Tài liệu Khảo sát ảnh hưởng của enzyme protease đến hiệu quả tách chiết phycocyanin từ tảo spirulina

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH - MÔI TRƯỜNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA ENZYME PROTEASE ĐẾN HIỆU QUẢ TÁCH CHIẾT PHYCOCYANIN TỪ TẢO SPIRULINA LÂM THỊ PHƯƠNG THÃO Đà Nẵng, năm 2022 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH - MÔI TRƯỜNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA ENZYME PROTEASE ĐẾN HIỆU QUẢ TÁCH CHIẾT PHYCOCYANIN TỪ TẢO SPIRULINA Ngành : Công nghệ sinh học Khóa : 2018-2022 Sinh viên : Lâm Thị Phương Thão Người hướng dẫn : Th.S Nguyễn Thị Bích Hằng Đà Nẵng, năm 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan các dữ liệu trình bày trong khóa luận này là trung thực. Đây là kết quả nghiên cứu của chúng tôi dưới sự hướng dẫn của ThS. Nguyễn Thị Bích Hằng công tác tại khoa Sinh – Môi trường, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác trước đây. Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm nếu vi phạm bất kỳ quy định nào về đạo đức khoa học. Tên SV (Ký tên) Lâm Thị Phương Thão i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm và giúp đỡ từ cá nhân và tập thể trong suốt thời gian thực hiện. Đầu tiên tôi xin chân thành bày tỏ lòng cảm ơn quý báu tới ThS. Nguyễn Thị Bích Hằng và T.S Trịnh Đặng Mậu, người đã tận tâm dẫn định hướng và tận tình chỉ dạy tôi những kiến thức về mặt chuyên môn cũng như đã tạo mọi điều kiện hỗ trợ tôi thực hiện và hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô giáo khoa Sinh – Môi trường, trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu, xây dựng thành công khóa luận. Tôi xin cảm ơn tập thể lớp 18 CNSH các bạn sinh viên NCKH tại phòng công nghệ sinh học đã luôn động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn đến gia đình tôi đã luôn lo lắng, chăm sóc và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này. Tôi xin chân thành cảm ơn ! Đà Nẵng, ngày 20 tháng 05 năm 2022 Sinh viên Lâm Thị Phương Thão ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................................. i LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................... ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ....................................................................................... vi DANH MỤC BẢNG BIỂU ............................................................................................ vii DANH MỤC HÌNH ẢNH ............................................................................................. viii TÓM TẮT ........................................................................................................................ ix MỞ ĐẦU ...........................................................................................................................1 1. Tính cấp thiết của đề tài .................................................................................................1 2. Mục tiêu đề tài ...............................................................................................................2 3. Ý nghĩa của đề tài ..........................................................................................................2 3.1. Ý nghĩa khoa học ........................................................................................................2 3.2. Ý nghĩa thực tiễn .........................................................................................................2 4. Nội dung nghiên cứu .....................................................................................................2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU...........................................................................3 