Tài liệu Khảo sát thành phần hóa học cây me rừng phyllanthus emblica linn. họ thầu dầu (euphorbiaceae)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA HÓA HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY ME RỪNG PHYLLANTHUS EMBLICA LINN. HỌ THẦU DẦU (EUPHORBIACEAE) Sinh viên thực hiện : Nguyễn Long Hải Mã số sinh viên : K38.201.027 Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Thị Ánh Tuyết THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH- THÁNG 5/ 2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA HÓA HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY ME RỪNG PHYLLANTHUS EMBLICA LINN. HỌ THẦU DẦU (EUPHORBIACEAE) Sinh viên thực hiện : Nguyễn Long Hải Mã số sinh viên : K38.201.027 Giảng viên hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Ánh Tuyết THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH- THÁNG 5/ 2016 LỜI CẢM ƠN Với tấm lòng trân trọng và biết ơn sâu sắc, tôi gửi lời cảm ơn chân thành đến Cô Nguyễn Thị Ánh Tuyết đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo cho tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận này. Các thầy/ cô khoa Hóa, đặc biệt là thầy/ cô bộ môn Hóa hữu cơ đã tận tình giảng dạy, chỉ bảo và tạo điều kiện để tôi hoàn thành khóa luận này. Thầy/ cô bộ môn Hóa Hữu cơ trường Đại Học Sư Phạm TP.HCM, đã nhận lời phản biện, đóng góp nhiều ý kiến giúp tôi hiểu rõ thêm về nội dung bài luận này. Các bạn sinh viên K38, Khoa Hóa ĐHSP TP.HCM đã cộng tác và giúp đỡ tôi thực hiện đề tài này. MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ DANH MỤC PHỤ LỤC PHỔ LỜI MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ............................................................................................... 2 1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT .............................................................................................. 2 1.1.1 Mô tả chung ............................................................................................................ 2 1.1.2 Vùng phân bố ......................................................................................................... 3 1.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ DƯỢC TÍNH ....................................................................... 3 1.2.1 Dược tính theo y học cổ truyền ............................................................................... 3 1.2.2 Nghiên cứu về dược tính ......................................................................................... 3 1.3 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC ................................................ 4 CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM......................................................................................... 13 2.1 HÓA CHẤT, THIẾT BỊ, PHƯƠNG PHÁP ............................................................ 13 2.1.1 Hoá chất ................................................................................................................ 13 2.1.2 Thiết bị .................................................................................................................. 13 2.1.3 Phương pháp tiến hành .......................................................................................... 13 2.1.3.1 Phương pháp phân lập các hợp chất ............................................................... 13 2.1.3.2 Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất .................................... 14 2.2 NGUYÊN LIỆU ...................................................................................................... 