Tài liệu Nghiên cứu bệnh vàng lá greening trên quýt tại xã gia luận – cát hải – hải phòng và biện pháp phòng trừ

MỤC LỤC Lời cam đoan.................................................................................................................... ii Lời cảm ơn ...................................................................................................................... iii Mục lục .............................................................................................................................iv Danh mục viết tắt ........................................................................................................... vii Danh mục bảng ............................................................................................................. viii Danh mục hình .................................................................................................................ix ĐẶT VẤN ĐỀ ..................................................................................................................1 1. Tính cấp thiết của đề tài ................................................................................... 1 2. Mục đích và yêu cầu ........................................................................................ 2 2.1. Mục đích .................................................................................................. 2 2.2. Yêu cầu .................................................................................................... 2 CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...........................................................................3 1.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước.................................................................. 3 1.1.1. Một số yếu tố ngoại cảnh ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển của cây có múi ....................................................................................... 3 1.1.2. Triệu chứng, lịch sử phát hiện, phân bố của bệnh vàng lá Greening ....... 4 1.1.3. Nghiên cứu về chẩn đoán, giám định bệnh vàng lá Greening ................. 7 1.1.4. Nghiên cứu về dịch tễ và sinh thái học của bệnh vàng lá greening ........ 9 1.1.5. Những nghiên cứu về quản lý tổng hợp và chống tái nhiễm bệnh Greening và các bệnh virus khác trên cây ăn quả có múi ...................... 13 1.2. Tình hình nghiên cứu trong nước ................................................................ 16 1.2.1.Cây ăn quả có múi ở Việt Nam và thành phần sâu bệnh hại ............... 16 1.2.2. Nghiên cứu về bệnh vàng lá greening và nguyên nhân gây bệnh ....... 18 CHƯƠNG II VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.........29 2.1. Địa điểm và thời gian.................................................................................. 29 2.2. Vật liệu nghiên cứu ..................................................................................... 29 2.3. Nội dung nghiên cứu .................................................................................. 29 2.3.1. Điều tra hiện trạng sản xuất quýt tại Gia Luận - Cát Hải – Hải Phòng ................................................................................................... 29 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iv 2.3.2. Đánh giá mức độ phổ biến và xác định triệu chứng bệnh vàng lá Greening trên quýt tại Gia Luận – Cát Hải – Hải Phòng ....................... 30 2.3.3. Xác định tác nhân gây bệnh và sự lan truyền của bệnh ........................ 30 2.3.4. Các biện pháp phòng trừ ...................................................................... 30 2.4. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................ 30 2.4.1. Phương pháp điều tra hiện trạng bệnh vàng lá Greening ...................... 30 2.4.2. Phương pháp chuẩn đoán bệnh vàng lá Greening và bệnh virus Tristeza ................................................................................................ 32 2.4.3. Xác định chủng lây nhiễm bằng bộ giống chỉ thị và sinh học phân tử ......................................................................................................... 34 2.4.4. Ảnh hưởng của thời gian chích hút trên cây bệnh đến khả năng nhiễm vi khuẩn gây bệnh vàng lá Greening của rầy trưởng thành ......... 36 2.4.5. Đánh giá khả năng tồn tại của vi khuẩn gây bệnh vàng lá Greening trong cơ thể rầy chổng cánh Diaphorina citri Kuwayama .................... 36 2.4.6. Nghiên cứu sự lan truyền bệnh VLG qua nhân giống vô tính được thực hiện theo phương pháp thông thường trong nghiên cứu về bảo vệ thực vật ........................................................................................... 37 2.4.7. Phương pháp nghiên cứu các giải pháp phòng chống bệnh vàng lá Greening .............................................................................................. 37 2.5. Xử lý số liệu thí nghiệm.............................................................................. 39 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...............................................................40 3.1. Hiện trạng sản xuất quýt tại huyện Cát Hải – Hải Phòng ............................. 40 3.1.1. Hiện trạng sử dụng giống quýt tại Gia Luận – Cát Hải – Hải Phòng .... 40 3.1.2. Thành phần bệnh hại chính trên quýt tại Gia Luận – Cát Hải – Hải Phòng ................................................................................................... 41 3.2. Mức độ phổ biến và triệu chứng bệnh vàng lá Greening trên quýt tại Gia Luận – Cát Hải – Hải Phòng ...................................................................... 44 3.2.1. Mức độ phổ biến của bệnh vàng lá greening trên quýt Gia Luận......... 44 3.2.2. Mức độ bệnh vàng lá Greening trên quýt ở các giai đoạn phát triển khác nhau ............................................................................................. 45 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page v 3.2.3. Xác định nhóm triệu chứng bệnh vàng lá Greening qua phân tích bằng sinh học phân tử .......................................................................... 46 3.1.3. Ảnh hưởng của bệnh vàng lá Greening trên quýt tới chất lượng quả ... 49 3.3. Xác định tác nhân gây bệnh và sự lan truyền của bệnh vàng lá Greening .... 50 3.3.1. Xác định sự hiện diện của bệnh vàng lá Greening và bệnh Tristeza trên cùng một mẫu bệnh ....................................................................... 50 3.3.2. Nghiên cứu sự lan truyền của bệnh vàng lá Greening qua nhân giống vô tính ........................................................................................ 51 3.3.3. Diễn biến mật độ rầy chổng cánh trên quýt Gia Luận ......................... 52 3.3.4. Ảnh hưởng của thời gian chích hút trên cây bệnh đến khả năng nhiễm vi khuẩn gây bệnh Greening của rầy trưởng thành ..................... 54 3.3.5. Khả năng tồn tại của vi khuẩn gây bệnh vàng lá Greening trong cơ thể rầy Diaphorina citri Kuwayama .................................................... 55 3.4. Xác định chủng vi khuẩn gây bệnh vàng lá Greening bằng cây chỉ thị và sinh học phân tử ........................................................................................ 57 3.4.1. Xác định chủng vi khuẩn gây bệnh vàng lá Greening bằng cây chỉ thị......................................................................................................... 57 3.4.2. Xác định chủng vi khuẩn gây bệnh vàng lá greening bằng kỹ thuật Multiplex –PCR ................................................................................... 60 3.5. Nghiên cứu các giải pháp phòng trừ bệnh vàng lá Greening........................ 62 3.5.1. Tạo cây mẹ So sạch bệnh Greening và Tristeza bằng kỹ thuật vi ghép đỉnh sinh trưởng .......................................................................... 63 3.5.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của biện pháp tỉa cành tạo tán đến thời gian ra lộc, số cành lộc quýt Gia Luận ......................................................... 65 3.5.3. Đánh giá hiệu lực của một số loại thuốc phòng trừ rầy chổng cánh (Diaphorina citri Kuwayama) ngoài đồng ruộng .................................. 68 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ............................................................................................70 1. Kết luận ......................................................................................................... 70 2. Đề nghị .......................................................................................................... 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO..............................................................................................72 PHỤ LỤC........................................................................................................................80 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vi DANH MỤC VIẾT TẮT CTAB Cetyltrimethylammonium bromide CĂQCM Cây ăn quả có múi CTV Bệnh tristeza (Citrus tristeza closterovirus) EDTA Ethylene diammine tetraacetic acid ELISA Enzyme-linked immuno sorbent assay DNA Deoxyribonucleic acid HLB Huanglongbing dNTPs Deoxy nucleotide triphosphates PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp (polymerase chain reaction PBS-T Phosphate-buyer saline-Tween RCC Rầy chổng cánh Diaphorina citri Kuwayama VLG Vàng lá Greening Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vii DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 3.1 . Hiện trạng sản xuất, sử dụng giống quýt tại Gia Luận – Cát Hải – Hải Phòng .................................................................................................................. 40 3.2. Thành phần bệnh hại chính trên quýt tại Gia Luận – Cát Hải – Hải Phòng ......... 42 3.3. Đánh giá mức độ phổ biến của bệnh vàng lá Greening trên cây quýt Gia Luận tại Cát Hải – Hải Phòng (2014) ............................................... 44 3.4. Kết quả giám định bệnh vàng lá Greening trên quýt tại Gia Luận ở các tuổi cây khác nhau (2014-2015) .............................................................. 45 3.5. Kết quả giám định một số nhóm triệu chứng bệnh vàng lá Greening trên quýt Gia Luận bằng kỹ thuật PCR (Viện BVTV,2014-2015) ........... 