Tài liệu đánh giá tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase và tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết cây bơ (persea americana mill)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI dP ha rm ac y, VN U KHOA Y DƯỢC ine an HOÀNG THỊ THÚY ed ic ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM ACETYLCHOLINESTERASE VÀ TÁC DỤNG M CHỐNG OXY HÓA CỦA DỊCH CHIẾT CÂY BƠ Sc ho ol of (Persea americana Mill.) Co py rig ht @ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI – 2019 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI dP ha rm ac y, VN U KHOA Y- DƯỢC an HOÀNG THỊ THÚY ed ic ine ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM ACETYLCHOLINESTERASE VÀ TÁC DỤNG M CHỐNG OXY HÓA CỦA DỊCH CHIẾT CÂY BƠ of (Persea americana Mill.) ho ol KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Khóa: QH.2014.Y Người hướng dẫn 1: ThS. ĐẶNG KIM THU Người hướng dẫn 2: PGS.TS BÙI THANH TÙNG Co py rig ht @ Sc (NGÀNH DƯỢC HỌC) HÀ NỘI – 2019 VN U LỜI CẢM ƠN Với mỗi sinh viên khóa luận là món quà cuối cùng để lại dưới mái trường ac y, thân yêu trước khi rời xa. Và tôi cũng thế, với tôi khóa luận không chỉ là món quà mà còn là hành trang tiếp bước cho tôi trên con đường sắp tới. Mỗi ngày thực nghiệm, mỗi ngày hoàn thành khóa luận tôi đã gặp muôn vàn khó khăn nhưng thật dP ha rm may mắn khi tôi nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu từ thầy cô, bạn bè và những người thân yêu để tôi hoàn thành món quà này một cách tốt nhất. Lời đầu tiên, tôi xin trân trọng cảm ơn hai thầy cô đã hướng dẫn tôi trong khóa luận này là ThS. Đặng Kim Thu và PGS.TS Bùi Thanh Tùng – Bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng khoa Y Dược. Các thầy cô luôn quan tâm, tận tình chỉ bảo an những kĩ năng, kiến thức không chỉ trong khóa luận này mà còn định hướng cho tôi trên con đường tương lai sắp tới, giúp tôi vững tin trên con đường phía trước. ed ic ine Tôi xin chân thành cảm ơn Khoa Y Dược đã trang bị cho tôi đầy đủ cơ sở vật chất và cho phép tôi thực hiện khóa luận này. Đồng thời trong quá trình thực hiện tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo phụ trách các bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng, Hóa dược – Kiểm nghiệm, Bào chế, Dược cổ truyền đã hết lòng giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi được sử dụng các dụng cụ, phòng thí nghiệm và cho tôi nhiều bài học M quý giá trong nghiên cứu khoa học. ho ol of Cuối cùng, với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt nhất tới bố mẹ, người thân và bạn bè của tôi – những người luôn bên tôi, giúp đỡ, chia sẻ và đồng hành cùng tôi để vượt qua mọi khó khăn không chỉ trong khóa luận này mà trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và cuộc sống của tôi. Hà Nội, ngày 14 tháng 05 năm 2019 Sinh viên Co py rig ht @ Sc Tôi xin chân thành cảm ơn! Hoàng Thị Thúy Độ hấp thụ (Absorbance) ACh Acetylcholinesterase ATCI Acetylthiocholin iodid DPPH 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl DTNB Acid 5-5’-dithiobis-2-nitrobenzoic EtOAc Ethylacetate EtOH Ethanol FDA Hiệp hội Quản lý Thuốc và Thực phẩm Hoa Kỳ IC50 Nồng độ ức chế 50% (Inhibitory Concentration 50%) rig ht @ ⃐ 𝐗 an ine M of n-buthanol Chỉ số hoạt động của ion hidro (Hydrogen power) ho ol Sc SD ed ic Đơn vị quốc tế (Interational Unit) n-BuOH Ph dP ha rm AChE IU py Acetylcholin ac y, A Co VN U DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Độ lệch chuẩn (Standard Deviation) Giá trị trung bình DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ VN U Hình 1.1. Sơ đồ quá trình sinh tổng hợp Acetylcholin ...............................................5 Hình 1.2. Các vị trí hoạt động của Enzym AChE .......................................................5 Hình 1.3. Quả Bơ (Persea americana Mill) .............................................................13 ac y, Hình 1.4. Công thức cấu tạo một số chất trong quả Bơ ............................................17 Hình 2.1. Nguyên liệu chiết xuất ..............................................................................20 dP ha rm Hình 2.2. Sơ đồ phản ứng tạo màu trong phương pháp đo quang sử dụng thuốc thử Ellman ...............................................................................................................24 Hình 3.1. Sơ đồ chiết xuất phân đoạn hạt quả Bơ .....................................................28 Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn khả năng chống oxy hóa của lá và các phần trong quả Bơ an ..........................................................................................................................29 ine Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn khả