Tài liệu Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của giống lan dendrobium mini lai trong điều kiện nuôi cấy in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH Phạm Thị Thu Ly KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA GIỐNG LAN DENDROBIUM MINI LAI TRONG ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY IN VITRO Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. BÙI VĂN LỆ Thành phố Hồ Chí Minh – 2014 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: - Ban Giám hiệu trường Đại học Sư phạm TP. HCM, Phòng Đào tạo Sau đại học, Khoa Sinh học, tất cả thầy cô đã tận tình dạy dỗ, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt thời gian theo học tại trường. - Thầy PGS. TS. Bùi Văn Lệ đã tận tình hướng dẫn, giảng dạy, bồi dưỡng kiến thức, đóng góp nhiều ý kiến quý báu và luôn tạo điều kiện tốt nhất để em hoàn thành luận văn. - ThS. Hoàng Minh Tâm, ThS. Đặng Thị Ngọc Thanh – thầy cô đã quan tâm, tận tình chỉ bảo và cho em những ý tưởng đề tài. - Thạc sĩ Nguyễn Văn Vinh, Trạm huấn luyện và thực nghiệm nông nghiệp Văn Thánh thuộc Trung tâm khuyến nông thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài. - ThS. Lê Minh Đức đã giúp đỡ và hỗ trợ cho em trong công tác phòng thí nghiệm để em thực hiện đề tài. - Quý Thầy Cô ngành Sinh học khoa Sư phạm Khoa học Tự nhiên trường Đại học Sài Gòn đã tạo điều kiện thuận lợi để em học tập và hoàn thành luận văn. - Các bạn sinh viên ngành Sư phạm Sinh học trường Đại học Sài Gòn đã nhiệt tình giúp đỡ trong quá trình thực hiện đề tài. - Cảm ơn tất cả những người thân, những người bạn đã luôn ở bên cạnh và động viên tôi trong suốt quá trình học tập. - Cuối cùng, con xin chân thành cảm ơn ba mẹ, hai chị và chồng đã luôn yêu thương, động viên và tạo điều kiện tốt nhất cho con hoàn thành qúa trình học tập. Một lần nữa xin chân thành cảm ơn. TP. Hồ Chí Minh, tháng 9 năm 2014 Phạm Thị Thu Ly MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cảm ơn Mục lục Danh mục các chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình MỞ ĐẦU .........................................................................................................................1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................3 1.1. Sơ lược đặc điểm lan Dendrobium và lan Dendrobium mini ............................3 1.1.1. Đặc điểm hình thái ......................................................................................5 1.1.2. Điều kiện sinh thái ......................................................................................7 1.1.2.1. Nhiệt độ ................................................................................................7 1.1.2.2. Độ ẩm và chế độ tưới nước ..................................................................8 1.1.2.3. Ánh sáng ...............................................................................................8 1.1.2.4. Nhu cầu dinh dưỡng .............................................................................8 1.1.3. Các phương pháp nhân giống cây lan Dendrobium và Dendrobium mini ngoài tự nhiên ...........................................................................................................9 1.2. 1.1.3.1. Giao phấn..............................................................................................9 1.1.3.2. Phương pháp tách chiết ........................................................................9 Sơ lược phương pháp nhân giống in vitro .........................................................9 1.2.1. Lược sử phát triển của công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật ........................9 1.2.2. Tầm quan trọng của phương pháp nhân giống in vitro .............................10 1.2.3. Điều kiện nhân giống in vitro....................................................................11 1.2.4. Các giai đoạn nuôi cấy mô thực vật ..........................................................11 1.2.4.1. Giai đoạn 1: Chọn lựa và khử trùng mẫu ...........................................11 1.2.4.2. Giai đoạn 2: Tạo thể nhân giống ........................................................11 1.2.4.3. Giai đoạn 3: Nhân giống in vitro ........................................................11 1.2.4.4. Giai đoạn 4: Tái sinh cây in vitro hoàn chỉnh ....................................12 1.2.4.5. Giai đoạn 5: Chuyển cây con ra vườm ươm ......................................12 1.2.5. Những ưu điểm và khó khăn trong nhân giống in vitro ............................12 1.2.5.1. Ưu điểm ..............................................................................................12 1.2.5.2. Khó khăn ............................................................................................13 1.2.6. Sơ lược các kỹ thuật dùng trong nuôi cấy mô thực vật .............................14 1.2.6.1. Nuôi cấy phôi .....................................................................................14 1.2.6.2. Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời........................................................14 1.2.6.3. Nuôi cấy mô phân sinh .......................................................................15 1.2.6.4. Nuôi cấy bao phấn ..............................................................................15 1.2.6.5. Nuôi cấy tế bào đơn ............................................................................15 1.2.6.6. Nuôi cấy protoplast ............................................................................16 1.2.7. Các phương pháp nhân giống in vitro cho lan Denrdobium .....................17 1.2.7.1. Nhân giống bằng chồi nách ................................................................17 1.2.7.2. Nhân giống bằng chồi đỉnh ................................................................17 1.2.7.3. Nhân giống bằng chồi bất định...........................................................17 1.2.7.4. Nhân giống qua nuôi cấy callus .........................................................17 1.2.7.5. Nhân giống bằng các đoạn giả hành...................................................17 1.2.7.6. Nuôi cấy hạt lai...................................................................................18 1.2.7.7. Dung hợp tế bào trần ..........................................................................18 1.3. Sơ lược về phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào (TCL) .............................18 1.4. Sơ lược phương pháp nuôi cấy tế bào trong môi trường lỏng lắc (nuôi cấy dịch treo tế bào)..................................................................................................................19 1.5. Giới thiệu về phôi soma và protocorm like bodies (PLBs) ............................20 1.5.1. Giới thiệu về phôi soma ............................................................................20 1.5.2. Giới thiệu về PLBs ....................................................................................21 1.6. Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật ...................................22 1.7. Một số chất hữu cơ dùng trong nuôi cấy in vitro .............................................23 1.8. Một số công trình nghiên cứu về lan Dendrobium in vitro...............................24 1.8.1. Trong nước ................................................................................................24 1.8.2. Trên thế giới ..............................................................................................24 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...........................26 2.1. Vật liệu .............................................................................................................26 2.1.1. Vật liệu nuôi cấy .......................................................................................26 2.1.2. Thiết bị và dụng cụ ....................................................................................26 2.1.3. Hóa chất.....................................................................................................26 2.2. Môi trường và điều kiện nuôi cấy ....................................................................26 2.3. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................27 2.4. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................27 2.4.1. Nội dung 1: Khảo sát phương pháp khử trùng mẫu ..................................27 Thí nghiệm 1: Khảo sát phương pháp khử trùng mẫu.........................................27 2.4.2. Nội dung 2: Khảo sát các loại môi trường nuôi cấy cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai ...............................................................................................29 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng thành phần các loại môi trường nuôi cấy cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai ..............................................................................29 2.4.3. Nội dung 3: Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai ...................................................30 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng NAA và BA đến khả năng cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai .........................................30 2.4.4. Nội dung 4: Khảo sát các điều kiện nuôi cấy đến khả năng cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai .................................................................................31 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng đến khả năng cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai......................................................................................31 2.4.5. Nội dung 5: Khảo sát ảnh hưởng của các hợp chất hữu cơ: vitamin, đường, nước dừa, khoai tây, bánh dầu đến khả năng nhân nhanh chồi và sự sinh trưởng của giống lan Dendrobium mini lai ............................................................32 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ vitamin lên sự tăng sinh chồi trong môi trường lỏng lắc ....................................................................................32 Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của bánh dầu đến khả năng sinh trưởng chồi của giống lan Dendrobium mini lai ...........................................................................33 Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của cơm dừa, bánh dầu đến khả năng sinh trưởng chồi của giống lan Dendrobium mini lai .............................................................35 Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng của cơm dừa, bánh dầu đến sinh trưởng của giống lan Dendrobium mini lai ở giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh...................................36 2.4.6. Xử lý, phân tích số liệu, dữ kiện ...............................................................37 2.5. Thời gian nghiên cứu .........................................................................................2 2.6. Nơi thực hiện đề tài ............................................................................................2 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ...............................................................38 3.1. Kết quả 1: Khảo sát phương pháp khử trùng mẫu ..............................................38 Thí nghiệm 1: Khảo sát phương pháp khử trùng mẫu.........................................38 3.2. Kết quả 2: Khảo sát các loại môi trường nuôi cấy cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai ..................................................................................................40 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng thành phần khoáng các loại môi trường nuôi cấy đến cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai .........................................................40 3.3. Kết quả 3: Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai .......................................................................42 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng NAA và BA đến khả năng cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai .........................................42 3.4. Kết quả 4: Khảo sát các điều kiện nuôi cấy đến khả năng cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai ..................................................................................................47 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng đến khả năng cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai......................................................................................47 3.5. Kết quả 5: Khảo sát ảnh hưởng của các hợp chất hữu cơ: vitamin, đường, nước dừa, khoai tây, bánh dầu và vitamin đến khả năng nhân nhanh chồi và sự sinh trưởng của giống lan Dendrobium mini lai............................................................................50 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ vitamin lên sự tăng sinh chồi trong môi trường lỏng lắc ....................................................................................50 Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của bánh dầu đến khả năng sinh trưởng chồi của giống lan Dendrobium mini lai ...........................................................................53 Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của cơm dừa, bánh dầu đến khả năng sinh trưởng chồi của giống lan Dendrobium mini lai .............................................................59 Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng của cơm dừa, bánh dầu đến sự sinh trưởng của giống lan Dendrobium mini lai ở giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh.............................63 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .....................................................................................67 1. Kết luận ..................................................................................................................67 2. Kiến nghị ................................................................................................................68 TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................................69 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT NAA : α-naphthaleneacetic acid BA : 6-benzyl adenin ABA : abcisic acid IAA : indol acetic acid IBA : indolbutyric acid TDZ : thidiazuron MS : Murasgige và Skoog WPM : Woody Plant Medium PLBs : Protocorm like bodies tTCL : Phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào cắt theo chiều ngang lTCL : Phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào cắt theo chiều dọc NT : Nghiệm thức DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Nồng độ javen và thời gian khử trùng mẫu................................................... 27 Bảng 2.2. Nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thực vật bổ sung vào các môi trường cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai ....................................................... 