Tài liệu Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết xuất từ vỏ trái cây đến khả năng sản xuất carotenoid của nấm men rhodosporidium paludigenum

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH - MÔI TRƯỜNG ⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA DỊCH CHIẾT XUẤT TỪ VỎ TRÁI CÂY ĐẾN KHẢ NĂNG SẢN XUẤT CAROTENOID CỦA NẤM MEN RHODOSPORIDIUM PALUDIGENUM Vũ Thị Uyên Đà Nẵng, năm 2022 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH - MÔI TRƯỜNG ⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA DỊCH CHIẾT XUẤT TỪ VỎ TRÁI CÂY ĐẾN KHẢ NĂNG SẢN XUẤT CAROTENOID CỦA NẤM MEN RHODOSPORIDIUM PALUDIGENUM Ngành: Công nghệ sinh học Khóa: 2018-2022 Sinh viên: Vũ Thị Uyên Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Minh Lý Đà Nẵng, năm 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan các dữ liệu trình bày trong khóa luận này là trung thực. Đây là kết quả nghiên cứu của tác giả và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác trước đây. Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm nếu vi phạm bất kì quy định nào về đạo đức khoa học. Vũ Thị Uyên i LỜI CẢM ƠN Khoá luận tốt nghiệp là một trong những dấu mốc quan trọng trong quá trình học đại học của tôi. Để hoàn thành được kết quả như ngày hôm nay đã có rất nhiều bàn tay nâng đỡ và dìu dắt tôi. Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, đầu tiên tôi xin chân thành cảm ơn đến quý thầy cô khoa Sinh – Môi trường, Trường đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng đã cùng với tri thức và tâm huyết của mình để truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho chúng tôi tại giảng đường. Cảm ơn Khoa đã hỗ trợ máy móc, dụng cụ thiết bị tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành khoá luận. Và đặc biệt hơn hết tôi xin chân thành cảm ơn Th.S Lê Thị Mai và TS. Nguyễn Minh Lý đã nhiệt tình dẫn dắt, quan tâm và truyền đạt tận tình, cho tôi những nền tảng kiến thức, những định hướng nghiên cứu để tôi có thể hoàn thành khoá luận một cách tốt nhất. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các bạn trong và ngoài lớp đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khoá luận. Và cuối cùng con xin được cảm ơn gia đình đã luôn yêu thương, quan tâm, động viên và là điểm tựa tinh thần cho con. Một lần nữa, tôi xin chân thành cảm ơn! Đà Nẵng, ngày 21 tháng 5 năm 2022 Sinh viên thực hiện ii MỤC LỤC MỞ ĐẦU ............................................................................................................................. 1 1. Tính cấp thiết của đề tài ................................................................................................... 1 2. Mục tiêu đề tài ................................................................................................................. 2 3. Ý nghĩa của đề tài ............................................................................................................ 2 3.1. Ý nghĩa khoa học .......................................................................................................... 2 3.2. Ý nghĩa thực tiễn ........................................................................................................... 2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................................. 3 1.1. Tổng quan về Carotenoid .............................................................................................. 