47 3.6. Một số chỉ tiêu trên quả quýt Gia Luận bị VLG và không bị bệnh .............. 49 3.7. Kết quả xác định sự hiện diện của bệnh VLG và bệnh Tristeza hại cây có múi tại Gia Luận – Cát Hải - Hải Phòng bằng sinh học phân tử .......... 50 3.8. Khả năng lan truyền bệnh vàng lá Greening qua nhân giống vô tính bằng phương pháp ghép (2014,2015) ...................................................... 52 3.9. Ảnh hưởng của thời gian chích hút trên cây bệnh đến khả năng nhiễm vi khuẩn gây bệnh vàng lá Greening của rầy trưởng thành ...................... 54 3.10. Khả năng tồn tại của vi khuẩn gây bệnh vàng lá Greening trong cơ thể rầy chổng cánh Diaphorina citri ....................................................... 55 3.11. Phản ứng của các cây chỉ thị với nguồn bệnh thu thập trên CCM tại Gia Luận – Cát Hải – Hải Phòng............................................................. 58 3.12. Thời kỳ tiềm dục của các chủng vi khuẩn gây bệnh vàng lá Greening ....... 59 3.13. Kết quả xác định chủng lây nhiễm bệnh vàng lá Greening bằng kỹ thuật Multiplex-PCR ............................................................................... 61 3.14. Kết quả vi ghép đỉnh sinh trưởng trên quýt Gia Luận tạo cây mẹ So ......... 63 3.15 . Ảnh hưởng của biện pháp tỉa cành tạo tán đến thời gian ra lộc, số lộc trên cành (Cát Hải – Hải Phòng) ............................................................. 65 3.16. Hiệu lực của một số loại thuốc hóa học phòng trừ rầy chổng cánh ............ 68 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page viii DANH MỤC HÌNH ẢNH STT Tên hình ảnh Trang 3.1. Cây giống chiết cành, giống tự sản xuất ...................................................... 41 3.2. Bệnh vàng lá Greening ............................................................................... 43 3.3. Bệnh đốm dầu hại trên quả ......................................................................... 43 3.4. Bệnh mốc xanh hại trên quả ........................................................................ 43 3.5. Bệnh chảy gôm ........................................................................................... 43 3.6. Quýt Gia Luận nhiễm bệnh ngay từ giai đoạn kiến thiết cơ bản .................. 46 3.7. Triệu chứng vàng lá lốm đốm trên quýt Gia Luận ....................................... 47 3.8. Triệu chứng vàng lá cục bộ ......................................................................... 48 3.9. Triệu chứng khô cành, chết cây, lá vàng ..................................................... 48 3.10. Kết quả giám định một số nhóm triệu chứng bệnh vàng lá Greening bằng PCR .................................................................................................. 48 3.11. Quả quýt bị bệnh kích thước nhỏ, phát triển không cân đối ....................... 49 3.12. Kết quả giám định bệnh Tristeza bằng kỹ thuật ELISA ............................. 51 3.13. Kết quả giám định bệnh Greening bằng kỹ thuật PCR .............................. 51 3.14. Cây bị nhiễm cả 2 loại bệnh VLG và Tristeza ........................................... 51 3.15. Diễn biến mật độ rầy chổng cánh trên quýt Gia Luận ............................... 53 3.16. Rầy non của rầy chổng cánh Diaphorina citri Kuwayama ....................... 53 3.17. Trưởng thành của RCC Diaphorina citri Kuwayama ............................... 53 3.19. Lây nhiễm chủng II trên chanh Eureka...................................................... 59 3.20. Lây nhiễm chủng II trên bưởi Wentan....................................................... 59 3.21. Lây nhiễm chủng II trên cam xã Đoài ....................................................... 60 3.22. Lây nhiễm chủng II trên quýt Ponkan ....................................................... 60 3.23. Lây nhiễm chủng I trên cam xã Đoài ........................................................ 60 3.24. Lây nhiễm chủng I trên quýt Ponkan......................................................... 60 3.25. Kết quả xác định chủng lây nhiễm bệnh vàng lá Greening bằng kỹ thuật Multi-PCR. ...................................................................................................... 62 3.26. Vi ghép đỉnh sinh trưởng trong phòng thí nghiệm ..................................... 64 3.27. Cây sau vi ghép được nuôi trong môi trường MS ...................................... 64 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ix 3.28. Đỉnh sinh trưởng của cây chụp dưới kính hiển vi soi nổi........................... 64 3.29. Cây mẹ So giống quýt Gia Luận được lưu giữ trong nhà lưới ................... 64 3.30. Ảnh hưởng của biện pháp tỉa cành tạo tán đến biến động mật độ rầy chổng cánh Diaphorina citri Kuwayama trên quýt Gia Luận ................... 67 3.31. Hiệu lực của một số loại thuốc hóa học phòng trừ rầy chổng cánh ............ 