HSP/Mir do phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện Công nghệ Sinh học cung cấp. - Dòng tế bào thuốc lá siêu sinh trưởng BY-2 do phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện Công nghệ Sinh học cung cấp. 4.2. Phạm vi nghiên cứu Chuyển gen mã hoá miraculin vào dòng tế bào thuốc lá BY-2 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, sau đó đánh giá biểu hiện của protein miraculin tái tổ hợp bằng phương pháp PCR và Dot Blot. Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 5.1. Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ bổ sung cho các tài liệu nghiên cứu khả năng chuyển gen quy định tổng hợp protein miraculin vào cây trồng thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và biểu hiện của protein miraculin sau khi chuyển gen. 5.2. Ý nghĩa thực tiễn Tạo dòng tế bào thuốc lá chuyển gen miraculin trên quy mô phòng thí nghiệm và là cơ sở cho việc thử nghiệm, sản xuất protein miraculin trên quy mô công nghiệp. 4 PHẦN II. NỘI DUNG CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Cây Thần kỳ 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại Cây Thần kỳ đã được nhắc đến vào năm 1725 bởi một nhà thám hiểm người Pháp có tên là Des Marchais sau khi đi khảo sát vùng Tây Phi. Đến năm 1852, cây Thần kỳ đã được tiến sĩ W.F.Daniell mô tả tỉ mỉ về đặc tính kỳ lạ này và định danh khoa học là: Synsepalum dulcificum, thuộc giới: Plantae, ngành: Magnoliophyta, lớp: Magnoliopsida, bộ: Ericales, họ: Sapotaceae, chi: Sideroxylon, đồng thời đặt tên là cây “Thần kỳ” [17]. Sở dĩ cây được gọi là cây Thần kỳ vì quả của nó khi ăn vào thì sau đó ăn các loại thức ăn có vị chua đều cảm thấy có vị ngọt. 1.1.2. Đặc điểm sinh trưởng, sinh thái của cây Thần kỳ Cây Thần kỳ thuộc loại cây tiểu mộc, chậm phát triển, không rụng lá mùa đông, tán rộng tối đa là 1 – 2 m. Bảng 1.1. Các chỉ tiêu sinh trưởng của cây Thần kỳ [4]. STT Các chỉ tiêu Đơn vị tính Kết quả nghiên cứu 1 Thời gian gieo hạt đến nảy mầm Ngày 30 2 Thời gian nảy mầm đến lúc có 2 lá mầm Ngày 28 3 Thời gian nảy mầm đến lúc có hoa Năm 3 – 3,5 4 Tốc độ tăng trưởng chiều cao/tháng cm 2–3 5 Từ khi có nụ đến lần hoa nở đầu tiên Ngày 24 – 28 6 Thời gian nở hết một chùm hoa Ngày 6–7 7 Thời gian từ hoa nở đến quả chín Ngày 45 – 50 8 Độ vươn xa của rễ cm 90 - 100 5 Cây Thần kỳ có thể trồng được ở vùng đất khô ráo, có độ pH axit, có độ ẩm cao, nắng nhiều. Khả năng chịu lạnh đến -7oC, do đó có thể trồng được ở mọi độ cao của Việt Nam. Bảng 1.2. Đặc điểm sinh học cây Thần kỳ Bộ phận Kết quả nghiên cứu Rễ Synsepalum dulcificum thuộc loại rễ nông, có rễ cái, đại bộ Rễ phận tập trung ở vùng 0 – 40 cm, độ vươn xa của rễ khá rộng nếu trồng ngoài tự nhiên, thường cách gốc khoảng từ 0 – 100 cm, có nhiều rễ tơ. Sự phân bố của rễ còn phụ thuộc đất trồng. Đây là loại cây tiểu mộc nhỏ, phát triển rất chậm và có thể cao 1,2 –1,5 m nếu trồng trong chậu, cao 3,0 – 4,5 m nếu trồng ngoài tự Thân và lá nhiên. Khoảng 10 năm cây mới có thể cao được 1,2 – 1,5 m. Tán cây tạo thành hình chóp. Có một thân chính, 4 – 5 nhánh phụ. Hoa Synsepalum dulcificum nhỏ có màu trắng, mùi rất thơm, có lông tơ ở mặt ngoài, đường kính khi nở khoảng 0,3 – 0,5 mm. Cuống nhỏ dài 0,2 – 0,3 mm. Đầu tiên ở nách lá xuất hiện mầm Hoa hoa, dần lớn lên thành nụ, trên một cành thường có 15 – 20 nụ ở nách lá, sau này nở thành hoa. Hoa mọc tâp trung hay đơn độc từ nách lá ở gần ngọn nhánh. Hoa có cánh dính liền ở đáy. Cánh hoa chia làm 