3 1.1.1. Giới thiệu ................................................................................................................... 3 1.1.2. Phân loại..................................................................................................................... 3 1.1.3. Tính chất của carotenoid ............................................................................................ 4 1.1.4. Hoạt tính sinh học và vai trò của carotenoid ............................................................. 6 1.2. Tổng quan về chủng nấm men Rhodosporidium .......................................................... 6 1.2.1. Phân loại..................................................................................................................... 6 1.2.2. Đặc điểm sinh học ...................................................................................................... 7 1.2.3. Con đường sinh tổng hợp carotenoid bởi nấm men ................................................... 8 1.2.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp carotenoid của nấm men .... 10 1.2.5. Nguyên liệu dùng trong nghiên cứu ........................................................................ 13 1.2.6. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng nấm men để sản xuất carotenoid sử dụng chất nền là bã thải nông nghiệp trên thế giới và Việt Nam .............................................................. 16 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................... 19 2.1. Vật liệu ........................................................................................................................ 19 2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................................... 19 2.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................................ 20 2.3.1. Bố trí thí nghiệm ...................................................................................................... 20 2.3.2. Phương pháp nghiên cứu ......................................................................................... 20 iii CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .......................................... 26 3.1. Ảnh hưởng của dịch chiết xuất từ các loại vỏ trái cây đến khả năng sản xuất carotenoid bởi chủng Rhodosporidium paludigenum .......................................................................... 26 3.1.1. Ảnh hưởng của dịch chiết vỏ trái cây thay thế đường D-glucose trong môi trường Hansen đến khả năng sản xuất carotenoid bởi chủng Rhodosporidium paludigenum. ..... 26 3.1.2. Khảo sát việc thay thế hoàn toàn dịch chiết từ vỏ dứa làm chất nền để sản xuất carotenoid ........................................................................................................................... 30 3.2. Ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, thời gian đến khả năng sản xuất carotenoid của Rhodosporidium paludigenum ........................................................................................... 32 3.2.1. Ảnh hưởng của pH đến khả năng sản xuất carotenoid của Rhodosporidium paludigenum ....................................................................................................................... 32 3.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sản xuất carotenoid của Rhodosporidium paludigenum ....................................................................................................................... 