Tài liệu Dự đoán giá trị pka của các phenolic bằng lý thuyết dft

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ch(RLED ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGUYỄN THỊ MỸ DỰ ĐOÁN GIÁ TRỊ pKa CỦA CÁC PHENOLIC BẰNG LÝ THUYẾT DFT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN SƯ PHẠM ĐÀ NẴNG, NĂM 2022 1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM DỰ ĐOÁN GIÁ TRỊ pKa CỦA CÁC PHENOLIC BẰNG LÝ THUYẾT DFT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN SƯ PHẠM Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thị Mỹ Lớp : 18SHH GV hướng dẫn : TS. Mai Văn Bảy ĐÀ NẴNG, NĂM 2022 2 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các kết quả nghiên cứu và các kết luận trong luận văn này là trung thực, được các đồng tác giả cho phép sử dụng và chưa từng công bố trong bất kỳ một công trình nào khác. Việc tham khảo các nguồn tài liệu đã được trích dẫn theo đúng quy định. Tác giả NGUYỄN THỊ MỸ i LỜI CẢM ƠN Trong quá trình học tập và nghiên cứu đề tài “Dự đoán giá trị pKa của các phenolic bằng lý thuyết DFT”, tôi đã nhận được sự hướng dẫn và giúp đỡ nhiệt tình từ TS. Mai Văn Bảy, với lòng biết ơn sâu sắc và kính trọng tôi chân thành gửi lời cảm ơn đến thầy, người luôn tận tâm chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo đang công tác tại khoa Hóa học trường Đại học Sư Phạm - Đại học Đà Nẵng, đã tận tình truyền đạt, hỗ trợ cho tôi những kiến thức quý báu giúp tôi hoàn thành nội dung nghiên cứu. Tuy đã nỗ lực hết sức nhưng trong đề tài không tránh khỏi những thiếu sót. Tôi rất mong nhận được những ý kiến đóng góp, chỉnh sửa và bổ sung của thầy cô để đề tài được hoàn thiện, thành công hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn! Tác giả Nguyễn Thị Mỹ ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH ẢNH viii CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Cân bằng acid – base và giá trị pKa 3 1.1.1. Định nghĩa về giá trị pKa 3 1.1.2. Vai trò của giá trị pKa trong các ứng dụng thực tế 4 1.2. Các phương pháp xác định giá trị pKa 5 1.2.1. Các phương pháp thực nghiệm xác định giá trị pKa 5 1.2.2. Các phương pháp tính toán giá trị pKa 10 1.3. Các hợp chất phenolic 15 1.4. Các nghiên cứu tính toán giá trị pKa của các phenolic 16 CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1. Mục tiêu nghiên cứu 18 2.2. Nội dung nghiên cứu 18 2.3. Phương pháp nghiên cứu 18 2.3.1. Cơ sở phương pháp hóa học tính toán 18 2.3.2. Bộ hàm cơ sở (basis set) 20 2.3.3. Phương pháp phiếm hàm mật độ 24 2.3.4. Mô hình dung môi 28 2.3.5. Các phần mềm tính toán và phương pháp tính toán 31 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 3.1. Tính trực tiếp giá trị pKa 32 3.2. Tính giá trị pKa sau hiệu chỉnh thống kê 40 KẾT LUẬN 48 ĐỊNH HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO 49 iii TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 54 PHỤ LỤC 60 iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ρ(r) Hàm mật độ electron ∆𝐺𝑠𝑜𝑙𝑣 Năng lượng Gibbs solvat hóa ArOH𝑟𝑒𝑓 Acid tham chiếu 𝐸0 Năng lượng của phân tử ở trạng thái cơ bản Hằng số Planck ̂ H Toán tử Hamilton Ka Hằng số acid K eq Hằng số cân bằng 𝑟𝑒𝑓 𝐾𝑎 Hằng số acid của ArOHre𝑓 