30 Bảng 2.3. Điều kiện nuôi cấy và nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thực vật bổ sung vào các môi trường cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai .......................... 31 Bảng 2.4. Nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thực vật và vitamin bổ sung vào các môi trường ảnh hưởng đến sự tăng sinh chồi lan Dendrobium mini lai ................. 33 Bảng 2.5. Nồng độ bánh dầu bổ sung vào các môi trường ảnh hưởng đến sự sinh trưởng chồi lan Dendrobium mini lai ............................................................................ 34 Bảng 2.6. Nồng độ cơm dừa và bánh dầu bổ sung vào các môi trường ảnh hưởng đến sự sinh trưởng chồi lan Dendrobium mini lai ......................................................... 35 Bảng 2.7. Nồng độ cơm dừa và bánh dầu bổ sung vào các môi trường ảnh hưởng đến sự sinh trưởng lan Dendrobium mini lai ở giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh............... 36 Bảng 3.1. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ javen và thời gian lắc mẫu lên quá trình khử trùng........................................................................................................................ 38 Bảng 3.2. Ảnh hưởng thành phần khoáng các loại môi trường nuôi cấy đến cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai ........................................................................... 41 Bảng 3.3. Tỉ lệ mẫu sống dưới ảnh hưởng của BA và NAA ........................................ 43 Bảng 3.4. Tỉ lệ mẫu tạo PLBs dưới ảnh hưởng của BA và NAA ................................ 43 Bảng 3.5. Tổng số chồi thu được dưới ảnh hưởng của BA và NAA ........................... 44 Bảng 3.6. Chiều cao chồi trung bình thu được dưới ảnh hưởng của BA và NAA ....... 44 Bảng 3.7. Tỉ lệ mẫu sống dưới ảnh hưởng của BA và NAA nuôi cấy trong điều kiện không có ánh sáng ................................................................................................. 47 Bảng 3.8. Tỉ lệ mẫu tạo PLBs dưới ảnh hưởng của BA và NAA nuôi cấy trong điều kiện không có ánh sáng ......................................................................................... 48 Bảng 3.9. Tổng số chồi thu được dưới ảnh hưởng của BA và NAA nuôi cấy trong điều kiện không có ánh sáng ......................................................................................... 48 Bảng 3.10. Chiều cao chồi trung bình thu được dưới ảnh hưởng của BA và NAA nuôi cấy trong điều kiện không có ánh sáng ................................................................. 49 Bảng 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ vitamin lên sự tăng sinh chồi lan trong môi trường lỏng lắc sau 49 ngày nuôi cấy ............................................................................ 51 Bảng 3.12. Tỉ lệ nhân chồi lan dưới ảnh hưởng của bánh dầu ..................................... 54 Bảng 3.13. Chiều cao cây trung bình dưới ảnh hưởng của bánh dầu ........................... 55 Bảng 3.14. Số lá trung bình thu được dưới ảnh hưởng của bánh dầu .......................... 56 Bảng 3.15. Hình thái, màu sắc lá dưới ảnh hưởng của bánh dầu ................................. 57 Bảng 3.16. Tổng số chồi thu được dưới ảnh hưởng của cơm dừa, bánh dầu ............... 59 Bảng 3.17. Tỉ lệ nhân chồi dưới ảnh hưởng của cơm dừa, bánh dầu .......................... 60 Bảng 3.18. Chiều cao chồi trung bình thu được dưới ảnh hưởng của cơm dừa, bánh dầu ................................................................................................................................. 60 Bảng 3.19. Số lá trung bình thu được dưới ảnh hưởng của cơm dừa, bánh dầu .......... 61 Bảng 3.20. Hình thái, màu sắc lá dưới ảnh hưởng của cơm dừa, bánh dầu ................. 61 Bảng 3.21. Chiều cao cây trung bình thu được dưới ảnh hưởng của cơm dừa, bánh dầu ở giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh......................................................................... 63 Bảng 3.22. Số lá trung bình thu được dưới ảnh hưởng của cơm dừa, bánh dầu ở giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh .................................................................................. 