1.1 Giới thiệu chung về tảo Spirulina ................................................................................3 1.2. Đặc điểm sinh học của tảo Spirulina .........................................................................3 1.2.1. Phân loại...................................................................................................................3 1.2.2. Đặc điểm hình thái và cấu trúc tế bào ......................................................................4 1.3. Thành phần hóa học của tảo Spirulina........................................................................5 1.4. Giá trị dinh dưỡng .......................................................................................................6 1.5. Tổng quan về enzyme protease (Alcalase) .................................................................7 1.5.1. Giới thiệu chung.......................................................................................................7 1.5.2. Cấu trúc ....................................................................................................................8 1.6. Giới thiệu chung về phương pháp bề mặt đáp ứng (rsm) ...........................................9 iii 1.7. Tình hình nghiên cứu ................................................................................................11 1.7.1. Thế giới ..................................................................................................................11 1.7.2. Việt Nam ................................................................................................................13 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................16 2.1. Vật liệu và phạm vi nghiên cứu ................................................................................16 2.1.1. Vật liệu nghiên cứu ................................................................................................16 2.1.2. Phạm vi nghiên cứu ...............................................................................................16 2.2. Phương pháp nghiên cứu ..........................................................................................16 2.2.1. Quy trình chiết xuất dịch tảo từ sinh khối tảo khô.................................................16 2.2.2. Khảo sát nồng độ enzyme protease........................................................................17 2.2.3. Khảo sát nhiệt độ chiết nguyên liệu .......................................................................17 2.2.4. Khảo sát thời gian chiết nguyên liệu......................................................................18 2.2.5. Phương pháp khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa ....................................................18 2.2.6. Phương pháp khảo sát kháng khuẩn ......................................................................18 2.2.7. Tối ưu hóa điều kiện chiết tảo Spirulina bằng phương pháp bề mặt đáp ứng (rsm)19 2.2.8. Phương pháp xử lý số liệu .....................................................................................20 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..................................................................21 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme protease đến hiệu suất chiết xuất của tảo Spirulina ......................................................................................................................................21 3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất chiết xuất của tảo Spirulina ........................25 3.3. Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất chiết xuất của tảo Spirulina .......................27 3.4. Tối ưu hóa điều kiện chiết xuất đến hiệu suất dịch chiết bằng phương pháp bề mặt đáp ứng ...............................................................................................................................28 3.5. Khả năng kháng oxi hóa của dịch chiết xuất từ tảo Spirulina ..................................33 3.6. Khả năng kháng khuẩn của dịch chiết xuất từ tảo Spirulina ....................................35 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .........................................................................................38 1. Kết luận ........................................................................................................................38 iv 2. Kiến nghị ......................................................................................................................38 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...............................................................................................39 PHỤ LỤC.........................................................................................................................46 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ABTS+ : 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt BBD : Box-Behnken design CCD : Central composite design DPPH :1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl FFD : Full factorial design H : Hăng suất chiết LHD : Latin hypecube design OD : Optical density PC : Phycocyanin RSM : Phương pháp bề mặt đáp ứng UAE : Siêu âm vi DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng Tên bảng Trang Bảng 2.1 Thể hiện giá trị thực của các biến độc lập và mã thí 20-21 nghiệm. Bảng 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme protease đến hiệu quả 23 chiết xuất tảo Spirulina. Bảng 3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu quả chiết xuất tảo 26 Spirulina. Bảng 3.3 Bảng 3.4 Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu quả chiết xuất tảo Spirulina. Thể hiện giá trị ước tính và mức độ ý nghĩa của các 28 30 hằng số hồi quy trong mô hình dự đoán hiệu suất chiết xuất dịch tảo dựa trên các biến nồng độ của enzyme, thời gian và nhiệt độ. Bảng 3.5 Thể hiện giá trị khảo sát các biến độc lập và mã thí 33 nghiệm. Bảng 3.6 Khả năng kháng khuẩn của dịch chiết tảo Spirulina. vii 36 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình Tên hình vẽ Trang Hình 1.1 Hình thái tảo Spirulina. 4 Hình 1.2 Thành phần hóa học của tảo Spirulina. 6 Hình 1.3 Enzyme protease. 8 Hình 1.4 Quy trình thiết kế mô hình tối ưu hóa trong 11 phương pháp bề mặt đáp ứng. Hình 2.1 Quy trình chiết xuất dịch tảo từ sinh khối khô tảo 17 Spirulina. Hình 3.1 Hiệu suất chiết xuất của dịch tảo ở các nồng độ 23 enzyme protease khác nhau. Hình 3.2 Dịch chiết xuất của tảo Spirulina sau khi chiết 24-25 xuất. Hình 3.3 Hiệu suất chiết xuất của dịch tảo ở các nhiệt độ 27 khác nhau. Hình 3.4 Hiệu suất chiết xuất của dịch tảo ở các thời gian 29 khác nhau. Hình 3.5 Mô hình phản ứng bề mặt 2D và 3D của hiệu suất 32 dịch bị ảnh hưởng bởi các biến độc lập: Thời gian, nhiệt độ và nồng độ bằng phương pháp đáp ứng bề mặt. Hình 3.6 Kháng oxi hóa của dịch chiết xuất và VTMC. 34 Hình 3.7 Hoạt tính kháng oxi hóa của dịch chiết xuất từ tảo 35 Spirulina. Hình 3.8 Vòng vô khuẩn Escherichia coli, Salmonella typhi, Staphylococcus aureu, Pseudomonas aeruginosa từ dịch chiết xuất tảo Spirulina. viii 37 TÓM TẮT Tảo Spirulina được ứng dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm. Việc chiết xuất hợp chất này bằng phương pháp thông thường dẫn đến hiệu