Tài liệu Khảo sát thành phần hóa học cây cành giao euphorbia tirucalli l. thu hái ở tỉnh bình thuận

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA HÓA HỌC BỘ MÔN HÓA HỌC HỮU CƠ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY CÀNH GIAO EUPHORBIA TIRUCALLI L. THU HÁI Ở TỈNH BÌNH THUẬN GVHD : TS. Bùi Xuân Hào ThS. Dương Thúc Huy SVTH : Lê Thị Kim Dung Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2016 TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA HÓA HỌC BỘ MÔN HÓA HỌC HỮU CƠ --- --- KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY CÀNH GIAO EUPHORBIA TIRUCALLI L. THU HÁI Ở TỈNH BÌNH THUẬN GVHD : TS. Bùi Xuân Hào ThS. Dương Thúc Huy SVTH : Lê Thị Kim Dung MSSV : K38.201.015 Tp. Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2015 NHẬN XÉT CỦA HỘI ĐỒNG ................................................................................................................................................................. ................................................................................................................................................................. ................................................................................................................................................................. ................................................................................................................................................................. ................................................................................................................................................................. ................................................................................................................................................................. ................................................................................................................................................................. ................................................................................................................................................................. ................................................................................................................................................................. ................................................................................................................................................................. ................................................................................................................................................................. ................................................................................................................................................................. ................................................................................................................................................................. ................................................................................................................................................................. ................................................................................................................................................................. ................................................................................................................................................................. ................................................................................................................................................................. ................................................................................................................................................................. ................................