Tài liệu Đánh giá đa dạng di truyền quần thể thuốc thượng (phaeanthus vietnamensis ban) ở bán đảo sơn trà thành phố đà nẵng bằng chỉ thị phân tử rapd và issr

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ THUỐC THƯỢNG (PHAEANTHUS VIETNAMENSIS BAN) Ở BÁN ĐẢO SƠN TRÀ - THÀNH PHỐ ĐÀ NẴNG BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ RAPD VÀ ISSR NGÔ VŨ BẢO TRÂN Đà Nẵng, 2022 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ THUỐC THƯỢNG (PHAEANTHUS VIETNAMENSIS BAN) Ở BÁN ĐẢO SƠN TRÀ - THÀNH PHỐ ĐÀ NẴNG BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ RAPD VÀ ISSR Ngành : Sư phạm Sinh học Khóa : 2018 - 2022 Sinh viên : Ngô Vũ Bảo Trân Người hướng dẫn : TS. Nguyễn Minh Lý Đà Nẵng, 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu được tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Minh Lý. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả Ngô Vũ Bảo Trân i LỜI CẢM ƠN Thưa thầy cô, song song với Thực tập Sư phạm, Khóa luận tốt nghiệp về thực nghiệm này là chính kết quả của cả một quá trình học hỏi, trau dồi kiến thức, nỗ lực không ngừng nghỉ của bản thân em. Em rất may mắn khi nhận được sự giúp đỡ, hỗ trợ tận tình từ quý thầy cô, gia đình và bạn bè của mình. Qua đây, em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến với tất cả mọi người đã luôn giúp đỡ, động viên, khích lệ em trong suốt thời gian vừa qua. Đầu tiên, cho phép em được gửi đến TS. Nguyễn Minh Lý lời cảm ơn sâu sắc nhất. Thầy là người trực tiếp hướng dẫn cũng như tận tình chỉ dạy, cả về việc định hướng tư duy, cách làm việc khoa học để em có thể sắp xếp hợp lí thời gian Thực tập Sư phạm và Khóa luận tốt nghiệp sao cho hiệu quả. Cảm ơn thầy đã tạo mọi điều kiện giúp em hoàn thành khóa luận này một cách trọn vẹn nhất. Xin cảm ơn TS. Trương Thị Thanh Mai, giáo viên chủ nhiệm và cũng là người truyền cảm hứng lớn nhất giúp em có được tự tin đến với khóa luận tốt nghiệp này. Bài dạy Sư phạm của cô thực sự rất tuyệt, cảm ơn cô đã luôn nhiệt huyết như thế! Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể các thầy cô trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng, và đặc biệt là các thầy cô giáo của Khoa Sinh – Môi trường. Những bài học của thầy cô trên giảng đường Sư phạm trong bốn năm qua, những truyền đạt kinh nghiệm quý báu đó sẽ là hành trang giúp chúng em vững bước trong tương lai. Cảm ơn anh Bá Duy, chị Diễm Sương, bạn Đức Toàn và các bạn, các anh chị ở phòng thí nghiệm, những người đã hướng dẫn em những thao tác cơ bản đầu tiên khi đến với Sinh học phân tử. Cũng nhờ hai anh chị và các bạn đã góp ý, chỉnh sửa giúp cho bài khóa luận của em được hoàn thiện hơn. Cảm ơn chú Phiến – Dược liệu Sơn Trà đã nhiệt tình trao đổi chỉ ra những thông tin bổ ích về cây thuốc Thượng cùng với chỉ dẫn của chú mà những hôm đi thu mẫu của em trở nên thuận lợi và dễ dàng. Cảm ơn bác bảo vệ đã cho phép chúng em được ở lại thâu đêm suốt sáng làm việc, cùng những hôm mất ngủ vì bị gọi dậy mở cửa để tụi em có được kết quả như ngày hôm nay. ii Và với tất cả lòng biết ơn, xin được gửi đến ba mẹ em, gia đình em - nguồn động viên tinh thần lớn nhất. Cùng tất cả bạn bè em và tập thể lớp 18SS. Cảm ơn vì đã đi cùng nhau, cùng nhau chia sẽ niềm vui nỗi buồn trong những năm tháng Sư phạm này. Ai rồi cũng có những lựa chọn riêng, lối đi riêng, hy vọng các bạn luôn hạnh phúc và thành công. Kiến thức