5 thùy, dính nhau ở đáy tạo thành hình ống. Lá nguyên, dày, dài, bóng, mọc so le hay tạo thành chùm ở đầu Lá các ngọn nhánh phụ, lá non màu xanh nhạt và đậm dần khi già. Lá xanh quanh năm và chỉ thường lá già mới rụng. 6 Chiều dài trung bình của quả khoảng từ 2 – 3,5 cm. Đường kính quả khoảng từ 1 – 1,8 cm. Trọng lượng quả khoảng 1 – 2 g. Vỏ quả mỏng, có một lớp phấn trắng trên bề mặt. Khi quả còn non có màu xanh đậm nhưng khi chín quả có màu đỏ, mọng nước. Thịt Quả quả khi chín có màu trắng, hơi nhớt, khi ăn lại có vị hơi chua. Mỗi quả có một hạt, hạt có dạng hình elip, kích thước từ 1,0 – 1,5 cm. Vỏ hạt cứng và gồm có hai mặt, mặt trên trơn và mặt dưới nhám có đường kẻ sọc. Bên trong vỏ, hạt gồm 2 tử diệp có màu xanh và áp sát, dính nhau ở cán phôi [4]. 1.2. Miraculin 1.2.1. Tính chất của miraculin Miraculin là một protein có khả năng làm chuyển đổi vị chua chuyển thành vị ngọt mặc dù chính bản thân miraculin không có vị ngọt. Bên cạnh đó miraculin còn có khả năng chuyển đổi vị ngọt ngay khi ở nồng độ rất thấp. Các nhà khoa học đã chỉ ra rằng chỉ với 0.4 mM miraculin tiếp xúc phản ứng với 0,02 M axit citric thì vị ngọt đạt được ước tính gấp khoảng 3000 lần so với đường sucrose về trọng lượng [25]. Do ó , để cung cấp các hiệu ứng làm ngọt như sucrose, chỉ một lượng nhỏ của miraculin cũng có thể tạo ra hiệu ứng tương tự. Điều này có ý nghĩa rất lớn bởi chỉ một lượng nhỏ miraculin thì bổ sung gần như không đáng kể đến lượng calo cho cơ thể. Vì vậy, miraculin có thể được sử dụng như một chất làm ngọt có hàm lượng calo thấp trong tự nhiên dành cho các bệnh nhân mắc bệnh liên quan đến việc tiêu thụ đường, bao gồm béo phì, tiểu đường. Miraculin không bền ở nhiệt độ cao và bị phân huỷ khi đun nóng. Vì vậy khi nấu chín, miraculin sẽ không còn tác dụng chuyển đổi tạo vị ngọt trên vị giác nữa. 7 Miraculin là một protein lưỡng tính, tan trong nước, không tan trong dung môi hữu cơ, không bền trong môi trường acid - base mạnh. Những thức ăn có vị chua như cam, chanh hoặc các loại đồ chua (như dưa chua, rau quả ngâm giấm chua...), cay hoặc đắng như tương ớt, rượu bia... đều trở nên ngọt sau khi nếm miraculin [21]. 1.2.2. Cấu tạo của miraculin Miraculin là glycoprotein có độ dài 220 amino acid, gồm đoạn peptide tín hiệu dài 29 amino acid ở đầu và chuỗi polypeptide đơn gồm 191 amino acid. Trọng lượng phân tử của miraculin dựa trên trình tự các amino acid và hàm lượng carbonhydrate là 24,6 kDa. Hàm lượng carbonhydate chiếm khoảng 13,9% trọng lượng phân tử, có 5 loại cấu trúc của chuỗi oligosarcharide bao gồm: glucosamine, mannose, galactose, xylose, and fucose. Dimer đồng hình (homodimer) miraculin có hoạt động thay đổi vị giác ở pH acid. Miraculin thường tồn tại ở dạng homotetramer hay dimer của homodimer [27]. Bảng 1.3. Chuỗi phân tử đường của miraculin Loại đường Tỷ lệ (%) Glucosamine 31 Mannose 30 Glactose 7 Xylose 10 Fucose 22 8 Trình tự acid amin của miraculin Hình 1.1. Các acid amin của miraculin [27] Trình tự nucleotide mã hóa miraculin 9 Hình 1.2. Trình tự nucleotide của miraculin và trình tự amino acid suy luận[19]. Chú thích: Các trình tự amino acid gạch chân được sử dụng cho việc thiết kế mồi PCR. Dấu mũi tên cho biết vị trí phân tách của quá trình dịch mã miraculin. Dấu (*) đánh dấu codon kết thúc . 