Tài liệu đánh giá khả năng định tính nhóm beta agonist trong thịt bằng kit betaagonist elisa của hãng randox (anh)

MỤC LỤC MỞ ĐẦU .................................................................................................................. 1 Đặt vấn đề ...................................................................................................1 Mục đích nghiên cứu ...................................................................................3 Phạm vi nghiên cứu .....................................................................................3 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 4 1.1. Lý thuyết về chất kích thích tăng trưởng họ Beta-agonist ......................4 1.1.1. Clenbuterol ........................................................................................7 1.1.2. Salbutamol ........................................................................................9 1.2. Tình hình nghiên cứu về nhóm Beta-agonist ở nước ngoài và trong nước .. 10 1.2.1. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài.................................................. 11 1.2.2. Tình hình nghiên cứu ở trong nước .................................................. 13 1.3. Thực trạng sử dụng Beta-agonist trong thịt ở trong nước và trên thế giới............................................................................................................ 15 1.4. Một số phương pháp được sử dụng để phân tích Beta-agonist ............. 16 1.4.1. Phương pháp ELISA ........................................................................ 17 1.4.2. Phương pháp phân tích sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) ............. 20 1.5. Một số vấn đề cơ bản về thẩm định phương pháp phân tích sàng lọc ... 21 Chương 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................................................................................... 23 2.1. Vật liệu nghiên cứu: ........................................................................... 23 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ...................................................................... 23 2.1.2. Địa điểm nghiên cứu ........................................................................ 23 2.1.3. Thời gian nghiên cứu ....................................................................... 23 2.1.4. Hóa chất và thuốc thử ...................................................................... 23 2.1.5. Thiết bị, dụng cụ .............................................................................. 23 2.2. Nội dung nghiên cứu .......................................................................... 23 2.3. Phương pháp nghiên cứu .................................................................... 24 2.3.1. Xác định sự có mặt của Salbutamol trong thịt lợn bằng phương pháp ELISA .............................................................................................. 26 2.3.2. Xác định sự có mặt của Clenbuterol trong thịt lợn bằng phương pháp ELISA .............................................................................................. 26 2.3.3. Xác định sự phù hợp của kit ELISA ................................................. 27 2.3.3.1. Độ tuyến tính (Linearity) / Khoảng xác định (Working ranger) ..... 27 2.3.3.2. Độ chọn lọc (Selecsibility) ............................................................ 27 2.3.3.3. Độ nhạy (Sensitivity) .................................................................... 28 2.3.3.4. Giới hạn phát hiện nhỏ nhất LOD ................................................. 28 2.3.3.5. Độ thu hồi (Recovery) .................................................................. 29 2.3.4. Thí nghiệm đảm bảo chất lượng kết quả thử nghiệm của kit ELISA . 30 2.3.5. Khẳng định khả năng phát hiện Beta-agonist của Kit bằng phương pháp định lượng LC/MS/MS ..................................................................... 