nhận được thì vô vàn mà sự tiếp thu kiến thức của em vẫn còn có hạn chế nhất định. Khóa luận này không tránh khỏi sai sót, kính mong sự chỉ dẫn, đóng góp của thầy cô để bài khóa luận của em được hoàn thiện hơn. Sau cùng em xin kính chúc các thầy cô, gia đình, bạn bè, những người yêu thương em dồi dào sức khỏe và thành công trong sự nghiệp. Em xin chân thành cảm ơn! Đà Nẵng, ngày 23 tháng 5 năm 2022 Sinh viên Ngô Vũ Bảo Trân iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................... ii MỤC LỤC ................................................................................................................ iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU ..................................................... vi DANH MỤC BẢNG BIỂU .................................................................................... vii DANH MỤC HÌNH ẢNH ..................................................................................... viii TÓM TẮT ................................................................................................................ ix MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 1. Tính cấp thiết của đề tài .......................................................................................... 1 2. Mục tiêu................................................................................................................... 2 3. Ý nghĩa .................................................................................................................... 2 3.1. Ý nghĩa khoa học ................................................................................................. 2 3.2. Ý nghĩa thực tiễn .................................................................................................. 2 4. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................... 2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................................3 1.1. Giới thiệu về cây thuốc Thượng........................................................................... 3 1.2. Đặc điểm thực vật học.......................................................................................... 3 1.3. Giá trị dược liệu ................................................................................................... 4 1.4. Đánh giá đa dạng di truyền dựa trên các chỉ thị phân tử RAPD và ISSR............ 7 1.4.1. Kĩ thuật RAPD .................................................................................................. 7 1.4.2. Kĩ thuật ISSR .................................................................................................... 9 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................11 2.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................ 11 2.3. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................................ 11 2.3. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................... 11 2.3.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số............................................................. 11 2.3.2. Phương pháp PCR ........................................................................................... 12 2.3.3. Phương pháp điện di ....................................................................................... 