suất thấp và thời gian xử lý lâu hơn. Nghiên cứu này thực hiện khảo sát ban đầu về ảnh hưởng của enzyme protease đến hiệu quả chiết xuất của tảo Spirulina. Nhằm tìm ra được tổ hợp các yếu tố tối ưu (thời gian, nhiệt độ và nồng độ) có sự hỗ trợ của enzyme protease để chiết xuất các hợp chất từ tảo Spirulina. Phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) được sử dụng để tìm ra các điều kiện tối ưu với các biến: nhiệt độ (T = 50 – 60ºC), thời gian (20 – 40 phút) và nồng độ (0,1 – 0,2%). Kết quả cho thấy, quá trình tối ưu hóa bằng phương pháp bề mặt đáp ứng (rsm) cho hiệu suất chiết xuất tối đa đạt được 24,05% ở thời gian 30 phút, nhiệt độ 56℃ và nồng độ 0,2%. Hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết đạt được 65,43 ± 1,363%. Bên cạnh đó, dịch chiết xuất từ tảo Spirulina có khả năng ức chế vi sinh vật gây hại như: Escherichia coli, Salmonella typhi, Staphylococcus aureu, Pseudomonas aeruginosa vùng ức chế vi sinh vật có kích thước lần lượt là: 10 ± 0,816 mm, 12 ± 0,945 mm, 11 ± 0,476 mm, 11 ± 0,571 mm, tốt hơn so với đối chứng. Kết quả của nghiên cứu này cho thấy enzyme protease có thể cải thiện đáng kể hiệu quả quá trình chiết xuất dịch chiết từ tảo Spirulina và tổ hợp các yếu tố tối ưu để chiết xuất dịch tảo trong các ngành công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm. Từ khóa: Phycocyanin, Spirulina, enzyme protease, kháng oxi hóa, kháng khuẩn. ix MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Từ ngày xưa, con người đã biết sử dụng nguồn thực phẩm giàu dinh dưỡng, những vị thuốc từ thiên nhiên để loại trừ bệnh tật và có được cơ thể khỏe mạnh. Ngày nay, cùng với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, nhiều công trình nghiên cứu đã lần lượt ra đời nhằm tìm ra những hoạt chất quý hiếm từ thiên nhiên có nhiều ứng dụng trong y học. Không những thế, những hoạt chất này còn mang lại nhiều ứng dụng quan trọng trong ngành thực phẩm và mỹ phẩm. Trong đó, không thể không nhắc đến các sản phẩm từ tảo Spirulina – loại thần dược được biết đến với nhiều giá trị dược lý đã được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu và công bố các kết quả về dược tính. Các loài tảo Spirulina có hoạt tính sinh học và giá trị dinh dưỡng cao do đó chúng có vai trò trong điều hòa chức năng sinh học và miễn dịch. Hiện nay tảo Spirulina là loại vi tảo được tiêu thụ nhiều nhất bởi những lợi ích mà nó mang lại như: giàu protein, chứa hàm lượng cao acid hypocholesterolemic γ-linoleic (GLA), vitamin B và các phycobiliprotein tự do (Sajilata, Singhal, and Kamat 2008). Nhờ khả năng chống oxy hóa và đặc tính chống viêm nên phycocyanin đã được ứng dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm (Kuddus và cs, 2013). Do đó nó đã được Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) gán danh hiệu là “siêu thực phẩm” (Khan, Bhadouria, and Bisen 2005), Với những đặc tính quý giá của tảo Spirulina nên việc nghiên cứu sản xuất các sản phẩm giàu hoạt chất sinh học là thật sự cần thiết đối với nhu cầu của con người. Nhằm thu được hàm lượng hợp chất sinh học cao nhất thì việc chiết xuất các hoạt chất trong tảo Spirulina phụ thuộc nhiều yếu tố khác nhau. Trong đó việc sử dụng dung môi là nước đang được ứng dụng rộng nhất, vì nước là dung môi có giá thành rẻ, không gây độc. Tuy nhiên, chưa tìm ra được phương pháp nào hợp lý và hiệu quả nhất, còn hạn chế bởi hiệu suất tách chiết thấp, chi phí cao để loại bỏ dung môi và hàm lượng các hợp chất tách chiết chưa được cao. Hiện nay, trong ngành công nghiệp sản xuất y dược, thực phẩm, mỹ phẩm enzyme protease được sử dụng rất phổ biến. Enzyme như một công cụ hỗ trợ có nhiều ưu điểm so với sử dụng hóa