𝑝𝐾𝑎𝑐𝑎𝑙𝑐 pKa tính toán 𝑒𝑥𝑝 𝑝𝐾𝑎 pKa thực nghiệm 𝑝𝐾𝑎𝑐𝑜𝑟𝑟 p𝐾𝑎 sau khi hiệu chỉnh thống kê 𝜙𝑘 Hàm cơ sở Xi Bộ mô tả B3LYP Phiếm hàm mật độ Becke 3 tham số Lee–Yang–Parr COSMO Conductor-like screening model CSM Mô hình dung môi liên tục DFT Density functional theory: thuyết phiếm hàm mật độ DZ Double zeta: orbital hóa trị được mô tả bằng hai hàm cơ sở ECP Effective core potential: thế năng lõi hiệu dụng FRC First principles computations: phương pháp tính toán dựa vào các nguyên tắt ban đầu GTO Gaussian-type orbital GGA Sự gần đúng độ dốc tổng quát HOMO Highest occupied molecular orbital: orbital phân tử bị chiếm cao nhất HF Phương pháp Hartree – Fock LANL2DZ The Los Alamos National Laboratory basis set v LDA Local density approximation: sự gần đúng mật độ cục bộ LUMO Lowest unoccupied molecular orbital: orbital phân tử không bị chiếm thấp nhất MAE Mean absolute error: sai số trung bình tuyệt đối MD Molecular dynamic MM Molecular mechanics MO Molecular orbital: orbital phân tử NTCD Bệnh mãn tính không lây PBE Phiến hàm Perdew – Burke – Ernzerhof PBE0 Phiếm hàm Perdew – Burke-Ernzerhof (PBE) lai Hartree – Fock PCM Polarizable solvation model: mô hình solvat hóa phân cực QM Quantum mechanics QMM Quantum molecular mechanics QSAR Quantitative structure – activity relationship: phương pháp định lượng giữa cấu trúc và hoạt tính QZ Quadruple zeta: orbital hóa trị được mô tả bằng bốn hàm cơ sở SDD Stuttgart – Dresden ECP SMD Solvation model based on density: mô hình solvat hóa dựa trên mật độ STO Slater-type orbital: orbital kiểu Slater TZ Triple zeta: orbital hóa trị được mô tả bằng ba hàm cơ sở VdW Bề mặt van der Waals được xây dựng từ bán kính van der Waals của nguyên tử (trừ nguyên tử H). ZPE Zero point energies: năng lượng điểm không vi DANH MỤC CÁC BẢNG exp Bảng 3.1. Số thứ tự của 50 hợp chất phenolic; giá trị pKa thực nghiệm (p𝐾a nguồn tham khảo (Ref.). ) và 33 Bảng 3.2. Sai số giữa giá trị pKa tính toán và thực nghiệm khi sử các phiếm hàm DFT và 3 hợp chất tham chiếu. 36 Bảng 3.3. Sai số giá trị pKa giữa tính toán và thực nghiệm sau khi hiệu chỉnh thống kê. 42 Bảng 3.4. Các phương trình tính p𝐾acorr theo p𝐾acalc khi sử dụng phenol làm hợp chất tham chiếu. 45 vii DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Giá trị pKa của một số hợp chất vô vơ và hữu cơ. 4 Hình 1.2. Sơ đồ tính pKa dựa vào chu trình nhiệt động học. 11 Hình 1.3. Sơ đồ tính pKa dựa vào chu trình nhiệt động học sử dụng acid 12 tham chiếu Hình 1.4. Cấu trúc cơ bản của flavonoid. 15 Hình 2.1. Cấu trúc bộ hàm cơ sở 6-31G cho nguyên tử N 22 Hình 2.2. Minh họa cách xây dựng chung của khoang dung môi 29 Hình 3.1. Sai số giữa giá trị p𝐾a tính toán và thực nghiệm khi sử dụng 35 4 phiếm hàm DFT và 3 hợp chất tham chiếu. Hình 3.2. Sai số tuyệt đối trung bình (MAE) giá trị pKa giữa tính toán 40 và thực nghiệm. Hình 3.3. Giản đồ hiệu chỉnh thống kê giữa giá trị pKa tính toán và thực 41 nghiệm. Hình 3.4. Sai số giữa giá trị p𝐾a tính toán và thực nghiệm sau khi hiệu 46 chỉnh thống kê. Hình 3.5. Sai số tuyệt đối trung bình (MAE) giá trị pKa giữa tính toán và thực nghiệm sau khi hiệu chỉnh thống kê. viii 46 MỞ ĐẦU Phản ứng chuyển proton là một trong