14 2.2.1 Thu hái nguyên liệu ............................................................................................... 14 2.2.2 Xử lý mẫu nguyên liệu .......................................................................................... 14 2.3 ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO ................................................................................. 14 2.3.1 Điều chế cao hexane và ethyl acetate của lá ......................................................... 14 2.3.2 Điều chế cao hexane và cao ethyl acetate của rễ .................................................. 16 2.4 CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT TRONG CAO ETHYL ACETATE CỦA LÁ ........... 16 2.4.1 Sắc kí cột silica gel trên cao ethyl acetate của lá .................................................. 17 2.4.2 Sắc kí cột sillica gel trên phân đoạn EA3 ............................................................. 17 2.4.3 Sắc kí cột sillica gel trên phân đoạn EA3.3 ......................................................... 18 2.5 CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ CÓ TRONG CAO HEXANE CỦA RỄ ........ 18 2.5.1 Sắc kí cột silica gel trên cao hexane ..................................................................... 18 2.5.2 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn RH6 của cao hexane của rễ ......................... 19 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................... 20 3.1 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT PEH1 ............................................................ 20 3.2 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT PEAC1 .......................................................... 23 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ....................................................................... 27 4.1 KẾT LUẬN ............................................................................................................. 27 4.2 ĐỀ XUẤT................................................................................................................ 28 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 29 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU NMR Nuclear magnetic reasonance spectroscopy COSY Homonuclear shift correlation spectroscopy HMBC Heteronuclear multiple bond correlation spectroscopy DEPT Distortionless enhancement by polarization transfer COSY Homonuclear shift correlation spectroscopy HSQC Heteronuclear single quantum correlation spectroscopy HMBC Heteronuclear multiple bond correlation spectroscopy HR-ESI-MS High resolution electrospray ionization mass spectrum J Coupling constant ppm Parts per million H Hexane EA Ethyl acetate Me Methanol DCM Dichloromethane Ac Acetone HSV Herpes simplex virus s Singlet d Doublet dd Doublet of doublets t Triplet m Multiplet DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Sắc kí cột silica gel trên cao ethyl acetate của lá 17 Bảng 2.2 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA3 của cao ethyl acetate của lá 17 Bảng 2.3 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA3.3 18 Bảng 2.4 Sắc kí cột silica gel trên cao hexane của rễ 19 Bảng 2.5 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn RH6 của cao hexane của rễ 19 Bảng 3.1 Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất PEH1 23 Bảng 3.2 Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất PEAC1 26 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ Trang Sơ đồ 2.1 Quy