Tài liệu Khảo sát sự phân bố của một số nhóm xạ khuẩn phân giải xenluloza phân lập từ đất xuân hòa

Khãa luËn tèt nghiÖp §µo ThÞ Lan LỜI CẢM ƠN Là một sinh viên khoa Sinh – KTNN cũng như bao sinh viên khác, với mong muốn được nghiên cứu một đề tài khoa học. Dưới sự hướng dẫn của Th.S Nguyễn Khắc Thanh, TS. Đinh Thị Kim Nhung, em đã hoàn thành khoá luận tốt nghiệp. Thầy và cô đã dành cho em sự chỉ bảo thường xuyên, quý báu và đầy hiệu quả. Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới thầy cô. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 5 năm 2007 Sinh viên Đào Thị Lan 1 Tr­êng §H S­ Ph¹m Hµ Néi 2 K29A- Sinh Khãa luËn tèt nghiÖp §µo ThÞ Lan LỜI CAM ĐOAN Khoá luận tốt nghiệp này được hoàn thành dưới sự hướng dẫn tận tình của ThS. Nguyễn Khắc Thanh. Em xin cam đoan: Đây là kết quả nghiên cứu của riêng em. Kết quả này không trùng với kết quả của bất kì tác giả nào đã được công bố. Nếu sai em xin chịu hoàn toàn trách nhiệm. Sinh viên Đào Thị Lan 2 Tr­êng §H S­ Ph¹m Hµ Néi 2 K29A- Sinh Khãa luËn tèt nghiÖp §µo ThÞ Lan MỤC LỤC Mở đầu 1. Lí do chọn đề tài 2. Mục tiêu của đề tài 3. Ý nghĩa của đề tài Chương 1. Tổng quan tài liệu 1.1. Sơ lược về các nhóm vi sinh vật có khả năng phân giải xenluloza 1.2. Sơ lược về xạ khuẩn 1.3. Hệ vi sinh vật đất 1.4. Sơ lược về xenluloza Chương 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 2.1. Đối tượng nghiên cứu 2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 2.3. Phương pháp nghiên cứu Chương 3. Kết quả và thảo luận 3.1. Kết quả nghiên cứu 3.2. Thảo luận Phần kết luận và kiến nghị Tài liệu tham khảo 3 Tr­êng §H S­ Ph¹m Hµ Néi 2 K29A- Sinh Khãa luËn tèt nghiÖp §µo ThÞ Lan DANH MỤC BẢNG, HÌNH ẢNH TRONG LUẬN VĂN Trang Bảng: Bảng 3.1. Số lượng khuẩn lạc xạ khuẩn phân giải xenluloza ở mỗi hộp petri tại mỗi độ sâu của các mẫu đất. Bảng 3.2. Sự phân bố của xạ khuẩn phân giải xenluloza trong một số mẫu đất Xuân Hòa. Hình: Hình 3.1 Ảnh khuẩn lạc xạ khuẩn phân giải xenluloza. Hình 3.2 Ảnh một số chủng xạ khuẩn phân giải xenluloza. 4 Tr­êng §H S­ Ph¹m Hµ Néi 2 K29A- Sinh Khãa luËn tèt nghiÖp §µo ThÞ Lan MỞ ĐẦU 1. Lí do chọn đề tài Vi sinh vật phân bố rộng khắp mọi nơi trên Trái Đất, từ đáy biển sâu đến độ cao hàng nghìn mét trong không khí, từ trong cơ thể động vật, thực vật, con người đến các vật liệu khô cằn như kính, sắt...Đều phát hiện thấy sự sống của vi sinh vật. Tuy nhiên đất vẫn là nơi cư trú phổ biến nhất của các nhóm vi sinh vật kể cả thành phần và số lượng. Bởi thế chúng đóng vai trò quan trọng, trước hết là đối với quá trình hình thành và phát triển của đất. Chính nhờ những vi sinh vật tự dưỡng đầu tiên mà thành phần của đá mẹ bị phân huỷ dần dần thành đất. Sự hoạt động tiếp theo của các nhóm vi sinh vật khác đã hình thành và tích luỹ chất mùn làm nên độ phì nhiêu của đất. Vi sinh vật tham gia mạnh mẽ vào các quá trình chuyển hoá vật chất trong đất, góp phần khép kín các vòng tuần hoàn vật chất trong tự nhiên. Hầu hết các khâu của các chu trình chuyển hoá vật chất trong đất đều có sự tham gia của vi sinh vật [7]. Đầu tiên phải kể đến nhóm vi sinh vật tham gia vào quá trình phân huỷ xenluloza - một hợp chất hữu cơ có khá nhiều trong đất, thành phần chính cấu tạo nên cơ thể thực vật. Ở cây bông xenluloza chiếm tới 90 % trọng lượng khô, ở các loài cây gỗ khác xenluloza chiếm 40-50%. Hàng ngày, hàng giờ một lượng lớn xenluloza được thải ra do thân, lá, rễ chết đi, rụng xuống... Mặt khác xenluloza là hợp chất hữu cơ khó phân giải. Vì thế việc phân giải