34 3.3.3. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sản xuất carotenoid của Rhodosporidium paludigenum ........................................................................................... 36 3.3. Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa và kháng khuẩn của carotenoid bởi chủng Rhodosporidium paludigenum lên men từ dịch chiết vỏ dứa ............................................ 39 3.3.1. Khả năng bắt gốc tự do ABTS ................................................................................. 39 3.3.2. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết carotenoid bởi chủng Rhodosporidium paludigenum từ dịch vỏ dứa .............................................................................................. 40 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................... 43 1. Kết luận.......................................................................................................................... 43 2. Kiến nghị ........................................................................................................................ 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 44 PHỤ LỤC........................................................................................................................... 50 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ABTS 2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate) DMSO Dimethyl Sulffoxide D Day GGPP geranylgeranyl pyrophosphate N Ngày NT Nghiệm thức PE Petroleum Ether v DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng Tên bảng Trang 3.1 Sinh khối khô, hàm lượng carotenoid của các nghiệm thức từ 26 chủng nấm men Rhodosporidium paludigenum 3.2 Hàm lượng đường khử của các nghiệm thức từ chủng nấm men 27 Rhodosporidium paludigenum 3.3 Sinh khối khô, hàm lượng carotenoid của chủng Rhodosporidium 30 paludigenum ở các nghiệm thức NT5, NT6, NT7 3.4 Sinh khối khô, hàm lượng carotenoid chủng nấm men 33 Rhodosporidium paludigenum ở các mức pH 3.5 Sinh khối khô, hàm lượng carotenoid ở các mức nhiệt độ từ chủng Rhodosporidium paludigenum 35 3.6 Sinh khối khô, hàm lượng carotenoid ở các mức thời gian nuôi 36 cấy từ chủng nấm men Rhodosporidium paludigenum 3.7 Hoạt tính kháng oxy hoá của dịch chiết carotenoid từ chủng 39 Rhodosporidium paludigenum 3.8 Hoạt tính kháng oxy hoá của dịch chiết carotenoid từ chủng Rhodosporidium paludigenum vi 41 DANH MỤC HÌNH ẢNH Tên hình vẽ Hình Trang 1.1 Một số phân nhóm trong carotenoids 4 1.2 Quá trình tổng hợp beta-carotene, torulene và torularhodin từ 10 acetyl – CoA của Rhodosporidium sp. 2.1 Khuẩn lạc và hình thái tế bào của chủng R. paludigenum 19 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 20 3.1 Sinh khối, hàm lượng carotenoid của các nghiệm thức từ chủng 28 nấm men R. paludigenum 3.2 Sinh khối thu được của R.paludigenum từ các nghiệm thức 28 3.3 Dịch chiết carotenoid của chủng R. paludigenum ở nghiệm thức 28 3.4 Sinh khối lỏng của R.paludigenum ở NT5, NT6, NT7 31 3.5 Dịch chiết carotenoid của R.paludigenum ở NT5, NT6, NT7 31 3.6 Sinh khối nấm men R. paludigenum thu được ở các mức pH 33 3.7 Dịch chiết carotenoid của chủng R. paludigenum ở các mức pH 33 3.8 Dịch chiết carotenoid của chủng R. paludigenum ở các mức nhiệt 35 độ vii 3.9 Hàm lượng carotenoid và sinh khối khô ở các mức thời gian nuôi 37 cấy 3.10 Dịch chiết carotenoid của chủng R. paludigenum ở các mức