64 Bảng 3.23. Số rễ thu được dưới ảnh hưởng của cơm dừa, bánh dầu ở giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh ........................................................................................................ 64 Bảng 3.24. Hình thái, màu sắc lá dưới ảnh hưởng của cơm dừa, bánh dầu ở giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh.......................................................................................... 66 DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 1.1. Tổng quan về lan Dendrobium ........................................................................ 3 Hình 1.2. Cơ quan sinh sản của lan thuộc họ Ochidaceae .............................................. 7 Hình 1.3. Một số kỹ thuật dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật .............................. 17 Hình 1.4. PLBs được hình thành từ phương pháp tTCL................................................. 22 Hình 2.1. Sơ đồ quy trình khử trùng mẫu ...................................................................... 29 Hình 3.1. Chồi lan non thu nhận ngoài vườn, cắt bớt bao lá và lá ................................ 39 Hình 3.2. Kết quả khử trùng chồi lan theo các nghiệm thức ......................................... 40 Hình 3.3. Lan Dendrobium mini lai nuôi cấy trên môi trường MS, Gamborg B5 và WPM sau 60 ngày.......................................................................................................... 42 Hình 3.4. PLBs sau 60 ngày nuôi cấy trên nghiệm thức 1 đến nghiệm thức 8 ............. 46 Hình 3.5. PLBs sau 60 ngày nuôi cấy trên nghiệm thức 1 đến nghiệm thức 8 trong điều kiện không có ánh sáng ................................................................................................. 50 Hình 3.6. Sự tăng sinh chồi lan trong môi trường lỏng lắc sau 49 ngày nuôi cấy từ nghiệm thức 1 đến nghiệm thức 6 ................................................................................. 52 Hình 3.7. Hình thái chồi lan trong môi trường lỏng lắc sau 49 ngày nuôi cấy từ nghiệm thức 1 đến nghiệm thức 6 ................................................................................. 53 Hình 3.8. Chồi lan Dendrobium mini lai trên các loại môi trường bánh dầu khác nhau sau 49 ngày nuôi cấy từ nghiệm thức 1 đến nghiệm thức 6 ................................. 58 Hình 3.9. Chồi lan Dendrobium mini lai trên các loại môi trường bánh dầu khác nhau sau 49 ngày nuôi cấy từ nghiệm thức 7 đến nghiệm thức 12 ............................... 59 Hình 3.10. Lan Dendrobium mini lai trên môi trường MS có bổ sung cơm dừa và bánh dầu xử lý nhiệt sau 49 ngày nuôi cấy từ nghiệm thức 1 đến 6 ............................. 62 Hình 3.11. Lan Dendrobium mini lai ở giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh trên môi trường MS có bổ sung cơm dừa và bánh dầu xử lý nhiệt sau 49 ngày nuôi cấy ........... 66 1 MỞ ĐẦU  Đặt vấn đề Ngày nay với nền kinh tế ngày càng phát triển, thì nhu cầu vật chất của con người ngày càng được cải thiện và nâng cao. Và đặc biệt nhu cầu tinh thần của người dân là không thể thiếu. Một trong những cách mà con người đã chọn để làm đẹp cho cuộc sống của mình là trồng hoa và cây cảnh. Việc lựa chọn từng loại hoa trồng tùy theo sở thích, vẻ đẹp của hoa và điều kiện nuôi trồng. Trong đó, hoa lan là hoa được nhiều người ưa thích. Hoa lan là loài hoa vương giả, với vẻ đẹp kiêu kì huyền bí, có vai trò quan trọng trong đời sống tinh thần và kinh tế. Ngoài ra chúng có hình dáng, màu sắc, kích thước phong phú và đa dạng, rất phù hợp với điều kiện khí hậu Việt Nam nên chúng được sản xuất khá phổ biến. Hoa lan ở nước ta rất phong phú và đa dạng, có nhiều giống khác nhau như: Cattleya, Phalaenopsis, Oncidium, Mokara, Vanda, Dendrobium… chúng đều cho hoa rất đẹp và mang nhiều màu sắc khác nhau. Hoa lan có thể dùng để trang trí, trưng bày, làm quà tặng… hay người ta có thể bán hoa, cắt cành kinh doanh. Trong số đó có lẽ Dendrobium là giống khá phong phú từ màu sắc, dạng hoa cho đến giống, loài. Mặt khác, Dendrobium cũng rất dễ trồng, siêng hoa và lâu tàn. Do đó, nó được ưa chuộng và được trồng phổ biến ở nước ta hiện nay nhằm phục vụ cho nhu cầu cuộc sống. Trong nhóm Dendrobium, giống lan Dendrobium mini đang được ưa chuộng tại các thị trường đặc biệt là Nhật và Hàn Quốc với nhiều nguyên nhân như: dễ trồng, không đòi hỏi nhiều diện tích trồng nhưng lại sản xuất được nhiều cây, lợi nhuận mang đến lớn hơn kỳ vọng, ra hoa quanh năm và lâu tàn (hoa có thể kéo dài từ 2-3 tháng), thích hợp trưng bày trên từng bàn làm việc hoặc cho cả phòng họp lớn, thích hợp cho đủ loại bình, chậu khác nhau. Một số giống lan Dendrobium mini với sắc hoa từ trắng tuyền đến hồng, hồng phớt, hồng nhạt và