xenluloza đóng vai trò quan trọng trong vòng tuần hoàn C. Nếu không có quá trình phân giải của vi sinh vật thì lượng chất hữu cơ khổng lồ này sẽ tràn ngập trái đất [8]. Có nhiều nhóm vi sinh vật có khả năng phân giải xenluloza cư trú ở trong đất như vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc, niêm vi khuẩn. Đáng chú ý nhất là xạ khuẩn. Chúng phân bố rộng rãi trong đất, tham gia vào nhiều quá trình phân giải 5 Tr­êng §H S­ Ph¹m Hµ Néi 2 K29A- Sinh Khãa luËn tèt nghiÖp §µo ThÞ Lan các hợp chất hữu cơ: xenluloza, tinh bột ....Góp phần khép kín vòng tuần hoàn vật chất trong tự nhiên. Đặc tính này được ứng dụng trong quá trình chế biến phân huỷ rác. Từ những lí do trên và với mục đích tìm hiểu, làm quen với phương pháp nghiên cứu vi sinh vật nói chung, phương pháp nghiên cứu xạ khuẩn phân giải xenluloza nói riêng, dưới sự hướng dẫn tận tình của ThS. Nguyễn Khắc Thanh, chúng tôi chọn đề tài “Khảo sát sự phân bố của một số nhóm xạ khuẩn phân giải xenluloza phân lập từ đất Xuân Hoà”. 2. Mục tiêu của đề tài Với phạm vi đề tài này, chúng tôi tiến hành phân lập một số nhóm xạ khuẩn có khả năng phân giải xenluloza ở 3 độ sâu: 5cm, 10cm, 20cm tại 3 địa điểm: Đồi Thằn Lằn, ruộng trồng lúa, vườn trồng rau ở làng Yên Mỹ – phường Xuân Hoà - thị xã Phúc Yên - tỉnh Vĩnh Phúc, từ đó khảo sát sự phân bố của chúng. 3. Ý nghĩa của đề tài Nội dung đề tài “Khảo sát sự phân bố của một số nhóm xạ khuẩn phân giải xenluloza phân lập từ đất Xuân Hoà” đã tìm hiểu đặc điểm của xạ khuẩn, khẳng định được vai trò của chúng trong môi trường đất. Đồng thời xem xét các điều kiện ảnh hưởng tới sự phân bố của xạ khuẩn phân giải xenluloza. Đề tài góp phần tạo cơ sở khoa học cho các phương thức canh tác, cày xới, cải tạo đất, bón phân... Theo hướng lợi dụng vi sinh vật phân giải xenluloza, tăng cường các quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ để làm giàu dinh dưỡng cho đất, tăng năng suất cây trồng. Mặt khác đề tài cho phép tuyển chọn những chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải xenluloza mạnh, từ đó có thể tạo ra một chế phẩm vi sinh vật chứa các chủng xạ khuẩn này phục vụ cho việc ủ rác sinh học. 6 Tr­êng §H S­ Ph¹m Hµ Néi 2 K29A- Sinh Khãa luËn tèt nghiÖp §µo ThÞ Lan CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Sơ lược về các nhóm vi sinh vật có khả năng phân giải xenluloza Tất cả các nhóm vi sinh vật phân giải xenluloza đều thuộc nhóm dị dưỡng, hoại sinh. Chúng có khả năng này nhờ có hệ enzym xenlulaza ngoại bào. Trong đất các nhóm vi sinh vật này gồm nhiều loại khác nhau: vi khuẩn, niêm vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc... Vi nấm là nhóm có khả năng phân giải xenluloza mạnh vì nó tiết ra môi trường một lượng lớn enzym đầy đủ các thành phần. Các nấm mốc có hoạt tính phân giải xenluloza đáng chú ý là Tricoderma. Hầu hết các loài thuộc chi Tricoderma sống hoại sinh trong đất và đều có khả năng phân giải xenluloza. Chúng tiến hành phân huỷ các tàn dư của thực vật để lại trong đất góp phần chuyển hoá một lượng hữu cơ khổng lồ. Tricoderma còn sống trên tre, nứa, gỗ tạo thành lớp mốc màu xanh phá huỷ các vật liệu trên. Trong nhóm vi nấm, ngoài Tricoderma còn có nhiều giống khác có khả năng phân giải xenluloza như Aspergillus, Fusarium, Mucor... [8]. Nhiều loài vi khuẩn cũng có khả năng phân huỷ xenluloza, tuy nhiên cường độ không mạnh bằng vi nấm. Do số lượng enzym tiết ra môi trường của vi khuẩn thường nhỏ hơn, thành phần các loại enzym không đầy đủ. Ở trong đất thường có ít loài