30 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 33 3.1. Xác định sự phù hợp của kit ELISA.................................................... 33 3.1.1. Độ tuyến tính (Linearity) / Khoảng xác định (Working ranger) ........ 33 3.1.2. Độ chọn lọc (Selecsibility) ............................................................... 37 3.1.4. Độ nhạy (Sensitivity); Độ thu hồi (Recovery). ................................. 42 3.2. Khẳng định lại khả năng phát hiện Beta-agonist của Kit ELISA bằng phương pháp Sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS......................................... 43 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page v 3.3. Ứng dụng sự phù hợp của phương pháp phát hiện Beta-agonist bằng kit ELISA trên nền mẫu thực tại thị trường. ............................................... 45 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................... 50 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................... 51 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT - Clen: Clenbuterol - ELISA: Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay - HPLC: High-performance liquid chromatograph - LC/MS/MS: Sắc ký lỏng khối phổ - LOD: Giới hạn phát hiện (Limit of Detection) - LOQ: Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation) - NN&PTNT: Nông nghiệp và Phát triển nông thôn - ppb: Phần tỷ (Parts per billion) - Sal: Salbutamol - TACN: Thức ăn chăn nuôi - TCVN: Tiêu chuẩn Việt Nam Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vii DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang Bảng 1.1. Nhóm chất β2-agonist 5 Bảng 1.2. Giới hạn cho phép Clenbuterol và Salbutamol trên các nền mẫu 15 Bảng 2.1. Độ thu hồi chấp nhận ở các nồng độ khác nhau 29 Bảng 3.1. Kết quả tổng hơp hệ số hồi quy tuyến tính Clenbuterol 34 Bảng 3.2. Kết quả tổng hơp hệ số hồi quy tuyến tính Salbutamol 36 Bảng 3.3. Kết quả phân tích Clenbuterol và Salbutamol trên nền mẫu thịt 37 Bảng 3.4. Kết quả phân tích Clenbuterol mẫu trắng đánh giá LOD 39 Bảng 3.5. Kết quả phân tích Clenbuterol mẫu thêm chuẩn đánh giá LOD 39 Bảng 3.6. Kết quả phân tích Salbutamol mẫu trắng đánh giá LOD 40 Bảng 3.7. Kết quả phân tích Salbutamol mẫu thêm chuẩn đánh giá LOD 41 Bảng 3.8. Kết quả phân tích Clenbuterol và Salbutamol mẫu thêm chuẩn 42 tại giá trị LOD Bảng 3.9. Kết quả phân tích mẫu mù bằng Elisa và LC/MS/MS 44 Bảng 3.10. Kết quả phân tích Clenbuterol trong các mẫu nghiên cứu 45 Bảng 3.11. Kết quả phân tích Salbutamol trong các mẫu nghiên cứu 47 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page viii DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của nhóm chất β1-agonist 4 Hình 1.2 5 Hình 1.3 Cấu trúc hóa học nhóm chất β2 -agonist có tác dụng kéo dài Cấu trúc hóa học nhóm chất β2 -agonist có tác dụng ngắn 6 Hình 1.4 Cấu trúc hóa học nhóm chất Beta-agonist chưa được phân 7 loại Hình 1.5 Vị trí lấy mẫu nghiên cứu 25 Hình 3.1 Độ hấp thụ OD dãy chuẩn của 5 bộ kit Clenbuterol 34 Hình 3.2 Độ hấp thụ OD dãy chuẩn của 5 bộ kit Salbutamol 36 Hình 3.3 Biểu đồ thể hiện sự tương đồng kết Clenbuterol trong thịt giữa phương LC/MS/MS Biểu đồ thể hiện sự tương đồng kết Salbutamol trong thịt giữa phương LC/MS/MS quả phân tích pháp Elisa và 49 quả phân tích pháp Elisa và 48 Hình 3.2 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ix MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Ngày nay khi xã hội phát triển càng cao thì nhu cầu đời sống con người cũng cao hơn, chất lượng an toàn thực phẩm chiếm một vị trí rất quan trọng. Các ngành, các cơ quan quản lý Nhà nước cũng đang có những đề án, chương trình nhằm nâng cao chất lượng quản lý và sử dụng các chất kháng sinh trong các lĩnh vực cụ thể. Tuy nhiên, việc quản lý và hướng dẫn sử dụng thuốc kháng sinh còn chưa được đồng bộ và triệt để, tình trạng sử dụng các chất kháng sinh còn khá tùy tiện. Dẫn đến sự tồn dư các chất kháng sinh, gây nguy hại đến sức khỏe người tiêu dùng. Trong lĩnh vực dược phẩm, Beta-agonist là nhóm chất được sử dụng nhiều trong điều trị bệnh hen suyễn hay tắc nghẽn phổi mãn tính, hai chất điển hình là Salbutamol và Clenbuterol. Nhu cầu của người sử dụng ngày càng cao, càng thúc đẩy sự tăng trưởng và tăng lượng nạc cho gia súc, gia cầm. Dẫn đến việc sử dụng kích thích tố tăng trưởng, hormone tăng trọng ngày càng phổ biến từ nhà sản xuất thức ăn chăn nuôi đến người chăn nuôi. Clenbuterol và Salbutamol được đưa vào trong thức ăn gia súc nhằm làm giảm lớp mỡ dưới da, tăng cơ, tăng trọng đối với gia súc, gia cầm. Ở Việt Nam, các loại dược liệu thuộc nhóm Beta-agonist trong đó có Clenbuterol và Salbutamol được xếp vào danh mục "Thuốc, hóa chất, kháng sinh cấm sử dụng, hạn chế sử dụng của Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn" (Bộ NN và PTNT, 2009). Kiểm soát sự hiện diện của nhóm Beta-agonist trong thức ăn gia súc, gia cầm vào những năm gần đây đã được Nhà nước quan tâm chú trọng, tuy nhiên chưa tập trung, triệt để. Việc định lượng chính xác dư lượng của các Beta-agonist trong thức ăn chăn nuôi là vấn đề cần được quan tâm trong công tác kiểm tra chất lượng sản phẩm. Đồng thời, việc xác định tồn dư Betaagonist trong thịt một số gia súc là rất cần thiết về mặt quản lý để đánh giá tình hình mức độ sử dụng các chất này trong thức ăn chăn nuôi và đưa ra những cảnh Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 1 báo về vệ sinh an toàn thực phấm. Phương pháp Sắc ký lỏng khối phổ (LCMS/MS) là phương pháp đã và đang được sử dụng để kiểm tra chính xác hàm lượng nhóm Beta-agonist tồn dư trong thực phẩm. Tuy nhiên với chi phí đầu tư thiết bị, máy móc cao, đòi hỏi đội ngũ kiểm nghiệm có trình độ chuyên môn; việc sàng lọc sự hiện diện nhóm Beta-agonist là công đoạn rất cần thiết trước khi tiến hành kiểm nghiệm sâu. ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) là một kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu cần phân tích. ELISA được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như y học, nông nghiệp và đặc biệt là trong các quy trình sàng lọc, kiểm tra an toàn chất lượng các sản phẩm thực phẩm. Trên thị trường có nhiều loại kit ELISA có khả năng định tính Betaagonist của các hãng khác nhau như: kit ELISA hãng Biooscientific (MaxSignalTM Beta-agonist, mã 1009), kit ELISA hãng Tecna (Beta-Agonist ELISA Kit, mã AA107), kit ELISA hãng Randox (Beta-Agonist ELISA, mã SU2148; Clenbuterol ELISA, mã CB-1418). Mỗi loại kit ELISA để phân tích định tính dư lượng Beta-agonist trong thịt của các hãng khác nhau là khác nhau rất nhiều về khả năng ứng dụng theo mục đích sử dụng và điều kiện thực tế tại phòng thử nghiệm ở Việt Nam. Việc đánh giá loại kit ELISA phù hợp cho phân tích định tính dư lượng Beta-agonist trong thịt lợn phải phù hợp với quy định trong Quyết định số 2002/657/EC do Ủy ban Châu Âu thiết lập cho phương pháp bán định lượng và cần được khẳng định bằng phương pháp định lượng Sắc ký lỏng khối phổ (LC/MS/MS). Để góp phần giúp cơ quan có thẩm quyền, đặc biệt là Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn Hà Nội lựa chọn loại kit ELISA phù hợp cho phân tích định tính dư lượng Beta-agonist trong thịt lợn, góp phần xây dựng các chiến lược phòng ngừa chất tồn dư độc hại trong thực phẩm có nguồn gốc động vật, đảm bảo cung cấp thực phẩm an toàn cho nguời tiêu dùng. Xuất phát từ sự cấp bách của tình hình thực tế, trên cơ sở khoa học của các công trình nghiên cứu về Betaagonist được công bố trong và ngoài nước, chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Đánh giá khả năng định tính nhóm Beta-agonist trong thịt bằng kit Beta-agonist Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 2 ELISA của hãng Randox (Anh)” Nghiên cứu này sẽ góp phần