các loại phản ứng cơ bản và phổ biến nhất trong hóa học. Khả năng chuyển proton của một chất trong môi trường được đặc trưng bằng hằng số phân li acid (𝐾𝑎 ) và thường được báo cáo theo giá trị p𝐾𝑎 . Nhiều hợp chất hóa học hoạt động như một acid hoặc base Brønsted – Lowry trong môi trường nước. Do đó, tùy thuộc vào các giá trị p𝐾𝑎 và pH, các hợp chất này có thể bị ion hóa ở các mức độ khác nhau và do đó quyết định đến các dạng tồn tại của chúng trong môi trường. Các phân tử có hoạt tính sinh học từ tự nhiên cũng như các phân tử thuốc thường là các acid yếu hoặc base yếu, cho nên mức độ ion hóa của chúng trong môi trường ảnh hưởng đến tính ưa béo, tính hòa tan, liên kết với protein và khả năng đi qua màng sinh chất, do đó p𝐾𝑎 ảnh hưởng đến các đặc tính hấp thụ, phân bố, chuyển hóa, bài tiết và độc tính của hợp chất. Vì vậy, giá trị p𝐾𝑎 là thông số rất quan trọng của các hợp chất trong dược phẩm cũng như các hợp chất được sử dụng phổ biến khác. Thông thường giá trị p𝐾𝑎 được xác định bằng thực nghiệm. Tuy nhiên, các giá trị p𝐾𝑎 thực nghiệm còn quá ít so với số lượng vô cùng phong phú của các hợp chất hóa học. Do đó, đã có nhiều công báo sử dụng các chiến lược tiếp cận khác nhau về lý thuyết để dự đoán giá trị p𝐾𝑎 như sử dụng mô hình QSAR (Quantitative structure– activity relationship) kết hợp với phương pháp máy học (machine learning); phương pháp cơ học lượng tử bán kinh nghiệm (Semi-Empirical Quantum Mechanics) và phương pháp sử dụng lý thuyết phiếm hàm mật độ (DFT). Kết quả các công báo này cho thấy việc dự đoán p𝐾𝑎 từ lý thuyết là khả thi. Tuy nhiên, đối với mỗi họ hợp chất cần được tiếp cận riêng và kết quả định lượng của mỗi mô hình phải được xây dựng dựa trên các hợp chất có cấu trúc hóa học tương tự nhau. Phenolic là các hợp chất có một hoặc nhiều nhóm hydroxyl gắn trên nhân thơm benzene, được tìm thấy trong hầu hết các mô thực vật. Các phenolic được biết đến là có hoạt tính sinh học, như tính kháng khuẩn (antibacterial activity) và kháng virut, khả năng chống viêm và chống tăng sinh (anti-inflammatory, and antiproliferative activities) và đặc biệt là nhiều phenolic có hoạt tính kháng oxy hóa mạnh và là nguồn chất chống oxy hóa dồi dào nhất trong chế độ ăn uống của con người. Trong môi 1 trường nước, các phenolic là acid yếu, điều này là do khả năng phân li proton của nhóm OH gắn trên vòng benzene. Tùy thuộc vào giá trị p𝐾𝑎 và pH của môi trường cơ thể, các phenolic có thể tồn tại dưới dạng trung hòa, ion hoặc cả hai dạng. Do đó, cân bằng acid – base của các phenolic trong môi trường tác động đến khả năng hoạt động sinh học của chúng và giá trị p𝐾𝑎 của các phenolic có tầm quan trọng trong các ứng dụng thực tiễn. Xuất phát từ thực trạng và nhu cầu trên, chúng tôi chọn đề tài nghiên cứu “Dự đoán giá trị pKa của các phenolic bằng lý thuyết DFT”. Cấu trúc của luận văn gồm các phần sau: – Mở đầu – Chương 1: Tổng quan tài liệu – Chương 2: Nội dung và phương pháp nghiên cứu – Chương 3: Kết quả và thảo luận – Kết luận – Tài liệu tham khảo – Định hướng nghiên cứu tiếp theo – Công báo liên quan đến luận văn – Phụ lục 2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Cân bằng acid – base và giá trị