năng chống oxy hóa của acid ascorbic ....................29 ed ic Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế enzym AChE của lá và các phần trong quả Bơ ...............................................................................................................31 Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế enzym AChE của Donezepil ...............31 M Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn khả năng chống oxy hóa của các phân đoạn hạt quả Bơ 33 of Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế enzym AChE của các phân đoạn dịch chiết hạt quả Bơ ................................................................................................34 ho ol Hình 3.8. Đồ thị Lineweaver – Burk cho phân đoạn dịch chiết n-BuOH hạt quả Bơ ..........................................................................................................................35 Co py rig ht @ Sc Hình 3.9. Đồ thị Dixon cho phân đoạn dịch chiết n-BuOH hạt quả Bơ để xác định hằng số ức chế Ki .............................................................................................36 DANH MỤC CÁC BẢNG VN U Bảng 1.1. Các chất chống oxy hóa nội sinh ................................................................8 Bảng 1.2. Các phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa..................................9 Bảng 1.3. Đặc điểm phân biệt ba giống Bơ ..............................................................14 ac y, Bảng 1.4. Thành phần quả Bơ ...................................................................................15 Bảng 1.5. Thành phần dinh dưỡng chính của 100g thịt Bơ tươi (USDA) ................16 dP ha rm Bảng 2.1. Thành phần của hỗn hợp phản ứng ...........................................................24 Bảng 3.1. Giá trị IC50 của lá Bơ, các phần trong quả Bơ và acid ascorbic về khả năng quét gốc tự do DPPH ...............................................................................30 Bảng 3.2. Giá trị IC50 của lá Bơ, các phần trong quả Bơ và chất chuẩn Donezepil về an khả năng ức chế enzym AChE .........................................................................32 ine Bảng 3.3. Giá trị IC50 các phân đoạn từ hạt quả Bơ và acid ascorbic về khả năng quét gốc tự do DPPH ........................................................................................33 Co py rig ht @ Sc ho ol of M ed ic Bảng 3.4. Giá trị IC50 của các phân đoạn dịch chiết từ hạt quả Bơ và chất chuẩn Donezepil về khả năng ức chế enzym AChE ...................................................34 MỤC LỤC VN U LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ac y, DANH MỤC BẢNG MỞ ĐẦU.............................................................................................................................. 1 dP ha rm CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN............................................................................................ 3 1.1. Tổng quan về bệnh Alzheimer ..........................................................................3 1.1.1. Bệnh Alzheimer ................................................................................................3 an 1.1.2. Enzym AChE và các chất ức chế enzym AChE ...............................................4 1.1.3. Quá trình oxy hóa trong cơ thể và các chất chống oxy hóa ..............................6 ed ic ine 1.2. Các phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa và tác dụng ức chế enzym AChE in vitro. ................................................................................................9 1.2.1. Các phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro ............................9 1.2.2. Các phương pháp thường dùng trong nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế M enzym Acetylcholinesterase in vitro .........................................................................11 of 1.3. Tổng quan về Bơ...............................................................................................13 ho ol 1.3.1. Nguồn gốc, phân boại .....................................................................................13 1.3.2. Đặc điểm thực vật ...........................................................................................15 Sc 1.3.3. Thành phần hóa học ........................................................................................15 1.3.4. Tác dụng và công dụng ...................................................................................18 @ CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..................... 