vi khuẩn có khả năng tiết ra đầy đủ 4 loại enzym trong hệ enzym xenlulaza. Nhóm này tiết ra một loại enzym, nhóm khác tiết ra các loại khác, chúng phối hợp với nhau để phân giải cơ chất trong mối quan hệ hỗ sinh. Nhóm vi khuẩn hiếu khí đại diện là: Cellulomonas, Pseudomonas, Achromobacter, Bacillus... [11]. Nhóm vi khuẩn kị khí Clostridium, đặc biệt là những cầu khuẩn thuộc chi Ruminococcus có khả năng phân huỷ xenluloza thành đường và các axit hữu cơ, 7 Tr­êng §H S­ Ph¹m Hµ Néi 2 K29A- Sinh Khãa luËn tèt nghiÖp §µo ThÞ Lan sống trong dạ cỏ của động vật nhai lại.Chính nhờ nhóm này mà trâu, bò có thể sử dụng được xenluloza có trong cỏ, rơm rạ làm thức ăn [11]. Niêm vi khuẩn (Myxobacteriales) là những vi khuẩn Gram âm, có khuẩn lạc nhày ướt, tế bào hình que, nhỏ bé (0,3 – 0,4 x 0,7 - 10  m), hơi uốn cong. Thường có đầu nhọn, có thành tế bào mỏng và nhuộm màu kém hơn so với các vi khuẩn khác. Niêm vi khuẩn phân giải xenluloza được tìm thấy trong các giống Promyxobacterium, Cytophaga, Sporocytophaga, Sorangium. Chúng sống trong môi trường ít axit và ít kiềm. Trên bề mặt các vật liệu chứa xenluloza, niêm vi khuẩn phát triển trong dạng các thể nhày không có hình xác định, lan rộng, không màu hoặc có màu vàng, da cam hay đỏ. Màu sắc khuẩn lạc thường tương ứng với các chỗ xenluloza bị phân giải nhiều hay ít. Tế bào niêm vi khuẩn bám sát vào các sợi xenluloza và chỉ thuỷ phân chúng khi tiếp xúc trực tiếp [1]. Xạ khuẩn có khả năng phân giải xenluloza mạnh, nó tiết ra đầy đủ 4 thành phần của hệ enzym xenlulaza. Vì vậy, nó có thể độc lập phân giải xenluloza mà không phải sống trong mối quan hệ hỗ sinh với bất kì loài nào khác. Xạ khuẩn phân giải xenluloza gồm các giống: Proactinomyces, Actinomyces, Micromonospora... và đặc biệt là chi Streptomyces thuộc nhóm ưa nóng, sinh trưởng và phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 45-500C rất thích hợp cho quá trình ủ rác thải. Người ta thường sử dụng những xạ khuẩn này để phân huỷ rác thải sinh hoạt. 1.2. Sơ lược về xạ khuẩn 1.2.1. Vị trí phân loại của xạ khuẩn trong sinh giới Theo Krasilnikov (1970), xạ khuẩn được tách thành một lớp riêng gồm xạ khuẩn bậc cao (có hệ sợi phát triển, có cơ quan sinh sản riêng) và nhóm xạ khuẩn bậc thấp (có hệ sợi không phát triển, tế bào hình que hoặc hình cầu). Trong cuốn 8 Tr­êng §H S­ Ph¹m Hµ Néi 2 K29A- Sinh Khãa luËn tèt nghiÖp §µo ThÞ Lan “Bergey’s Manual” (1970), Bergey đã xếp xạ khuẩn thành một bộ riêng (Actinomycetales). Xạ khuẩn có thể phát triển thành hệ sợi ngắn như họ Mycobacteriaceae và Actinomycetaceae hoặc hệ sợi dài như họ Streptomycetaceae. Theo hệ thống phân loại hiện nay - hệ thống phân loại chia sinh giới thành 7 giới thì xạ khuẩn thuộc ngành: Tenericutes Giới: Eubacteria Siêu giới: Procaryote. 1.2.2. Hình thái và kích thước Xạ khuẩn có cấu tạo gần giống vi khuẩn Gram dương. Tuy vậy đa số tế bào xạ khuẩn lại có cấu tạo dạng sợi, phân nhánh phức tạp và có nhiều màu sắc giống như nấm mốc. Khi nuôi cấy trên môi trường đặc (thạch, gelatin, silicagen) xạ khuẩn mọc thành khuẩn lạc có hình dạng khác nhau, mỗi khuẩn lạc gồm nhiều sợi kết vào với nhau tạo thành. Màu sắc của xạ khuẩn hết sức phong phú: màu trắng, vàng, da cam, đỏ, lục, lam, tím, nâu, đen... đây là một đặc điểm phân loại quan trọng. Đường kính sợi của xạ khuẩn khoảng từ 0,1- 0,5  m (chỉ bằng một đến vài phần mười đường kính của sợi nấm (0,5 – 1,5  m). Có thể phân biệt 2 loại sợi khác nhau. Sợi khí sinh: là hệ sợi mọc trên bề mặt môi trường tạo thành bề mặt của khuẩn lạc xạ khuẩn, từ đây phát sinh ra bào tử. Sợi cơ chất: là sợi cắm sâu vào môi trường làm nhiệm vụ hấp thu chất dinh dưỡng. Sợi cơ chất sinh ra sắc tố thấm vào môi trường, sắc tố này thường có màu khác với màu của sợi khí sinh. Có loại sắc tố tan trong nước, có loại sắc tố chỉ tan trong dung môi hữu cơ. Đây cũng là một đặc điểm phân loại quan trọng. 