pKa 1.1.1. Định nghĩa về giá trị pKa Phản ứng chuyển proton hay cân bằng acid – base là một trong các quá trình hóa học cơ bản và phổ biến nhất. Cân bằng acid – base chủ yếu xảy ra trong môi trường dung môi phân cực, thường gặp nhất là môi trường nước. Trong trường hợp đơn giản, phản ứng phân li proton của một acid HA trong môi trường nước được biểu diễn theo phương trình: HA(aq) + H2 O(aq) ⇌ H3 O+ (aq) + A− (aq) (1.1) Một acid càng mạnh khi mức độ phân li proton của nó càng lớn và có thể được đánh giá định lượng dựa vào hằng số cân bằng của phản ứng trong Phương trình (1.1). 𝐾𝑒𝑞 = [H3 O+ ][A− ] [HA][H2 O] (1.2) Theo qui ước của IUPAC, độ mạnh của acid được đánh giá qua hằng số phân li acid, Ka, và được đánh giá gần đúng qua biểu thức theo nồng độ của chất tan (chính xác là đánh giá qua hoạt độ): [H3 O+ ][A− ] 𝐾𝑎 = [HA] (1.3) Một acid càng mạnh khi giá trị Ka của nó càng lớn. Thông thường, độ mạnh của một acid được đánh giá qua giá trị pKa, và được định nghĩa là: 𝑝𝐾𝑎 = − lg 𝐾𝑎 (1.4) Khác với Ka, một acid càng mạnh khi giá trị pKa của nó càng nhỏ, như được trình bày trong Hình 1.1 liệt kê giá trị pKa của một số hợp chất vô cơ và hữu cơ. 3 Hình 1.1. Giá trị pKa của một số hợp chất vô vơ và hữu cơ. 1.1.2. Vai trò của giá trị pKa trong các ứng dụng thực tế Cân bằng acid – base hay phản ứng chuyển proton là một trong các loại phản ứng cơ bản và phổ biến nhất trong hóa học.[1] Cân bằng acid - base của một chất trong môi trường được đặc trưng bằng hằng số phân li acid (𝐾𝑎 ) và thường được báo cáo theo giá trị p𝐾𝑎 . Nhiều hợp chất hóa học hoạt động như một acid hoặc base Brønsted – Lowry trong môi trường nước. Do đó, tùy thuộc vào các giá trị p𝐾𝑎 và pH, các hợp chất này có thể bị ion hóa ở các mức độ khác nhau và do đó quyết định đến các dạng tồn tại của chúng trong môi trường. Trong phần này, chúng tôi chủ yếu nêu vai trò và ý nghĩa của giá trị pKa đối với các hợp chất có hoạt tính sinh học được ứng dụng trong dược phẩm. Các phân tử có hoạt tính sinh học từ tự nhiên cũng như các phân tử thuốc thường là các acid yếu hoặc base yếu, cho nên mức độ ion hóa của chúng trong môi trường ảnh hướng đến tính ưa béo, tính hòa tan, liên kết với protein và khả năng đi qua màng sinh chất và do đó p𝐾𝑎 ảnh hưởng đến các đặc tính hấp thụ, phân bố, chuyển hóa, bài tiết và độc tính của hợp chất.[2] Vì vậy, giá trị p𝐾𝑎 là thông số rất 4 quan trọng của các hợp chất trong dược phẩm cũng như các hợp chất được sử dụng phổ biến khác. Nhận thức về ảnh hưởng của hằng số phân li acid - base, pKa, đối với các đặc tính dược học của thuốc và hóa chất đã được thiết lập từ lâu trong ngành công nghiệp dược phẩm và hóa chất. Wells ước tính rằng 75% thuốc là base yếu, 20% acid yếu và phần còn lại chứa các chất không ion, ampholyte và rượu [3]. Vì phần lớn các loại thuốc là acid hoặc base yếu, cho nên thông tin về giá trị pKa trong mỗi trường hợp sẽ giúp tính toán được phân bố các dạng tồn tại (trung hòa và anion) của phân tử khi ở trong các môi trường có pH khác nhau. Điều này đặc biệt quan trọng trong các hệ thống sinh lý, nơi trạng thái ion hóa sẽ ảnh hưởng đến tốc độ mà hợp chất có thể khuếch tán qua màng lipid. Các giá trị pKa của