chất, trong đó có độ đặc hiệu cao, hiệu quả của xúc tác ở nhiệt độ vừa phải và thân thiện với môi trường. Enzyme protease thường được dùng để tăng chất lượng thực phẩm, thức ăn và gia súc hoặc tăng hiệu suất tách chiết các chất từ nguyên liệu thực vật. 1 Trên thế giới đã có công trình nghiên cứu về enzyme dùng để tách chiết tảo Spirulina nhưng tại Việt Nam việc sử dụng enzyme trong tách chiết còn hạn chế. Với một nguyên liệu tự nhiên giàu chất dinh dưỡng và có nhiều ứng dụng như tảo Spirulina nên việc nghiên cứu tạo ra sản phẩm từ nguyên liệu này là thật sự cần thiết đối với nhu cầu thiết yếu của con người. Với mong muốn thu được hàm lượng các hợp chất sinh học cao nhất, góp phần đa dạng hóa các sản phẩm từ tảo Spirulina, kéo dài thời gian bảo quản và tạo ra sản phẩm mới giàu giá trị dược lý, sản phẩm có lợi cho sức khỏe cũng như đáp ứng được nhu cầu của người sử dụng trong việc điều trị bệnh. Do đó, tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Khảo sát ảnh hưởng của enzyme protease đến hiệu quả chiết xuất phycocyanin từ tảo Spirulina”. 2. Mục tiêu đề tài Tối ưu hóa điều kiện tách chiết phycocyanin từ tảo Spirulina bằng enzyme protease đạt hiệu quả và hoạt tính sinh học cao. 3. Ý nghĩa của đề tài 3.1. Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp một số dẫn liệu khoa học về các yếu tố ảnh hưởng để quá trình tách chiết phycocyanin từ tảo Spirulina bằng enzyme protease. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn Việc khảo sát và tìm ra những khoảng giá trị của các yếu tố sẽ giúp cho việc tách chiết phycocyanin từ tảo Spirulina một cách hiệu quả nhất, từ đó có thể áp dụng cho các quy trình tách chiết phycocyanin từ tảo Spirulina ứng dụng trong sản xuất y dược phẩm, thực phẩm và cả trong mỹ phẩm từ tảo Spirulina. Và kết quả cũng là tiền đề mở ra hướng nghiên cứu và phát triển sản phẩm mới từ tảo tốt cho sức khỏe của con người. 4. Nội dung nghiên cứu - Khảo sát nồng độ enzyme protease ảnh hưởng đến hiệu suất tách chiết phycocyanin từ tảo Spirulina. - Khảo sát thời gian đến hiệu tách chiết phycocyanin từ tảo Spirulina. - Khảo sát nhiệt độ đến hiệu suất tách chiết phycocyanin từ tảo Spirulina. - Tối ưu hóa điều kiện tách chiết phycocyanin từ tảo Spirulina. - Đánh giá hoạt tính kháng oxi hóa của dịch tách chiết phycocyanin từ tảo Spirulina. - Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của dịch tách chiết phycocyanin từ tảo Spirulina. 2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung về tảo Spirulina Tảo Spirulina hay tảo xoắn Spirulina là tên gọi do nhà tảo học Deurben (Đức) đặt vào năm 1827 dựa trên hình thái tảo Spirulina. Do hình dạng “xoắn lò xo” với khoảng 5-7 vòng đều nhau không phân nhánh dưới kính hiển vi nên được gọi là Spirulina với tên khoa học là tảo Spirulina platensis (bắt nguồn từ chữ spire, spiral có nghĩa là “xoắn ốc”) và trước đây được coi là thuộc chi Spirulina. Spirulina thuộc vi khuẩn lam (Cyanobacteria) nên chúng thuộc sinh vật nhân sơ hay nhân nguyên thủy (Ciferri and Tiboni 2003). Cũng vào năm 1827, Turpin lần đầu tiên phân lập được tảo Spirulina từ nguồn nước tự nhiên. Năm 1960, Tiến sĩ Clement người Pháp tình cờ phát hiện loại tảo này khi đến hồ Tchad ở Trung Phi. Nhà khoa học này không khỏi kinh ngạc khi vùng đất cằn cỗi, đói kém quanh năm nhưng những thổ dân ở đây rất cường tráng và khỏe mạnh. Khi Clement tìm hiểu về thức ăn của họ, bà phát hiện trong mùa không săn bắn, họ chỉ dùng một loại bánh màu xanh mà nguyên liệu chính là thứ họ vớt lên từ hồ. Qua phân tích, bà phát hiện ra loại bánh có tên Dihe này chính là tảo Spirulina. Năm 1963, bà đã nghiên cứu thành công việc nuôi Spirulina ở quy mô công nghiệp.