20 ht 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị ...............................................................................20 rig 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu......................................................................................20 py 2.1.2. Chuẩn bị mẫu nghiên cứu ...............................................................................20 Co 2.1.3. Hóa chất, dung môi .........................................................................................20 2.1.4. Thiết bị, dụng cụ .............................................................................................21 2.2. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................21 VN U 2.3. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................22 2.3.1. Phương pháp chiết xuất ...................................................................................22 2.3.2. Phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa .............................................22 ac y, 2.3.3. Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE ....................................23 2.3.4. Phương pháp đánh giá đặc điểm động học ức chế enzym AChE ...................26 dP ha rm 2.4. Phương pháp xử lí số liệu ................................................................................27 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ ................................................................................................ 28 3.1. Chiết xuất và phân đoạn dịch chiết ................................................................28 an 3.2. Kết quả đánh giá hoạt tính cao chiết lá và các phần trong quả Bơ .............29 3.2.1. Kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa theo phương pháp DPPH .............29 ine 3.2.2. Kết quả đánh giá khả năng ức chế enzym AChE ............................................30 ed ic 3.3. Kết quả đánh giá hoạt tính cao chiết phân đoạn hạt quả Bơ .......................32 3.3.1. Kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa theo phương pháp DPPH .............32 M 3.3.2. Kết quả đánh giá khả năng ức chế enzym AChE ............................................34 of 3.3.3. Kết quả xác định động học ức chế enzym AChE ...........................................35 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN .............................................................................................. 37 ho ol 4.1. Về kết quả sàng lọc tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzym AChE của dịch chiết lá và quả Bơ ............................................................................................37 Sc 4.2. Về kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzym AChE của các phân đoạn dịch chiết của bộ phận có tác dụng mạnh nhất ..........................38 ht @ CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ................................................................. 41 Co py rig TÀI LIỆU THAM KHẢO MỞ ĐẦU VN U Bệnh Alzheimer là một bệnh thoái hóa thần kinh tiến triển liên quan đến tuổi, làm suy yếu khả năng nhớ và nhận thức [34]. Theo Tổ chức Y tế Thế giới năm 2017, 44 triệu người trên thế giới bị mất trí nhớ và trong đó chiếm tới 60-70% là ac y, bệnh nhân Alzheimer [23]. Bệnh lý học của Alzheimer hiện vẫn chưa được làm sáng tỏ và hiện nay các nhà khoa học cho rằng ở các bệnh nhân Alzheimer có sự kết dP ha rm hợp của các yếu tố di truyền và môi trường gây ra. Vì thế việc hiểu biết về cơ chế bệnh vẫn cần được làm sáng rõ và sẽ là chìa khóa để phát triển thuốc điều trị bệnh. Các nghiên cứu cho thấy sự thiếu hụt trong các chất dẫn truyền thần kinh gây ra suy giảm nhận thức và mất trí nhớ ở bệnh nhân Alzheimer [55]. Acetylcholinesterase (AChE) là một enzym có tác dụng thủy phân chất dẫn truyền ed ic ine an thần kinh acetylcholine. Một số phương pháp điều trị khác nhau có mục tiêu tăng cường dẫn truyền cholinergic bằng cách tăng lượng tiền chất ACh, ngăn chặn quá trình thủy phân bởi chất ức chế AChE, kích thích các thụ thể nicotinic và muscarinic hoặc sử dụng các chất có tác dụng tương tự cholinergic [61]. Bởi vậy, các chất ức chế enzym AChE đóng vai trò quan trọng trong việc điều trị bệnh @ Sc ho ol of M Alzheimer. Mặt khác, sự gia tăng quá mức của các gốc tự do trong cơ thể gây ra hiện tượng “stress oxy hóa” được cho là một trong những nguyên nhân gây ra các bệnh mạn tính và thoái hóa như bệnh Alzheimer và Parkinson. Tuy nhiên các chất ức chế enzym AChE như physostigmine, galantamine, tacrine, donepezil, metrifonate,... lại không mang lại hiệu quả cao và gây ra nhiều tác dụng không mong muốn như: buồn nôn, nôn, đau bụng tiêu chảy, khó tiêu, phát ban.... [44]. Physostigmin là chất ức chế AChE đầu tiên được dùng cho nghiên cứu điều trị bệnh Alzheimer, nhưng đã bị thu hồi