một loại thuốc ảnh hưởng đến tính ưa béo, tính hòa tan, liên kết protein và tính thấm, do đó ảnh hưởng trực tiếp đến các đặc điểm dược động học như hấp thụ, phân phối, chuyển hóa và bài tiết [4]. Mối liên hệ giữa giá trị pKa và các đặc tính sinh khả dụng của thuốc dẫn đến yêu cầu đối với các hợp chất sử dụng trong dược phẩm là các giá trị pKa của chúng phải được đo lường để tuân thủ quy định. Quy trình bào chế để tối ưu hóa việc phân phối thuốc cũng yêu cầu thông tin về giá trị pKa của thuốc. Do tầm quan trọng của tham số này đối với ngành dược phẩm, nên khả năng ước tính hoặc đo lường giá trị pKa sẽ mang lại lợi ích to lớn. Điều này đặc biệt quan trọng khi xem xét số lượng lớn các hợp chất có thể được xem xét cho mục đích sàng lọc, ví dụ như thư viện các hợp thiên nhiên hay thư viện các hợp tổng hợp [5]. 1.2. Các phương pháp xác định giá trị pKa 1.2.1. Các phương pháp thực nghiệm xác định giá trị pKa 1.2.1.1. Phương pháp chuẩn độ điện thế (Potentiometry) Đây là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất để xác định pKa bởi sự đơn giản và chi phí thấp của nó. Trong phép chuẩn độ điện thế, một lượng thuốc thử đã biết trước được thêm từng bước vào dung dịch chất phân tích. Sự thay đổi điện thế (E) sau phản ứng được đo bằng cách sử dụng hai điện cực, một chất chỉ thị và một điện cực so sánh. Đường cong sigmoid được xây dựng sau đó dựa vào đồ thị phụ thuộc của điện thế theo thể tích thuốc thử, trong đó điểm uốn tạo ra điện thế ở trạng 5 thái cân bằng. Với việc sử dụng các chất chuẩn có pKa đã biết, điện thế này có thể được chuyển đổi tuyến tính thành pKa của hợp chất cần đo. 1.2.1.2. Phương pháp đo độ dẫn (Conductometry) Việc xác định hằng số phân li acid bằng phép đo độ dẫn dựa trên giả thiết rằng chất điện li mạnh bị phân li hoàn toàn ở mọi nồng độ, trong khi chất điện li yếu chỉ phân li hoàn toàn ở độ pha loãng vô hạn. Phương pháp này không yêu cầu thông tin về độ pH của dung dịch, do đó nó có thể dễ dàng áp dụng cho các hệ không chứa nước nơi phép đo độ pH như vậy là không thể thực hiện được. Một mối liên hệ giữa pKa và độ dẫn được thiết lập để tính giá trị pKa sau đó. Phương pháp đo độ dẫn điện cung cấp một phương pháp xác định pKa tương đối nhanh và đáng tin cậy và cũng có khả năng đạt được độ chính xác cao với độ lệch pKa nhỏ nhất là ± 0.01 ‒ 0.03 đơn vị. Nhược điểm chính của phương pháp này là các phép đo độ dẫn không chọn lọc, tức là không thể đo các ion khác nhau một cách riêng biệt. Điều này đòi hỏi phải làm việc với các hợp chất tinh khiết. 1.2.1.3. Phương pháp phân tích vôn – ampe (voltammetry) Trong phép đo voltammetry, một điện thế thay đổi được áp dụng trên dung dịch mẫu và đo dòng điện thu được. Khi điện thế đạt đến thế khử của chất phân tích, điều này sẽ làm tăng dòng điện, tiếp theo là giảm do sự cạn kiệt của phân tử. Khi pKa của một chất được xác định bằng voltammetry, về nguyên tắc người ta có thể đo phản ứng điện hóa của chính phân tử đó. Tuy nhiên, cần phải có thông chính xác về đặc tính điện hóa của chất mẫu và do đó thường phải thêm chất tham chiếu với các đặc tính đã biết. Sau đó, sự dịch chuyển của các peak của chất chuẩn khi thêm acid được sử dụng để xác định