vào việc quản lý, bảo đảm vệ sinh an toàn thực phẩm và bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng. Mục đích nghiên cứu Đánh giá sự phù hợp của kit ELISA trong việc sàng lọc định tính Betaagonist (Clenbuterol và Salbutamol) trong thịt. Tạo thuận lợi cho các cơ quan quản lý nhà nước trên địa bàn Hà Nội lựa chọn kit thử nhanh, phù hợp để nâng cao chất lượng quản lý an toàn thực phẩm. Phạm vi nghiên cứu Beta-agonist là một nhóm các hợp chất tự nhiên, có nguồn gốc từ các Catecholamines, hiện có khoảng hơn 20 hợp chất khác nhau. Hiện nay tại Việt Nam, những chất thường được sử dụng trong chăn nuôi là Clenbuterol, Sabutamol, Ractopamine, Malbutamol, Zilpatrol, Cimaterol nhưng phổ biến nhất là Clenbuterol, Sabutamol (Dương Thanh Liêm và cs, 2002). Do vậy trong nghiên cứu, tác giả tập trung với đối tượng nghiên cứu là Kít ELISA định tính Clenbuterol và Salbutamol của Hãng Randox (Anh). Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 3 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Lý thuyết về chất kích thích tăng trưởng họ Beta-agonist Beta-agonist là loại hợp chất cường giao cảm, kích thích tăng trưởng gồm những hợp chất tổng hợp có dẫn xuất từ thiên nhiên như là Adrenaline và Noradrenaline do tủy của tuyến thượng thận tiết ra. Chúng là một nhóm thuốc gồm nhiều hóa chất khác nhau Nhóm chất thuộc họ Beta-agonist được chia thành nhiều loại tùy theo tác dụng của các hợp chất (Witkamp, R. F.,1996) - Nhóm β1–agonists Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của nhóm chất β1-agonist Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 4 - Nhóm β2–agonists thường dùng trong điều trị hen suyễn dưới dạng hít, tác dụng sau 2 - 3 phút, kéo dài 3- 5 giờ gồm các chất trình bày trong bảng 1.1 Bảng 1.1. Nhóm chất β2-agonist Nhóm Điển hình Tác dụng ngắn Levoalbuterol Salbutamol (Albuterol, Ventolin) Terbutaline Pirbuterol (Maxair) Procaterol Orciprenaline Metaproterenol (Alupent) Fenoterol Bitolterol mesylate Ritodrine Tác dụng kéo dài Tác dụng siêu dài Salmeterol (Serevent Indacaterol Diskus) Formoterol (Foradil) Bambuterol Clenbuterol Hình 1.2. Cấu trúc hóa học nhóm chất β2 -agonist có tác dụng kéo dài Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 5 Hình 1.3. Cấu trúc hóa học nhóm chất β2 -agonist có tác dụng ngắn Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 6 Ngoài ra còn có nhóm thuộc Beta-agonist nhưng chưa được phân loại chính xác như : Hình 1.4. Cấu trúc hóa học nhóm chất Beta-agonist chưa được phân loại Trong số các chất kích thích tăng trưởng thuộc họ β2 –agonists, có 2 hợp chất thường được sử dụng để trộn vào thức ăn chăn nuôi ở Việt Nam là clenbuterol và salbutamol. 1.1.1. Clenbuterol Clenbuterol được dùng với tên biệt dược là broncodil, clenburol, ventolax, protovent; nó thường tồn tại ở dưới dạng Clenbuterol Hydrochloride. Clenbuterol được chấp nhận sử dụng trong một số quốc gia như một thuốc giãn phế quản cho bệnh nhân. Nó có thể gây nguy hiểm nếu sử dụng ở hàm lượng nhiều hơn 0,12 mg. Clenbuterol có sự tương đồng về cấu trúc cũng như dược tính đối với Salbutamol, tuy nhiên ảnh hưởng của nó mạnh hơn và lâu hơn. Nó làm tăng khả năng điều khí, kích thích hệ thống thần kinh trung ương, huyết áp và vận chuyển oxy. Theo Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ, Clenbuterol không phải là một thành phần của bất kỳ loại thuốc điều trị và bị cấm đối với các vận động viên (Guest, 2007). Tại Mỹ, đối với bất kỳ động vật sử dụng làm thức ăn cho người có sử dụng Clenbuterol đều bị cấm bởi FDA (FARAD, 2014). Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 7 Clenbuterol có thể gây ra những tác dụng phụ: căng thẳng, nhiễm độc giáp, nhịp tim nhanh, huyết áp cao,... Sử dụng quá nhiều so với khuyến cáo khoảng 120 mg có thể gây ra chấn động cơ, đau đầu, chóng mặt và kích ứng dạ dày. Có thể xác định sự hiện diện của nó trong tinh dịch hay nước tiểu (MedicineNet, 2015). Vào tháng Chín năm 2006, hơn 330 người ở Thượng Hải cho biết đã có ngộ độc thực phẩm do ăn thịt lợn nhiễm clenbuterol đã được làm thức ăn cho các loài động vật để giữ cho thịt nạc. Vào tháng Hai năm 2009, ít nhất 70 người ở một tỉnh của Trung Quốc (Quảng Đông) bị ngộ độc thực phẩm sau khi ăn nội tạng lợn cho là chứa clenbuterol dư lượng (Wang Ying, 2009). Trong tháng 3 năm 2011, Bộ Nông nghiệp Trung Quốc đã mở chiến dịch đàn áp về phụ gia bất hợp pháp trong thức ăn cho lợn, sau khi một công ty con của Tập đoàn Shuanghui, nhà sản xuất thịt lớn nhất Trung Quốc, sử dụng Clenbuterol trong các sản phẩm thịt lợn. Tổng cộng có 72 người ở tỉnh Hà Nam, nơi Shuanghui đặt trụ sở, đã bị bắt vì sản xuất, bán hoặc sử dụng clenbuterol (Xinhua, 2011). Tình hình đã được cải thiện đáng kể ở Trung Quốc kể từ tháng 4 năm 2011 khi lệnh cấm của Clenbuterol đã được công bố bởi Bộ Nông nghiệp Trung Quốc. * Clenbuterol trong y học - Một số tên gọi khác của clenbuterol trong y học: Spiropent, Ventipulmin... - Trong y học, clen có tác dụng làm dãn phế quản, dãn cơ trơn ở cuống phổi,clen còn là dược phẩm được chỉ định để điều trị các chứng bệnh có liên quan đến phổi như hen suyễn, tuy nhiên có thể gây tổn hại đến hệ thần kinh và tuần hoàn của con người. * Clenbuterol trong thú y Trong thú y, clen được sử dụng để điều trị các căn bệnh dị ứng đường hô hấp ở ngựa, điều trị bệnh đường hô hấp ở trâu, bò,..Thuốc có thể thải dần qua đường tiểu và một ít qua phân nhưng với thời gian rất dài. Ngoài ra, clen còn dùng làm thuốc điều tiết sinh trưởng trong cơ thể vật nuôi. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 8 Clenbuterol là giúp giảm mỡ trong cơ thể thông qua việc tăng quá trình đồng hóa. Tác động này được thực hiện bằng cách làm tăng nhẹ nhiệt độ của cơ thể. Nếu nhiệt độ cơ thể tăng lên 100C thì cơ thể sẽ đốt cháy thêm 5% năng lượng dùng duy trì sự sống. Khi đó, cơ thể sẽ thích ứng bằng cách giảm tiết thyroxin cho các hoạt động trong cơ thể, sẽ dẫn tới bệnh của tuyến giáp. Tóm lại, những tác hại nêu trên đã cảnh báo rằng việc sử dụng clen nói riêng và việc sử dụng các chất Beta-agonist làm chất kích thích tăng trưởng nói chung là nguy hiểm cho sức khỏe con người nên từ lâu các chất này đã bị cấm sử dụng trong nước, cũng như ở nhiều nước trên thế giới, nhưng chúng vẫn tiếp tục được sử dụng một cách bất hợp pháp vì mang lại lợi nhuận cao cho người chăn nuôi. 1.1.2. Salbutamol Salbutamol được dùng cho người với tên biệt dược là albuterol, salbutamol,... Salbutamol được bán trên thị trường vào năm 1968 của Allen & Hanburys (Anh) dưới thương hiệu Ventolin, và đã được sử dụng để điều trị bệnh hen suyễn. Nó đã được phê duyệt cho sử dụng tại Mỹ bởi FDA tháng 5 năm 1982 [30]. Salbutamol là nằm trong danh sách World Health Organization's List of Essential Medicines, một danh sách gồm các loại thuốc quan trọng nhất cần thiết trong một hệ thống y tế cơ bản (WHO, 2014). Salbutamol kết hợp với các thụ thể β2-adrenergic với ái lực cao hơn các thụ thể β1. Trong đường hô hấp, sự họat hóa các thụ thể β2 làm giãn các cơ ở khí quản và do đó khí quản mở rộng ra và lượng không khí vào phổi sẽ tăng lên. Salbutamol sulfate cho hiệu quả khá nhanh chỉ trong vòng 5-15 phút sau khi xịt mũi. Trong sản khoa, họat động của các thụ thể β2 làm giản cơ trơn tử cung và vì vậy nó có tác dụng làm trì hoãn việc đẻ non. Salbutamol thường được sử dụng để điều trị co thắt phế quản (do bất kỳ nguyên nhân nào, do chất gây dị ứng hen suyễn hoặc do tập luyện), cũng như bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 9 Salbutamol cũng được sử dụng trong sản khoa, nó được sử dụng như một thuốc giảm co để thư giãn các cơ trơn tử cung để trì hoãn sinh non. Salbutamol được sử dụng để điều trị tăng kali máu cấp tính vì nó kích thích kali chảy trong các tế bào do đó làm giảm mức độ trong máu. Salbutamol cũng đã được thử nghiệm