13 2.3.4. Phương pháp xử lí dữ liệu ............................................................................... 14 iv CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ..............................................................15 3.1. Kết quả tối ưu hóa phản ứng PCR ..................................................................... 15 3.1.3. Tối ưu hóa nồng độ mồi trong phản ứng PCR ................................................ 16 3.2. Hiệu quả của mồi RAPD và ISSR trong đánh giá đa dạng di truyền ................ 16 3.3. Mối quan hệ di truyền của quần thể Thuốc Thượng dựa trên phân tích ISSR và RAPD ........................................................................................................................ 20 3.3.1. Mối quan hệ di truyền của quần thể thuốc Thượng dựa trên chỉ thị RAPD ... 20 3.3.2. Mối quan hệ di truyền của quần thể thuốc Thượng dựa trên chỉ thị ISSR ..... 22 3.3.3. Mối quan hệ di truyền của quần thể thuốc Thượng dựa trên chỉ sự kết hợp của chỉ thị RAPD và ISSR ......................................................................................... 24 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................26 5.1. Kết luận .............................................................................................................. 26 5.2. Kiến nghị ............................................................................................................ 26 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................27 PHỤ LỤC .................................................................................................................33 Phụ lục 1. Hình ảnh điện di của 41 mẫu thuốc Thượng với 5 mồi RAPD và 3 mồi ISSR .......................................................................................................................... 33 Phụ lục 2. Hệ số tương đồng di truyền của 41 mẫu thuốc Thượng được xử lý bằng phần mềm NTSYSpc 2.1........................................................................................... 34 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU bp Base pair CTAB Cetyltrimethylammonium bromide ISSR Inter simple sequence repeat PCR Polemerase Chain Reaction PIC Polymorphic Information Content RAPD Random Amplified Polymorphic DNA SD Standard Deviation TBE Tris-borate-EDTA vi DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 2.1. Tên bảng Thông tin của các mẫu thuốc Thượng được sử dụng trong nghiên cứu. Trang 11 2.2. Trình tự các đoạn mồi ISSR được sử dụng trong nghiên cứu. 12 2.3. Trình tự các đoạn mồi RAPD được sử dụng trong nghiên cứu. 13 3.1. Giá trị PIC và phần trăm các đoạn đa hình của 41 mẫu thuốc Thượng với 5 chỉ thị RAPD và 3 chỉ thị ISSR. vii 17 DANH MỤC HÌNH ẢNH Tên hình vẽ Trang Một số hình ảnh hình thái cây Thuốc Thượng thu tại vườn dược 4 Hình 1.1 1.2. 1.3. liệu Sơn Trà. Nguyên lý của kỹ thuật RAPD-PCR (Arif và cs) 8 Một biểu diễn sơ đồ của ISSR-PCR với một mồi đơn (Reddy và 9 cs, 2002). 3.1. Tối ưu nhiệt độ mồi ISSR và RAPD. 15 3.2. Tối ưu nồng độ mồi ISSR và RAPD. 16 3.2. 