khỏi thị trường do một số tác dụng không mong muốn. Tacrine cũng gây độc đối với gan trong các thử nghiệm lâm sàng [62]. Ngoài ra, các thuốc thuộc nhóm chống oxy hóa như vitamin E, Ginkgo biloba… được sử dụng để điều trị những tổn thương liên quan đến nhận thức ở bệnh nhân Alzheimer py rig ht có nguồn gốc từ tự nhiên. Vì vậy, việc nghiên cứu các dược liệu vừa có hoạt tính chống oxy hóa vừa có khả năng ức chế enzym AChE để phòng và điều trị bệnh Alzeimer là hướng nghiên cứu thu hút sự quan tâm của nhiều nhà nghiên cứu trên thế giới. Co Bơ có tên khoa học là Persea americana Mill (Lauraceae), là một loại cây cận nhiệt đới có nguồn gốc từ Mexico và Trung Mỹ. Nghiên cứu cho thấy trong Bơ có chứa các hợp chất peptone, b-galactoside, acid glycosylated abscisic, alkaloids, 1 cellulose, polygalacto urease, polyuronoids, cytochrome P450,…[48, 64]. Bơ cũng VN U đã được sử dụng cho điều trị một số bệnh như lở loét, tăng huyết áp, đau bụng, viêm phế quản [15], tiêu chảy và tiểu đường [22]. Ngoài ra, Bơ có hàm lượng kali cao và ít natri, giúp điều chỉnh cân bằng điện giải và áp lực máu trong cơ thể, giúp ổn định huyết áp [32]. Các hợp chất béo omega-3, carotenoid và vitamin làm cho dP ha rm ac y, quả Bơ có tác dụng chống viêm [15]. Lá Bơ có tác dụng hạ glucose huyết và hạ cholesterol toàn phần và LDL, có tác dụng phòng ngừa xơ vữa động mạch [28]. Hơn nữa, lá Bơ còn có tác dụng trên hệ thần kinh như chống co giật [53], ức chế enzym AChE và butyrylcholinesterase và tác dụng chống oxy hóa [51]. Tác dụng ngăn ngừa và điều trị bệnh của dược liệu ngày càng thu hút sự chú ý của các nhà nghiên cứu để tìm ra sản phẩm tự nhiên tiềm năng dùng làm thuốc để chống lại bệnh Alzheimer. Tuy nhiên, qua tìm hiểu thì tại Việt Nam chưa có nghiên ine an cứu nào về đánh giá tác dụng ức chế AChE và chống oxy hóa DPPH của lá và quả Bơ trồng tại Việt Nam để có thể định hướng phát triển thành các sản phẩm hỗ trợ điều trị bệnh Alzheimer. Vì vậy, chúng tôi đề xuất tiến hành đề tài: “Đánh giá tác ed ic dụng ức chế enzym acetylcholinesterase và tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết cây Bơ (Persea americana Mill.)” với mục tiêu: Mục tiêu 1: Sàng lọc tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzym AChE của M các bộ phận cây Bơ (Persea americana Mill.). Co py rig ht @ Sc ho ol of Mục tiêu 2: Đánh giá tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzym AChE của các phân đoạn dịch chiết của bộ phận có tác dụng mạnh nhất. 2 VN U CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về bệnh Alzheimer 1.1.1. Bệnh Alzheimer ac y, Alzheimer là bệnh thần kinh thoái hóa tiến triển, làm mất trí nhớ và giảm khả năng nhận thức, là một vấn đề đáng lo ngại, đặc biệt ở những người cao tuổi. Bệnh dP ha rm đã được mô tả đặc điểm lâm sàng lần đầu tiên tại Đức vào ngày 03 tháng 11 năm 1906 bởi ông Alois Alzheimer. Năm 1910, Kraepelin đã lấy tên ông đặt cho tên bệnh – bệnh Alzeimer trong tái bản lần thứ 8 bài viết Tâm thần học (Psychiatrie) của mình [60]. Bệnh Alzheimer là nguyên nhân phổ biến nhất của chứng mất trí nhớ ở hầu ine dạng bệnh điển hình là Alzeimer [6]. an hết các quốc gia. Tỷ lệ mắc bệnh Alzeimer tăng dần theo tuổi, 96% là từ 65 tuổi trở lên. Chi phí cho việc chăm sóc và điều trị ở nước Mỹ ước tính 200 tỷ USD mỗi năm cho căn bệnh này [26]. Việt Nam có khoảng hơn 9 triệu người bị sa sút trí tuệ với ed ic Các yếu tố nguy cơ mắc bệnh bao gồm cả yếu tố di truyền và yếu tố không di truyền. Yếu tố di truyền được thấy ở 5% các bệnh nhân mắc bệnh được nghiên cứu là những đột biến liên quan đến thay thế một nucleotide trong chuỗi ADN (đa hình Sc ho ol of M nucleotide đơn) (tại nhiễm sắc thể 1, 14 hoặc 21) và các biến thể ε4 (alen) của gen mã hóa apolipoprotein E (APOE), nằm trên nhiễm sắc thể 19 [43]. Các yếu tố nguy cơ không di truyền được đưa ra là: tuổi, giới tính. Tuổi là yếu tố nguy cơ quan trọng nhất đối với bệnh Alzeimer khi các nghiên cứu chỉ ra rằng người trên 60 tuổi sẽ có tỷ lệ mắc bệnh tăng gấp đôi cứ sau 5-6 năm: ở nhóm tuổi 65-69 số người bị bệnh là 2%; ở nhóm tuổi 80-85 số người bị bệnh là 30-40%. Các nghiên cứu cũng cho thấy giới tính là một yếu tố nguy cơ quan trọng khi tỷ lệ mắc bệnh của phụ nữ cao hơn khoảng 1,5 – 2 lần so với nam giới [25]. @ Bệnh Alzheimer có đặc điểm là tiến triển chậm và bắt đầu rất từ từ nên bệnh ht nhân thường khó phát hiện bệnh ở giai đoạn khởi phát. Bệnh cảnh lâm sàng là hội chứng sa sút trí tuệ điển hình và tiến triển theo 3 giai đoạn chính: Co py rig • Giai đoạn 1: Thường kéo dài 2 – 3 năm, được đặc trưng bởi các triệu chứng: suy giảm trí nhớ, giảm hiệu suất trong giải quyết các công việc thường ngày, rối loạn định hướng không gian. • Giai đoạn 2: Suy giảm trí tuệ diễn