9 Tr­êng §H S­ Ph¹m Hµ Néi 2 K29A- Sinh Khãa luËn tèt nghiÖp §µo ThÞ Lan Một số xạ khuẩn không có sợi khí sinh mà chỉ có sợi cơ chất, loại sợi này làm cho bề mặt xạ khuẩn nhẵn và khó tách ra khi cấy truyền. Loại chỉ có sợi khí sinh thì ngược lại rất dễ tách toàn bộ khuẩn lạc khỏi môi trường [8]. Khuẩn lạc xạ khuẩn rất đặc biệt nó không trơn ướt như vi khuẩn, nấm men mà thường có dạng thô ráp, rắn chắc, xù xì, có thể dạng phấn, dạng da, dạng nhung, dạng vôi, phụ thuộc vào kích thước bào tử. Trường hợp không có sợi khí sinh khuẩn lạc có dạng màng dẻo. Kích thước khuẩn lạc thay đổi tuỳ loài xạ khuẩn và tuỳ điều kiện nuôi cấy. Khuẩn lạc thường có dạng phóng xạ (vì thế gọi là xạ khuẩn), một số có dạng những vòng tròn đồng tâm cách nhau một khoảng cách nhất định. Nguyên nhân của hiện tượng này là do xạ khuẩn sinh ra chất ức chế sinh trưởng khi sợi mọc qua vùng này chúng sinh trưởng yếu đi, qua được vùng có chất ức chế chúng lại sinh trưởng mạnh thành vòng tiếp theo. Vòng này lại sinh ra chất ức chế sinh trưởng sát với nó khiến khuẩn ti lại phát triển yếu đi. Cứ thế tạo khuẩn lạc có dạng vòng tròn đồng tâm [1,7,8]. Còn khi nuôi cấy trong môi trường lỏng thì một số loài xạ khuẩn mọc thành dạng màng nhày hay vòng trên thành bình nuôi cấy trên bề mặt môi trường. Một số khác phát triển thành dạng bông hoặc dạng kết tủa kiểu vi khuẩn. Khi nuôi cấy chìm trên máy lắc hoặc nồi lên men được khuấy đảo liên tục thì xạ khuẩn hoặc phát triển thành dạng bông chứa đầy thể tích môi trường hoặc thành dạng lắng cặn xốp hay đặc. Nhưng thường gặp hơn cả là xạ khuẩn phát triển thành những dạng quả cầu nhỏ với kích thích từ hạt cát (0,1 mm) đến hạt đậu Hà Lan (2 - 3 mm). Những quả cầu nhỏ đó được tạo lên bởi những sợi khuẩn ti đan xen vào nhau. Kích thước của những quả cầu đó phụ thuộc vào bản chất chủng, loài của xạ khuẩn và phụ thuộc vào thành phần môi trường nuôi cấy [10]. 10 Tr­êng §H S­ Ph¹m Hµ Néi 2 K29A- Sinh Khãa luËn tèt nghiÖp §µo ThÞ Lan 1.2.3. Cấu tạo tế bào Khuẩn lạc xạ khuẩn tuy có dạng sợi phân nhánh phức tạp đan xen nhau nhưng toàn bộ hệ sợi chỉ là một tế bào có nhiều nhân, không có vách ngăn ngang. Giống như vi khuẩn, nhân thuộc loại đơn giản, không có màng nhân. Thành tế bào xạ khuẩn giống với thành tế bào vi khuẩn Gram dương. Thành tế bào thường có cấu tạo lỏng lẻo, có nhiều lỗ nhỏ li ti cho nhiều chất có phân tử lượng đi qua: thành tế bào không chứa xenluloza và kitin, trong thành có Naxetiglucozamin, protein, lipit, axit teicoic có thể chiếm tới 60% trọng lượng khô của thành tế bào. Màng tế bào chất dày khoảng 50 nm và có cấu trúc tương tự như màng tế bào chất của vi khuẩn. Nhân không có cấu trúc điển hình, chỉ là những nhiễm sắc thể không có màng. Khi còn non, toàn bộ tế bào chỉ có một nhiễm sắc thể sau đó hình thành nhiều hạt rải rác trong toàn bộ hệ khuẩn ti (gọi là hạt cromatin). 