thời 37 gian nuôi cấy 3.11 Hoạt tính kháng oxy hoá của dịch chiết carotenoid từ chủng 39 R. paludigenum 3.12 Sự thay đổi màu ABTS+ của mẫu 40 3.13 Khả năng kháng khuẩn của dịch chiết carotenoid từ R. 41 paludigenum viii TÓM TẮT Carotenoid là họ sắc tố có vai trò quan trọng đối với động vật và con người nhờ khả năng tăng cường đáp ứng miễn dịch, biến đổi thành vitamin A hay khả năng bắt các gốc oxy hóa. Các chất tạo màu tự nhiên ngày càng được tìm kiếm nhiều hơn để thay thế các chất tổng hợp. Nghiên cứu này được thực hiện để khảo sát tiềm năng của vỏ trái cây (cam, dứa, xoài, chuối, dưa hấu) như một nguồn cacbon để sản xuất carotenoid từ Rhodosporidium paludigenum. Dịch chiết xuất từ nghiệm thức 5 (vỏ dứa, KH2PO4, MgSO4 .7H2O, peptone) cho hàm lượng carotenoid cao nhất 3720,139 µg/L. Đặc biệt, dịch chiết từ NT7 (vỏ dứa) có thể thay thế hoàn toàn môi trường Hansen, hàm lượng sinh khối khô và carotenoid là 3,48 ± 0,2 g/L và 4482,355 ± 284,24 µg/L. Đã xác định được điều kiện lên men là pH = 6, nhiệt độ là 25oC và thời gian nuôi cấy là ngày thứ 6 đạt hàm lượng carotenoid là 4568,309 ± 85,32 µg/L, 5033,307 ± 62,96 µg/L và 6362,014 ± 538,84 µg/L. Dịch chiết carotenoid có hoạt tính kháng oxy khá mạnh (93,521 ± 0,31%) và đồng thời có khả năng kháng vi khuẩn E. Coli, Pseudomonas aeroginosa và Salmonella sp. với đường kính vòng vô khuẩn lần lượt là 8 ± 0,5 mm, 12 ± 0,5 mm và 11 ± 0,5 mm. Từ khoá: Carotenoid, Rhodosporidium paludigenum, vỏ trái cây. ix MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Carotenoid là một trong những loại sắc tố đóng vai trò quan trọng đối với sức khỏe con người và động vật. Hiện nay, có hơn 700 dẫn xuất của sắc tố carotenoid. Động vật và con người không có khả năng tổng hợp carotenoid và chế độ ăn uống là nguồn duy nhất bổ sung carotenoid. Hầu hết các carotenoid thường được phát hiện trong huyết tương người là α-carotene, β-carotene, lycopene, lutein, zeaxanthin và β-cryptoxanthin. Nhiều thành phần bữa ăn như rau, trái cây, lòng đỏ trứng, cá, ví dụ: cá hồi và cá hồi và động vật giáp xác đại diện cho một nguồn tuyệt vời của carotenoid (Trần Thị Huyền Nga, 2010). Carotenoid rất quan trọng vì chúng có thể được sử dụng làm tiền chất vitamin A, thuốc nhuộm tự nhiên, chất chống oxy hóa và có thể hoạt động ức chế khối u, chứng tỏ tiềm năng của chúng đối với ngành dược phẩm, hóa chất, thực phẩm và thức ăn chăn nuôi (Baker và Guenther, 2004; Frengova và Beshkova, 2009). Các bằng chứng dịch tễ học và dữ liệu thực nghiệm cho thấy rằng carotenoid trong thực phẩm ức chế sự khởi phát của nhiều bệnh, chẳng hạn như xơ cứng động mạch, đục thủy tinh thể, đa xơ cứng và ung thư (Forman và cs, 2004; Frengova và Beshkova, 2009). Mặc dù đã có nhiều loại carotenoid tự nhiên và tổng hợp, nhưng carotenoid được tổng hợp từ vi sinh vật đã thu hút nhiều sự chú ý trong những năm gần đây (Agnieszka, K., Malgorzata và cs, 2016). Carotenoid phân bố rộng rãi trong vi sinh vật bao gồm vi khuẩn, nấm men và tảo. Sản xuất thương mại các carotenoid từ vi sinh vật có hiệu quả cao vì chúng có thể được kiểm soát dễ dàng trong suốt quá trình (De Haan A và cs, 2016). Nấm men đỏ là một nhóm các loài nấm men có khả năng tích tụ các sắc tố carotenoid bao gồm β-caroten, torulene và thorularodin có nhiệm vụ tạo màu cho khuẩn lạc như màu vàng, cam và đỏ. Rhodotorula sp., Rhodosporidium sp., Phaffia sp. và gần đây là Candida sp. là những loài nấm men ưu thế nhất có thể tổng hợp