ra nhanh chóng, rõ rệt. Nhân cách của người bệnh cũng bắt đầu có những biến đổi. Thường gặp các triệu chứng: rối loạn ngôn ngữ, rối loạn tri giác, rối loạn hành vi, thay đổi tính cách. 3 VN U • Giai đoạn 3: Giai đoạn cuối cùng. Bệnh nhân có thể nằm liệt giường, rối loạn đại tiểu tiện, các triệu chứng loạn thần (hoang tưởng, ảo giác…) thường xuất hiện rõ rệt trong bệnh cảnh lâm sàng. Bệnh nhân không thể giao tiếp và nhận diện khuôn mặt, không thể tự chăm sóc bản thân. ac y, Cho tới thời điểm hiện tại, vẫn chưa có loại thuốc nào có thể chữa khỏi bệnh Alzheimer mà chỉ có thể giúp làm chậm tiến triển của bệnh và làm giảm một số triệu chứng. Tất cả các bệnh nhân mắc Alzheimer cần được ổn định cân bằng dP ha rm chuyển hóa và cân bằng thể dịch, đồng thời duy trì trọng lượng cơ thể ở mức bình thường, điều chỉnh huyết áp, mỡ máu cũng như các vấn đề khác gây khó chịu cho người bệnh. Ngoài ra cần áp dụng các biện pháp chăm sóc y tế cơ bản tùy theo mức độ nặng nề, suy giảm trí nhớ của người bệnh và các triệu chứng xuất hiện về sau. ed ic ine an Dược liệu có khả năng phòng ngừa và điều trị một số bệnh, trong đó có bệnh Alzheimer [40]. Có rất nhiều nghiên cứu đã đánh giá hiệu quả của dịch chiết toàn phần với tác dụng chống lại Alzheimer và tiến hành phân lập các hợp chất có tác dụng bảo vệ hiệu quả [21]. Các nghiên cứu hóa thực vật chỉ ra nhiều hợp chất có giá trị bao gồm lignans, flavonoid, tannin, polyphenol, triterpenes, sterol và ankaloid với một phổ rộng các tác dụng dược lý như kháng viêm, chống amyloidogenic, kháng cholinesterase, hạ lipid, chống oxy hóa, chống chết rụng tế bào [40]. M 1.1.2. Enzym AChE và các chất ức chế enzym AChE @ Sc ho ol of Acetylcholin (ACh) là chất trung gian hóa học có mặt trong phần lớn các khe synap thần kinh trung ương, thần kinh thực vật, thần kinh-cơ. ACh tìm thấy ở hành não, cầu não, thân não, não trung gian, thể vân và vỏ não mới (nhiều nhất ở vùng vận động). Trong tủy sống, các hạch thần kinh thực vật, các tận cùng thần kinh tiếp xúc với cơ quan ngoại vi đều chứa ACh. Trong các nghiên cứu cho thấy ACh có liên quan đến sự tiến triển của bệnh viêm dây thần kinh và quá trình sản sinh sợi amyloid, những đặc điểm điển hình được thấy trong tế bào não của bệnh nhân mắc Alzheimer [56]. Co py rig ht Acetylcholin được tổng hợp từ cholin và acetyl Coenzym A do enzym cholin acetyl transferase xúc tác phản ứng, sau đó, được lưu giữ ở vị trí cuối dây thần kinh, trong các túi. Các chất trong túi được giải phóng khi vị trí cuối dây thần kinh bị khử cực và khi đó ACh được giải phóng vào khe synap và gắn với thụ thể. ACh sau khi được giải phóng có thời gian bán thải rất ngắn vì sự có mặt của enzym AChE. Đây là enzym thủy phân dây nối este trong phân tử ACh tạo ra cholin và acid acetic. Cholin sau đó được thu nhận lại vào tế bào thần kinh để tổng hợp ACh. Do đó, 4 những chất có tác dụng ức chế AChE sẽ kéo dài thời gian tồn tại và thời gian tác an dP ha rm ac y, VN U dụng của ACh [8, 20]. ine Hình 1.1. Sơ đồ quá trình sinh tổng hợp Acetylcholin ed ic AChE, với vai trò thủy phân ACh, là một protein có hình elip chứa một rãnh sâu, được gọi là hẻm. Quá trình thủy phân ACh được xúc tác bởi AChE diễn ra ở đáy của hẻm enzym theo cơ chế khá phức tạp. Ở đáy của hẻm, nơi xảy ra sự thủy phân cơ chất ACh, có 4 vị trí hoạt động chính (hình 1.2) là vị trí este hóa, vị trí oxy- Co py rig ht @ Sc ho ol of M anion, vị trí anion và túi acyl [39]. Hình 1.2. Các vị trí hoạt động của Enzym AChE 5 AChE là một trong những enzym thủy phân nhanh nhất. Hoạt tính của nó VN U mạnh gấp khoảng 10 lần so với serin protease hoặc butyrylcholinesterase (enzym thủy phân ACh chủ yếu ở tế bào thần kinh đệm) ở cùng điều kiện nhiệt độ và pH [36]. Theo giả thuyết cholinergic, các chất đối kháng cholinergic gây ra suy giảm dP ha rm ac y, trí nhớ và khả năng nhận thức của con người còn các chất đối kháng muscarinic thì có tác dụng ngược lại [65]. Do vậy, việc ức chế AChE sẽ duy trì nồng độ và thời gian hoạt động của ACh tại các khe synap, từ đó có tác dụng duy trì khả năng ghi nhớ và khả năng học tập của con người [58]. Sự giảm sút nồng độ ACh thường gặp ở các bệnh nhân Alzheimer, theo nghiên cứu của tác giả Di Giovanni S. và cộng sự, trong não của bệnh nhân Alzheimer có sự thiếu hụt đến gần 90% lượng chất dẫn truyền thần kinh này [33]. Trong khi nguyên nhân gây bệnh còn chưa được các nhà ine an khoa học làm rõ thì các chất ức chế AChE là lựa chọn hàng đầu cho các bệnh nhân Alzheimer, thông qua việc duy trì nồng độ ACh trong não, các chất này có tác dụng làm giảm các triệu chứng và ngăn chặn sự tiến triển của bệnh [49]. ed ic AChE chủ yếu có mặt trong hệ thần kinh trung ương, xúc tác thủy phân chất dẫn truyền ACh. Ở bệnh