(Gershwin M và công sự n.d.) E., Amha Belay, 2007). Năm 1973, Tổ chức Nông lương Quốc tế (FAO) và Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đã chính thức công nhận tảo xoắn Spirulina là nguồn dinh dưỡng và dược liệu quý, đặc biệt trong chống suy dinh dưỡng và chống lão hóa (Đặng Thỵ Sy, 2005). Năm 1977, Viện sinh vật học là nơi tiên phong trong việc nuôi trồng tảo Spirulina ở Việt Nam theo mô hình ngoài trời, không mái che, có sục khí CO2 tại xí nghiệp nước suối Vĩnh Hảo (Bình Thuận). 1.2. Đặc điểm sinh học của tảo Spirulina 1.2.1. Phân loại Spirulina (Arthrospira) là một loài vi tảo màu xanh, mắt thường không thể nhìn thấy được. Theo phân loại mới, tảo Spirulina là vi khuẩn lam dạng sợi (thường gọi là tảo xoắn) thuộc ngành vi khuẩn lam (Cyanobacteria) hay tảo lam (Cyanophyta). Là một nhóm vi sinh vật, nhưng chúng khác với vi khuẩn và nấm men ở chỗ chúng có diệp lục và có khả năng 3 tổng hợp được các chất hữu cơ từ các chất vô cơ dưới tác dụng của ánh sáng mặt trời (Đặng Đình Kim 1999). Phân loại khoa học của tảo Spirulina: (Lê Văn Lang 1999). Lãnh giới (domain): Bacteria Ngành (phylum): Cyanobacteria Lớp (class): Chroobacteria Bộ (ordo): Oscillatoriales Họ (familia): Phormidiaceae Chi (genus): Arthrospira Loài: Arthrospira maxima, Arthospira platensis Ở Việt Nam, giống được nghiên cứu đầu tiên, lưu giữ ở viện Sinh vật học là S.platensis Geitler do Cộng Hòa Pháp cung cấp. Hình 1.1. Hình thái tảo Spirulina 1.2.2. Đặc điểm hình thái và cấu trúc tế bào Về hình dạng, tảo Spirulina thường ở dạng xoắn kiểu lò xo có màu xanh lục lam với các vòng xoắn khá đều, ở hai đầu cuối của sợi thường co hẹp và mút lại. Tuy nhiên, do điều kiện và thời kì phát triển mà hình dạng tảo có thể thay đổi chút ít: sợi tảo duổi ra hoặc uốn xoắn nhưng mật độ thưa dày và hình dạng khác nhau như chữ C, chữ S,... Riêng một đặc điểm không thay đổi là sợi tảo không phân nhánh, không có bao và dị bào. 4 Về kích thước, tảo trưởng thành thường dài từ 250  1000 m, bề ngang 6  8 m, đường kính vòng xoắn 35  50 m, bước xoắn 60 m nhưng tùy mức độ xoắn hay thẳng mà kích thước này cũng có sự thay đổi. Về cấu tạo, tảo Spirulina có cấu tạo đa bào với gần 100 tế bào trên mỗi sợi tảo. Tế bào chưa có nhân điển hình, vùng nhân cũng không có giới hạn rõ ràng. Tảo Spirulina chưa có lục lạp mà thay vào đó là các thể thylakoid xếp thành vòng chứa các sắc tố chlorophyl, phycocyanin, carotenoid. Màng tế bào cũng không có cấu tạo vách của cellulose giống như thực vật mà chỉ là các lớp peptidoglycan dễ dàng bị đồng hóa bởi các enzyme tiêu hóa. Chính vì những đặc điểm đó mà tảo Spirulina được xếp vào ngành Vi khuẩn chứ không phải ngành Tảo như trước đây. Về đặc điểm vận động, tảo Spirulina có thể thực hiện theo hai kiểu: tự xoắn do chuyển hình dạng từ xoắn sang thẳng hay ngược lại; hoặc tịnh tiến trong môi trường nước như những phiêu sinh vật nhờ các không bào khí hình trụ. Vận tốc di chuyển của chúng có thể đạt 5 micron/giây. Vận động này được thực hiện bởi các lông ở sườn bên cơ thể (fimbria) - là các sợi có đường kính 5–7 nm và dài 1–2-micron nằm quanh cơ thể. Các lông này hoạt động như tay chèo giúp cho vi khuẩn lam hoạt động. 1.3. Thành phần hóa học của tảo Spirulina Cho đến nay, tảo Spirulina vẫn được xem là một loại thực phẩm dinh dưỡng hoàn hảo giàu dưỡng nhất được tìm thấy trên thế giới. Chứa hơn 50 vi chất dinh dưỡng, nhiều hơn bất kỳ các loại thức ăn, rau xanh, quả hạt hay các loại thảo dược khác. Tảo Spirulina chứa khoảng 60% chất đạm (protein) là nguồn cung cấp chất. Đặc biệt, đạm trong tảo Spirulina là tổng hợp của hơn 18 loại acid amin trong đó có 8 loại là thiết yếu và tất cả đều dễ tiêu hóa (đến 95%) do bản chất là đạm