hiệu quả các phân tử này với khả năng sinh trưởng cao (Aksu, Z., Eren và cs, 2005). Trong số các loại nấm men đỏ sản xuất caroteinoid thì Rhodosporidium sp. được đánh giá cao. 1 Nấm men có thể tổng hợp carotenoid khi được nuôi cấy trong môi trường thương mại, chứa nhiều nguồn cacbon tinh chế khác nhau, chẳng hạn như glucose, xylose, cellobiose, sucrose, glycerol và sorbitol, tuy nhiên loại môi trường này có chi phí cao. Một số loại chất nền chi phí thấp hơn đã được nghiên cứu để sản xuất carotenoid bởi nấm men đỏ, chẳng hạn như nước mía (Bonadio và cs, 2018), váng sữa, mật đường, rượu ngô (Galal và Ahmed, 2020) và các loại nông sản chất thải công nghiệp khác (Mata-Gómez và cs, 2014). Chất thải từ trái cây là chất nền tiềm năng để sản xuất carotenoid vi sinh vật do chứa nhiều cacbon và khoáng chất (Tarangini và Mishra, 2014). Hơn nữa, vỏ trái cây cũng chứa các tiền chất carotenoid bao gồm geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP) liên quan đến quá trình sinh tổng hợp carotenoid theo con đường methyl - D - erythritol - 4 - phosphate (MEP) (Loto và cs, 2012). Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu về chủng Rhodosporidium sp. sinh tổng hợp carotenoid nhưng chưa có nhiều nghiên cứu về ảnh hưởng của chất nền nuôi cấy đến khả năng sản xuất carotenoid của chủng nấm men Rhodosporidium paludigenum. Xuất phát từ các cơ sở lý luận và thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành đề tài: Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết xuất từ vỏ trái cây đến khả năng sản xuất Carotenoid của nấm men Rhodosporidium paludigenum. 2. Mục tiêu đề tài Xác định được ảnh hưởng của chất nền đến khả năng sản xuất carotenoid của chủng Rhodosporidium paludigenum. 3. Ý nghĩa của đề tài 3.1. Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp thêm dẫn liệu khoa học về ảnh hưởng của chất nền đến khả năng sản xuất carotenoid của chủng Rhodosporidium paludigenum. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả đề tài là cơ sở cho việc sản xuất carotenoid từ chủng nấm men Rhodosporidium paludigenum. 2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về Carotenoid 1.1.1. Giới thiệu Carotenoid là nhóm chất màu hoà tan trong lipid tự nhiên, làm cho rau quả có màu da cam, màu vàng và màu đỏ, được tìm thấy trong thực vật và một số cơ thể sinh vật quang hợp, thực vật, tảo, nấm mốc, mấn men và vi khuẩn. Nhóm này gồm từ 65 - 70 chất màu tự nhiên, tiêu biểu là carotene, licopene, xanthophylls, capsanthin,... Số lượng các carotenoid tìm thấy trong tự nhiên lên đến 600 loại với các màu sắc khác nhau. Carotenoid không phải là tên riêng của một chất nào mà là tên của một nhóm các hợp chất có công thức cấu tạo tương tự nhau và tác dụng bảo vệ cơ thể cũng tương tự nhau. Cấu trúc cơ bản của các carotenoid là một mạch thẳng, gồm 40 cacbon được cấu thành từ 8 đơn vị isoprenoid chứa 5 cacbon liên kết nhau, đối xứng qua trung tâm. Điểm nổi bật và đặc biệt trong cấu trúc là hệ thống nối đôi liên hợp, xen kẽ nối đơn, nối đơn tạo chuỗi polyene. Carotenoid phần lớn là tecpenoit C40, hoạt động như chất chống oxy hóa bảo vệ màng lọc O2 và các gốc peroxyl; khả năng chống oxy hóa của chúng là do cấu trúc của chúng. Các sắc tố carotenoid xuất hiện phổ biến trong hệ thống quang hợp của thực vật bậc cao, tảo và vi khuẩn quang dưỡng. Mặt khác, ở các sinh vật không quang hợp, carotenoid rất quan trọng trong việc bảo vệ chống lại các tổn thương do quá trình oxy hóa. Do đó, nhiều vi khuẩn và nấm dựa vào carotenoid để bảo vệ khi phát triển trong điều kiện có nhiều ánh sáng và không khí (Britton G và cs, 1997). 