nhân Alzheimer thấy có sự giảm trầm trọng nồng độ chất dẫn truyền thần kinh ACh. Tình trạng này gây suy giảm khả năng nhận thức đối với ho ol of M người bệnh. Giả thuyết về vai trò của hệ cholinergic trong bệnh Alzheimer được đưa ra lần đầu tiên vào năm 1982 bởi tác giả Whitehouse và cộng sự. Sau đó, giả thuyết này nhanh chóng trở thành động lực cho quá trình nghiên cứu theo hướng cải thiện chức năng hệ cholinergic trên bệnh nhân mắc bệnh Alzheimer. Theo giả thuyết này, những chất ức chế sự hoạt động của AChE làm tăng nồng độ và thời gian hoạt động của ACh ở synap thần kinh từ đó cải thiện triệu chứng bệnh [31, 56]. Sc 1.1.3. Quá trình oxy hóa trong cơ thể và các chất chống oxy hóa @ Quá trình oxy hóa trong cơ thể Oxy hóa là quá trình xảy ra phản ứng hóa học, trong đó các electron được rig ht chuyển sang chất oxy hóa hình thành nên gốc tự do. Sự gia tăng các gốc tự do trong cơ thể sinh ra các phản ứng dây chuyền phá hủy tế bào. Co py Các gốc tự do là nguyên tử, phân tử hoặc ion với electron chưa ghép cặp rất không ổn định và phản ứng hóa học với các phân tử khác. Các dạng hoạt động của gốc tự do ROS, RNS, RSS [1, 9, 29]. Bản chất của các gốc tự do là có khả năng 6 phản ứng cao, thời gian tồn tại ngắn phụ thuộc vào bản chất và điều kiện của hệ mà VN U nó tồn tại [13, 29]. Cơ chế hình thành các gốc tự do trong cơ thể: ac y, • Từ chuỗi hô hấp tế bào trong ty thể. • Từ quá trình peroxyd hóa lipid. • Từ phản ứng tạo gốc khác trong cơ thể. Đích phân tử chính của các gốc tự do là các protein, ADN (acid deoxyribonucleic), ARN (acid ribonucleic), đường và lipid. Những phản ứng của dP ha rm gốc tự do có liên quan đến nhiều bệnh nghiêm trọng như ung thư, tim mạch, béo phì, bệnh Alzheimer, Parkinson, lupus ban đỏ, loét dạ dày,… [29, 37]. Các cơ chế chống oxy hóa [42]: an 1) Ức chế các enzym xúc tác làm tăng sản xuất các ROS/ RNS. 2) Tác động vào đường truyền tín hiệu oxy hóa khử, thúc đẩy quá trình chống ine oxy hóa của tế bào. 3) Phản ứng trực tiếp với ROS/ RNS tạo ra các chất ít độc hoặc mất hoạt tính. ho ol of M ed ic Stress oxy hóa là sự mất cân bằng giữa chất oxy hóa và chất chống oxy hóa dẫn đến sự gián đoạn tín hiệu và kiểm soát oxy hóa khử gây ra nhiều thiệt hại cho các phân tử sinh học [79]. Một số nghiên cứu đã chứng minh rằng stress oxy hóa đóng một vai trò quan trọng trong sinh lý bệnh Alzheimer [69]. Một số chất chống oxy hóa như N-acetylcystein, curcumin, resveratrol, vitamin E, acid ferulic, selen, coenzym Q (CoQ) và melatonin đã được thử nghiệm về khả năng cải thiện hiệu suất nhận thức ở những người mắc bệnh Alzheimer [70]. Vì vậy những chất có khả năng cân bằng chất oxy hóa và chất chống oxy hóa sẽ là chất tiềm năng trong quá trình chẩn đoán và điều trị bệnh Alzheimer. Sc Các chất chống oxy hóa ❖ Các chất chống oxy hóa nội sinh @ Các chất chống oxy hóa trong cơ thể người được chia thành 2 loại, các chất ht chống oxy hóa có bản chất là enzym và các chất chống oxy hóa không phải enzym. Co py rig Các chất chống oxy hóa có bản chất là enzym quan trọng ngăn chặn sự hình thành hoặc trung hòa các gốc tự do trong cơ thể là: glutathion peroxidase, catalase, superoxid dismutase, Glucose-6 phosphat dehydrogenase. Các chất chống oxy hóa không phải enzym cũng được tổng hợp trong cơ thể nhưng rất ít, chủ yếu từ thức ăn bổ sung [29]. 7 Các enzym VN U Bảng 1.1. Các chất chống oxy hóa nội sinh Các chất không phải enzym Co – Enzym: Q10 Catalase Vitamin A Superoxide dismutase Hợp chất chứa nito (non –protein): uric Glucose – 6 phosphat dehydrogenase Hợp chất chứa S: Glutathion dP ha rm ac y, Glutathion peroxidase Mỗi chất chống oxy hóa có cơ chế tác dụng riêng với từng loại gốc tự do và có thể hiệp đồng với nhau để loại trừ gốc tự do. Nhờ các chất chống oxy hóa này an mà quá trình oxy hóa chỉ xảy ra ở mức độ sinh lý nhất định, khi đó các dạng oxy hóa hoạt động thực hiện được chức năng sinh lý và duy trì được cân bằng trao đổi chất. Việc tìm kiếm các hợp chất chống oxy hóa mới có thể tạo ra sự kết hợp hiệu ine quả trong điều trị một số bệnh có liên quan đến quá trình oxy hóa trong cơ thể. ❖ Chất chống oxy hóa trong hóa dược ed ic Thuốc chống viêm: Theo nghiên cứu, nhóm thuốc này được xếp thành 3 nhóm: ho ol of M • Nhóm 1: Những chất làm giảm gốc O2●, ●OH, H2O2 như aspirin, indomethacin, ibubrofen… • Nhóm 2: Những chất làm giảm ●OH nhưng làm giảm mạnh O2●, H2O2 như hydrocortisol, 2 -3 hydroxybenzoic… • Nhóm 3: Thuốc làm giảm ●OH ở nồng độ rất thấp như phenylbutanol. Các chất chống oxy hóa tổng hợp Sc BHA (butylated hydroxyanisole), BHT (butylated hydroxytoluene), PG (propyl gallate), OG (octyl gallate), TBHQ (tert – butylhydroquinon)… @ ❖ Các chất chống oxy hóa có nguồn gốc thực vật Trong thế giới thực