trình điều chế cao hexane và cao ethyl acetate của lá 15 Sơ đồ 2.2 Quy trình điều chế cao hexane và cao ethyl acetate của rễ 16 Hình 1.1 Cây me rừng Hình 3.1 Một số tương quan HMBC của hợp chất PEH1-a và PEH1-b 22 Hình 3.2 Một số tương quan COSY của hợp chất PEH1-a và PEH1-b 22 Hình 3.3 Một số tương quan COSY và HMBC của hợp chất PEAC1 25 2 DANH MỤC PHỤ LỤC PHỔ Phụ lục 1 Phổ 1H-NMR của hợp chất PEH1 Phụ lục 2 Phổ 13C-NMR của hợp chất PEH1 Phụ lục 3 Phổ COSY của hợp chất PEH1 Phụ lục 4 Phổ HSQC của hợp chất PEH1 Phụ lục 5 Phổ HMBC của hợp chất PEH1 Phụ lục 6a Phổ 1H-NMR của hợp chất PEAC1 Phụ lục 6b Phổ 1H-NMR của hợp chất PEAC1 Phụ lục 7a Phổ 13C-NMR của hợp chất PEAC1 Phụ lục 7b Phổ 13C-NMR của hợp chất PEAC1 Phụ lục 8a Phổ DEPT của hợp chất PEAC1 Phụ lục 8b Phổ DEPT của hợp chất PEAC1 Phụ lục 9 Phổ COSY của hợp chất PEAC1 Phụ lục 10 Phổ HSQC của hợp chất PEAC1 Phụ lục 11a Phổ HMBC của hợp chất PEAC1 Phụ lục 11b Phổ HMBC của hợp chất PEAC1 Phụ lục 12 Phổ HR-ESI-MS của hợp chất PEAC1 LỜI MỞ ĐẦU Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa đã tạo điều kiện cho sự phát triển thảm thực vật vô cùng phong phú. Con người đã khai thác nhiều tính năng của các loài cây phục vụ cho đời sống, sản xuất và sinh hoạt, nhất là dùng để chữa bệnh. Từ lâu, dân gian đã xuất hiện nhiều loại cây chữa bệnh gan, tiểu đường, thận,… Chi Phyllanthus là một chi lớn với khoảng 550 đến 750 loài [2], gồm từ những cây thân thảo đến cây bụi hay cây gỗ nhỏ như: Phyllanthus emblica L. (me rừng), Phyllanthus urinaria (chó đẻ răng cưa), Phyllanthus urinaria L. (cây diệp hạ châu ngọt), Phyllanthus reticulatus Poir. (cây phèn đen), Phyllanthus flexuosus (diệp hạ châu), Phyllanthus amarus (diệp hạ châu đắng),...những cây này được biết đến với tính năng chữa bệnh. Trong những năm gần đây, sự quan tâm đến chi này tăng lên đáng kể. Với nhịp điệu phát triển của hóa học và y học, các nhà khoa học không những nghiên cứu về đặc điểm thực vật mà còn về dược tính. Cây me rừng (Phyllanthus emblica L.) thuộc chi Phyllanthus được dùng nhiều trong y học cổ truyền để điều trị bệnh thận, nhiễm trùng đường ruột, tiểu đường, viêm gan B. Các nghiên cứu về thành phần hóa học của cây này trên thế giới đã được thực hiện, nhưng ở Việt Nam còn rất ít. Với mong muốn làm rõ thêm thành phần hóa học, từ đó hiểu thêm về tác dụng chữa bệnh của cây và đóng góp những khoa học có giá trị vào kho dược liệu của Y học dân tộc Việt Nam, chúng tôi tiến hành nghiên cứu hóa học trên cây me rừng được thu hái ở Bình Thuận. 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT Tên thường: cây me rừng Tên gọi khác: chùm ruột núi, dư cam tử, ngưu cam tử, du cam tử. Tên khoa học: Phyllanthus emblica L. Thuộc họ dầu (Euphorbiaceae) 1.1.1 Mô tả chung [1] Cây cao 3m, phân nhiều cành, cành nhỏ mềm, có lông, dài 20cm. Lá xếp thành hai dãy trên các cành nhỏ trông giống như một lá kép lông chim, cuống lá rất ngắn. Lá kèm rất nhỏ hình ba cạnh. Hoa nhỏ, đơn tính cùng gốc. Cụm hoa thành xim co mọc ở nách lá phái dưới của cành, với rất nhiều hoa đực và hoa cái. Hoa nở từ tháng 3 đến tháng 11 hằng năm. Quả hình cầu. Hạt hình ba cạnh, màu hồng nhạt. Hình 1.1 Cây me rừng 2 1.1.2 Vùng phân bố Cây me rừng phân bố rộng rãi ở vùng cận nhiệt đới và nhiệt đới châu Á như ở Trung Quốc, Ấn Độ, In-đô-nê-xi-a, bán đảo Mã Lai [17]. Ở nước ta, cây me rừng được trồng là loại cây mọc hoang trên các đồi trọc, xuất hiện nhiều tại các vùng rừng núi Việt Bắc và Tây Bắc [1]. 1.