1.1.2. Phân loại Carotenoid lần đầu tiên được công bố bởi Willstatter vào năm 1907. Ông đã phân loại chính xác 2 nhóm chính: carotenes là hydrocacbon như β-carotene và lycopene (C40H56 ) và xanthophylls, bao gồm oxy cùng với hydro và cacbon (C40H56O2). Xanthophylls về cơ bản là sản phẩm oxy hóa của carotenes, bao gồm lutein, zeaxanthin, canthaxanthin và βcryptoxanthan. Carotenoid có cấu trúc polyene liên hợp cho phép các điện tử trong liên kết đôi dễ dàng phân định vị trí, làm giảm trạng thái cơ bản của phân tử. Hệ thống cốt lõi của các liên kết cacbon - cacbon liên hợp này tạo ra các carotenoid chống oxy hoá. Cấu trúc 3 này cũng tạo ra tính ưa béo khiến các sắc tố vừa làm chậm quá trình peroxy hóa lipid vừa ổn định cấu trúc lipid - protein như màng tế bào. Nói chung, các carotenoid có tên gọi tùy theo sự biến đổi cấu trúc của các vòng bên, đặc biệt là vị trí liên kết đôi. Hình 1.1. Một số phân nhóm trong carotenoids Một số carotenoid của vi sinh vật được tạo ra bởi nấm men được báo cáo là: ● β-carotene (β-β'-carotene) phân tử này đã được sử dụng làm chất tạo màu thực phẩm hoặc như một chất bổ sung thực phẩm hoạt động như tiền vitamin A, với nồng độ dao động từ 2 đến 50 ppm. Nó cũng được thêm vào các công thức nước trái cây và đồ uống (chất nền ưa nước) và những chất khác (chất nền ưa béo) như bơ, bơ thực vật và pho mát. ● Astaxanthin (3,3′-dihydroxy-β, β-carotene-4,4′-dione) là một sắc tố đỏ gây ra màu ở động vật không xương sống, cá và chim. Tương tự như vậy, carotenes được mô tả trước khi nó được sử dụng như một chất tạo màu để tạo ra màu đỏ hồng điển hình của cá hồi nuôi, cá hồi và tôm (Johnson EA và cs, 1979; Reynders MB và cs, 1996). ● Canthaxanthin (β-β′-caroten-4, 4’-dione) là một keto-caroten quốc tế được các ngành công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm quan tâm chủ yếu (Hannibal L và cs, 2000). 1.1.3. Tính chất của carotenoid 1.1.3.1. Tính chất vật lý 4 ● Kết tinh ở dạng tinh thể, hình kim, hình khối lăng trụ, đa diện, dạng lá hình thoi. Nhiệt độ nóng chảy cao: 130 - 220oC. ● Có độ hoà tan cao, không tan trong nước. Hoà tan trong chất béo, các dung môi chứa Clo và các dung môi không phân cực khác làm cho hoa quả có màu da cam, màu vàng, màu đỏ. ● Màu sắc của carotenoid được tạo ra nhờ sự có mặt của hệ các nối đôi liên hợp trong phân tử. Phần lớn các nối đôi tạo hình trans. Khả năng hấp thụ sóng mạnh nhất ở những bước sóng khác nhau của hệ nối đôi liên hợp được sử dụng để phân tích, định tính cũng như định lượng carotenoid. ● Tính hấp thụ ánh sáng: chuỗi polyne liên hợp đặc trưng cho màu thấy được của carotenoid. Dựa vào độ quang phổ của nó, người ta thấy khả năng hấp thụ ánh sáng phụ thuộc vào nối đôi liên hợp, phụ thuộc vào nhóm C9 mạch thẳng hay mạch vòng, cũng như các nhóm chức gắn trên vòng. Ngoài ra trong mỗi dung môi hoà tan khác nhau, khả năng hấp thụ ánh sáng tối đa cũng khác nhau với cùng một loại. Khả năng hấp thụ ánh sáng mạnh chỉ cần 1 gam cũng thấy bằng mắt thường. 