trong teo cơ tủy sống và cho thấy lợi ích khiêm tốn. Thuốc được suy đoán để điều chỉnh nối thay thế của gen SMN2, tăng lượng protein SMN bị thiếu được coi là nguyên nhân gốc rễ của bệnh (Lewelt, 2011 và Van Meerbeke, 2011). Các tác dụng phụ thường gặp nhất là run tốt, lo lắng, đau đầu, chuột rút cơ bắp, khô miệng,... Các triệu chứng khác có thể bao gồm nhịp tim nhanh, loạn nhịp tim, đỏ bừng mặt, thiếu máu cục bộ cơ tim (hiếm) và rối loạn giấc ngủ, hành vi. Hiếm khi xảy ra, nhưng quan trọng, là phản ứng dị ứng co thắt phế quản nghịch lý, nổi mề đay, phù mạch, hạ huyết áp và đột quỵ. Ở liều lượng cao có thể gây hạ kali máu (British National Formulary, 2008). * Tác dụng của Clenbuterol và Salbutamol lên động vật nuôi và người Clenbuterol và salbutamol là những hormone tăng trưởng tổng hợp hóa học có tác dụng kích thích gia súc, gia cầm tăng trọng nhanh do có tác dụng điều khiển các chất dinh dưỡng hướng tới mô cơ, tăng quá trình tổng hợp protein để tích lũy nạc và giảm tích lũy mỡ trong cơ thể. Chính vì sự tăng trọng nhanh mà thời gian chăn nuôi được rút ngắn, giảm được chi phí thức ăn, thuốc men Clenbuterol và Salbutamol tích lũy trong thực phẩm thịt sẽ làm ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng thông qua dây chuyền thực phẩm, gây ra các triệu chứng rối loạn nhịp tim, tim đập nhanh, tăng huyết áp, co thắt phế quản, phù nề, run cơ, liệt cơ, choáng váng,… Việc lạm dụng Salbutamol có thể được phát hiện bởi sự hiện diện của nó trong huyết tương hoặc nước tiểu (thường vượt quá 1000 mg/L) (Baselt, 2008 và Schweizer, 2004) 1.2. Tình hình nghiên cứu về nhóm Beta-agonist ở nước ngoài và trong nước Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 10 1.2.1. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài Salbutamol có thể được điều chế từ một dẫn xuất acetophenone có nguồn gốc từ axit salicylic. Salbutamol đã được chứng minh để cải thiện trọng lượng cơ bắp ở chuột và các báo cáo giai thoại ra giả thuyết rằng, nó có thể là một thay thế cho Clenbuterol với mục đích đốt cháy chất béo, tạo cơ bắp (Caruso J.F., 1995, 2005). Năm 1999, nghiên cứu của tác giả Peter R.Cheeke cho thấy: • Để đạt được danh hiệu vô địch trong các cuộc thi hội chợ, người ta đã cho các con vật sử dụng “doping” với clenbuterol để tăng khối cơ. • Người tiêu thụ gan động vật sử dụng thức ăn chứa clenbuterol có biểu hiện run rẩy, tim đập nhanh, đau đầu, chóng mặt và buồn nôn. • Dư lượng của clenbuterol tồn tại trong võng mạc mắt và trong tóc lâu tới vài tháng. Các tác giả Warriss P. D và cộng sự (1990 và 1991), Fawcett J. P và cộng sự (2004) đã nghiên cứu ảnh hưởng của salbutamol lên thịt heo, một số chuyển hóa về mặt sinh học của gia súc khi sử dụng hợp chất này. Do tính độc hại của các hợp chất thuộc nhóm Beta-agonist, từ nhiều năm, các nhà nghiên cứu trên thế giới đã không ngừng phát triển các các phương pháp, quy trình để xác định clenbuterol, salbutamol nói riêng và các hợp chất thuộc nhóm Beta-agonist nói chung. Nhiều phương pháp khác nhau được nghiên cứu: phương pháp ELISA, sắc ký khí (GC), sắc ký lỏng (LC), sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS), sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS). Các trị số thường được dùng cho việc đánh giá độ chính xác của các phương pháp phân tích chủ yếu là giới hạn phát hiện (LOD) hoặc giới hạn định lượng (LOQ), hiệu suất thu hồi, các trị số này trên nguyên tắc cần đáp ứng các quy định và tiêu chuẩn đã có của Châu Âu và của Codex. Theo các tài liệu đã công bố, từ năm 1990 đến 1999, nhiều tác giả đã nghiên cứu phương pháp phân tích clenbuterol, salbutamol bằng LC-MS, LCMS/MS với các giá trị LOD cho clenbuterol trong nhiều nền mẫu khác nhau (thịt, gan, thận, thức ăn gia súc, mẫu máu..) thường đạt từ 0,02 đến 0,5 ppb; với phương pháp phân tích Beta-agonist trên các nền mẫu sinh học bằng sắc ký khí Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 