69 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page x ĐẶT VẤN ĐỀ 1. Tính cấp thiết của đề tài Cây ăn quả có múi gồm cam, quýt, chanh, bưởi thuộc họ Rutaceae là những cây ăn quả có giá trị dinh dưỡng và kinh tế cao, đã và đang được ưu tiên phát triển trồng ở nhiều quốc gia trên thế giới. Ở Việt Nam cây ăn quả có múi được trồng rộng khắp ở hầu hết các tỉnh trong cả nước, từ trung du, miền núi phía Bắc đến đồng bằng sông Hồng, sông Cửu Long. Ở mỗi vùng trồng cam, quýt đều có những giống đặc sản như cam Canh, bưởi Diễn của Hà Nội, cam Sành của Hà Giang, Tuyên Quang, quýt đỏ Bắc Quang, Hà Giang, bưởi Đoan Hùng - Phú Thọ, cam Xã Đoài Nghệ An, bưởi Năm Roi, Da Xanh của đồng bằng sông Cửu Long… Diện tích trồng cam, quýt ở Việt Nam ngày càng được mở rộng, việc phát triển cây cam, quýt được xem như là một giải pháp hữu ích trong chuyển dịch cơ cấu cây trồng ở nhiều địa phương. Tuy nhiên, một trong những nguyên nhân hạn chế sự phát triển của cam quýt là do sự gây hại nghiêm trọng của nhiều côn trùng và bệnh hại đặc biệt là bệnh Greening. Hiện nay không chỉ riêng Việt Nam mà nhiều nước trên thế giới đang phải đương đầu và gánh chịu những thiệt hại lớn do sự suy thoái nhanh chóng của các vườn trồng cam, quýt. Bệnh lây lan nhanh và tàn phá nặng nề ở các vườn trồng tập trung, các vườn hộ gia đình. Quýt Gia Luận là loại cam bóc (thuộc nhóm quýt Citrus nobilis) có rất lâu đời trên địa bàn xã Gia Luận, huyện Cát Hải. Quýt Gia Luận có giá trị dinh dưỡng cao, thơm ngon, hương vị đặc trưng, quả chín màu vàng đẹp mắt, quả tròn, đáy quả bằng, múi mọng, tép nhỏ, ruột vàng đỏ, vỏ rất mỏng, dễ tách múi, ăn ngọt đậm, trở thành cây ăn quả truyền thống đặc sản đem lại hiệu quả kinh tế tương đối ổn định cho người dân địa phương Cát Hải. Tuy nhiên, những năm gần đây diện tích trồng quýt Gia Luận bị suy giảm mạnh. Theo phòng Nông nghiệp huyện Cát Hải, từ năm 2001 diện tích quýt Gia Luận tại xã Gia Luận khoảng 50ha đến nay chỉ còn khoảng 20ha tập trung ở các vùng xa vùng nguyên sản, những diện tích trồng mới trên đất đã canh tác quýt Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 1 trước đây đều sinh trưởng kém, có hiện tượng thoái hóa, nhiễm sâu bệnh nặng, đặc biệt là bệnh vàng lá Greening, năng suất và chất lượng vườn cây thấp, nguy cơ suy thoái vùng sản xuất truyền thống nếu không có biện pháp phục hồi và bảo vệ nguồn gen kịp thời. Đề tài “Nghiên cứu bệnh vàng lá Greening trên quýt tại xã Gia LuậnCát Hải – Hải Phòng và biện pháp phòng trừ”, được thực hiện nhằm tìm hiểu thêm về bệnh vàng lá Greening trên quýt Gia Luận, từ đó đưa ra một số biện pháp góp phần khôi phục và phát triển vùng sản xuất quýt Gia Luận, nâng cao thu nhập cho người nông dân. 2. Mục đích và yêu cầu 2.1. Mục đích Tìm hiểu mức độ gây hại của bệnh vàng lá Greening trên quýt Gia Luận tại huyện Cát Hải – thành phố Hải Phòng. Nghiên cứu phương pháp chẩn đoán bệnh Greening và xác định chủng lây nhiễm của bệnh trên quýt Gia Luận từ đó đề xuất một số biện pháp phòng chống. 2.2. Yêu cầu Điều tra tình hình bệnh, thu thập mẫu bệnh vàng lá Greening trên vườn kinh doanh, đánh giá mức độ phổ biến của bệnh trên quýt Gia Luận. Xác định phương pháp chẩn đoán bệnh Greening bằng PCR và xác định được chủng lây nhiễm của bệnh trên quýt Gia Luận. Nghiên cứu khảo sát một số biện pháp phòng chống có hiệu quả. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 2 CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước 1.1.1. Một số yếu tố ngoại cảnh ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển của cây có múi Trên thế giới cây cam quýt có lịch sử trồng trọt lâu đời nhất, nhiều kết quả nghiên cứu cho rằng hầu hết các giống cam quýt trồng hiện nay đều có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Đông Nam Châu Á. Các nghiên cứu về phân loại cam quýt đã được các nhà khoa học tiến hành từ trên 200 năm trước, trong đó đều thống nhất là cam, quýt, chanh, bưởi thuộc họ cam (Rutaceae), họ phụ cam quýt (Aurantoideae), có gần 250 loài. Theo Salunkhe (1995) thì cam quýt là loại cây có khả năng thích nghi rộng nên có thể trồng ở nhiều nơi trên thế giới, tuy nhiên thích nghi nhất là các vùng có khí hậu nhiệt đới và á nhiệt đới: Trung Quốc, Mỹ, Braxin, Ấn Độ và Ai Cập... Cam quýt thích hợp trồng trọt trên đất ẩm, bằng phẳng, tầng canh tác dày, có độ pH: 5,5- 6,5 nếu pH thấp cần bón vôi khử chua. Cam quýt có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới nóng ẩm ưa khí hậu ấm nhưng cũng có thể chịu rét, vùng trồng trọt: 35°S - 40°N. Nhiệt độ cây có thể sinh trưởng từ 12 đến 39°C, nhiệt độ thích hợp nhất từ 23-29°C, cây ngừng sinh trưởng khi : 10°C > t° > 40°C, cây bị hại khi : -5°C > t° > 50°C. Các giống thích nghi với điều kiện nhiệt độ thấp thường có chất lượng, mã quả tốt hơn các giống chịu nhiệt độ cao. Cam quýt phù hợp với ánh sáng tán xạ: 10.000 -15.000 lux, vườn cam quýt cần thông thoáng. Cam quýt là cây ưa ẩm ít chịu hạn và không chịu úng. Lượng mưa thích hợp cho các vùng trồng cam quít: ± 2000mm. Cam quýt cần nhiều nước ở thời kì: nẩy mầm, phân hoá mầm hoa, hình thành quả và quả lớn. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 3 1.1.2. Triệu chứng, lịch sử phát hiện, phân bố của bệnh vàng lá Greening Khi cây bị bệnh vàng lá Greening vi khuẩn không gây hại mạch gỗ nhưng gây các vết chết hoại trong mạch libe, sự vận chuyển đường đến các bộ phận của cây bị cản trở. Lá nhỏ, bị biến vàng hay lốm đốm vàng, tuổi thọ của lá bị rút ngắn, sự phân chia tế bào luôn xảy ra khiến gân lá bị sưng. Vi khuẩn cũng hiện diện nhiều ở cuống quả và làm quả bị lệch tâm, quả nhỏ, khối lượng quả giảm và hàm lượng đường trong quả thấp dẫn đến chất lượng của quả giảm (Aubert, 1987). Rễ cây bị bệnh làm nghẽn mạch dẫn, rễ bị hoại tử nhiều, rễ tơ không hút được dinh dưỡng để nuôi cây. Cây bị rụng quả cùng với sự phát triển của bệnh, cây sẽ chết sau 2-5 năm tuỳ mức độ nhiễm (Aubert et al.,1988). Vi khuẩn gây bệnh vàng lá Greening (VLG) là vi khuẩn gram âm. Vi khuẩn không định hình, có vách dầy, không có nhân, không nuôi cấy được trên môi trường nhân tạo, vi khuẩn di chuyển theo dòng nhựa trong cây (Bové, 2006) Vi khuẩn gây bệnh VLG là Candidatus Liberibacter (Ca. L) thuộc αProteobacteria, họ Eubacteria (Jagoueix et al, 1996). Căn cứ vào khả năng chịu nhiệt độ nên vi khuẩn được chia làm dòng châu Á và châu Phi. Vi khuẩn dòng châu Á có tên “Ca. L. asiaticus” chịu được nhiệt từ 27 – 32°C. Dòng châu Phi có tên “Ca. L. africanus” mẫn cảm với nhiệt độ 22 – 24°C. Nghiên cứu về khả năng chịu nhiệt của dòng vi khuẩn gây bệnh ở Braxin và ở Hoa kỳ, Teixeira et al., (2005), Halbert et al., (2008) đã đề nghị dòng vi khuẩn gây bệnh ở Braxin và dòng vi khuẩn gây bệnh ở Hoa Kỳ là những dòng chịu nhiệt. Vi khuẩn được lan truyền qua mắt ghép, cành chiết và qua côn trùng môi giới là rầy chổng cánh Diaphorina citri (D. citri) ở châu Á và rầy Trioza erytreae (T. erytreae) ở châu Phi. Bệnh có nhiều tên gọi ở các nước khác nhau như Hoàng Long Binh, chồi vàng, Greening, thoái hóa mạch dẫn, v.v. Tại các hội thảo quốc tế về bệnh ở Trung Quốc năm 1995, tổ chức IOCV (International Organization of Citrus Virologists) đã đề nghi đặt tên bệnh là huanglongbing. Đề nghị này đã được chấp nhận và tên “huanglongbing” được sử dụng rộng rãi cho đến nay (Bové, 2006). Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 4 Trung Quốc: Bệnh vàng lá Greening đã được ghi nhận lần đầu tiên vào năm 1919 với các tên gọi Huanglongbing hay chồi vàng (yellow shoot) ở Nam Trung Quốc và bệnh đã được tài liệu hóa năm 1943. Bệnh VLG đã trở thành một vấn đề nghiêm trọng ảnh hưởng đến ngành trồng cây ăn quả có múi ở Trung Quốc. Nghiên cứu về bệnh VLG đã được tiến hành ở miền Nam Trung Quốc từ 1941-1955. Các nghiên cứu về nguyên nhân gây bệnh đã chứng minh các triệu chứng vàng lá gân xanh, lốm đốm vàng trên lá cam quýt không phải là do rối loạn sinh lý, thiếu hụt khoáng, cũng không phải bệnh truyền qua đất do tuyến trùng hoặc nhiễm nấm Fusarium. Bệnh VLG được xác nhận là một bệnh truyền nhiễm lan truyền qua mắt ghép. Tại Đài Loan vào năm 1951 bệnh được phát hiện ở Đài Loan với tên gọi Likubin (Bové, 2006) Nam Phi: Một dạng triệu chứng bệnh tương tự như triệu chứng VLG, đã được quan sát vào năm 1928 ở Nam Phi với tên gọi "chồi vàng" hay còn gọi là "greening" (Oberholzer et al., 1965). Thời gian đầu bản chất truyền nhiễm của bệnh đã không xác định được, trong các báo cáo đầu tiên về bệnh greening vào năm 1937, các tác giả cho rằng các nguyên tố độc hại trong đất đã là nguyên nhân gây ra triệu chứng greening . Khi giải phẫu chồi cây bị vàng trên cây cam ngọt ở Nam Phi, Schneider (1968) đã phát hiện mạch libe có những đốm hoại tử trong hệ thống mạch dẫn của lá trưởng thành, mạch trở nên tắc nghẽn và ngăn cản sự vận chuyển của các chất dinh dưỡng. Nghiên cứu về bệnh trong những năm tiếp theo người ta đã chứng minh được bệnh VLG ở Nam Phi được truyền qua mắt ghép (McClean and Schwarz, 1970). Philippines: Bệnh được mô tả lần đầu tiên ở Philippines năm 1921 và tác giả cho rằng bệnh có liên quan đến sự thiếu hụt kẽm của cây. Bệnh gây hại nghiêm trọng trên cây có múi ở Philippine trong thập niên 1950. Năm 1967 các nghiên cứu đã chứng minh được rầy chổng cánh D. citri là môi giới truyền bệnh ở Philippine (Martinez and Wallace,1967). Salibe and Cortez (1968) đã nhận thấy sự tương đồng của triệu chứng bệnh ở Philippine với các triệu chứng "lá vàng lốm đốm" ở Trung Quốc, Đài Loan và triệu chứng bệnh “greening" ở Nam Phi. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 5 Ấn Độ: Bệnh VLG đã được phát hiện và gây hại trên cây có múi ở Ấn Độ trong thời gian dài. Các vườn cây có múi ở Ấn Độ cho sản lượng thấp, cành bị khô chết, cây chết chậm nhưng cũng có thể bị héo đột ngột. Thuật ngữ “dieback” đã được sử dụng để gọi chung cho những triệu chứng này, khi lần đầu tiên chúng được quan sát bởi Roghoji Bhonsale ở các tỉnh miền Trung Ấn Độ vào thế kỷ 18 (Capoor, 1963). Xuất phát từ thực tiễn trong sản xuất “Dieback” là thuật ngữ chỉ các triệu chứng bệnh gây ra bởi nhiều yếu tố như kết cấu đất, thiếu hụt dinh dưỡng, nấm gây bệnh trên cành và virus. Asana (1958) đã ghi nhận được triệu chứng rõ rệt nhất của bệnh là những vết lá vàng lốm đốm. Trong một số trường hợp, nguyên nhân chủ yếu gây ra triệu chứng “dieback” là virus gây bệnh tristeza (CTV) (Vasudeva and Capoor, 1958; Capoor, 1963). Năm 1966 bệnh tiếp tục được nghiên cứu (Fraser et al., 1966; Fraser and Singh, 1968). Ứng dụng phương pháp lai (dot-blot) người ta đã phát hiện được sự có mặt của vi khuẩn gây bệnh VLG trong những lá có triệu chứng vàng lốm đốm. Các tác giả cũng chỉ ra rằng không phải lúc nào vi-rút gây bệnh CTV cũng hiện diện trong cây có triệu chứng bệnh dạng “dieback”. Các biểu hiện triệu chứng ở lá thường bị gây ra bởi một hoặc một vài tác nhân khác. Triệu chứng bệnh được mô tả cũng tương tự như triệu chứng bệnh "greening" tại Nam Phi của Oberholzer et al. (1965), và "Huanglongbing" của Lin (1956) tại Trung Quốc. Với nhiều thí nghiệm theo các hướng khác nhau Capoor và đồng nghiệp đã thành công trong việc xác định sự lan truyền của bệnh bằng rầy chổng cánh D. citri (Capoor et al.,1967). Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy triệu chứng chết cây luôn cho kết quả dương tính với vi khuẩn gây bệnh VLG. Trong số những cây dương tính với vi khuẩn gây bệnh VLG, đã không phát hiện được vi-rút gây bệnh CTV. Đến năm 1971, Bové và đồng nghiệp đã phát hiện được vi khuẩn VLG trong cây cam ngọt và đồng thời lây nhiễm bệnh thành công bằng rầy môi giới. CTV đã được loại khỏi triệu chứng “dieback” dựa trên các kết quả nghiên cứu của Capoor năm 1969 (Bové and Saglio, 1974). Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 6 Bệnh vàng lá Greening được phát hiện ở Indonexia năm 1965 và được gọi là “thoái hóa mạch dẫn”; Thái Lan năm 1960, Myanmar năm 1960, Nhật Bản năm 1994 (Bové, 2006). 1.1.3. Nghiên cứu về chẩn đoán, giám định bệnh vàng lá Greening Bệnh có thể được chẩn đoán dựa theo các dạng triệu chứng trên đồng ruộng. Tuy nhiên các dạng triệu chứng bệnh sẽ thay đổi trên từng giống khác nhau (Hajivand et al., 2011). Mặt khác sự thể hiện của triệu chứng bệnh còn phụ thuộc vào số lượng của vi khuẩn có trong cây. Khi số lượng vi khuẩn trong cây thấp, mặc dù đã bị nhiễm bệnh cây vẫn không biểu hiện triệu chứng, nên không phát hiện được bệnh. 1.1.3.1. Xác định tác nhân gây bệnh bằng kính hiển vi điện tử Dưới kính hiển vi điện tử quan sát được vi khuẩn có lông cứng, kích thước 350 – 550 nm × 600 – 1500 nm, vách tế bào có 2 lớp, độ dầy từ 20 – 25 nm. Hình dạng của vi khuẩn thường có hình gậy, thon dài và được thay đổi từ tế bào non cho đến lúc thành thục (Huang, 1987). Màng tế bào chất thành thục có xu hướng bao bọc tế bào chất. Chu kỳ của vi khuẩn gây bệnh gồm (i) bắt đầu nhân lên về số lượng, (ii) phân hạch nhị phân, (iii) tạo thành chuỗi, (iv) phân tách thành nhiều đoạn và (v) sinh sản bằng cách phân đôi. Cho đến năm 1992, kính hiển vi điện tử đã được sử dụng rộng rãi để xác định nguyên nhân gây bệnh (Garnier and Bové, 1996). Tuy nhiên, sử dụng kính hiển vi điện tử không thể phân biệt được các dòng vi khuẩn châu Á và vi khuẩn châu Phi. 1.1.3.2. Xác định tác nhân gây bệnh bằng phương pháp sinh học phân tử Phương pháp PCR đã được ứng dụng cho kỹ thuật chẩn đoán tác nhân gây bệnh. Đầu tiên dựa trên sự khuếch đại của đoạn 16S rDNA với sản phẩm thu được ở 1160 bp. Các cặp mồi OI1/OI2c có khả năng nhận biết được cả dòng châu Á và châu Phi, cặp mồi OA1/OI2c ưu tiên cho dòng châu Phi. Để nhận biết được dòng châu Á và châu Phi trên cùng một phản ứng được sử dụng mồi xuôi là OI1 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 7 + OA1, và mồi OI2c là mồi ngược trong phản ứng PCR. Bằng sản phẩm đặc hiệu nên dễ dàng nhận biết dòng châu Á hoặc châu Phi (Jagoueix et al., 1996). Hung và các tác giả khác (1999) đã sử dụng cặp mồi đặc hiệu để chẩn đoán bệnh vàng lá Greening, sản phẩm thu được ở 226 bp. Li, (2007) đã tiến hành so sánh hai phương pháp chuẩn đoán bệnh vàng lá greening bằng PCR thông thường và Real time PCR, cả hai phương pháp này đều đáng tin cậy trong việc chuẩn đoán bệnh vàng lá Greening. Phương pháp realtime PCR là phương pháp hiệu quả hơn trong việc phát hiện, chuẩn đoán sớm bệnh và có khả năng phát hiện vi khuẩn Ca. L trong các mô chưa biểu hiện triệu chứng bệnh. 1.1.3.3. Nghiên cứu về các dòng vi khuẩn khác nhau gây bệnh vàng lá greening Các triệu chứng của bệnh vàng lá greening chịu ảnh hưởng của nhiệt độ. Các triệu chứng cây thấp lùn, tàn lụi xuất hiện phổ biến, gây hại nghiêm trọng tại các vùng có khí hậu khô nóng như ở California, Arizona, Morocco, Iran và Iraq. Ở Châu Phi, bệnh vàng lá greening xuất hiện có khí hậu mát như ở Nam Phi (Garnier and Bové., 2000) Ở Madagascar, HLB và rầy T. erytreae chỉ xuất hiện trên các cao nguyên cao (1.200-1.500 m trên mực nước biển). Kenya, HLB và T. erytreae không được nhìn thấy dưới độ cao 600 đến 700m. Ngược lại, ở châu Á, HLB và vector rầy Á, D. citri được tìm thấy ở vùng thấp so với mực nước biển. Tại Indonesia, trong năm 1984, HLB và D. citri đã có mặt trong toàn bộ vùng đất thấp ven biển Java, nhưng nhiều cây trong vườn nằm giữa 800 và 1200 m trên mực nước biển vẫn khỏe mạnh (Aubert et al., 1987). Tại Bắc Bali, bệnh VLG xuất hiện phổ biến ở độ cao dưới 650m và hiếm khi bắt gặp ở độ cao trên 1000m, sự xuất hiện của bệnh có quan hệ mất thiết với sự xuất hiện của rầy chổng cánh D. citri (Bové et al., 2000). 1.1.3.4. Nghiên cứu các chủng gây bệnh vàng lá Greening Su, (2008) đã xác định được các chủng vi khuẩn gây bệnh VLG ở Đài Loan bằng phương pháp sử dụng cây chỉ thị, kết hợp với công nghệ sinh học. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 8 Từ các mẫu bệnh thu thập, virus được làm sạch. Các nguồn virus này được sử dụng để lây bệnh trên các giống cây có múi khác nhau được dùng làm cây chỉ thị như Quýt Ponkan, cam Liucheng, bưởi Wentan và chanh Eureka. Cho đến nay đã xác định được 4 chủng vi khuẩn gây bệnh khác nhau. - Chủng I gây bệnh trên cam ngọt và quýt - Chủng II có độ độc cao nên đã gây bệnh ở cả bốn giống chanh, cam, quýt và bưởi - Chủng III gây hại ở mức trung bình nên triệu chứng bệnh biểu hiện ở cam ngọt, quýt và biểu hiện nhẹ trên bưởi - Chủng IV gây bệnh trên cam ngọt và quýt nhưng triệu chứng ẩn và phải sử dụng đến phương pháp PCR để phát hiện bệnh, tuy nhiên chủng này bắt gặp rất ít trên đồng ruộng. Ở Đài Loan đã xác định được bưởi đã bị nhiễm chủng II của vi khuẩn gây bệnh VLG từ năm 1970 và chủng II cũng được phát hiện ở Đông Nam Á năm 1980. Tomimura et al., (2009, 2010) đã báo cáo về sự đa dạng của các chủng vi khuẩn gây bệnh VLG và mối quan hệ giữa chúng với sự phát sinh hình thành chủng mới gây bệnh ở Đảo Okinawa (Nhật Bản), Đài Loan, các nước Đông Nam Á. Từ kết quả giải trình tự gen, các mẫu vi khuẩn được phát hiện thuộc ba nhóm. Ở Đài Loan chủng I thuộc nhóm A, chủng II thuộc nhóm B. Kết quả phân tích trình tự gen cũng cho thấy vi khuẩn Ca. L. asiaticus là tác nhân gây bệnh VLG ở các nước Đông Nam Á. Chủng I và II cũng đã được tìm thấy ở Okinawa, nhưng ở Đài Loan thuộc chủng I (Tomimura, 2012). 1.1.4. Nghiên cứu về dịch tễ và sinh thái học của bệnh vàng lá greening 1.1.4.1. Nghiên cứu sự lan truyền bệnh vàng lá Greening Bệnh có thể lây lan rất nhanh đạt tỷ lệ trên 95% trong khoảng thời gian từ 3 đến 9 năm sau khi xuất hiện triệu chứng đầu tiên (Bové et al., 2000). Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 9 Bệnh VLG được lan truyền qua con đường nhân giống và lan truyền bởi côn trùng môi giới (D. citri) theo kiểu bền vững (Hung et al., 2000). Bệnh còn được lan truyền qua phương thức xuất nhập khẩu quả tươi; người ta đã thu thập và xác định được tỷ lệ môi giới đi theo các lô hàng (Halbert et al., 2012). 1.1.4.2. Đặc điểm sinh học, sinh thái của rầy chổng cánh Diaphorina citri Kuwayama Rầy chổng cánh phân bố rộng ở phương Đông và Nam Á (Pakistan, và Ấn Độ), Nam Trung Quốc, Đông Nam Á (Myanmar, Malaysia, Indonesia, Philippine), Đài Loan, Ả rập Xê út, Mauritius và Reunion và gây thành dịch ở Braxin, Nam Mỹ. Rầy chổng cánh ít được phát hiện ở những vùng có độ cao trên 400 mét so với mực nước biển. Loài côn trùng này đã được phát hiện cách đây hơn 85 năm (Bové, 2006). Rầy chổng cánh D. citri có kích thước nhỏ, (dài từ 2,7 – 3,3 mm), cánh lốm đốm màu nâu. Sự khác nhau có ý nghĩa ở phần bụng của trưởng thành không biết đã xuất hiện từ khi nào mà chúng có 3 mối quan hệ chặt chẽ về màu sắc (xám/nâu, xanh/xanh lá cây, cam/vàng) (Wenninger and Hall, 2008). Tỷ lệ đực cái là xấp xỉ tương đương nhau (Aubert et al.,1988). Khi trưởng thành chích hút vào cây hoặc ngừng ăn, chúng đều đậu trên lá, chồi non, cơ thể tạo thành một góc 45° so với bề mặt của cây. Môi giới truyền bệnh Greening ở châu Phi có tên khoa học là T. erytreae, nhiệt độ thích hợp cho môi giới phát triển ở 22 – 25°C. Trưởng thành đực và cái thường ở cạnh nhau và chúng phát ra tín hiệu trước khi đẻ trứng. Tập tính sống của trưởng thành cái tiết ra pheromone giới tính. Trưởng thành đực và cái giao phối nhiều lần. Vị trí đẻ trứng và sự vận động của chúng bị giới hạn bởi số giờ nắng trong ngày (Wenninger and Hall, 2008). Con cái có thể đẻ trứng trong suốt chu kỳ sống nếu đủ nguồn thức ăn. Trưởng thành cái có thể đẻ được 500 – 800 trứng trong suốt 2 tháng, tối đa 900 trứng trong 1 vòng đời (Tsai and Liu, 2000). Nhiệt độ thấp và cao hơn ngưỡng nhiệt độ đẻ trứng là dưới 16°C và trên 41,6°C, nhiệt độ thích hợp nhất cho đẻ trứng ở 29,6°C (Hall and Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 10 McCollum, 2011). Ẩm độ ảnh hưởng đến vị trí đẻ trứng, ẩm độ dưới 40% làm cho trứng không nở được (Skelley and Hoy, 2004). Trứng thuôn dài, hình quả hạnh nhân, thành mỏng. Trứng ban đầu vàng nhạt, sau chuyển dần thành màu cam. Giai đoạn trứng kéo dài 3-6 ngày, chiều dài trứng 0,038mm, trứng từ 10 – 12 ngày và được tìm thấy nhiều trên chồi non. Rầy có 5 tuổi. Vào mùa đông, trưởng thành có thể sống hơn 6 tháng. Hàng năm rầy chổng cánh hoàn thành 9-10 lứa, thậm chí gối 16 lứa trong 1 năm. Trưởng thành tuổi năm ít di chuyển, chỉ di chuyển khi có tác động vào chúng, trong khi đó ở các tuổi khác chúng thường xuyên di chuyển (Tsai and Liu, 2000) Thời gian phát triển của trứng và rầy non phụ thuộc rất chặt vào nhiệt độ. Từ trứng đến trưởng thành ở nhiệt độ 28°C là 14,1 ngày; ở 15°C lên tới 49,3 ngày (Tsai et al., 2002). Trưởng thành sau khi vũ hóa được 2 – 3 ngày bắt đầu giao phối và sau giao phối 1 – 2 ngày bắt đầu đẻ trứng. Nhiệt độ tối ưu ở 24 – 28°C, mỗi thế hệ từ 20 – 22 ngày ở 25°C (Tsai and Liu, 2000). Theo Nava et al., (2007) vòng đời con đực sống trung bình từ 21 – 25 ngày, con cái sống trung bình 31 – 32 ngày ở 24°C. Tsai and Liu (2000) cho rằng tối đa chúng có thể sống 117 ngày ở 15°C và 51 ngày ở 30°C; đã chứng minh