1.1.3.2. Tính chất hoá học ● Carotenoid nhạy cảm với oxy và ánh sáng. Khi các tác nhân này bị loại bỏ, carotenoid trong thực phẩm rất bền, kể cả ở nhiệt độ cao. ● Một trong những đặc điểm của carotenoid là có nhiều nối đôi luân hợp tạo nên những nhóm mang màu của chúng. Màu của chúng phụ thuộc vào những nhóm mang màu này. ● Dễ bị oxy hoá trong không khí, cần bảo quản trong khí trơ, chân không. Ở nhiệt độ thấp nên bao kín tránh ánh sáng mặt trời. Carotenoid khi bị oxy hoá: ❖ Làm giảm chất lượng sản phẩm ❖ Làm thay đổi màu sắc thực phẩm ❖ Tạo ra nhiều chất mùi (hợp chất có mùi thơm như aldehide không no hoặc keton đóng vai trò tạo hương thơm cho trà). ● Rất nhạy cảm với acid và chất oxy hoá, bền vững với kiềm. Do có hệ thống nối đôi liên hợp nên nó dễ bị oxy hoá mất màu hoặc đồng phân hoá, hydro hoá tạo màu khác. 5 1.1.4. Hoạt tính sinh học và vai trò của carotenoid Carotenoid là tiền vitamin A, là chất chống oxy hoá tự nhiên có khả năng bắt giữ oxy đơn phân tử. Các tính năng chống oxy hóa của các hợp chất này không phụ thuộc vào hoạt tính tiền vitamin A của nó, bởi vì khả năng bắt giữ oxy bằng liên kết đôi của nó. Ngoài các đặc tính được mô tả ở trên, carotenoid cũng phát huy tác dụng tốt cho sức khỏe bao gồm: cải thiện khả năng miễn dịch và giảm nguy cơ mắc các bệnh thoái hóa như ung thư, bệnh tim, đục thủy tinh thể và thoái hóa điểm vàng (Palozza P và cs, 2003). Ăn vào có thể ngăn chặn quá trình hình thành và cháy nắng trên da, nhưng chúng phải được tiêu thụ trong nhiều tuần để làm tăng nồng độ của chúng trong máu, do đó tăng khả năng bảo vệ. Carotenoid là hợp chất rất quan trọng đối với sức khỏe con người. Chúng có thể ngăn ngừa sự thiếu hụt vitamin A, được biết đến như một hợp chất thiết yếu để thúc đẩy tăng trưởng, phát triển phôi thai và chức năng thị giác. Tính ưa béo của các carotenoid quyết định sự phân bố dưới tế bào của chúng. Người ta cho rằng carotenoid trong màng có thể bảo vệ chúng như chất chống oxy hóa. Bên cạnh đó, các carotenoid phân cực có thể điều chỉnh tính lưu động của màng (Anna M. Kot và cs, 2020). Một trong những chức năng của chúng có liên quan đến việc bảo vệ tầm nhìn của chúng ta. Sự thiếu hụt carotenoid có thể dẫn đến mù lòa và đã được xem xét trong các tài liệu, đây là một vấn đề nghiêm trọng đối với trẻ em, đặc biệt là ở các nước đang phát triển (Anna M. Kot và cs 2020). 1.2. Tổng quan về chủng nấm men Rhodosporidium 1.2.1. Phân loại Chủng nấm men đỏ Rhodosporidium được Bano phân lập vào năm 1967, chủng nấm men này còn được gọi là nấm men sinh sắc tố carotenoid bởi vì chúng có khả năng tổng hợp và tích luỹ một lượng lớn các sắc tố carotenoid trong đó chủ yếu là β-Carotene, torulene và torularhodin. Hiện nay, chi Rhodosporidium được phát hiện gồm chín loài, trong đó các loài R. babjevae, R. diobovatum, R. kratochvilovae, R. lusitaniae, R. paludigenum, R. sphaerocarpum và R. toruloides và số chi khác như Cystofilobasidium, Kondoa và Sakaguchia. Phân loại: Giới (Kingdom): Fungi Ngành (Division): Basidiomycota 6 Lớp (Class): Ustilaginomycetes Bộ (Order): Ustilaginates Họ (Family): Ustilaginaceae Chi (Genus): Rhodosporidium 1.2.2. Đặc điểm sinh học 1.2.2.1. Đặc điểm hình thái Tế bào nấm men Rhodosporidium có nhiều hình dạng khác nhau tùy thuộc vào từng loài và từng thời điểm sinh trưởng, hình dạng tế bào có thể thay đổi từ hình cầu đến hình oval đa số có quầng sáng xung quanh tế bào. Tế bào ở dạng đơn bào, kích thước tế bào dao động trong khoảng 2 - 3 μm chiều rộng và 5 - 10 μm chiều dài. Khuẩn lạc của Rhodosporidium phát triển nhanh, bề mặt trơn mịn, sáng bóng hoặc có khi hơi mờ đục, ít khi ghồ ghề hoặc nhớt, mép khuẩn lạc phẳng đều, không có răng cưa. Màu sắc khuẩn lạc thay đổi từ màu cam nhạt, hồng nhạt đến