................................................................................................................................. ................................................................................................................................................................. ................................................................................................................................................................. ................................................................................................................................................................. ................................................................................................................................................................. ................................................................................................................................................................. LỜI CẢM ƠN Bằng tất cả sự trân trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành gửi lời cảm ơn Thầy Bùi Xuân Hào và thầy Dương Thúc Huy đã theo sát, nhiệt tình giảng dạy, hướng dẫn, quan tâm, giúp đỡ và động viên em trong quá trình làm khóa luận tốt nghiệp. Tất cả quý thầy cô Khoa Hóa, đặc biệt quý thầy cô Bộ môn Hóa hữu cơ đã tận tình dạy dỗ, truyền thụ cho em nhiều kiến thức khoa học quý báu trong suốt bốn năm qua. Các bạn trong phòng thí nghiệm đã giúp đỡ, chia sẻ những vui buồn trong quá trình làm khóa luận. Ba, Mẹ và những người thân trong gia đình là chỗ dựa tinh thần vững chắc nhất giúp em vượt qua mọi khó khăn, tạo mọi điều kiện tốt nhất để em hoàn thành tốt khóa luận này. -i- MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................................ i MỤC LỤC ............................................................................................................................. ii DANH MỤC CÁC CHỮ KÍ HIỆU VÀ VIẾT TẮT ......................................................... iv DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, BẢNG BIỂU.................................................... v DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC ............................................................................................ vi LỜI MỞ ĐẦU .................................................................................................................. - 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................................... - 2 1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CÂY CÀNH GIAO[1] ................................................... - 2 - 1.1.1. Mô tả chung[1] ............................................................................................... - 2 - 1.1.2 Vùng phân bố ................................................................................................... - 2 1.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ DƯỢC TÍNH ................................................................ - 3 - 1.2.1 Dược tính theo y học cổ truyền ........................................................................ - 3 1.2.2 Nghiên cứu về dược tính .................................................................................. - 4 1.2.3 Độc tính ............................................................................................................ - 4 1.2.4 Ứng dụng khác ................................................................................................. - 4 1.3 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HOÁ HỌC ......................................... - 5 - CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM .................................................................................... - 10 2.1. HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ ......................................................................................