được một con cái nếu không qua đẻ trứng sống được trên cây ký chủ ưa thích lên tới 188 ngày (trung bình 90 ngày) ở 27°C (Richardson and Hall, 2012). Một số yếu tố tạo nên sự sống sót của rầy chổng cánh là mối quan hệ giữa ẩm độ, ký chủ và tình trạng chống chịu của chúng (Nava et al., 2007). Rầy non và trưởng thành chích hút chồi mầm hoặc lá non làm cho lá bị cong, khô, lá héo và rụng; ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển của cây. Quả bị ảnh hưởng đến chất lượng (kém dinh dưỡng, hương vị) và kích thước quả. Rầy non bài tiết ra các hạt sáp trắng, nguyên nhân của sự phát triển của các nấm muội đen trên bề mặt lá, làm giảm sự quang hợp và hô hấp của lá gây ảnh hưởng đến hoa, quả và giá trị sản phẩm trên thị trường, sự gây hại có thể lên đến 83-95% (Anomynous, 1996) Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 11 Sakamaki (2005) cho rằng rầy chổng cánh không thể bay xa và không tồn tại được trong thời gian dài, do kích thước và cánh rất yếu. Thực tế D. citri có thể bay trong suốt thời gian 47 phút đối với con cái, 49 phút đối với con đực; khoảng cách mà chúng di chuyển được với con cái là 978m, con đực 1.241m. Từ số liệu ngoại suy của Arakawa and Mivamolo (2007), tốc độ bay trung bình 1,4km/giờ trong điều kiện không có gió và trung bình mỗi con bay được 25,4 phút. Trưởng thành hoạt động trong ánh sáng ban ngày, nhưng hoạt động linh hoạt vào buổi chiều. Mỗi cá thể rầy có thể bay từ 30-100 mét/tháng ở Florida, hoạt động mạnh nhất vào mùa xuân (Hall and Hentz, 2011). 1.1.4.3. Sự lan truyền của bệnh VLG trên đồng ruộng do rầy chổng cánh Diaphorina citri Kuwayama Sự lan truyền bệnh VLG bởi rầy chổng cánh trên đồng ruộng là rất phổ biến (Su, 1998, 2008). Bệnh VLG sẽ bị tái nhiễm khi mật độ quần thể RCC cao. Lan truyền tự nhiên của bệnh sẽ xảy ra trong suốt giai đoạn sinh trưởng của chồi, nguồn thức ăn dồi dào cho RCC sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho việc lan truyền bệnh (Hung et al., 2004). Cây khỏe gần cây bị bệnh sẽ bị nhiễm trước, đồng thời bệnh sẽ lan truyền theo đường zíc zắc. Tỷ lệ cây bị nhiễm bệnh cao nhất khoảng giai đoạn 1,5 tháng sau lây nhiễm (từ cuối tháng 3 cho đến giữa tháng 4), khi đó tỷ lệ rầy chổng cánh mang vi khuẩn gây bệnh là nhiều nhất đồng thời khả năng phân tán của chúng cũng là lớn nhất. Đây là khoảng thời gian cần tiến hành phun phòng trừ môi giới. Tỷ lệ bệnh sẽ tích lũy tăng dần đạt khoảng 70% sau hai năm nếu không phun thuốc và không hủy bỏ cây bệnh. Ở phía Nam Đài Loan đã có cuộc điều tra về bệnh VLG sau trồng 5 năm (1999 – 2004). Tỷ lệ tích lũy bệnh VLG ở công thức phun thuốc trừ rầy môi giới là 17%, công thức không phun thuốc trừ rầy chổng cánh tỷ lệ bệnh VLG là 57% (Hung et al., 2004). Ở Đài Loan khi nghiên cứu về khả năng truyền bệnh bằng rầy chổng cánh, kết quả cho thấy RCC trưởng thành sau khi chích hút vào cây một ngày cho tỷ lệ nhiễm dưới 5%, trong khi đó RCC ở tuổi non cho tỷ lệ cây bị nhiễm bệnh VLG cao hơn. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 12 Rầy chổng cánh D. citri thường tấn công vào thân chính của cây, đặc biệt là chồi non. Thả 50 rầy trưởng thành/cây và cho chúng chích hút 2 ngày (cây gieo từ hạt được 20 ngày tuổi), ở điều kiện nhiệt độ từ 26 – 28°C, dưới điều kiện ánh sáng 5.000 lux trong 14giờ/ngày, giữ 3 tuần. Sau lẫy nhiễm vài ngày đã có 16 cây bị chết héo do rầy tấn công, một số cây đã biểu hiện triệu chứng lá vàng lốm đốm, vàng toàn lá và chết (11 cây); 4 cây cho triệu chứng cây bị thấp lùn, vàng lốm đốm, 19 cây không cho triệu chứng. Bộ rễ cây bị bệnh phát triển rất kém (Koizumi et al., 1997). Các thí nghiệm lây bệnh nhân tạo cũng chỉ ra rằng D. citri đã lan truyền bệnh VLG trên đồng ruộng ở Florida (Teixeira et al., 2005). Thí nghiệm khác cũng chỉ ra mức độ lan truyền bệnh trên 50%. 1.1.5. Những nghiên cứu về quản lý tổng hợp và chống tái nhiễm bệnh Greening và các bệnh virus khác trên cây ăn quả có múi 1.1.5.1. Nghiên cứu phục tráng cây ăn quả có múi Kỹ thuật vi ghép đối với cây cam quýt hay còn gọi là kỹ thuật ghép đỉnh sinh trưởng (Shoot tip grafting) được Murashige áp dụng lần đầu tiên vào năm 1972 sau đó được cải tiến hoàn chỉnh bởi Navarro 1975, 1976, 1980, 1981 và H.J. Su năm 1984. Nguyên tắc của phương pháp này là tác nhân gây bệnh greening và các loại virus khác trên cây có múi thường lưu dẫn trong cây theo nhựa qua hệ thống mạch dẫn. Tại đỉnh sinh trưởng là nơi chưa hình thành mạch dẫn do vậy tác nhân gây bệnh chưa xâm nhiễm vùng đỉnh sinh trưởng này. Dùng kỹ thuật vi ghép là cắt phần chưa bị bệnh này rồi ghép vào cây cam 3 lá được nuôi cấy trong ống nghiệm có thể phục tráng và làm sạch bệnh các giống cây có múi dù rằng nó đã bị nhiễm bệnh. Vi ghép được thực hiện trong phòng thí nghiệm, không phụ thuộc vào mùa vụ, các cá thể được tạo ra có độ thuần sinh học cao, thể hiện đầy đủ các ưu điểm của cây mẹ. Ở Pháp: từ năm 1958 tập đoàn quỹ gen cây có múi quan trọng được Trạm nghiên cứu nông học San Giuliano ở đảo Corse quản lý theo các tiêu chuẩn nghiêm ngặt . Hệ thống cấp chứng chỉ được hỗ trợ của Viện INRA và Trung tâm Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 13