đỏ cam. Kích thước khuẩn lạc tùy thuộc vào môi trường dinh dưỡng và thời gian phát triển khuẩn lạc. Quan sát dưới kính hiển vi không thấy có sự hình thành khuẩn ty, một số loài có sinh khuẩn ty giả trên môi trường PDA nhưng rất kém phát triển, hình thành nang bào tử trên môi trường acetate agar, nang bào tử hình cầu, mỗi túi bào tử gồm một đến hai nang. 1.2.2.2. Đặc điểm sinh sản Đa số các loài nấm men thuộc chủng Rhodosporidium sinh sản vô tính bằng hình thức nảy chồi: Đầu tiên, nhân tế bào mẹ bắt đầu kéo dài ra và sau đó co lại ở giữa, tế bào mẹ bắt đầu phát triển một chồi con, một phần nhân chuyển vào chồi con và một phần ở tế bào mẹ, nguyên sinh chất cũng chuyển sang chồi con, khi chồi con gần bằng chồi mẹ thì nó được tách ra và sống độc lập, đa số các vị trí nảy chồi không cố định trên tế bào mẹ (nảy chồi đa hướng). Đây là phương pháp sinh sản vô tính chủ yếu nhất ở nấm men, ngoài ra trong một số trường hợp vẫn phát hiện hình thức sinh sản hữu tính bằng cách tiếp hợp ở các chủng nấm men Rhodosporidium. Tốc độ sinh sản của Rhodosporidium khá nhanh, thời gian để đa số tế bào tăng lên gấp đôi thường từ 2 đến 6 giờ. Quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm men gồm 4 giai đoạn: 7 ➢ Giai đoạn tiềm sinh ➢ Giai đoạn phát triển hàm mũ ➢ Giai đoạn cân bằng ➢ Giai đoạn suy vong Thời gian sinh trưởng tốt nhất của Rhodosporidium trong khoảng 24 - 96 giờ tuỳ loài, tuỳ thuộc vào thành phần môi trường dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy. 1.2.2.3. Đặc điểm sinh hoá Chủng nấm men Rhodosporidium có các đặc điểm sinh hóa như sau: - Có khả năng sử dụng các nguồn cacbon khác nhau như glucose, sucrose, lactose, mannitol, galactose, maltose, arabinose, sorbitol, inositol, glycerol, tinh bột, acid lactic và acid citric. - Có khả năng đồng hóa các nguồn nitơ khác nhau như NaNO3, KNO3, NH4Cl và (NH4)2SO4. - Phát triển tốt ở nhiệt độ trong khoảng 25oC tới 30oC - Có chứa sắc tố carotenoid - Không tạo thành hợp chất loại tinh bột - Không tạo ra acid acetic - Khả năng sinh tổ hợp sắc tố carotenoid - Không hình thành bào tử và không sinh sản hữu tính - Có hoặc không đồng hóa NO3- Có chứa enzyme khử bão hòa (desaturase), đặc biệt có khả năng chuyển hóa acid oleic thành acid linolenic. 1.2.3. Con đường sinh tổng hợp carotenoid bởi nấm men Năm 1964, Simpson và cộng sự đã mô tả một con đường sinh tổng hợp có thể có để tổng hợp carotenoid. Sau đó, Goodwin (1980) đã sửa đổi các con đường chung để sinh tổng hợp carotenoid bởi nấm men và kết luận rằng con đường sinh tổng hợp carotenoid bao gồm ba giai đoạn: 8 Giai đoạn 1: Chu trình Mevalonate Biến đổi acetyl - CoA thành 3 - hydroxymethyl glutaryl - CoA (HMG-CoA) bởi HMG - CoA synthase. HMG - CoA chuyển đổi thành hợp chất C6, mevalonic acid (MVA), tiền chất đặc biệt đầu tiên của con đường sinh tổng hợp terpenoid. MVA trải qua một chuỗi các phản ứng phosphoryl hóa bởi enzyme MVA kinase đồng thời bị decarboxyl hóa để tạo thành isopentenyl pyrophosphate (IPP). Giai đoạn 2: Sinh tổng hợp isoprene IPP biến đổi đồng phân thành dimethylallyl pyrophosphate (DMAPP) bằng cách gắn liên tiếp 3 phân tử IPP tạo thành DMAPP. Các phản ứng này được xúc tác bởi prenyl transferase tạo thành hợp chất C20 geranyl geranyl pyrophotphate (GGPP). Sự trùng hợp 2 phân tử GGPP tạo ra phytoene (hợp chất C40 đầu tiên của quy trình). Cuối cùng của giai đoạn này, lycopene được hình thành. Giai đoạn 3: Chuỗi phản ứng carotenoidgenic 9