giá trị pKa. Ưu điểm của voltammetry là nó được sử dụng đặc biệt trong các phép đo giá trị pKa trong dung môi ít phân cực, một điều thường khó thực hiện chính xác với việc sử dụng các kỹ thuật như chuẩn độ điện thế. 1.2.1.4. Phương pháp đo nhiệt lượng (Calorimetry) Tất cả các phương pháp đo nhiệt lượng đều hoạt động theo cùng một nguyên tắc: một quá trình vật lý hoặc hóa học diễn ra trong một hệ đi kèm với hiệu ứng nhiệt và lượng nhiệt này sẽ được đo lường. Để đo các giá trị pKa, một kỹ thuật gọi là Đo nhiệt lượng chuẩn độ đẳng nhiệt (Isothermal Titration Calorimetry: ITC) đã được sử 6 dụng. Ở đây, một phép chuẩn độ acid - base thông thường được thực hiện bên trong nhiệt lượng kế trong khi năng lượng cần thiết để giữ nhiệt độ của hệ không đổi sẽ được đo. Nó cũng là một trong những kỹ thuật phân tích lâu đời nhất. Mô hình đầu tiên được ghi lại được thực hiện bởi Lavoisier và Laplace vào năm 1783. Trong những năm gần đây, phương pháp ITC đã được sử dụng để đo hằng số phân li của peptit và ảnh hưởng của liên kết lên các nhóm ion hóa cụ thể. Phương pháp này cũng tính toán pKa gián tiếp từ sự thay đổi enthalpy đo được. Độ không đảm bảo nằm trong khoảng 0.05 ‒ 0.15 pKa đơn vị tùy thuộc vào kỹ thuật đo nhiệt lượng. 1.2.1.5. Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic resonance: NMR) Trước khi NMR được sử dụng để xác định hằng số phân li acid, kỹ thuật này đã được áp dụng để xác định vị trí khử proton của một acid, hoặc vị trí tạo proton của một base. Trong những trường hợp này, nhiệt độ của hệ được giảm đến mức độ cân bằng acid - base diễn ra chậm trên thang thời gian NMR, do đó sẽ quan sát được hai cực đại riêng biệt đối với HA và A‒. Năm 1957, Grunwald và cộng sự đã sử dụng NMR để xác định pKa của mono-, di- và trimethyl amine, bằng cách xác định độ chuyển dịch hóa học của trạng thái triplet từ proton trong (các) nhóm CH3 như một hàm của pH. Một mối tương quan tuyến tính đã được tìm thấy giữa độ chuyển dịch hóa học và độ acid - base. Các thí nghiệm có thể được thực hiện trong nước bằng cách sử dụng phép đo tham chiếu. Từ đó thu được đường cong sigmoid để tính pKa. Giá trị pKa có thể được đo chính xác lên đến ± 0.05 đơn vị. 1.2.1.6. Phương pháp điện di (Electrophoresis) Trong điện di, các loài mang điện được tách ra dưới tác dụng của điện trường, di chuyển với vận tốc tỷ lệ với tỷ lệ kích thước trên điện tích của chúng. Việc sử dụng điện di để xác định giá trị pKa phụ thuộc vào tính chất khác nhau của các dạng proton hóa và deproton hóa của chất phân tích. Khi hai dạng tồn tại ở trạng thái cân bằng nhanh, độ linh động thực được đo có thể liên quan đến mức độ phân li (α) của chất phân tích. Đường cong sigmoid được xây dựng dựa vào mối liên hệ giữa độ linh với pH sẽ được sử dụng để xác định giá trị pKa. Phương pháp điện di có thể đạt được độ chính xác ± 0.03 – 0.08 tùy thuộc vào chất phân tích, đặt phương pháp này gần ngang 7 bằng với phương pháp đo điện thế về độ chính xác. Phương pháp này có một số ưu điểm chính so với các phương pháp thay thế truyền thống khác. Thứ nhất, chỉ cần một lượng rất nhỏ mẫu cho phép đo, theo thứ tự microlit về thể tích và với giới hạn phát hiện trong khoảng 10-6 M. Điều này cho phép xử lý các loài hòa tan kém mà không gặp nhiều khó khăn. Vì điện di là một kỹ thuật tách, các mẫu không tinh khiết có thể được xử lý dễ dàng và vì các phân tử được đo trực tiếp nên không cần biết chính xác về nồng độ mẫu. Ngoài ra, thiết bị thương mại có khả năng hoạt động tự động mà không yêu cầu sửa đổi, cho phép tiến hành số lượng lớn các phép đo với tốc độ nhanh. 