3.4. Ảnh điện di của mẫu thuốc Thượng đại diện được khuếch đại bằng mồi ISSR. Ảnh điện di của mẫu thuốc Thượng đại diện được khuếch đại bằng mồi RAPD. 18 19 Biểu đồ hình cây 41 cá thể thuốc Thượng nghiên cứu được 3.5. khuếch đại bằng mồi RAPD theo hệ số của Jaccard và kiểu 20 phân nhóm UPGMA. Biểu đồ hình cây 41 cá thể thuốc Thượng nghiên cứu được 3.6. khuếch đại bằng mồi ISSR theo hệ số của Jaccard và kiểu phân 22 nhóm UPGMA. Biểu đồ hình cây 41 cá thể thuốc Thượng nghiên cứu được 3.7. khuếch đại bằng mồi RAPD và ISSR theo hệ số của Jaccard và kiểu phân nhóm UPGMA. viii 24 TÓM TẮT Phân tích mối quan hệ di truyền 41 mẫu thuốc Thượng bằng 37 đoạn mồi RAPD và ISSR thu được 8 đoạn mồi có khả năng đánh giá đa dạng di truyền quần thể thuốc Thượng (với 5 đoạn mồi RAPD: OPC-02, OPC-03, OPC-04, OPF-02, OPF03) và 3 đoạn mồi ISSR: ISSR51, ISSR59, ISSR64). Kết quả cho thấy: tổng số băng thu được là 1191, số locus ghi được là 187 trong đó có 185 locus đa hình. Hệ số PIC của chỉ RAPD là 0.26 và của chị ISSR là 0.29. Biểu đồ hình cây thể hiện mối quan hệ di truyền giữa 41 mẫu thuốc Thượng phân tích với chỉ thị RAPD và ISSR dựa trên ba biểu đồ bởi chỉ thị RAPD, ISSR và RAPD cộng với ISSR. Cả 3 biểu đồ đều chia làm 2 nhánh chính có hệ số tương đồng di truyền trong khoảng 0.71 đến 1. Các mẫu thu ở cùng một địa điểm và cùng lứa tuổi đều nằm trong những nhánh phụ riêng. Từ khóa: đa dạng di truyền, Phaeanthus vietnamensis Ban, chỉ thị phân tử ISSR, chỉ thị phân tử RAPD ix MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Cây thuốc Thượng (Phaeanthus vietnamensis Ban) là loài đặc hữu được đưa vào trong sách đỏ Việt Nam; phân bố rải rác nơi khu vực Trung Bộ: Thừa Thiên – Huế, Đà Nẵng, Quảng Nam. Loài này nổi bật với công dụng kháng khuẩn, kháng viêm (Nguyễn Thị Ái Thuận và cs) (Nguyễn Thị Đông Hằng và cs), chữa vết thương mềm, thuốc Thượng có vai trò không nhỏ trong các bài thuốc dân gian của Việt Nam: dùng lá non hấp chín trên nồi cơm, lấy nước nhỏ mắt chữa đau mắt đỏ; vỏ rễ, vỏ thân, lá đem nấu cao dán mụn nhọt sưng tấy; dùng chữa đau bụng, tiêu chảy, kiết lỵ, cầm máu vết thương ngoài da. Qua những nghiên cứu về thành phần hóa học gần đây chỉ ra rằng chi Pheanthus (họ Na - Annonacea), trong đó có thuốc Thượng được xem là nguồn giàu các hợp chất gây độc tế bào ung thư tiềm năng nhờ sự có mặt của alkaloid, acetogenin (Bùi Thanh Phong, 2016), ngoài ra còn có các hợp chất có hoạt tính sinh học như triterpen, pholyphenol,… Số lượng cá thể của quần thể thuốc Thượng trong tự nhiên ngày càng suy giảm vì bị khai thác quá mức. Diện tích rừng tự nhiên giảm sút. Đặc tính sinh sản hữu tính chậm. Cùng với sự ra đời của các kĩ thuật công nghệ sinh học mới được đẩy mạnh với độ chính xác cao hơn, rút ngắn chu kỳ nhân giống so với các kỹ thuật nhân giống cổ điển. Các nhà khoa học đã tiến hành nhân giống vô tính cây thuốc Thượng tuy nhiên còn gặp nhiều khó khăn trong nhân giống in vitro. Nghiên cứu chọn tạo, cải thiện giống thực vật là việc cần thiết cũng để bảo tồn sự đa dạng sinh học, bảo tồn nguồn gen cây thuốc quý của Việt Nam. Song, sự sẵn có của nguyên liệu đầu vào, khả năng tiếp cận các nguồn gen đa dạng sẽ đảm bảo rằng việc nhân giống loài này trở nên chắc chắn hơn. Xác định sự đa dạng di truyền cây thuốc Thượng là điều cần thiết tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào về điều này. Ứng dụng chỉ thị phân tử ISSR và RAPD để xác định đa dạng di truyền của quần thể thuốc Thượng cho phép phát hiện tính đa hình các đoạn DNA bằng việc sử 1 dụng mồi đơn chứa trình tự nucleotide ngẫu nhiên làm cơ sở cho công tác bảo tồn, duy trì và sử dụng hợp lý loài thuốc Thượng. Hiện nay, tại Khu bảo tồn thiên nhiên Bán đảo Sơn Trà đã phát triển