thực vật. Bên cạnh đó, tảo Spirulina còn là nguồn bổ sung nhiều loại vitamin như vitamin A, vitamin E, vitamin B complex (B1, B2, B6, B12) … với hàm lượng B12, lượng betacarotene, lượng vitamin E rất cao. Giàu khoáng chất cần thiết cho cơ thể và xương khớp như potassium, calcium, magnesi, zinc… và giàu acid béo GLA thiết yếu và chất xơ. Ngoài ra, tảo Spirulina còn chứa nhiều chất chống lão hóa (để bảo vệ tế bào) quan trọng như phycocyanin, chlorophyl và carotenoid… đã góp phần làm cho tảo Spirulina hoàn toàn khác biệt và độc nhất so với các loại thực phẩm thiên nhiên khác (Lê Văn Lang 1999). 5 Hình 1.2. Thành phần hóa học của tảo Spirulina. 1.4. Giá trị dinh dưỡng Tảo Spirulina chứa hàm lượng protein rất cao và chứa đầy đủ các vitamin. Spirulina có giá trị dinh dưỡng cao vì chứa hàm lượng protein cao và các chất có hoạt tính sinh học khác. Giá trị protein trung bình của tảo Spirulina là 65%, cao hơn so với nhiều loại thực phẩm. Chỉ số hóa học (chemical score - C.S) của protein của tảo cũng rất cao, trong đó các loại acid amin chủ yếu như leucin, isoleucin, valin, lysin, methionin và tryptophan đều có mặt với tỷ lệ vượt trội so với chuẩn của tổ chức Lương nông quốc tế (FAO) quy định. Hệ số tiêu hóa và hệ số sử dụng protein (net protein utilization - N.P.U) rất cao (80 -85% protein của tảo được hấp thu sau 18 giờ). Ngoài ra, tỷ lệ chất xơ trong tảo cũng rất cao. Phần lớn chất béo trong tảo Spirulina là axit béo không no, trong đó axit linoleic 13,784 mg kg. y-linoleic 11.980 mg/kg (Nguyễn Hữu Thước và cộng sự 2004 n.d.). Đây là điều hiếm thấy trong các thực phẩm tự nhiên khác. Spirulina chứa Provitamin A (-caroten) (chiếm 1,4 % chất khô) cao hơn 20 lần so với trong cà rốt, đây là chất chống oxy hóa mạnh, bảo vệ cơ thể khỏi những tổn hại cơ bản. 6 Không giống vitamin A tổng hợp và dầu gan cá, B- caroten hoàn toàn không độc hại, thậm chí khi sử dụng với số lượng lớn. Tảo Spirulina giàu vitamin A dễ chuyển hóa, cần thiết cho mắt, làn da, răng, móng, tóc, xương và một hệ thống miễn dịch tốt, bảo vệ cơ thể khỏe mạnh. Bên cạnh đó, tảo Spirulina là một nguồn giàu vitamin B, đặc biệt là vitamin B12, quan trọng với người ăn chay, gấp 2 - 6 lần gan bò sống (Lê Văn Lang, 1999). Thực phẩm dinh dưỡng này cũng chứa các vitamin khác như Bị, B, Bo, E và H (Mai Ngọc Thảo, 2008), là nguồn sắt cao, chứa 14 chất khoáng tự nhiên và nhiều nguyên tố vi lượng. Tảo Spirulina cung cấp 21% thiamin và riboflavin so với nhu cầu hàng ngày. 1.5. Tổng quan về enzyme protease (Alcalase) 1.5.1. Giới thiệu chung Enzyme Protease là một loại enzyme có bản chất là protein được sinh vật tổng hợp nên, tham gia vào các phản ứng hóa sinh học. Đặc tính: - Được tạo ra trong tế bào sinh vật, không độc hại, thân thiện với môi trường. - Tham gia phản ứng cả trong tế bào sống và cả khi được tách khỏi tế bào sống. - Có thể tham gia xúc tác các phản ứng trong và ngoài cơ thể từ giai đoạn đầu đến giai đoạn cuối giải phóng hoàn toàn năng lượng dự trữ trong các hợp chất hóa học. - Có thể được thực hiện một phản ứng: xảy ra ngoài tế bào (như trong ống nghiệm). - Phản ứng enzyme tiêu hao năng lượng rất ít, hiệu suất và tốc độ cao. - Có tính chọn lọc cao. - Chịu sự điều khiển bởi gen và các điều kiện phản ứng. Protease là enzyme xúc tác thủy phân các mối liên kết peptide trong phân tử protein. Nó được ứng dụng một cách rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như công nghiệp chế biến thực phẩm, y học, nông nghiệp, công nghiệp thuộc da, công nghiệp sản xuất xà phòng... và chiếm khoảng 60% thị trường enzyme. Hiện nay, trên thế giới các chế phẩm protease đã được thương mại hóa và được đưa vào ứng dụng một cách rộng rãi. Tuy vậy, trong thời gian gần đây trên thế giới nhiều nhà khoa học vẫn tiếp tục tiến hành nghiên cứu thu nhận, tinh chế, xác định các tính chất của chế phẩm thu được (Gessesse và cộng sự., 2002; (Singh, Mehrotra, and Agarwal 1999) Gajju và cộng sự., 1996, Kim và cộng sự, 2001; Rai, Mussarat và cộng sự, 2009). 