- 10 - 2.1.1. Hoá chất ...................................................................................................... - 10 - 2.1.2. Thiết bị ........................................................................................................ - 10 - 2.2. NGUYÊN LIỆU ..................................................................................................- 10 - 2.2.1. Thu hái nguyên liệu..................................................................................... - 10 - 2.2.2. Xử lý mẫu nguyên liệu ................................................................................ - 11 - 2.3. ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO .............................................................................- 11 -ii- 2.4 CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG CAO ETHYL ACETATE ........ - 11 - 2.4.1 Sắc kí cột silica gel trên cao ethyl acetate ...................................................... - 11 2.4.2 Sắc kí cột sillica gel trên phân đoạn HA.1.6 .................................................. - 12 2.4.3 Sắc kí cột sillica gel trên phân đoạn HA.1.6.12 ............................................. - 12 2.4.4 Sắc kí cột sillica gel trên phân đoạn HA.2.4 .................................................. - 12 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ - THẢO LUẬN .................................................................... - 14 3.1 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT G.B1 ....................................................... - 14 - 3.2 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT G.C2 ....................................................... - 17 - CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN – ĐỀ XUẤT ....................................................................... - 19 4.1. KẾT LUẬN .........................................................................................................- 19 - 4.2 ĐỀ XUẤT ...........................................................................................................- 19 - TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................ - 20 PHỤ LỤC -iii- DANH MỤC CÁC CHỮ KÍ HIỆU VÀ VIẾT TẮT Ký hiệu, Tiếng Anh Tiếng Việt chữ viết tắt Proton (1) Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của Resonance proton (1) Carbon (13) Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của Resonance carbon (13) AcOH Acetic acid Axit axetic C Chloroform Cloroform Bu Butanol Butanol d Doublet Mũi đôi dd Doublet of doublets Mũi đôi đôi ddd Doublet of doublet of doublets Mũi đôi đôi đôi EA Ethyl Acetate Etyl axetat Et Ethanol Etanol H n-Hexane n-Hexan HMBC Heteronuclear Multiple Bond Phổ tương tác dị hạt nhân qua Coherence nhiều liên kết Me Methanol Metanol ppm Par per million Một phần một triệu s Singlet Mũi đơn 1 H-NMR 13 C-NMR SKC Sắc ký cột SKLM Sắc ký lớp mỏng UV Ultra Violet Tia cực tím W Water Nước -iv- DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, BẢNG BIỂU  HÌNH ẢNH Hình 1.1. Cây cành giao ......................................................................................... 2 Hình 1.2. Các hợp chất cô lập được từ E.tirucalli ................................................. 7 Hình 3.1. Cấu trúc vòng A của hợp chất G.B1 .................................................... 15 Hình 3.2. Cấu dạng và tương quan HMBC của G.B1 .......................................... 15 Hình 3.3. Công thức cấu tạo và tương quan HMBC của G.C2............................ 18 Hình 4.1. Hai hợp chất cô lập được từ cao ethyl acetate ...................................... 