11 (GC-MS), các nghiên cứu được công bố cho giá trị LOD < 0,5 ppb hoặc không công bố giá trị LOD. Riêng trong năm 1999, Guy và cộng sự thuộc trung tâm nghiên cứu Nestlé - Switzerland đã thông báo phương pháp phân tích clenbuterol trong thịt gia súc bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ ba tứ cực (với qui trình chiết mẫu bằng HClO4) với LOD đạt 0,01 ppb, hiệu suất thu hồi đạt 6370%. Từ năm 2001 đến năm 2004, nhiều tác giả đã sử dụng sắc ký khí hoặc sắc ký lỏng ghép khối phổ một tứ cực để phân tích clenbuterol, salbutamol trong các nền mẫu sinh học, giới hạn phát hiện cho các nghiên cứu này từ 0,8-2,5 ppb (cho clenbuterol), 3,5ppb (cho salbutamol), hiệu suất thu hồi lớn hơn 90%. - Năm 2005 Kootstra P.R. và cộng sự thuộc Viện Nghiên cứu sức khỏe và môi trường ở Hà Lan đã sử dụng kỹ thuật tách chiết bằng cột SPE với cột nhồi là loại polymer in dấu phân tử (MIPs: Molecularly Imprinted Polymers) và kết hợp với phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ (bẩy ion) để phân tích các chất thuộc nhóm Beta-agonist trong thịt bò. Giới hạn phát hiện đạt được 0,1 ppb. - Năm 2010, Pleadin J., và cộng sự công bố phương pháp xác định dư lượng của clenbuterol trong thịt heo bằng ELISA và kỹ thuật LC/MS/MS với LOD dưới 0,1 ppb sau khi cho heo uống clenbuterol với nồng độ 20 µg/kg trọng lượng heo, trong 1 ngày. Cũng trong năm 2010, Xu Z..,và cộng sự thuộc Khoa Hóa và kỹ thuật hóa, trường đại học Sun Yat-sen (Trung quốc) đã công bố phương pháp phân tích ractopamine, isoxpurine, clenbuterol trong thịt, gan, thận heo bằng cách kết hợp kỹ thuật chiết mẫu bằng SPE với cột nhồi là loại polymer in dấu phân tử MIP (Molecularly imprinted polymers) và kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp (HPLC), với LOD từ 0,1-0,21 ppb, hiệu suất thu hồi từ 83,7- 92,3 %. Đầu năm 2011, Liu B., và cộng sự thuộc khoa Hóa trường Đại học Baodinh, Trung quốc đã thông báo phương pháp xác định clenbuterol trong thịt heo bằng quy trình chiết pha rắn (có sự hỗ trợ trong quá trình chiết bằng sóng siêu âm) và kỹ thuật HPLC-UV, giới hạn phát hiện LODclen = 0,07ppb, hiệu suất thu hồi từ 87,9-103,6% Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 12 Nhìn chung, Beta-agonist không được phép sử dụng làm chất tăng trọng trong thức ăn chăn nuôi ở nhiều nước trên thế giới, hàm lượng tối đa cho phép (MRLs) hiện nay chỉ có quy định cho clenbuterol với MRL là 0,1 ppb trong thịt, 0,5ppb trong gan theo Châu Âu hoặc 0,2 ppb trong thịt và 0,6 ppb trong gan theo Codex Alimentarius. Riêng đối với Việt Nam, Beta-agonist tuyệt đối bị cấm sử dụng trong TACN và do đó không được có trong thịt gia súc, gia cầm (Bộ NN và PTNT, 2009) 1.2.2. Tình hình nghiên cứu ở trong nước Việc phân tích Clenbuterol, Salbutamol tại nhiều phòng thí nghiệm ở Việt Nam vào năm 2006, chủ yếu được thực hiện với phương pháp ELISA (dựa vào phản ứng kháng nguyên - kháng thể). Tuy nhiên, không có nhiều công trình lớn về ứng dụng phương pháp này để định tính Beta-agonist trong thịt, bởi ELISA có tính sàng lọc và có thể cho kết quả dương tính giả. Theo quyết định 2002/657/ EC của châu Âu, một phương pháp sàng lọc, dù đã được chứng minh có thể áp dụng được cho đối tượng kiểm nghiệm, vẫn phải được xác minh lại bằng một phương pháp có tính khẳng định hơn nếu nghi ngờ về kết quả. Năm 2006, trong hội thảo về hormon tăng trưởng do Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông nghiệp miền Nam và Hiệp hội thức ăn chăn nuôi tổ chức, Cục Chăn nuôi (Bộ NN&PTNT) đã công bố kết quả kiểm tra (từ 20/6 - 3/11/2006) theo đó cơ quan chức năng đã phát hiện 47/428 mẫu dương tính với clenbuterol. Năm 2007, Phạm Xuân Viết và cộng sự, Trường Đại Học Dược Hà Nội đã nghiên cứu phương pháp sắc kỷ lỏng hiệu năng cao, một tứ cực, để định lượng salbutamol trong huyết tương, hiệu suất chiết salbutamol ở các nồng độ 10, 75, 200ppb khoảng 80%. Năm 