1.2.1.7. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid chromatography: HPLC) Quan sát ban đầu cho thấy rằng thời gian rửa giải có thể được thay đổi bằng cách điều chỉnh độ pH được thực hiện bởi Singhal. Với sự phát triển của HPLC pha đảo vào cuối những năm 1970, các mô hình tiên tiến đã được tạo ra liên hệ giữa hệ số công suất (k) với mức độ phân li (α). Vẽ đồ thị k so với pH thu được một đường cong sigmoid với điểm uốn là α = 0.5 tại pH = pKa. Đây là cơ sở để đo giá trị pKa bằng phương pháp HPLC. 1.2.1.8. Phương pháp UV-Vis Trước năm 1900, người ta đã biết rằng sự thay đổi độ acid có thể dẫn đến sự thay đổi màu sắc của các chất tự nhiên. Phép đo phổ với ánh sáng khả kiến giúp đo được giá trị pKa của các chất chỉ thị acid/base và điều này lần lượt được mở rộng sang việc sử dụng ánh sáng UV để đo pKa của các thành phần khác. Yêu cầu đối với phép đo UV/pH này là sự hiện diện của nhóm mang màu gần vị trí ion hóa trong phân tử. Nếu điều này được đáp ứng, thì phổ của dạng phân li và không phân li có thể khác nhau. Về nguyên tắc, bất kỳ bước sóng nào cũng có thể được sử dụng để xác định pKa, ngoại trừ tại điểm đẳng lập mà tại đó bước sóng của cả hai dạng có cùng độ hấp thụ mol. Tuy nhiên, sự lựa chọn tốt nhất là bước sóng mà tại đó độ hấp thụ của các mol phân tử càng khác nhau càng tốt. Phương pháp này đã được cải tiến hơn nữa bằng cách đo sự hấp thụ của hai bước sóng khác nhau ở một pH thay đổi. Tỷ lệ hấp thụ ở hai bước sóng đó được vẽ 8 biểu đồ dựa trên độ pH. Bằng cách này, một đường cong sigmoid thu được và pKa có thể được xác định từ điểm uốn như bình thường. Một trong các bước sóng phải được gán cho loài mang màu và bước sóng khác phải bất biến khi pH thay đổi. Bằng cách sử dụng bước sóng thứ 2 làm tham chiếu, sự thay đổi nồng độ tổng sẽ không ảnh hưởng đến kết quả cuối cùng. 1.2.1.9. Phương pháp huỳnh quang (Fluorometry) Việc sử dụng quang phổ huỳnh quang để xác định các giá trị pKa phụ thuộc vào sự khác biệt trong phổ huỳnh quang giữa acid hoặc base tự do và dạng liên hợp của nó. Mặc dù phép đo huỳnh quang có thể có độ nhạy và chọn lọc cao hơn so với phép đo phổ thông thường, nhưng nó có nhược điểm là chỉ áp dụng được cho các chất huỳnh quang. Ngoài ra, người ta biết rằng sự phụ thuộc vào pH của phép đo huỳnh quang thường không phù hợp với những gì thu được từ phép đo phổ hoặc các phương pháp khác. Lý do cho điều này là do sự trao đổi proton ở trạng thái kích thích cũng như trạng thái cân bằng ở trạng thái cơ bản. Điều này gây ra vấn đề vì pKa đối với trạng thái cơ bản và pKa* đối với trạng thái kích thích có thể khác nhau khá mạnh, và vị trí của điểm uốn trong chuẩn độ huỳnh quang sẽ phụ thuộc vào cả hai giá trị cũng như động học của sự chuyển proton ở trạng thái kích thích. Một vấn đề khác có thể xảy