1.2.4. Sinh sản Xạ khuẩn sinh sản bằng bào tử. Bào tử được hình thành trên các nhánh phân hoá khuẩn ti khí sinh gọi là cuống sinh bào tử. Cuống sinh bào tử ở các loài xạ khuẩn có kích thước và hình dạng khác nhau. Có loài dài tới 100 - 200 nm, có loài chỉ khoảng 20 - 30 nm, có loài cấu trúc theo hình lượn sóng, có loài lò xo hay xoắn ốc. Sự sắp xếp theo kiểu mọc đơn, mọc đôi, mọc vòng hoặc từng chùm. Đặc điểm hình dạng của cuống sinh bào tử là một tiêu chuẩn phân loại. Bào tử được hình thành từ cuống sinh bào tử theo kiểu kết đoạn (fragmentation) hoặc cắt khúc (segmentation). Ngoài hình thức sinh sản bằng bào tử. Xạ khuẩn có thể sinh sản bằng khuẩn ti. Các đoạn khuẩn ti gãy ra môi trường phát triển thành hệ khuẩn ti [1,2,7]. 11 Tr­êng §H S­ Ph¹m Hµ Néi 2 K29A- Sinh Khãa luËn tèt nghiÖp §µo ThÞ Lan 1.2.5. Ý nghĩa thực tiễn của xạ khuẩn Xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật phân bố rộng rãi trong đất. Chúng tham gia tích cực vào các quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ trong đất như xenluloza, tinh bột... góp phần khép kín vòng tuần hoàn vật chất trong tự nhiên. Nhiều loài xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng sinh được ứng dụng trong công nghệ sản xuất kháng sinh mới. Một số giống xạ khuẩn có khả năng phân giải xenluloza. - Streptomyces là một giống xạ khuẩn phân nhánh mạnh, màu sắc của hệ sợi phong phú, đa dạng. Hệ sợi cơ chất có thể tiết ra các sắc tố. Phần cuối của hệ sợi khí sinh mang cuống bào tử có nhiều hình dạng khác nhau từ thẳng tới lượn sóng, vòng hở có móc, xoắn. Các chuỗi bào tử dài và ngắn tuỳ thuộc vào loài. - Micromonospora: không tạo thành khuẩn ti khí sinh, chứa một bào tử, ở đầu cuống mang bào tử phân nhánh yếu. - Microbispora: tưong tự như Micromonospora nhưng tạo thành khuẩn ti khí sinh mang 2 conidi. Cả hai giống này đều phổ biến trong đất, bùn, phân giải mạnh mẽ xenluloza. - Actinoplanes và Streptosporangium: sống dưới các bã thực vật có bào tử nằm trong nang [1,4,10]. 1.3. Hệ vi sinh vật đất 1.3.1. Sự phân bố của vi sinh vật đất Vi sinh vật phân bố khắp mọi nơi trên trái đất. Nhưng phổ biến nhất là ở trong đất. Bởi vì trong môi trường đất cung cấp một nguồn thức ăn phong phú cho vi sinh vật. Các chất vô cơ có trong đất là nguồn thức ăn cho nhóm vi sinh vật tự dưỡng, chúng chuyển hoá các hợp chất này (hợp chất của S, P, Fe...) và nguồn thức ăn cho nhóm vi sinh vật dị dưỡng là các chất hữu cơ: xenluloza, tinh 12 Tr­êng §H S­ Ph¹m Hµ Néi 2 K29A- Sinh Khãa luËn tèt nghiÖp §µo ThÞ Lan bột, protein... Đất còn là nơi giúp vi sinh vật khỏi bị tiêu diệt bởi ánh nắng mặt trời. Do sự phân bố không đều của các chất dinh dưỡng kéo theo sự phân bố của các vi sinh vật ở các tầng đất khác nhau. Mức độ thoáng khí của đất cũng là một điều kiện ảnh hưởng đến sự phân bố của vi sinh vật. Các nhóm hiếu khí phát triển nhiều ở những nơi có nồng độ oxi cao và ngược lại hàm lượng oxi thấp thường tập trung các loại vi sinh vật kị khí. Độ ẩm và nhiệt độ trong đất cũng ảnh hưởng đến sự phát triển của vi sinh vật đất. Đại đa số các loài vi sinh vật có ích đều phát triển mạnh ở độ ẩm 60 80%. Độ ẩm quá thấp hoặc quá cao đều ức chế vi sinh vật. Chỉ có nấm mốc và xạ khuẩn là phát triển được ở điều kiện khô. Nếu độ ẩm thấp dưới 20% thì vi khuẩn phát triển kém nhưng xạ khuẩn lại phát triển mạnh. Đất vùng nhiệt đới có độ ẩm 70 - 80% và nhiệt độ từ 20 - 300C là điều kiện thích hợp với đa số vi sinh vật. Bởi vậy trong mỗi gam đất trồng thường có hàng triệu đến hàng tỉ tế bào vi sinh vật gồm nhiều nhóm khác nhau về vị trí phân loại cũng như hoạt tính sinh lí sinh hoá [7 ]. Các nhóm vi sinh vật chính cư trú trong đất: vi khuẩn, vi nấm, xạ khuẩn, virut, tảo, nguyên sinh động vật. Trong đó vi khuẩn là nhóm chiếm nhiều nhất về số lượng. Theo nhiều tài liệu đáng tin cậy thì trung bình vi khuẩn chiếm 90% tổng số, xạ khuẩn 8%, vi nấm 1%, còn lại 1% là tảo và nguyên sinh động vật. Tỉ lệ này thay đổi theo các loại đất khác nhau cũng như khu vực địa lí khác nhau, tầng đất, thời vụ, chế độ canh tác...