điểm vàng… Tuy nhiên, giống lan Dendrobium mini trên thị trường Việt Nam hiện nay chưa phong phú về màu sắc, nhiều giống còn mang những khuyết điểm như: thân cây yếu, phát hoa ngắn, hoa mau tàn, màu sắc hoa nhợt nhạt…, số lượng hoa trên thị trường không nhiều để phục vụ cho nhu cầu của con 2 người. Nên việc nhân giống lan Dendrobium mini để thỏa mãn sự hiếu kì của khách hàng và thu lại lợi ích kinh tế là một việc làm cần thiết. Phương pháp nuôi cấy in vitro là phương pháp duy nhất hiện nay có thể nhân giống lan trên qui mô công nghiệp, các cây lan con được sản xuất hoàn toàn giống nhau từ một cây bố mẹ quí mới được lai tạo và được xem là có giá trị sau lần ra hoa đầu tiên. Do đó, đề tài “Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của giống lan Dendrobium mini lai trong điều kiện nuôi cấy in vitro” được thực hiện.  Mục tiêu của đề tài - Xác định được phương pháp khử trùng mẫu. - Xác định được môi trường cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai tốt nhất. - Xác định môi trường nhân chồi lan Dendrobium mini lai tối ưu trong điều kiện in vitro. - Xác định môi trường tạo cây lan con Dendrobium mini lai hoàn chỉnh tốt nhất trong điều kiện in vitro.  Đối tượng nghiên cứu Giống lan Dendrobium mini lai.  Nội dung nghiên cứu Khảo sát quy trình khử trùng mẫu. Khảo sát môi trường cảm ứng tạo chồi. Khảo sát môi trường nhân chồi Dendrobium mini lai trong điều kiện in vitro. Khảo sát môi trường tạo cây lan con Dendrobium mini lai hoàn chỉnh trong điều kiện in vitro.  Thời gian nghiên cứu Từ tháng 01/12/2013 đến 31/01/2014: Viết và bảo vệ đề cương. Từ tháng 2/2014 đến tháng 8/2014: Thu mẫu, thực nghiệm, lặp lại nghiệm thức. Tháng 8/2014: Hoàn thành luận văn.  Nơi thực hiện đề tài Phòng thí nghiệm bộ môn Sinh học, trường Đại học Sài Gòn. 3 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Sơ lược đặc điểm lan Dendrobium và lan Dendrobium mini Vị trí phân loại: Lan Dendrobium thuộc: - Giới: Plantae (Thực vật) - Ngành: Angiospermatophyta (Thực vật Hạt kín) - Lớp: Liliopsida (Monocotyledones) (Một Lá mầm) - Lớp phụ: Liliidae (Bạch huệ) - Bộ: Orchidales (Bộ Lan) - Họ: Orchidaceae (Phong lan) - Giống: Dendrobium sp. Hình 1.1. Tổng quan về lan Dendrobium [20] Họ Orchidaceae có khoảng 750 chi, 25000 loài, chiếm vị trí thứ hai sau họ Cúc trong ngành thực vật Hạt kín và là họ lớn nhất trong ngành Một lá mầm. Các loài trong hệ thống này phân bố rất rộng, do đó hình thái và cấu tạo cũng hết sức đa dạng và phức tạp [10]. Giống lan Dendrobium được đặt tên vào năm 1799, rất phong phú về chủng loại, với khoảng 1600 loài phân bố trên các vùng thuộc Châu Á nhiệt đới, tập trung nhiều nhất ở Đông Nam Á và Úc Châu. 4 Tên Dendrobium có nguồn gốc từ chữ Hy Lạp. Dendron nghĩa là cây gỗ và bios là tôi sống. Dendrobium là giống phụ sinh, sống trên cây gỗ. Có người gọi là Hoàng Lan, có người gọi là Đăng Lan. Dendrobium có trên 1.600 loài và chia thành 2 dạng chính [17]: - Dạng đứng (Dendrobium phalaenopsis) thường mọc ở xứ nóng, chịu ẩm và rất siêng ra hoa với các giống tiêu biểu như: Nhất điểm hồng, Nhất điểm hoàng, Báo hỉ, Ý thảo, Thủy tiên, Sonia. - Dạng thòng (Dendrobium nobile) chịu khí hậu mát mẽ với các giống tiêu biểu như: Giả hạc, Hạc vĩ, Long tu, Phi điệp vàng. Với 1600 loài khác nhau đòi hỏi nhiều cách chăm sóc khác nhau, nguyên do là vì chúng du nhập từ nhiều địa danh khác nhau như Nhật Bản, Triều Tiên và Newzealand, đặc biệt là Guinea là nơi sản sinh ra nhiều loài Dendrobium nhất [1]. Ở Việt Nam, Dendrobium có đến 100 loài, xếp trong 14 tông được phân biệt bằng thân (giả hành), lá và hoa [14]. Dendrobium là loài lan sống trên các cành cây nhưng không cộng sinh, phân bố nhiều ở Châu Âu và Nam Thái Bình Dương, được tìm thấy nhiều ở Châu Úc, Tân Guinea, Thái Lan, Việt Nam và dãy núi Himalaya. Dendrobium được trồng phục vụ cho lan chậu và lan cắt cành. Hiện nay, thị trường Dendrobium ngày càng đa dạng và phong phú do các loại lan lai có nguồn gốc khác nhau [10]. Điều kiện sinh thái của Dendrobium rất đa dạng, có loài chỉ mọc và ra hoa ở vùng lạnh, có loài ở vùng nóng, có loài ở trung gian, và cũng có loài thích nghi với điều kiện khí hậu nào.  Lan Dendrobium mini Lan Dendrobium mini là một loài lai tạo, thân đứng. Loài lan này được chọn lọc từ Thái Lan và được du nhập vào nước ta. Đặc điểm của loài lan này là cây dạng bụi, lùn (chỉ cao 15 – 20 cm), nhưng ra hoa rất nhiều, hoa nở quanh năm. Cây nhỏ nhưng nhảy chồi rất mạnh, nhảy chồi ngay cả trên các thân già hay cây suy yếu. Hoa có kích thước không lớn chỉ khoảng 4 x 5 cm nhưng hoa rất đẹp, số hoa trên cành nhiều từ 6 - 13 hoa, hoa rất bền lâu tàn (1,5 – 2 tháng). Thông thường trên một giả hành có tới 3 - 4 phát (cành) hoa, nếu cây tốt có thể lên đến 5 phát hoa [5]. 