19  SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1. Quá trình ly trích và cô lập từ cây cành giao ....................................... 13  BẢNG BIỂU Bảng 1.1. Hoạt tính trên nhựa cây và cao chiết của cây ......................................... 4 Bảng 1.2. Đa dạng hóa học trên các bộ phận của cây ............................................ 6 Bảng 2.1. Kết quả sắc ký cột cao ethyl acetate ..................................................... 11 Bảng 3.1. Dữ liệu phổ của hợp chất G.B1 ............................................................ 16 Bảng 3.2. Dữ liệu phổ của hợp chất G.C2............................................................ 18 -v- DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC Phụ lục 1. Phổ 1H-NMR của hợp chất G.B1 Phụ lục 2. Phổ 13C-NMR của hợp chất G.B1 Phụ lục 3. Phổ 13C-NMR giãn rộng của hợp chất G.B1 Phụ lục 4. Phổ HMBC của hợp chất G.B1 Phụ lục 5. Phổ 1H-NMR của hợp chất G.C2 Phụ lục 6. Phổ 13C-NMR của hợp chất G.C2 Phụ lục 7. Phổ HMBC của hợp chất G.C2 -vi- LỜI MỞ ĐẦU Việt Nam là một nước nhiệt đới có nhiều điều kiện thuận lợi cho các loài thực vật có giá trị phát triển. Từ xa xưa, con người đã biết sử dụng cây cỏ để làm thuốc chữa bệnh, từ đó tìm ra được nhiều phương thuốc có thể chữa được một số bệnh nan y như ung thư, sốt rét… Ngày nay, ngành hóa học các hợp chất tự nhiên kết hợp với ngành y dược học, sinh học không ngừng nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các dược thảo có trong các phương thuốc cổ truyền để ứng dụng vào việc chữa bệnh. Tuy nhiên nhiều cây thuốc chỉ được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian, chưa được nghiên cứu một cách có hệ thống, trong đó có cây cành giao. Cây cành giao mọc hoang tại nhiều vùng ở Việt Nam. Tuy nằm trong từ điển cây thuốc Nam nhưng hiện nay chưa có nghiên cứu hóa sinh học về cây cành giao được thực hiện. Những nghiên cứu đi trước về Euphorbia tirucalli L. cho thấy cây cành giao là loại cây có nhiều tiềm năng. Xuất phát từ những ứng dụng y học quý giá, chúng tôi tiến hành khảo sát thành phần hóa học của cây cành giao với mong muốn tìm ra những hợp chất có hoạt tính sinh học góp phần nâng cao giá trị của các dược thảo Việt Nam. -1- Khóa luận tốt nghiệp Lê Thị Kim Dung CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CÂY CÀNH GIAO[1] Tên thông thường: Cành giao Tên gọi khác: lục ngọc thụ, xương khô, bút chì, thanh san hô, san hô xanh, nọc rắn. Thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae). Tên khoa học: Euphorbia tirucalli L. Hình 1.1 Cây cành giao 1.1.1. Mô tả chung[1] Cây cành giao có thể cao 4-7 m, thân có thể có đường kính bằng cổ tay, cành nhiều, mọc so le hay hơi vòng, màu xanh, gầy. Lá nhỏ, hình mác hẹp, hơi dày, rất chóng rụng, phiến lá dài 12-16 mm, rộng 2 mm. Hoa tập trung ở những chỗ phân nhánh hoặc tận cùng ở đầu cành. Quả nang, hơi có lông, có 3 mảnh vỏ. Hạt hình trái xoan, nhẵn. 1.1.2 Vùng phân bố Cành giao có nguồn gốc ở đảo Mangat (châu Phi). Phát hiện thấy ở Việt Nam từ năm 1970.[1] Cây cành giao có mặt ở hầu hết các châu lục, đặc biệt các vùng có khí hậu nhiệt đới hoặc khô như châu Phi, châu Á và Nam Mỹ. Cây cành giao được xác định bởi Linnaeus vào năm 1973.[7] -2- Khóa luận tốt nghiệp Lê Thị Kim Dung 1.