Ở những đất có đầy đủ chất dinh dưỡng, độ thoáng khí tốt, nhiệt độ, độ ẩm và pH thích hợp thì vi sinh vật phát triển nhiều về số lượng, thành phần. Sự phát triển của vi sinh vật lại chính là các nhân tố làm cho đất thêm phì nhiêu, màu mỡ [6]. 13 Tr­êng §H S­ Ph¹m Hµ Néi 2 K29A- Sinh Khãa luËn tèt nghiÖp §µo ThÞ Lan Bởi vậy khi đánh giá độ phì nhiêu của đất phải tính đến thành phần và số lượng vi sinh vật. Nếu chỉ tính đến hàm lượng chất hữu cơ thì khó giải thích được tại sao ở một vùng đất chiêm trũng hàm lượng chất hữu cơ, chất mùn, đạm, lân đều cao mà cây trồng lại kém phát triển. Vì các chất khó tiêu đối với cây trồng không được chuyển hoá thành dạng dễ tiêu. Các chất độc tích luỹ dần trong đất trong quá trình trao đổi chất của cây cũng không được phân giải nhờ vi sinh vật, gây ảnh hưởng xấu đến cây trồng. Sự phân bố của vi sinh vật trong đất chia ra theo các kiểu phân loại sau đây. * Phân bố theo chiều sâu Quần thể vi sinh vật thường tập trung nhiều ở tầng canh tác. Đó là nơi tập trung của rễ cây, chất dinh dưỡng, có cường độ chiếu sáng, nhiệt độ, độ ẩm thích hợp nhất. Số lượng vi sinh vật giảm dần theo tầng đất, càng xuống sâu càng ít vi sinh vật. Riêng đối với đất bạc màu do hiện tượng rửa trôi, tầng 0 - 20cm ít chất dinh dưỡng hơn tầng 20 - 40cm. Bởi vậy ở tầng này lượng vi sinh vật nhiều hơn ở tầng trên. Sau đó giảm dần ở các tầng dưới. Thành phần vi sinh vật cũng thay đổi theo tầng đất: vi khuẩn háo khí, vi nấm, xạ khuẩn thường tập trung ở tầng mặt vì tầng này chứa nhiều oxi. Càng xuống sâu các nhóm vi sinh vật hiếu khí càng giảm mạnh. Ngược lại các nhóm vi sinh vật kị khí như vi khuẩn phản nitrat phát triển mạnh ở độ sâu 20 - 40cm ở vùng khí hậu nhiệt đới nóng ẩm thường có quá trình rửa trôi xói mòn nên tầng 0 - 20cm dễ biến động, tầng 20 - 40cm ổn định hơn [8]. * Phân bố theo các loại đất Ở các loại đất khác nhau có điều kiện dinh dưỡng độ ẩm thoáng khí, pH khác nhau. Bởi vậy sự phân bố của vi sinh vật khác nhau. Ở đất lúa nước tình trạng ngập nước lâu ngày làm ảnh hưởng đến độ thông khí, chế độ nhiệt, chất 14 Tr­êng §H S­ Ph¹m Hµ Néi 2 K29A- Sinh Khãa luËn tèt nghiÖp §µo ThÞ Lan dinh dưỡng ... chỉ có một lớp mỏng ở trên khoảng 0 - 3cm là có quá trình oxi hoá ở tầng dưới quá trình khử chiếm ưu thế. Cho nên trong đất lúa nước các loại vi sinh vật kị khí phát triển mạnh như vi khuẩn amôn hoá, vi khuẩn phản nitrat hoá, vi khuẩn cố định nitơ, vi nấm và xạ khuẩn đều rất ít. Tỉ lệ giữa vi khuẩn hiếu khí trên kị khí thường nhỏ hơn một (vùng chiêm trũng Hà Nam Ninh tỉ lệ này là 0,2 – 0,3). Ở đất trồng màu, không khí lưu thông tốt quá trình oxi hoá chiếm ưu thế do đó các loài vi sinh vật hiếu khí phát triển mạnh, vi sinh vật kị khí phát triển yếu. Tỉ lệ giữa vi khuẩn hiếu khí trên kị khí thường lớn hơn 1, có trường hợp đạt 4 - 5 như vùng đất phù sa sông Hồng [1]. * Phân bố theo cây trồng Đối với tất cả các loại cây trồng, vùng rễ là vùng vi sinh vật phát triển mạnh nhất. Do rễ cây cung cấp một lượng lớn chất hữu cơ khi nó chết đi. Khi còn sống, bản thân rễ cây cũng thường xuyên tiết ra các chất dinh dưỡng cho vi sinh vật. Rễ cây còn làm cho đất thoáng khí, giữ được độ ẩm. Tất cả những yếu tố đó làm cho số lượng vi sinh vật ở vùng rễ phát triển mạnh. Tuy nhiên mỗi loại cây