vật có rất nhiều chất có tác dụng chống oxy hóa thuộc Vitamin E: Ức chế phản ứng oxy hóa lipid, bảo vệ tế bào và các phần tử chức năng khỏi sự oxy hóa quá mức nhờ đó có tác dụng chống lão hóa, kéo dài tuổi thọ. Vitamin C: Là chất cho điện tử, có khả năng loại bỏ những gốc tự do ở pha nước của tế bào, có khả năng tái tạo Vitamin E dạng oxy hóa về dạng khử [30]. py rig - ht nhiều nhóm khác nhau. Đáng chú ý nhất là các vitamin và dẫn xuất của phenol: Co - 8 Flavonoid: Là một nhóm các phenolic thực vật có tác dụng chống oxy hóa và tạo phức chelat rất đáng chú ý. Chúng tập trung nhiều nhất trong trái cây, rau quả, rượu, trà và cacao. Flavonoid tồn tại trong thực phẩm dưới dạng glycoside và polymer, được thoái hóa ở nhiều mức độ trong đường tiêu hóa. Xu hướng ức chế quá trình trung gian tạo gốc tự do của một số flavonoid bị chi phối bởi cấu trúc hóa học của nó (cấu trúc nhân flavan, số lượng và vị trí các nhóm thế). Một số flavonoid có hoạt tính chống oxy hóa cao EGCG từ chè xanh, Genistein trong đậu nành, quercetin, resveratrol [38]. Xanthan: Là một hợp chất phenol thực vật có hoạt tính chống oxy hóa, có mặt trong một số thực vật nhiệt đới. ac y, VN U - dP ha rm - Ngoài ra còn có nhiều dẫn chất khác thuộc nhóm các phenolic tự nhiên cũng có tác dụng chống oxy hóa như carotenoid, acid phenolic, lignin, … Các phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa và tác dụng ức chế enzym AChE in vitro. 1.2.1. Các phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro an 1.2. ed ic ine Đánh giá khả năng chống oxy hóa có rất nhiều phương pháp được chia thành 2 loại: phương pháp in vitro và phương pháp in vivo [18]: Bảng 1.2. Các phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa M Các phương pháp in vitro Các phương pháp in vivo Khả năng làm giảm sắt trong huyết tương. Khả năng làm giảm glutathion Glutathion peroxidase Glutathion – S – Tranferase Superoxid dismutase Catalase γ– glutanyl transpeptidase Dọn gốc tự do DPPH Dọn gốc tự do HO Dọn gốc tự do nitric oxid Dọn gốc tự do peroxynitrite Phương pháp định lượng ABTS Phương pháp TRAP Phương pháp FRAP Dọn gốc tự do superoxid (SOD) 1. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. Dọn gốc tự do hydroxyl Phương pháp HORAC Phương pháp ORAC Phương pháp RP Phương pháp DMPD Enzym xanthin oxidase Phương pháp CUPRAC… 8. Glutathion reductase 9. Peroxid hóa lipid 10. Thử nghiệm LDL 2. 3. 4. 5. 6. 7. Co py rig ht @ Sc ho ol of 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9 Một số thử nghiệm đánh giá hoạt tính chống oxy hóa in vitro VN U Thử tác dụng dọn gốc tự do DPPH dịch sau phản ứng để tính lượng DPPH còn lại sau phản ứng. ac y, Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng giữa gốc tự do DPPH (màu tím đỏ) với chất chống oxy hóa để tạo ra hợp chất của DPPH có màu vàng và không hấp thụ ánh sáng tử ngoại tại bước sóng 517 nm. Đo độ hấp thụ tại bước sóng 517 nm của dung dP ha rm Ưu điểm: Nhanh, cho kết quả khá chính xác, dễ thực hiện và không tốn kém. Tuy nhiên, DPPH không tồn tại trong cơ thể sống nên phép thử này chỉ mang ý nghĩa xác định khả năng loại bỏ gốc tự do của mẫu cần thử. Dùng trong sàng lọc các mẫu dược liệu [13, 17, 29, 47]. Thử tác dụng dọn gốc tự do superoxid O2● ine an Nguyên tắc: Gốc tự do O2● được hình thành trong quá trình oxy hóa xanthin thành acid uric được xúc tác bởi enzym xanthinoxidase. Gốc O2● tạo thành phản ứng với nitrobule tetrazolium sẽ tạo ra chất có màu xanh đậm, hấp thụ bước sóng tại 560 nm, đo hấp thụ quang của dung dịch phản ứng tại bước sóng này sẽ biết lượng ed ic O2● tham gia phản ứng [13, 18, 29, 50] đối ổn định và chính xác. M Ưu điểm: Nhanh, dễ thực hiện, yêu cầu ít máy móc, kết quả thu được tương of Thử tác dụng dọn gốc tự do hydroxyl ●OH Nguyên tắc: Phương pháp dựa trên phản ứng đường 2 – deoxyribose của gốc OH. Khi hoạt động sẽ oxy hóa đường deoxyribose để tạo ra sản phẩm cuối cùng là MDA (maloydialdehyd). Phân tử MDA khi phản ứng với acid thiobarbituric (TBA) ở nhiệt độ cao sẽ có màu hồng có hấp thụ ánh sáng cực đại ở bước sóng 532 nm. Đo hấp thụ quang của dung dịch tại bước sóng này sẽ cho biết nồng độ MDA được tạo ra sau quá trình oxy hóa. Từ đó tính được mức độ deoxyribose bị oxy hóa và mức độ dọn gốc tự do ●OH của mẫu thử. @ Sc ho ol ● Co py rig ht Ưu điểm: Nhanh, dễ thực hiện, chi phí thấp. Tuy nhiên gốc ●OH có hoạt tính rất mạnh nên rất khó để đánh giá mức độ tác dụng và kết quả ít chính xác hơn các thử nghiệm trên [13, 18, 29, 47]. 