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ DƯỢC TÍNH 1.2.1 Dược tính theo y học cổ truyền Toàn cây cành giao có vị cay, hơi chua, tính mát, hơi có độc, có tác dụng thúc sữa, sát trùng, khử phong, tiêu viêm, giải độc. Dân gian thường dùng cành giao để trị đau nhức, côn trùng đốt, chấn thương… Theo Schmelzer, Gurib-Fakim (2008) và Van Damme (1989) thì ở Đông Phi, mủ của cành giao được sử dụng để chống liệt dương, mụn cóc, động kinh, đau răng, trĩ, rắn cắn. Ở Malaysia, rễ hoặc thân cành giao được dùng để chữa trị loét mũi, trĩ và các chỗ sưng. Các mảnh rễ trộn với dầu dừa chữa đau dạ dày. Ở Ấn Độ, Kumar (1999) ghi lại rằng cành giao là loại cây không thể thiếu trong vườn nhà và được sử dụng như là một phương thuốc cho các bệnh như: phì lá lách, hen suyễn, bệnh phù, bệnh phong, huyết trắng, khó tiêu, vàng da, đau bụng, các khối u, sỏi bàng quang. Duke (1983) và Van Damme (1989) đề cập rằng tại Brazil, cành giao được sử dụng chống lại bệnh ung thư, u dạng ung thư, ung thư biểu mô, bướu thịt, các khối u và mụn cóc mặc dù vẫn còn tranh cãi về cơ sở khoa học về hợp chất chống ung thư của cây. Ở Malabar (Ấn Độ) và Moluccas, mủ được sử dụng như thuốc gây nôn và trị giang mai. Ở Indonesia, dịch của rễ được sử dụng trị đau nhức xương trong khi thuốc đắp của rễ hoặc lá cây được sử dụng điều trị loét mũi, trĩ. Nước sắc từ thân cây để chữa bệnh phong và tê liệt tay chân sau khi sinh con (Duke, 1983). Ở Java, mủ được sử dụng để chữa trị các bệnh về da và gãy xương.[15] Một số bài thuốc theo y học cổ truyền: Chữa viêm xoang, viêm mũi dị ứng: dùng khoảng 15 đốt cành cây cành giao, cắt nhỏ từng đoạn 5 mm, cho vào túi nilon đập nát rồi cho vào ấm có vòi với lượng nước vừa đủ, đun sôi, dùng giấy cuộn thành ống lắp vào đầu vòi, cho vào mũi để hít hơi nước, hơi thuốc vào mũi, thỉnh thoảng hít cả vào miệng. Thời gian xông 10-15 phút. Xông liên tục 35 ngày, bệnh nặng có thể xông 7-10 ngày. Cần chú ý không dùng cho phụ nữ có thai.[22] Chữa côn trùng, ong đốt, rắn cắn, bò cạp đốt…: dùng cành cây cành giao giã nhỏ, đắp lên vết thương.[22] Chữa mụn cơm: dùng nhựa mủ cây cành giao đắp lên mụn cơm.[22] -3- Khóa luận tốt nghiệp Lê Thị Kim Dung 1.2.2 Nghiên cứu về dược tính Cao chiết các bộ phận của cây được thử nghiệm các loại hoạt tính sinh học và dược học, được mô tả trong bảng 1.1 Bảng 1.1 Hoạt tính trên nhựa cây và cao chiết của cây Hoạt tính Kháng virus Nguồn Nhựa cây Kháng ung thư và điều trị AIDS Kháng viêm Miễn dịch Cao chiết cây Nhựa cây Cao chiết cây Kháng khuẩn Kháng oxi hóa và chức năng bảo vệ gan Chất diệt côn trùng và sinh vật gây hại: Brevicoryne brassicae Aedes aegypti và Culex quinquefasciatus Biomphalaria gabrata Lymneae natalensis Cao chiết cây Cao chiết cây Nhựa cây Tài liệu trích dẫn Ramesh 2009[16] Avelar 2011[2] Betancur-Galvis 2002[3] Dias 2006[4] Santana 2014[17] Valadares 2006[19] Lirio 1998[11] Jyothi 2008[9] Mwine J., Van Damme 2011[15] 1.2.3 Độc tính Các loài Euphorbia đều chứa nhựa nhưng nhựa cây cành giao được xem độc nhất. Cây cành giao có nhiều diterpenoid loại phorbol gây độc tuy không gây chết người nhưng làm tổn thương nặng da và mắt. Nhựa của cây cành giao có thể làm phồng da và xung huyết da, gây nôn mửa với liều lớn nhưng nó lại là thuốc tẩy với liều nhỏ và chữa trị đau răng, đau tai, thấp khớp, mụn cóc, ho, thần kinh và bọ cạp cắn.[5][6] 1.2.4 Ứng dụng khác Nguồn năng lượng thay thế: Nhựa cây chứa hàm lượng lớn triterpenoid có 30 carbon có thể thực hiện cắt mạch để cho xăng có chỉ số octane cao.[15] Nguồn cao su: Nhựa cây chứa nhiều terpene và resin có thể chuyển hóa thành cao su với giá thành thấp. Trong suốt chiến tranh thế giới thứ II, nhựa cây được sử dụng ở Nam Phi.[15] -4- Khóa luận tốt nghiệp Lê Thị Kim Dung Nông lâm nghiệp: Với đặc tính chống hạn cây được sử dụng ở các vùng đất bán hạn hán để bảo vệ đất.[15] 1.3 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HOÁ HỌC Euphorbia tirucalli có chứa chất nhựa màu trắng như sữa trong toàn cây khi cắt ngang. Nhựa cây có thể chiếm tới 28% trọng lượng khô, trong đó gồm 21-27% các hợp chất tan trong nước, 59-63% resin và 12-14% các hợp chất như cao su.[15] Cho đến nay, số lượng nghiên cứu về thành phần hóa học của Euphorbia tirucalli L. tương đối ít và thành phần hóa học chính chủ yếu là các hợp chất phytosterol, tritepene, diterpene, polyphenol…(Uchida Hidenobu Y.H. và cộng sự, 2009; Lin S.