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ DƯỢC TÍNH Hầu hết các bộ phận đều được dùng làm thuốc như quả, lá, thân, rễ. 1.2.1 Dược tính theo y học cổ truyền Quả có vị chua, ngọt, đắng, tính mát, có tác dụng nhuận phế, hóa đờm, sinh tân.Rễ vị đắng, chát, tính mát, có tác dụng hạ áp. Tại Ấn Độ, cây me rừng là một trong những loài thảo dược được sử dụng phổ biến. Cây me rừng giàu vitamin C, có tác dụng bảo vệ, tăng hấp thụ thức ăn, tăng cường phổi, nhuận tràng, tốt cho da và tóc, chống oxi hóa, kháng viêm, chống ung thư da và gan. Một số bài thuốc cổ truyền Chữa cảm mạo, phát sốt, ho, đau cổ họng, miệng khô khát: mỗi ngày dùng 10-30 quả sắc uống. Chữa viêm ruột, đau bụng, cao huyết áp: ngày dùng 15-20g rễ sắc uống. Chữa lở loét, mẩn ngứa: dùng lá nấu nước rửa bên ngoài. Trị tiểu đường: quả me rừng 15-20g ướp muối và uống mỗi ngày. 1.2.2 Nghiên cứu về dược tính Quả có tác dụng chống oxi hóa, kháng khuẩn, sát trùng, kháng vi rút, kháng viêm [10]. 3 Hợp chất geraniin (52) có tác dụng chống oxi hóa rất tốt với IC 50 là 4,7 μM cho DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) và 65,7 μM cho quá trình oxi hóa chất béo. Các hợp chất khác như quercetin (48), kaempferol (49), quercetin 3-O-β-D-glucopyranoside (50), kaempferol 3-O-β-D-glucopyranoside (51), isocorilagin (53) cũng có tác dụng chống oxi hóa [13]. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của các hợp chất được cô lập từ quả me rừng cho thấy một số hợp chất có tác dụng gây độc tế bào ung thu vú như geraniin (52) và isocorilagin (53) với IC 50 lần lượt là 13,2 và 80,9 μg/ml, cùng với các hợp chất quercetin 3-O-β-D-glucopyranoside (50) (IC 50 15.5 μg/ml), kaempferol 3-O-β-Dglucopyranoside (51) (IC 50 31.2 μg/ml), quercetin (48) (IC 50 125 μg/ml), kaempferol (49) (IC 50 125 μg/ml). Ngoài ra, isocorilagin có khả năng gây độc tế bào ung thư phổi với IC 50 là 51,4 μg/ml [15]. Chiết xuất từ cây me rừng được Xiaoli Liu cùng các cộng sự nghiên cứu vào năm 2009 cho thấy có khả năng kháng khuẩn, chống lại các vi khuẩn Gram dương (S. aureus, B. cereus và B. subtilis), Gram âm (E. coli, P. aeruginosa, S. typhi) và nấm (C. abican, C. tropicalis và A. niger) [14]. Tác dụng kháng virus HSV-1 và HSV-2 của hợp chất 1,2,4,6-tetra-O-galloyl-β-Dglucose (54) được cô lập từ cây me rừng cũng được thử nghiệm. Kết quả cho thấy hợp chất này có khả năng ức chế sự phát triển của HSV với IC 50 là 31,7 μM [16]. Dịch chiết ethanol của cây me rừng có tác dụng hạ men gan và phục hồi gan bị tổn thương do ethanol khi thử nghiệm trên chuột với liều lượng 75 mg/kg/ngày [9]. Dịch chiết từ cành me rừng có tác dụng cải thiện nồng độ tinh dịch của chuột đực đã được tiêm valproic acid (một loại thuốc trị bệnh động kinh nhưng có tác dụng phụ ảnh hưởng đến khả năng sinh sản của nam giới) [6]. 1.3 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC Các nghiên cứu về thành phần hóa học của Phyllanthus emblica L. được trình bày như sau. 4 Các nghiên cứu trước 1998 cho thấy cây me rừng có chứa các hợp chất như zeatin (1), zeatin nucleotide (2), zeatin riboside (3), chebulic acid (4), chebulinic acid (5), corilagin (6), 3,6-di-O-galloyl-β-D-glucose (7), gallic acid (8), ethyl gallate (9), glucosegallin (10), ellagic acid (11), giberellin (A1, A3, A4, A7, A9) (12-16), leucodelphinidin (17), rutin (18) và β-sitosterol (19) [2]. NH OH N N OH N N N N NH N H HO N O HO P O OH (1) N N N H OH (2) O O OHOH HO OH RO OR O N N (3) OR OR HO O HO O O O O O OH O HO O HO O HOOC O COOH OH HOOC COOH (4) O O OH OH R=Galloyl (5) HO OH HO OH HO OH R=Galloyl (6) 5 O OR O OR O HO RO OH HO OH R2 (8) R=H (9) R=C2H5 O OH O H HO O O HO HO OH OH R=Galloyl (7) O O OH HO OH OR OH R=Galloyl (10) HO O O (11) OH O H OH OH O H HO H R1 OH O OH R (13) R=OH (15) R=H (12) R1=R2=OH (14) R1=H, R2=OH (16) R1=R2=H OH OH OH (17) OH HO O OH H H OR OH O H HO R=Rha-glu (18) H H (19) Năm 2000, Ying-Jun Zhang và các cộng sự đã cô lập được các hợp chất phyllaemblic acid (20) và dẫn xuất (21-23) từ rễ của cây me rừng [17]. O R3O O OR2 O O O O (20) R1=R2=R3=H (21) R1=CH3, R2=R3=H (22) R1=CH3, R2=CH3CO, R3=H (23) R1=CH3, R2=R3=CH3CO OR1 Năm 2001, Ying-Jun Zhang cùng các cộng sự đã cô lập được 6 hợp chất phenolic mới là L-malic acid 2-O-gallate (24), mucic acid 2-O-gallate (28), 2-O-galloyl mucic acid 6 1,4-lactone (29), 5-O-galloyl mucic acid 1,4-lactone (31), 3-O-galloyl mucic acid 1,4lactone (33), và 3,5-di-O-galloyl mucic acid 1,4-lactone (34) cùng với các dẫn xuất methyl ester của những hợp chất này (25-27, 30, 32) [18] và các hợp chất phyllanemblinin A-F (35-40) từ cây me rừng [19]. OR H H OH HOOC COOH H RO R1OOC H OH OH H R=Galloyl (25) R1=R2=CH3 (26) R1=H, R2=CH3 (27) R1=CH3, R2=H (28) R1=R2=H R=Galloyl (24) H OR3 OR4 O O RO H O R1O HO R1O COOR2 O OR2 (29) R1=Galloyl, R2=R3=R4=H (30) R1=Galloyl, R2=R3=H, R4=CH3 (33) R1=R3=R4=H, R2=Galloyl (34) R1=R4=H, R2=R3=Galloyl O H HO OH R=Galloyl (31) R1=H (32) R1=CH3 OH HO HO OH HO HO OH O HO HO OR O O O O O O R=Galloyl (35) O O HOOC HO OH O H OH OH O O O HO HO O O HO O OR O OR O O O OH O HO H R=Galloyl (36) OH HO OH O COOH OH R=Galloyl (37) 7 OR4 O R3O R2O OR1 OH (38) R1=Galloyl, R2=neoche, R3=R4=H (39) R1=Galloyl, R2=H, R3=neoche, R4=H (40) R1=Galloyl, R2=R3=H, R4=neoche Năm 2007, Chun-Bin Yang cùng các cộng sự đã cô lập được hợp chất ellagitanin mới là phyllanthunin (41), cùng 8 hợp chất khác đã biết như: gallic acid (8), ethyl gallate (9), ellagic acid (11), β-sitosterol (19), daucosterol (42), stearic acid (43), lauric acid (44), cinnamic acid (45) [3]. OH OR OH O O O OH O O O O H HO HO O HO OH OH O OH H OH R=Galloyl (41) HO HO O OH H O (42) O R COOH OH (43) R=n-C17H35 (44) R=n-C11H23 (45) Năm 2008, S. K. El-Desouky và cộng sự đã cô lập được hợp chất mới là apigenin-7O-(6”-butyryl-β-glucopyranoside) (46) và các hợp chất khác như gallic acid (8), 1,2,3,4,6-penta-O-galloylglucose (47) [8]. Xiaoli Liu và các cộng sự đã cô lập thêm 6 hợp chất từ quả me rừng: quercetin (48), kaempferol (49), quercetin-3-O-β-D-glucopyranoside (50), kaempferol 3-O-β-D-glucopyranoside (51), geraniin (52), isocorilagin (53) [13]. 8 O O OH O HO HO OR O O RO RO OH O OR OR R=Galloyl (47) OH O (46) R OH OH HO OH HO O HO OH O OH O OH OH OH (50) R=OH (51) R=H (49) OH HO O HO OH (48) HO O O OH OH O O OH OH HO OH O OR O O O HO O O O HO O O O O HO HO H O OH R=Galloyl (52) OR OH OH HO O HO OH O HO O O HO HO R=Galloyl (53) Năm 2011, Yangfei Xiang cùng các cộng sự đã cô lập được 1,2,4,6-tetra-O- galloylβ-D-glucose (54) từ lá và cành của cây me rừng [16]. 9 RO O RO HO OR OR R=Galloyl (54) Năm 2012, Wei Lou và các cộng sự đã cô lập được từ vỏ của trái me rừng các hợp chất chebulagic acid (55), chebulanin (56), isomallotusinin (57), và isocorilagin (53) [11]. Mahbuba Khatun và các cộng sự đã cô lập được β-sitosterol-3-O-β-D-glucoside (58) từ cây me rừng [5]. OH HO HO HO O O OR O O O O OH O O HO O O HOOC OR OH O OH O O O O O O O O HO O OH OH OH R=Galloyl (56) R=Galloyl (55) O OR O O HO O OH O HO O HOOC OH HO OH O OH HO HO OH HO O OH R=Galloyl (57) OH HO HO H O OH (58) Năm 2013, Wei-Yan Qi và cộng sự đã cô lập được các hợp chất sterol (59-70), từ cành và lá của cây me rừng, trong đó có 2 hợp chất sterol mới là trihydroxysitosterol (60) và 5α,6β,7α-acetoxysitosterol (61) [12]. 10