10 VN U 1.2.2. Các phương pháp thường dùng trong nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế enzym Acetylcholinesterase in vitro Quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc mới cần phải trải qua rất nhiều giai đoạn và một trong những giai đoạn đầu của quá trình là nghiên cứu sàng lọc. Có nhiều phương pháp được sử dụng trong giai đoạn này và phương pháp thử in vitro dP ha rm ac y, được áp dụng khi nó đáp ứng được một số tiêu chí như: có thể tiến hành trên nhiều mẫu, lượng mẫu thử ít, kết quả nhanh, chi phí thấp. Các nhà khoa học trong và ngoài nước đã tiến hành nhiều phương pháp thử nghiệm để xác định hoạt tính của enzym AChE, bao gồm: phương pháp đo quang, phương pháp điện di, phương pháp huỳnh quang với cơ chất phát huỳnh quang, phương pháp sử dụng thang pH hay xác định hoạt độ điện hóa của enzym AChE. Đối với nghiên cứu tác dụng ức chế enzym AChE in vitro, có 2 phương pháp thường được sử dụng là phương pháp sử dụng 1.2.2.1. an thuốc thử Ellman và phương pháp sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B. Phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman ed ic ine Phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman được xây dựng và ứng dụng sớm nhất trong số những phương pháp được sử dụng đánh giá tác dụng ức chế AChE in vitro. Hiện nay, phương pháp này vẫn được sử dụng khá phổ biến ở nhiều nghiên cứu cùng hướng, trong đó, phương pháp đo quang được sử dụng nhiều hơn phương of M pháp sắc ký lớp mỏng sinh học. Phương pháp này sử dụng cơ chất là acetylthiocholin iodid (ATCI) và thuốc thử là 5,5’ - dithiobis - nitrobenzoic acid (DTNB). ho ol ❖ Phương pháp đo quang @ Sc Phương pháp của Ellman dùng để xác định hoạt tính của enzym AChE dựa vào đo quang được tác giả này mô tả lần đầu tiên vào năm 1961 [45]. Nguyên tắc của phương pháp: cơ chất ATCI bị thủy phân nhờ xúc tác của cholinesterase tạo thiocholin. Thiocholin phản ứng với thuốc thử DTNB giải phóng ra hợp chất 5-thio2-nitrobenzoic acid màu vàng. Hợp chất này được xác định bằng cách đo độ hấp thụ ht của dung dịch ở bước sóng 412 nm. Co py rig Sau đó, nhiều nghiên cứu sàng lọc về tác dụng ức chế AChE in vitro khác tiếp tục được thực hiện. Tuy nhiên, so với phương pháp gốc được công bố bởi Ellman, phương pháp được triển khai trong các nghiên cứu sau đó đều có một số thay đổi về: nguồn gốc và hoạt độ của enzym, loại đệm sử dụng, nồng độ dung dịch cơ chất và thuốc thử… cũng như tỷ lệ phối hợp của chúng vào hỗn hợp phản ứng [57, 59]. 11 ❖ Phương pháp sắc ký lớp mỏng VN U Trên cơ sở phương pháp đo quang sử dụng thuốc thử Ellman, phương pháp sắc ký lớp mỏng sinh học đã được phát triển. Ở phương pháp này, sau khi bản mỏng được triển khai, hỗn hợp gồm dung dịch thuốc thử DTNB và cơ chất ATCI được AChE sẽ làm xuất hiện các vết màu trắng trên nền vàng [16]. ac y, phun lên bản mỏng, sau đó mới phun dung dịch enzym. Những chất gây ức chế dP ha rm Một trong những hạn chế của phương pháp sắc ký lớp mỏng sinh học là có thể gặp phải hiện tượng dương tính giả, hiện tượng vết màu trắng xuất hiện trên bản mỏng không phải do tác dụng ức chế enzym AChE. Để khắc phục hạn chế này, bên cạnh bản mỏng thử phải tiến hành làm thí nghiệm với một bản mỏng khác (bản đối chiếu). Các bước tiến hành trên bản đối chiếu tương tự như trên bản thử chỉ khác ở giai đoạn phun thuốc thử hiện màu. Đối với bản thử, hỗn hợp dung dịch thuốc thử ine an DTNB và cơ chất ATCI được phun trước, sau đó mới phun dung dịch enzym AChE. Với bản đối chiếu, dung dịch thuốc thử DTNB được phun trước, sau đó hỗn hợp gồm dung dịch cơ chất ATCI và dung dịch enzym AChE được phun sau. Cách 1.2.2.2. ed ic bố trí thử nghiệm như trên nhằm đảm bảo những vết màu trắng xuất hiện trên cả hai bản là những vết cho phản ứng dương tính giả [14]. Phương pháp sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B M So với phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman, số lượng nghiên cứu sử dụng ho ol of phương pháp này để đánh giá tác dụng ức chế AChE in vitro khá hạn chế. Phương pháp này sử dụng cơ chất là α-naphthyl acetat và thuốc thử là muối Fast Blue B (muối O-dianisidin bis(diazotized) zinc double). ❖ Phương pháp đo quang @ Sc Thử nghiệm đo quang sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B được công bố lần đầu tiên bởi tác giả Van Asperen K. vào năm 1962 [63]. Nguyên tắc của phương pháp: cơ chất α-naphthyl acetat bị thủy phân bởi enzym esterase giải phóng chất α- Co py rig ht naphthol. Chất này sau đó phản ứng với thuốc thử muối Fast Blue B tạo thành sản phẩm màu diazo. Hợp chất này được xác định bằng cách đo độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 600 nm. Tuy nhiên, sau đó không có nhiều nghiên cứu sử dụng phương pháp này để nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế AChE in vitro và một trong số đó là nghiên cứu của tác giả Di Giovanni S. [33, 46]. Phương pháp được sử dụng trong nghiên cứu của tác giả này có một số thay đổi so với phương pháp của 12