-J. và cộng sự, 2001; Yoshida T. và cộng sự, 1991).[11][18][21] Nhựa của Euphorbia tirucalli L. cũng được nghiên cứu riêng cho thấy thành phần chính gồm các diterpene thuộc khung sườn ingenane và tigliane (Fuerstenberger G. và cộng sự, 1985; Fuerstenberger G., 1977).[5][6] Năm 1977, Fuerstenberger G. và Hecker E. cô lập được 4 hợp chất mới từ mủ của cây Euphorbia tirucalli. Đó là các hợp chất 12,13,20-tri-O-acetylphorbol (1), phorbol (2), 3,5,20-tri-O-acetylingenol (3) và ingenol (4).[5] Năm 2001, Lin S.-J. đã cô lập được 14 hợp chất, đó là 3,3',4-tri-O-methyl-4-Orutinosyl ellagic acid (22), gallic acid (23), 1-O-galloyl-β-D-glucoside (24), 1,2,3-tri-Ogalloyl-β-D-glucoside (25), corilagin (26), pedunculagin (27), casuariin (28), quercitrin (29), putranjivain B (30), putranjivain A (31), 2,3-(S)-hexahydroxydiphenoyl-Dglucopyranoside (32) và 5-desgalloylstarchyurin (33).[10] -5- Khóa luận tốt nghiệp Lê Thị Kim Dung Bảng 1.2 Đa dạng hóa học trên các bộ phận của cây [15] Hợp chất hóa học 4-Deoxyphorbol di-ester (5) Nguồn (bộ phận) Nhựa cây Tài liệu trích dẫn Kinghorn 1979 Campesterol (7), stigmasterol (8), β-sitosterol (9), isofucosterol (10), cycloartenol (11) (sterol) Cycloeuphordenol (12) (triterpene) Toàn cây Uchida và cộng sự 2010 Nhựa cây Khan 2010 Cyclotirucanenol (13) (triterpene) Nhựa cây Khan và Ahmed 1988 Diterpene ester Nhựa cây Khan và Malik 1990 Euphol (14) và β-amyrin (15) (triterpenoid) Toàn cây Uchida và cộng sự 2010 Euphorbin A (polyphenol) Thân cây Yoshida và Yokoyama 1991 Euphorcinol (16) (pentacyclic triterpene) Vỏ thân cây Khan 1989 Euphorbol (17) Nhựa cây Furstenberger và Hecker 1977 Serine protease Nhựa cây Lynn và Clevett 1985 Steroid Nhựa cây Nielson và cộng sự 1979 Taraxerane triterpene (18) Vỏ thân cây Rasool 1989 Tirucalicine (6) (diterpene) Nhựa cây Khan 2010 Tirucallin A (19) (tannin) Thân cây Yoshida và Yokoyama 1991 Tirucallin B (20) và euphorbin F (21) (dimer) Thân cây Yoshida và Yokoyama 1991 Trimethylellagic acid Nhựa cây Chatterjee và cộng sự 1977 -6- Khóa luận tốt nghiệp Lê Thị Kim Dung HO H OAc HO H HH O H OH OAc OH O HH O HO HO HO HO HO CH2OH Phorbol (2) OAc 12,13,20-tri-O-acetylphorbol (1) 3,5,20-tri-O-acetylingenol (3) O HO H H H OH AcO O HH O Ingenol (4) OAc MeO CH2OH 4-Deoxyphorbol (5) CH2OAc OAc H H AcO HO AcO CH2OH OH H O H H Tirucalicine (6) H H H H H H H H H H H H HO HO HO b -Sitosterol (9) Stigmasterol (8) Campesterol (7) H H H H H H H H H HO HO HO �Isof ucosterol (10) Cycloeuphordenol (12) Cycloartenol (11) H H H H H H HO Cyclotirucanenol (13) HO HO H H b -Amyrin (15) Euphol (14) Hình 1.2 Các hợp chất cô lập từ E. tirucalli -7- Khóa luận tốt nghiệp Lê Thị Kim Dung H H H H HO OH Euphorcinol (16) OH HO HO H Taraxerane (18) H Euphorbol (17) OH OH OH OH HO O OH O OO O O O O O OH O O O HO OH HO OH O O O OH OH OH O OH O O O O O O O OH OH O OH OH H O O OH OH OH HO OH OH Tirucallin A (19) HO O O OH O O H HO OH HO OH HO OH O OHHO HO O O O OH O HO H H H H HO HO OH OH Tirucallin B (20) O O HO O O HO O O O O O OH O OH OHHO O HO OH HO OH OH HO OH HO HO O O OH HO HO H OH OH b O O O O CO CO OH O HO Euphorbin F (21) MeO OH O CO OH H O MeO O OH OO O OH O OMe O OH OH OH O O OH OH OH O a O OH O CO HO O HO OH OH 3,3',4-tri-O-methyl-4'-O-rutinosyl ellagic acid (22) Hình 1.2 Các hợp chất cô lập từ E. tirucalli (tiếp) -8- Khóa luận tốt nghiệp COOH HO Lê Thị Kim Dung HO HO HO O OH OH OH O OH O HO O galloyl O O a o g ll yl galloyl O galloyl 1-O-galloyl-β - D-glucoside (24) Gallic acid (23) OH O O OH galloyl = OH 1,2,3-tri-O-galloyl-β - D-glucoside (25) HO OH OH HO OH HO HO OH CO HO OCH2 HO COO O CO HO O OH OH Casuariin (28) OH HO O O OH HO O OH OH CO O CH2 O H HO H OH O OH O OH OO HO OH HO OH OH H HO O O HO O