trồng trong quá trình sống thường tiết ra bộ rễ những chất khác nhau. Bộ rễ khi chết đi cũng có thành phần các chất khác nhau. Số lượng và thành phần của các chất hữu cơ này quyết định số lượng và thành phần vi sinh vật sống trong vùng rễ đó. Ví dụ như vùng rễ cây họ đậu thường phân bố nhóm vi khuẩn cố định nitơ cộng sinh, vùng rễ lúa là nơi cư trú của các nhóm cố định nitơ tự do hoặc hội sinh... số lượng và thành phần vi sinh vật cũng thay đổi theo các giai đoạn phát triển của cây trồng, phù hợp với hàm lượng các chất tiết ra bộ rễ và các sản phẩm chết của cây. Khi cây còn non có rất ít vi sinh vật phân giải xenluloza, nhưng khi cây già hàm lượng xenluloza tăng lên do quá 15 Tr­êng §H S­ Ph¹m Hµ Néi 2 K29A- Sinh Khãa luËn tèt nghiÖp §µo ThÞ Lan trình cây già hoá và chết dần kéo theo sự tăng lên của vi sinh vật phân giải xenluloza [1]. 1.3.2. Sự phân bố của xạ khuẩn Xạ khuẩn phân bố rộng rãi trong tự nhiên, có thể gặp xạ khuẩn trong đất, nước, rác, bùn... Nhưng quan trọng và đáng chú ý hơn cả là xạ khuẩn trong đất. Ở nhiều vùng trên thế giới số lượng xạ khuẩn trong đất chiếm tới 20 - 40 % tổng số các vi sinh vật đất. Theo Waksman thì trong đất xạ khuẩn chiếm từ 9 - 45% tổng số vi sinh vật và trong 1 gam đất có khoảng 29000 - 24000000 mầm xạ khuẩn [10]. Xạ khuẩn có thể gặp trong các loại đất từ bắc bán cầu đến nam bán cầu và số lượng xạ khuẩn ở nam bán cầu bao giờ cũng cao hơn ở bắc bán cầu. Số lượng xạ khuẩn trong đất không chỉ phụ thuộc vào loại đất mà còn phụ thuộc vào mức độ canh tác, mức độ bao phủ của thực vật. Đất giàu dinh dưỡng và lớp đất trên bề mặt (đến 40 cm) thường có số lượng xạ khuẩn lớn. Trong 1 gam đất canh tác có thể phân lập được 5 triệu mầm xạ khuẩn hoặc hơn. Đất vùng sa mạc có độ ẩm thấp, chế độ nhiệt khắc nghiệt, đất lại nghèo chất dinh dưỡng nên số lượng xạ khuẩn trên lớp đất mặt chỉ dao động trong khoảng 10 - 100 nghìn mầm xạ khuẩn trên 1 gam đất khô [1,10]. Sự phân bố của xạ khuẩn còn phụ thuộc nhiều vào độ pH của môi trường. Trong đất trung tính, kiềm yếu hoặc axit yếu với giới hạn pH 6,8 – 7,5 thì có mật độ xạ khuẩn cao hơn so với độ pH quá thấp hoặc quá cao. Số lượng xạ khuẩn trong đất cũng còn phụ thuộc vào các khoảng thời gian trong năm. Vì vậy khi chọn mẫu đất để nghiên cứu về sự phân bố của xạ khuẩn, người ta rất chú ý đến thành phần các lớp đất, thời gian lấy mẫu đất, sinh cảnh trên bề mặt đất, độ ẩm của đất và các yếu tố khác. 16 Tr­êng §H S­ Ph¹m Hµ Néi 2 K29A- Sinh Khãa luËn tèt nghiÖp §µo ThÞ Lan 1.4. Sơ lược về xenluloza 1.4.1. Đặc điểm chung của xenluloza Xenluloza có công thức: (C6H10O5)n, (n = 5000 – 10000) – là loại polyxacarit chủ yếu trong xác thực vật, chiếm tới 50 - 80% trọng lượng khô. Lượng xenluloza có trên hành tinh này lên tới 3500 tỉ tấn. Xenluloza chiếm khoảng một nửa toàn bộ Cacbon hữu cơ của sinh quyển. Hợp chất cao phân tử này cấu tạo bởi hàng trăm, hàng nghìn gốc  - D - glucoz, có cấu trúc không gian như sau: O CH2OH O . . .H . ..H O O OH CH2OH O OH O O OH O CH2OH Liên kết trong phân tử xenluloza gồm các liên kết  - 1.4 – glucozit và liên kết H2 giữa 2 gốc  - D-glucoz kế tiếp nhau. Các phân tử  - D - glucoz có cấu trúc không gian dạng ghế bành, hai phân tử gần nhau quay góc với nhau 1800C. Vì thế phân tử xenluloza có cấu trúc mạch thẳng, không phân nhánh, tạo thành một sợi dài. Các sợi liên kết với nhau thành sợi nhỏ có đường kính 10 - 40 nm gọi là vi sợi. Các vi sợi được liên kết với nhau bởi các phân tử hêmixenluloza và lignhin tạo nên độ cứng cho cấu trúc