2008, Trung Tâm Dịch Vụ Phân Tích Thí nghiệm TPHCM đã nghiên cứu và xây dựng qui trình phân tích clenbuterol bằng sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS) đạt hiệu suất thu hồi từ 65- 88%; giá trị LOD đối với TACN là 0,16 ppb (clen), 0,11 ppb (sal); giá trị LOD đối với thịt là 0,05 ppb (clen), 0,07 ppb (sal) báo cáo đề tài cấp thành phố năm 2008. Năm 2009, Bùi Quốc Anh (công ty Inotech - Thành phố Hồ Chí Minh) Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 13 nghiên cứu đề tài bộ kit phát hiện nhanh chất Clenbuterol trong thịt gia súc, gia cầm trong thời gian 2 giờ. Tuy nhiên, đây chỉ là phương pháp định tính dựa trên sự biến đổi màu của thuốc thử. Năm 2007, trong lúc nhiều phòng thí nghiệm vẫn còn dùng phương pháp ELISA để kiểm tra clenbuterol thì nhóm tác giả Nguyễn Thị Thu Thủy, Lâm Văn Xự, Phạm Thị Ánh, Trần Kim Tính, Chu Phạm Ngọc Sơn, đã nghiên cứu thành công phương pháp phân tích clenbuterol trong thức ăn chăn nuôi và sản phẩm thịt bằng sắc ký lỏng ghép khối phổ một tứ cực (LC/MS) (Nguyễn Thị Thu Thủy, 2007). Tuy kỹ thuật LC/MS một tứ cực không đạt độ nhạy và độ chọn lọc bằng sắc ký lỏng ghép khối phổ ba tứ cực LC-MS/MS, nhưng giá trị LOD cũng khá thấp (LODClen (thịt): 0,038 ppb và LODClen (TACN): 0,497 ppb). Giá trị LODClen này (≤1/5 MRL) phù hợp đối với trị số MRL 0,2 ppb theo tiêu chuẩn của Codex, không phù hợp đối với MRL 0,1 ppb theo tiêu chuẩn Châu Âu. + Cuối năm 2007, nhóm tác giả Nguyễn Thị Thu Thủy, Lâm Văn Xự, Phạm Thị Ánh, Trần Kim Tính, Chu Phạm Ngọc Sơn, Kefei Wang, tiếp tục nghiên cứu phương pháp phân tích clenbuterol trong thức ăn chăn nuôi và sản phẩm thịt bằng sắc ký lỏng ghép khối phổ ba tứ cực (LC-MS/MS) với LOD = 0,01 ppb cho thịt heo, điểm mới là có sử dụng thêm nội chuẩn đồng vị Clenbuterol-d9 để loại trừ ảnh hưởng nền mẫu khi tách chiết và sự khử ion nếu có khi định lượng với đầu dò khối phổ theo chế độ ESI (+) (Nguyễn Thị Thuy Thủy, 2008). Trị số LODClen công bố 0,01 ppb phù họp với cả tiêu chuẩn về MRL của Châu Âu và Codex. Chính phương pháp nầy được áp dụng trong điều tra mức độ tồn dư clenbuterol và salbutamol trong thịt heo, thịt gà trên thị trường hoặc do chúng tôi tự nuôi với thức ăn có chứa clenbuterol và salbutamol. + Năm 2009, nhóm tác giả Nguyễn Thị Thu Thủy, Nguyễn Nhựt Xuân Dung, Phạm Thị Ánh, Chu Phạm Ngọc Sơn nghiên cứu ảnh hưởng của clenbuterol, salbutamol trên sự tăng trọng gà, heo và đánh giá độ tồn lưu của chúng trên gà heo bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ ba tứ cực (LC/MS/MS). Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 14 + Vào tháng 4 năm 2011, nhóm tác giả Nguyễn Thị Thu Thủy, Lâm Văn Xự, Phạm Thị Ánh, Chu Phạm Ngọc Sơn, Trần kim Tính đã báo cáo về phân tích salbutamol trong thịt và thức ăn chăn nuôi bằng LC-MS/MS (Nguyễn Thị Thu Thủy và cs, 2011). 1.3. Thực trạng sử dụng Beta-agonist trong thịt ở trong nước và trên thế giới Theo Thông tư số 57/2012/TT-BNNPTNT ngày 07 tháng 11 năm 2012 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (Bộ NN và PTNT, 2012), giới hạn cho phép của Clenbuterol và Salbutamol trên các nền mẫu được quy định như sau: Bảng 1.2. Giới hạn cho phép Clenbuterol và Salbutamol trên các nền mẫu Loại mẫu Clenbuterol (ppb) Salbutamol (ppb) Thức ăn chăn nuôi 50,0 50,0 Thuốc thú y 50,0 50,0 Nước uống 5,0 5,0 Nước tiểu 2,0 2,0 Thịt 0,2 5,0 Thận 0,2 5,0 Gan 0,2 5,0 Máu 0,2 5,0 Theo kết quả điều tra của Chi cục Thú y Thành phố Hồ Chí Minh năm 2005, trong 500 mẫu thịt lợn lấy tại TPHCM có 30% mẫu dương tính với chất clenbuterol. Tháng 11/2009 Chi cục Thú y TP.HCM phối hợp với Sở Y tế TP.HCM kiểm tra định kỳ thịt lợn đã phát hiện có đến 10% của 500 mẫu thịt dương tính với clenbuterol. Gần đây, Cục An toàn vệ sinh thực phẩm đã kiểm tra sự có mặt của các chất beta-angonist trong các mẫu thức ăn gia súc sản xuất công Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 15