ra khi các thành phần đệm dẫn đến dập tắt huỳnh quang phụ thuộc vào pH. 1.2.1.10. Phương pháp đo phân cực (Polarimetry) Việc xác định hằng số phân li acid bằng phép đo phân cực liên quan đến phép đo chuyển động quang học của ánh sáng phân cực phẳng bởi dung dịch mẫu như một hàm của pH. Phương pháp này phụ thuộc vào sự khác biệt về độ quay quang học giữa các dạng ion hóa và không ion hóa của chất phân tích. Phương pháp đo phân cực được chứng minh là một phương pháp có độ nhạy hợp lý để xác định các giá trị pKa. 1.2.1.11. Phương pháp động học (Kinetic method) Phương pháp động học xác định các giá trị pKa phụ thuộc vào việc đo tốc độ phản ứng của phản ứng đối chứng bị ảnh hưởng bởi độ pH của môi trường phản ứng. Trong khi các phép xác định dựa trên động học phản ứng hiếm khi gặp trong tài liệu, Bunnett và Nudelman đã chứng minh một phương pháp mà nguyên tắc này có thể được áp dụng một cách có hệ thống. Phương pháp của họ liên quan đến một phản ứng 9 đối chiếu, phản ứng của ion thiophenoxide với 2,4-dinitrofluorobenzene để tạo thành một hệ thống vòng kép liên hợp, có thể dễ dàng theo dõi bằng phép đo phổ hấp thụ. Tốc độ của phản ứng này được xác định bởi sự phân li của thiophenol để tạo ra ion tự do, và sự phân li này bị kìm hãm bởi sự gia tăng nồng độ proton solvat hóa. Khi biết hằng số phân li của thiophenol, thực hiện phản ứng trong dung dịch đệm của chất phân tích cho phép tính pKa. Giả thiết được đặt ra rằng nồng độ proton solvat hóa, và do đó vị trí của cân bằng thiophenol/thiophenoxide, hoàn toàn được kiểm soát bởi chất đệm chưa biết, và do đó tốc độ phản ứng chỉ phụ thuộc vào thành phần đệm và pKa của acid đệm. 1.2.2. Các phương pháp tính toán giá trị pKa Kể từ khi khoa học hóa học tính toán bắt đầu hình thành vào đầu những năm 1970 với sự phát triển của phần mềm hiệu quả để tính toán các obitan phân tử và sự phát triển của các phương pháp cơ học phân tử đầu tiên, nhiều phương pháp khác nhau đã được phát triển để ước tính tính toán các đặc tính phân tử. Một số phương pháp này đã được đánh giá để xác định hằng số phân li acid. Giá trị pKa thực nghiệm có thể được xác định thường xuyên với độ chính xác từ 0.01 đến 0.1 đơn vị đối với hầu hết các loại acid phổ biến. Sai số này tương ứng với sai số của năng lượng Gibbs phân li của acid từ 0.014 đến 0.14 kcal/mol. Tuy nhiên, các phương pháp hóa học lượng tử hiện đại cung cấp sai số trung bình khoảng 1 kcal/mol đối với năng lượng pha khí, điều này làm cho dự đoán pKa chính xác trở thành một trong những thách thức hiện nay của hóa học tính toán. Đã có nhiều mô hình tính toán pKa đã được đề xuất và đang xây dựng với mục tiêu hướng đến độ chính xác tiệm cận với thực nghiệm trong việc dự đoán giá trị pKa. 1.2.2.1. Phương pháp tính toán dựa vào các nguyên tắt ban đầu (First principles computations: FRC) FRC là phương pháp tính toán các tính chất vật lý và hóa học trực tiếp từ các đại lượng vật lý cơ bản như khối lượng và điện tích, lực Coulomb của electron, v.v ... dựa trên nguyên lý cơ học lượng tử. Phương pháp này tính giá trị pKa dựa trên mối liên hệ nhiệt động học giữa giá trị pKa và thay đổi năng lượng Gibbs của phản ứng phân li proton của acid. 10