7 Ở Việt Nam cũng đã có một số nghiên cứu về protease vi sinh vật, tuy nhiên chỉ mới dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm (Lê Gia Hy và cộng sự 2000); Lê Đức Mạnh và cộng sự, 1995) ..., nghiên cứu ứng dụng enzyme vẫn còn hạn chế. 1.5.2. Cấu trúc Enzyme protease là enzyme thủy phân các liên kết peptid (-CO-NH-) trong phân tử protein giải phóng các acid amin, pepton hoặc dittripepton. Hình 1.2. Enzyme Protease Cấu trúc bậc bốn của phân tử protein ảnh hưởng đến quá trình phân giải cơ chất dưới tác dụng của các protease. Dạng monomer và dimer của cơ chất dễ phân giải hơn dạng tetramer. Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa…) và động vật (gan, dạ dày bê…). So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt. Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất. Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng. 8 1.6. Giới thiệu chung về phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) Bề mặt đáp ứng (Response surface method - RSM) là một phương pháp toán thống kê được ứng dụng rộng rãi trong mô hình hóa và phân tích các quá trình mà trong đó biến đáp ứng chịu ảnh hưởng bởi các biến độc lập (Braimah và cộng sự 2016). Mục đích của phương pháp là để tối ưu hóa giá trị của biến đáp ứng (Rushing và cộng sự, 2013). Trong phương pháp này, một mối quan hệ gần đúng phù hợp giữa các biến độc lập và biến đáp ứng được khảo sát, xây dựng thành mô hình (phương trình *) và trực quan hóa dưới dạng đồ thị địa hình (topography graph). Dựa trên mô hình đó, các điểm tối ưu, tối thiểu cục bộ (local maximum and local minimum), các đường dốc (ridge) được xác định và dùng để tìm ra vị trí mà giá trị của biến đáp ứng là tối đa (điểm tối ưu) (Bradley, 2007). Tương ứng với điểm này, các giá trị của các biến độc lập cũng được đề xuất. Y = f (X1) + f (X2) +.... + f (Xn) + ε (*) Với Y là biến phụ thuộc ; X1, X2… Xn là các biến độc lập; ε là sai số thực nghiệm Dữ liệu đầu vào của RSM là dữ liệu thu thập được từ các thí nghiệm được thiết kế. Thiết kế Box-Behnken (BBD) và thiết kế hỗn hợp trung tâm (CCD) là hai dạng thiết kế thí nghiệm chính được sử dụng trong phương pháp bề mặt đáp ứng (Koc and KaymakErtekin, 2010). Thiết kế LHD và thiết kế FFD cũng đã được áp dụng cho các nghiên cứu tối ưu hóa trong những năm gần đây (Prakash Maran và cs, 2013; Şahin và cs, 2017; Wang và cs, 2008; R. Wang et al. 2007). Thiết kế các thí nghiệm là giai đoạn quan trọng nhất của RSM. Bước này nhằm mục đích lựa chọn các điểm phù hợp nhất trong đó biến đáp ứng cần được khảo sát có khả năng cho giá trị tối ưu nhất. Các mô hình toán học được xây dựng trong RSM cũng chủ yếu liên quan đến dạng thiết kế thí nghiệm, do đó việc lựa chọn thiết kế thí nghiệm có ảnh hưởng lớn trong việc xác định tính chính xác của việc xây dựng mô hình đáp ứng bề mặt. Tuy nhiên, phương pháp phản ứng bề mặt cũng cho phép sử dụng các kết quả thí nghiệm như những thí nghiệm sàng lọc để khám phá bề mặt của biến đáp ứng và đưa ra những đề xuất thí nghiệm tiếp theo để đạt được vị trí tối ưu mong muốn (Aydar 2018). Sau khi lựa chọn thiết kế, phương trình hồi quy mô hình được xác định và hệ số của phương trình mô hình được dự đoán. Mô hình được sử dụng trong RSM nói chung là một phương trình bậc hai đầy đủ hoặc dạng rút gọn của phương trình này. Mô hình dự đoán được biểu diễn bằng phương trình bậc 2 đầy đủ : 9