5 1.1.1. Đặc điểm hình thái Dendrobium thuộc nhóm đa thân, vừa có thân thật vừa có giả hành. Giống lan này đều có bộ phận sinh dưỡng như rễ, thân, giả hành, lá và cơ quan sinh sản như hoa, trái [14]. - Dendrobium có hệ rễ khí sinh, có một lớp hú tẩm dày bao quanh gồm những lớp tế bào chết chứa đầy không khí nên rễ ánh lên màu xanh bạc. Vì vậy, rễ hút được nước mưa chảy dọc trên vỏ cây gỗ hay nước lơ lửng trong không khí, hơi sương và hơi nước, giúp cây hút dinh dưỡng và chất khoáng, mặt khác giúp cây bám chặt vào giá thể, không bị gió cuốn. Một số loài có thân lá kém phát triển thậm chí tiêu giảm hoàn toàn, có hệ rễ chứa diệp lục tố giúp cây hấp thụ ánh sáng cần thiết cho sự ra hoa và quang hợp [14]. Rễ lan Dendrobium cũng giống như rễ lan Vũ Nữ, Cattleya thuộc loại rễ bán gió, không chịu được lạnh, nếu bị lạnh trong thời gian dài rễ cây sẽ bị mục nát và cây bị chết [10]. Nhóm này thường có rễ nhỏ nhưng rất nhiều rễ, chủ yếu bám vào giá thể, vào thân cây để hút dưỡng chất dính vào giá thể như nước, cho nên khi trồng vào chậu, phải để giá thể nhiều hơn, gần như toàn bộ rễ đều bám vào giá thể, vào thành chậu, chỉ có một số ít rễ chìa ra ngoài. Đối với lan, rễ bán gió phải trồng với giá thể nhỏ hơn và nhiều hơn, để bộ rễ bám dày đặc hút nhiều dưỡng chất [17]. - Thân: Dendrobium thuộc nhóm đa thân (còn gọi là nhóm hợp trục) có hệ thống nhánh nằm ngang bò dài trên giá thể hoặc nằm sâu trong đất gọi là thân rễ. Một số Dendrobium lá chỉ có ở các mầm non, là loài chóng tàn, chóng vàng úa và rụng vào mùa thu, thân phình to giống như củ không có lá là nơi dự trữ năng lượng [2]. - Giả hành: Là những đoạn phình to, bên trong có các mô mềm chứa dịch nhày làm giảm sự mất nước và dự trữ chất dinh dưỡng để nuôi cây trong điều kiện khô hạn khi cây sống bám trên cao. Ngoài ra giả hành còn chứa diệp lục tố nên có thể quang hợp được [14]. Hình dạng và kích thước của giả hành rất đa dạng: hình cầu, thuôn dài hay hình trụ xếp chồng lên nhau tạo thành thân có lá mọc xen kẽ. Một số loài ở xứ lạnh chỉ có nhiệm vụ dự trữ chất dinh dưỡng nên giả hành không có màu xanh nhưng phía trên có nang lá [10]. 6 - Lá: Các lá mọc xen kẽ nhau và ôm lấy thân giả do lá có tận cùng bằng một cuốn thay thuôn dài xuống thành bẹ ôm thân, hình dạng và cấu trúc lá rất đa dạng [14]. Lá có hình kim, trụ có rãnh hay phiến mỏng. Dạng lá mềm mại mọng nước, nạc, có màu xanh bóng, đậm hay nhạt tùy thuộc vào vị trí sống của cây. Phiến lá trải rộng hay gấp lại theo gân vòng cung như cái quạt hay chỉ gấp lại theo gân giữa như hình chữ V. Những lá sát dưới gốc đôi khi giảm đi chỉ còn những bẹ không phát triển hay giảm hẳn thành vảy [10]. Các loài thuộc giống Dendrobium vùng nhiệt đới nói riêng và họ Orchidaceae nói chung đôi khi rụng lá vào mùa khô hạn. Sau đó, cây ra hoa hay sống ẩn để khi gặp mưa thì cho chồi mới [2]. - Hoa: Dendrobium thuộc nhóm phụ ra hoa ở nách lá. Chồi hoa mọc từ các mắt ngủ giữa các đọt lá trên thân gần ngọn và cả trên ngọn cây. Sự biểu hiện trước khi ra hoa khác biệt như có nhiều loài rụng hết lá trước khi ra hoa. Thời gian ra hoa đầu mùa mưa hay đầu tết. Giống Dendrobium khi đủ dinh dưỡng thì cho hoa thành từng chùm, phát hoa dài và thời gian ra hoa trung bình 1-2 tháng. Hoa có thể mọc từ thân thành từng chùm hay từng hoa. Hoa có màu trắng, vàng đến tím. Thường lá đài sau nằm một mình, hai lá đài bên dài ra dính lại với nhau ở mép dưới và dính vào đáy của trụ tạo thành một phần dưới chân của trụ phía dưới gọi là cằm. Môi gắn vào cằm, đôi khi kéo dài về phía sau tạo thành cựa, móc hay túi. Môi nguyên hay có thùy, gai, sọc có lông hoặc không. Hai cánh hoa bên giống như hai lá đài. Trụ thấp, phần đực của đỉnh trụ có nắp đậy, nắp gắn vào trụ nhờ một chỉ ngắn về phía sau, bốn khối phấn nhỏ dính lại với nhau từng cặp [14]. - Quả: Họ Orchidaceae đều có quả thuộc loại quả nang, khi hạt chín, các nang bung ra chỉ còn dính nhau ở phần đỉnh và gốc. Ở một số loài, khi chín quả không nứt ra nên hạt chỉ ra khỏi quả khi quả bị mục nát [10]. 7 a) b) Hình 1.2. Cơ quan sinh sản của lan thuộc họ Ochidaceae [20] a) Cấu tạo hoa chi tiết b) Quả lan 1.1.2. Điều kiện sinh thái 1.1.2.1. Nhiệt độ Nhiệt độ tác động ở cây lan qua con đường quang tổng hợp, cường độ quang hợp gia tăng theo nhiệt độ, thường nhiệt độ tăng 10 % thì tốc độ quang hợp tăng lên gấp đôi. Nhiệt độ còn ảnh hưởng đến sự ra hoa ở một số loài lan như lan Bạch Câu Dendrobium crumenatum đòi hỏi giảm nhiệt độ khoảng 5 - 6oC trong vài giây thì 9 ngày sau chúng sẽ nở hoa đồng loạt. Ở 18,5oC, Dendrobium nobile chỉ tăng trưởng mà không ra hoa nhưng chúng sẽ ra hoa khi nhiệt độ hạ xuống 13oC hay thấp hơn [9]. Căn cứ vào nhu cầu nhiệt độ, có thể tạm chia Dendrobium thành hai nhóm chính [11]: - Nhóm ưa lạnh: sinh trưởng và phát triển tốt ở nhiệt độ lý tưởng là 150C, gồm các giống được lấy từ các vùng cao nguyên ở độ cao trên 1.000m. Các loài này nếu