1.2.3. Cơ chế tác dụng của miraculin Khả năng chuyển đổi vị giác của protein miraculin chủ yếu được đảm nhiệm bởi hai histidine Çó là His29 và His59 [21]. Bình thường, khi chúng ta ăn thức ăn thì những khẩu vị của thức ăn khi tiếp xúc sẽ làm kích hoạt những tế bào tiếp nhận đặc thù chứa bên trong các gai vị giác nằm trên lưỡi và tạo ra sự kết nối với các tế bào thụ thể ngọt, mặn …, sau đó gửi đến não những tín hiệu cho chúng ta biết là khẩu vị ngọt, mặn, đắng, chua hay những vị khác. Miraculin là protein có tính chất làm thay đổi cấu hình của các thụ thể trên tế bào vị giác. Điều này là do kết quả của sự hoạt hoá các thụ quan vị ngọt trên lưỡi do miraculin tác động và ảnh hưởng này được kéo dài cho đến khi các chồi vị giác trở lại bình thường. Protein miraculin không kết nối với bất cứ một tế bào thụ thể mùi vị nào cả do đó miraculin không tạo ra cảm giác vị giác. Tuy nhiên, protein miraculin có thể thay đổi cấu hình các thụ thể của tế bào vị giác trên lưỡi. Trong môi trường pH acid, trong đó có vị chua nói chung, các thụ thể ngọt của G-protein kết hợp cùng thụ thể vị giác trên gai lưỡi được kích hoạt, hình dạng của các thụ thể thay đổi làm miraculin nối dính chặt vào chúng, như cơ chế chìa khóa trong ổ khóa. Mà trong phân tử của miraculin có chuỗi các phân tử đường do đó tạo ra vị ngọt trong thời gian miraculin lưu lại trên lưỡi. Hiệu ứng này chỉ kết thúc cho đến khi thụ thể vị giác trở lại bình thường. Vì miraculin kết hợp khá chặt chẽ vào các thụ thể cảm nhận vị giác ở trên gai lưỡi cho nên ảnh hưởng tạo ngọt của miraculin có thể kéo dài đến vài giờ [21]. 10 Sự tác động của các phân tử miraculin đã làm sai lệch sự định hướng của các thụ thể cảm nhận vị giác trên gai lưỡi, làm cho lưỡi trở nên thích ứng và nhận định duy nhất với vị ngọt trong một khoảng thời gian nhất định. Thời gian và cường độ của hiện tượng thay đổi vị giác phụ thuộc vào các yếu tố khác nhau như nồng độ miraculin, thời gian tiếp xúc của miraculin với lưỡi, và độ pH acid. Tác dụng này có thể kéo dài từ 1 đến 2 giờ và sẽ biến mất nhanh chóng nếu dùng trà nóng hay nước nóng để xúc miệng do miraculin bị phân hủy ở nhiệt độ cao. 1.2.4. Tình hình nghiên cứu và sản xuất miraculin chuyển gen trên thế giới Miraculin đóng vai trò lớn trong việc chuyển đổi vị giác tạo cảm giác vị ngọt, nhưng nguồn gốc của miraculin được chiết xuất từ quả của cây Thần kỳ sống ở vùng nhiệt đới nên đã hạn chế về khả năng nhân rộng loại cây này tới những vùng khí hậu khác, bên cạnh đó nếu chỉ chiết xuất miraculin từ quả của cây Thần kỳ thì số lượng thu được sẽ không nhiều như mong đợi, chính vì lí do này các nhà khoa học đã tiến hành nhiều nghiên cứu nhằm mục đích chuyển gen mã hóa miraculin vào các loài sinh vật khác để sản xuất miraculin trên quy mô công nghiệp. Trên thế giới đã có nhiều công trình khoa học được công bố về chuyển gen mã hóa miraculin vào các loài sinh vật. Năm 2006, các nhà khoa học đã chuyển gen mã hóa miraculin vào cây rau diếp, và đã biểu hiện thành công miraculin tái tổ hợp tích lũy nhiều trong lá. Cây rau diếp biến đổi gen đã có khả năng cảm ứng vị ngọt. Tuy nhiên, sự biểu hiện miraculin trên cây rau diếp chuyển gen không thực sự ổn định, qua các thế hệ tiếp theo thì khả năng tích lũy protein miraculin giảm dần. Mặc dù vậy, kết quả này cũng đã chứng tỏ được khả năng sản xuất miraculin ở các loài thực vật ăn được, và nó mở ra một chiến lược mới trong việc sản xuất protein miraculin trên quy mô lớn ở các đối tượng thực vật [25]. Năm 2007, các nhà khoa học đã chuyển gen mã hóa miraculin vào chủng Aspergillusn oryzae NS4. Kết quả của quá trình chuyển gen thu được