O O H O O HO HO O CO O CO OOC OH CO OH O O HO Putranjivain B (30) OH Putranjivain A (31) OH CH2OH O O HO OH HO OH HO OH HO OH OH O C OH O CO OH OH OH O HO HO OH HO Quercitrin (29) OC OH HO O HO HO O OH HO O O HO OH O HO OH OH O O OH HO OH OH OH O HO OH OH HO Pedunculagin (27) HO HO OH O O H CO HO O O H H O HO OH HO O O C HO HO C O HO 2,3-(S )-hexahydroxydiphenoyl-D-glucopyranoside (32) OH H C O O H O H O H OH O CH2 5-desgalloylstarchyurin (33) Hình 1.2 Các hợp chất cô lập từ E. tirucalli (tiếp) -9- OH H OH Khóa luận tốt nghiệp Lê Thị Kim Dung CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM 2.1. HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ 2.1.1. Hoá chất  Silica gel 0.04-0.06 mm, Himedia dùng cho cột sắc kí.  Sắc kí bảng mỏng loại Kieselgel 60F 254 (20×20), Merck.  Dung môi dùng cho quá trình thí nghiệm gồm: n-hexane, ethyl acetate, acetic acid, chloroform, acetone, methanol, ethanol, butanol và nước cất.  Thuốc thử hiện hình các vết chất hữu cơ trên bản mỏng: sử dụng vanillin/H 2 SO 4 . 2.1.2. Thiết bị  Các thiết bị dùng để giải ly, dụng cụ chứa mẫu.  Các cột sắc kí.  Máy cô quay chân không.  Bếp cách thuỷ.  Đèn soi UV bước sóng 254 nm và 365 nm.  Cân điện tử.  Các thiết bị ghi phổ 1H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125 MHz) và HMBC trên máy Bruker, tại phòng Phân tích Trung tâm trường Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh, số 227, Nguyễn Văn Cừ, Quận 5, thành phố Hồ Chí Minh. 2.2. NGUYÊN LIỆU 2.2.1. Thu hái nguyên liệu Mẫu được dùng trong nghiên cứu khoá luận là thân cây cành giao Euphorbia tirucalli L. được thu hái tại huyện Hàm Thuận Bắc, tỉnh Bình Thuận vào tháng 3 năm 2015. - 10 - Khóa luận tốt nghiệp Lê Thị Kim Dung 2.2.2. Xử lý mẫu nguyên liệu Mẫu nguyên liệu được rửa sạch, loại bỏ phần sâu bệnh, phơi khô rồi xay thành bột mịn. Sau đó tiến hành đun hoàn lưu với ethanol và phân lập các hợp chất. 2.3. ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO Bột cây 3.5 kg được trích kiệt với ethanol mỗi lần 10 lít và lặp lại hai lần theo phương pháp đun hoàn lưu trong vòng 7 giờ, lọc, cô quay thu hồi dung môi. Trong quá trình cô quay thu hồi dung môi, thấy kết tủa xuất hiện, lọc riêng phần tủa ethanol thô (250.4 g) và phần dịch ethanol thô Et1 (290.3 g). Tiếp tục hòa phần tủa ethanol thô với ethanol đun nóng, thu được phần dịch Et2 (101.2 g) và phần tủa còn lại (149.2 g). Cao ethanol Et1, Et2 được chiết lỏng-lỏng lần lượt với các dung môi n-hexane, ethyl acetate và butanol thu được các cao tương ứng như minh họa trong sơ đồ 2.1. 2.4 CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG CAO ETHYL ACETATE 2.4.1 Sắc kí cột silica gel trên cao ethyl acetate Sắc ký cột cao ethyl acetate - EA1, EA2 trên silica gel pha thường sử dụng hệ dung hexane: ethyl acetate với độ phân cực tăng dần từ 50% đến 100% ethyl acetate. Dịch giải ly qua cột được hứng vào các lọ. Theo dõi quá trình giải ly bằng sắc kí lớp mỏng (SKLM). Những lọ cho kết quả SKLM giống nhau được gộp chung thành một phân đoạn. Bảng 2.1 Kết quả sắc ký cột cao ethyl acetate Tên Phân Sắc kí lớp mỏng Ghi chú đoạn EA1 EA2 EA1 EA2 EA1 EA2 1 HA.1.1 (1.58 g) HA.2.1 (0.37 g) Nhiều vết Vệt dài Chưa khảo sát Chưa khảo sát 2 HA.1.2 (2.76 g) HA.2.2 (3.14 g) Vệt dài Nhiều vết Chưa khảo sát Đã khảo sát 3 HA.1.3 (1.15 g) HA.2.3 (2.12 g) Nhiều vết Nhiều vết Chưa khảo sát Chưa khảo sát 4 HA.1.4 (2.48 g) HA.2.4 (4.21 g) Nhiều vết Nhiều vết Chưa khảo sát Đã khảo sát 5 HA.1.5 (2.35 g) HA.2.5 (2.69 g) Vệt dài Nhiều vết Chưa khảo sát Chưa khảo sát 6 HA.1.6 (2.50 g) HA.2.6 (3.15 g) Nhiều vết Nhiều vết Đã khảo sát Chưa khảo sát 7 HA.1.7 (1.95 g) HA.2.7 (1.84 g) Nhiều vết Nhiều vết Đã khảo sát Chưa khảo sát 8 HA.1.8 (0.24 g) HA.2.8 (0.89 g) Nhiều vết Vệt dài Đã khảo sát Chưa khảo sát - 11 -