thành tế bào thực vật. Chính kiểu cấu trúc như trên mà xenluloza rất bền, dai, chắc. Xenluloza không tan trong bất kì dung môi nào (trừ dung dịch Schweitzer - dung dịch Amonic của muối đồng). Phân tử xenluloza bền vững và mềm dẻo, do đó màng có độ bền rất lớn, nó có thể bị uốn cong nhiều mà không bị gãy. Trong cơ thể người không có enzym thuỷ phân xenluloza nên không tiêu hoá được, chúng chỉ có tác dụng cơ học trong việc lôi cuốn các chất cặn bã ở đường tiêu hoá. Riêng 17 Tr­êng §H S­ Ph¹m Hµ Néi 2 K29A- Sinh Khãa luËn tèt nghiÖp §µo ThÞ Lan động vật nhai lại: trâu, bò trong dạ dày có tồn tại một lượng lớn các vi khuẩn có khả năng phân giải xenluloza (15 - 20 tỉ vi khuẩn trên 1 cm3 ở dạ cỏ của bò). Vì vậy xenluloza là nguồn Cacbohidrat quan trọng trong thức ăn của động vật ăn cỏ. Trong đất, bùn, phân chuồng có rất nhiều loại vi sinh vật có khả năng phân giải xenluloza, chúng góp phần quan trọng vào việc đảm bảo vòng tuần hoàn Cacbon trong tự nhiên. 1.4.2. Hệ enzym phân giải xenluloza Sở dĩ một số nhóm vi sinh vật phân giải được xenluloza là nhờ phức hệ enzym xenlulaza bao gồm 4 enzym khác nhau tác dụng vào các mối liên kết của đại phân tử xenluloza. Đầu tiên enzym xenlobiohidrolaza (enzym C1) có tác dụng cắt đứt liên kết hidro, biến xenluloza tự nhiên có cấu hình không gian thành dạng xenluloza vô định hình không còn cấu trúc lớp. Enzym thứ 2 là Endoglucanaza có khả năng cắt đứt các liên kết  - 1.4 – glucozit tạo thành những chuỗi dài. Enzym thứ 3 là Exogluconaza tiến hành phân giải các chuỗi trên thành disaccarit gọi là Xenlobioza. Cả hai loại enzym Endoglucanaza và Exogluconaza gọi chung là Cx. Enzym thứ tư là  - glucosidaza tiến hành thuỷ phân Xenlobioza thành glucoza. C1 Xenluloza tự nhiên Cx Xenlobioza Xenluloza  -1.4 - glucozit vô định glucoza. 18 Tr­êng §H S­ Ph¹m Hµ Néi 2 K29A- Sinh hình Khãa luËn tèt nghiÖp §µo ThÞ Lan CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu Một số nhóm xạ khuẩn có khả năng phân giải xenluloza. 2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 2.2.1. Địa điểm Tiến hành khảo sát sự phân bố của một số nhóm xạ khuẩn có khả năng phân giải xenluloza ở 3 độ sâu khác nhau: 5cm, 10cm, 20cm, tại 3 địa điểm: đồi Thằn Lằn, ruộng, vườn trồng rau ở làng Yên Mỹ - Xuân Hoà - Phúc Yên-Vĩnh Phúc. 2.2.2. Thời gian nghiên cứu Đề tài này được tiến hành từ 1 - 8 - 2006 đến 30 - 1 - 2007 tại phòng thí nghiệm vi sinh trường ĐH Sư Phạm Hà Nội 2. 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Hoá chất - Tinh bột tan, glucoza, sacaroza: K2HPO4, NaNO3, MgSO4.7H2O, KCl, NaCl, CaCO3, (NH4)2 SO4 , FeSO4 , thạch aga, nước cất. - Xenluloza dưới dạng giấy thấm. - Dung dịch KCl 1N. 2.3.2. Dụng cụ, thiết bị - Dụng cụ: Đĩa petri, ống nghiệm, bàn trang, pipet, đèn cồn, bình tam giác, giá đựng ống nghiệm. - Thiết bị: Cân Sartorius, nồi hấp, tủ sấy, tủ cấy vô trùng, tủ ấm, tủ lạnh máy đo pH hãng Horiba. 19 Tr­êng §H S­ Ph¹m Hµ Néi 2 K29A- Sinh Khãa luËn tèt nghiÖp §µo ThÞ Lan 2.3.3. Môi trường Để phân lập xạ khuẩn có thể sử dụng các loại môi trường sau: Môi trường 1: môi trường Czapek (nguyên gốc) Thành phần: sacaroza 30g NaNO3 3g K2HPO4 1g MgSO4.7H2O 0,5g KCl 0,5g FeSO4 0,01g Thạch aga 20g Nước cất 1000 ml pH = 7,2 – 7,4 Môi trường 2: môi trường Czapek (glucoza) Thành phần: glucoza 30g CaNO3 3g (NH4 )2 SO4 2g K2HPO4 1g MgSO4.7H2O 1g NaCl 1g Thạch aga 20g Nước cất pH 1000 ml = 6,8 Môi trường 3: môi trường Czapek (tinh bột) Thành phần: Tinh bột tan CaNO3 20g 3g 20 Tr­êng §H S­ Ph¹m Hµ Néi 2 K29A- Sinh