được trồng ở nhiệt độ cao hơn hoặc bằng 25oC, thì cây vẫn sống nhưng hiếm khi ra hoa. - Nhóm ưa nóng: nhiệt độ thích hợp cho các loài của nhóm này là 25oC, gồm đa số các giống Dendrobium ở vùng nhiệt đới, và các loài của giống Dendrobium lai hiện đang trồng tại thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh phía Nam. Ngoài ra, còn có một nhóm Dendrobium trung gian có thể sống ở cả vùng lạnh và vùng nóng, nhưng ở vùng lạnh cây sinh trưởng và ra hoa nhiều hơn như Dendrobium primulinum, Dendrobium farmeri nhiệt độ lý tưởng của các loài này là 20oC. 8 1.1.2.2. Độ ẩm và chế độ tưới nước Các cây lan sống bám trên các cây cao, chúng lấy nước từ các trận mưa, từ hơi nước trong không khí. Chính ẩm độ quyết định sự hiện diện của các loài phong lan. Trong thời kỳ sinh trưởng cần tưới đủ, nhất là vào mùa nóng. Giữa các lần tưới cần xem xét các giá thể trồng có bị đọng nước không. Khô hoặc gần khô là tốt nhất. Phải đảm bảo cho giá thể trồng được thông thoáng làm cho rễ lan có lúc khô, và được khô từng lúc là điều rất quan trọng. Chế độ thở của lan có một phần nhờ vào rễ. Thời kỳ sinh trưởng độ ẩm cần từ 60 đến 70 %. Thời kỳ nghỉ cần giảm thích đáng. Dendrobium cũng giống như các giống lan khác chỉ phát triển tốt trong không khí ẩm và thoáng. Ẩm độ tương đối cần thiết là 40 – 70%. Cấu tạo giá thể quá ẩm và úng thì bộ rễ sẽ bị thối và biểu hiện là cây con mọc ra từ phần ngọn của thân [19]. 1.1.2.3. Ánh sáng Dendrobium là loài lan ưa sáng (60 – 70 %), rất thích hợp với ánh sáng mạnh, có những loài yêu cầu ánh sáng tới 80 – 90 %. Nhờ đó mà chúng phát triển được các giả hành thật mạnh mẽ, tất nhiên không để ánh nắng chiếu trực tiếp có thể làm cháy lá [16]. Nếu thừa ánh sáng cây sẽ bị vàng lá, giả hành bị teo lại, cây xấu đi nhưng cây sẽ thích nghi dần, vẫn ra hoa nhiều và đẹp. Nếu thiếu ánh sáng, cây sẽ bị thoái hóa rõ rệt, cây èo uột và số lượng hoa sẽ ít đi [20]. 1.1.2.4. Nhu cầu dinh dưỡng Dendrobium thân đứng đòi hỏi dinh dưỡng cao, chúng cần rất nhiều phân bón và có thể dùng nhiều dạng phân bón khác nhau. Còn các loại Dendrobium thân thòng hấp thu phân chậm nên phải dùng nồng độ thật loãng. Các loại phân hữu cơ như: phân heo, bánh dầu khô, phân tôm cá, phân trâu có thể dùng rất tốt bằng cách phân bò khô pha loãng với nước rồi tưới, hoặc vò chặt từng viên đặt trên bề mặt giá thể, rễ lan sẽ hấp thụ dần dần các dưỡng chất được phóng thích qua quá trình tưới nước. Các loại phân vô cơ được dùng thường có công thức 30 – 10 – 10 dùng 3 lần/tuần với nồng độ 1 muỗng cà phê/4 lít. Trong suốt mùa tăng trưởng, ta bón phân 10 – 20 – 30 làm 2 lần/tuần để tạo một sức chịu đựng cho cây trước khi bước vào mùa nghỉ. Trong mùa tăng trưởng nếu cây có nụ hoa, thay phân 30 – 10 – 10 bằng phân 10 – 20 – 20 với chu kỳ bón như trên cho đến khi hoa tàn. Trong 9 mùa nghỉ hoàn toàn không bón phân cho Dendrobium, hay đúng hơn giảm và không bón phân cho Dendrobium khi cây hoàn tất thời kì tăng trưởng hằng năm của nó. Thường phân bón được dùng ở dạng hỗn hợp và bổ sung thêm các chất phụ gia là các sinh tố và các nguyên tố vi lượng. 1.1.3. Các phương pháp nhân giống cây lan Dendrobium và Dendrobium mini ngoài tự nhiên 1.1.3.1. Giao phấn Giao phấn trong tự nhiên là hiện tượng thông thường, gần như bắt buộc đối với hầu hết các loài lan. Đó là nguyên nhân vì sao họ lan có số lượng chủng loại rất phong phú. Đó cũng là phương thức tồn tại, phát triển và tiến hoá ưu thế hơn cả của họ thực vật này trong hướng thụ phấn nhờ côn trùng. Việc giao phấn đều tạo ra những giống mới, qua chọn lọc, có những đặc tính hơn hẳn cây bố mẹ. 1.1.3.2. Phương pháp tách chiết Phương pháp này dùng để tách các chậu lan quá đầy, đồng thời làm tăng số lượng cây mới. Các giả hành già đựợc tách ra khi hoa đã tàn và chỉ tách khi đã trồng đựợc từ 2 - 3 năm. Giả hành già được ươm lại trên giá thể ẩm để tạo chồi con, các chồi con được nuôi cùng với giả hành cho đến lúc đã tạo ra rễ mới, đủ sức phát triển mới tách lần thứ hai. Từ một giả hành có thể cho mỗi đợt 1 - 2 cây con. Phương pháp chiết tách đảm bảo được tính chất di truyền của cây bố mẹ nhưng lại cho một thế hệ cây con sinh trưởng không đồng đều nên khó cung cấp một số lượng cây con lớn để phục vụ cho nuôi trồng với quy mô lớn. 1.2. Sơ lược phương pháp nhân giống in vitro 1.2.1. Lược sử phát triển của công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật Nuôi cấy mô tế bào thực vật là thuật ngữ mô tả các phương thức nuôi cấy các bộ phận thực vật trong ống nghiệm có chứa môi trường trong điều kiện vô trùng. Đối tượng nuôi cấy bao gồm từ các cấu trúc có tổ chức như đỉnh sinh trưởng, chồi bất định, phôi đến các cấu trúc không có tổ chức như mô sẹo, dịch huyền phù tế bào, tế bào trần (protoplast) [18]. Năm 1665 Robert Hook quan sát được tế bào sống dưới kính hiển vi và đưa ra khái niệm tế bào.