quần thể cây thuốc thượng với số lượng cá thể lớn được sưu tập từ nhiều địa phương khác nhau (Quảng Nam, Đà Nẵng, Thừa Thiên Huế). Và tập chung chủ yếu để khai thác và phát triển nguồn giống, cung cấp các mẫu lá làm thuốc đông y. Bên cạnh đó, đến thời điểm hiện tại chưa có nghiên cứu nào tại Việt Nam được công bố về các đặc điểm di truyền của cây thuốc Thượng. Xuất phát từ những lý do trên, khóa luận “Đánh giá đa dạng di truyền của quần thể thuốc thượng (Phaeanthus vietnamensis Ban) ở bán đảo Sơn Trà bằng chỉ thị RAPD và ISSR” được thực hiện với mục đích đánh giá mức độ đa dạng di truyền của loài cây này, góp phần vào sự bảo tồn loài cây này có hiệu quả hơn. 2. Mục tiêu Xác định được mức độ đa dạng di truyền của quần thể cây thuốc Thượng trồng tại Khu bảo tồn thiên nhiên Bán đảo Sơn Trà, thành phố Đà Nẵng. 3. Ý nghĩa 3.1. Ý nghĩa khoa học Cung cấp thông tin khoa học về đặc điểm di truyền của cây quần thể cây Thuốc thượng tại Việt Nam. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả nghiên cứu sẽ phục vụ cho việc bảo tồn và sử dụng hợp lí nguồn gene cây thuốc Thượng. Ngoài ra, cũng sẽ nền tảng khoa học của khóa luận là nguồn tài liệu tham khảo phục vụ cho giảng dạy. 4. Nội dung nghiên cứu - Nội dung 1: Tối ưu hóa quy trình phản ứng PCR - RAPD và PCR – ISSR; - Nội dung 2: Xác định hiệu quả của các chỉ thị phân tử RAPD và ISSR trong đánh giá đa dạng di truyền; - Nội dung 3: Xác định mối quan hệ di truyền trong quần thể thuốc Thượng bằng chỉ thị RAPD và ISSR. 2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về cây thuốc Thượng Phân loại khoa học Giới : Plantae Bộ : Magnoliales Họ : Annonaceae Chi : Phaeanthus Loài : Phaeanthus vietnamensis Ban Tên tiếng Việt : Thuốc Thượng Tên gọi khác : Thuốc Mọi, Da Xà Lắc, Thuốc Dấu Cà Doong Năm 1979: Thuốc Thượng được DS. Đống Việt Thắng, nguyên Trưởng Trạm Nghiên cứu Dược liệu tỉnh Quảng Nam – Đà Nẵng cũ ghi nhận lần đầu tiên trong đợt công tác triển khai phong trào “Thuốc nam tự túc ở xã”, tại huyện Duy Xuyên. Đây là một cây thuốc quen thuộc của vùng Quảng Nam – Đà Nẵng (Tường, 2019). Năm 1994: Nguyễn Tiến Bân đã xác định thuốc Thượng là loài mới, tác giả đã định tên cho loài này là: Phaeanthus vietnamensis Ban. Cây còn có các tên gọi khác là Thuốc mọi, thuốc dấu cà doong, da xà lắc. Là một loài đặc hữu của Trung bộ Việt Nam. 1.2. Đặc điểm thực vật học Cây gỗ nhỏ hoặc cây bụi, cao 2-10m. Cành cây non gần như nhẵn. Lá thuôn hoặc gần hình mác, cỡ 9 – 16 x 3 – 6,5cm, chóp lá thường thành mũi dài và nhọn, gốc lá hình nêm và hơi lệch; gân bên 9 – 11 đôi, nổi rõ ở mặt dưới, cong hình cung và hơi vấn hợp ở gần mép; cuống lá dài 5 – 6mm, không có lông. Hoa mọc so le với lá, thường thành xim 2 – hoa; cuống chung dài 1 – 1,5cm; cuống hoa dài 1,5 – 3cm, mang 4 – 6 lá bắc nhỏ. Lá đài và cánh hoa ngoài gần giống nhau, hình mác, dài trên 1 mm; cánh hoa trong màu vàng (khi già trở nên trắng), hình trứng, dài 8 – 12mm, rộng 4 – 6mm, dính nhau bởi mép từ gốc tới đỉnh. Nhị nhiều; mào trung đới hình đĩa hơi nhọn đầu. Lá noãn nhiều; bầu có lông; núm nhụy hình đầu, có lông, không có vòi nhụy. Noãn 1, bao phấn đính gốc. Phân quả hình trái xoan, cỡ 12 – 15 x 6 – 7mm, 3 khi chín màu vàng sau đó thành màu mận chín; cuống phân quả dài 13 – 15mm; vỏ quả rất mỏng. Ra hoa tháng 5-12, có quả tháng 6-1 (năm sau) (Bân, Sách đỏ Việt Nam - Phần II - Thực vật, 2007). "Cây mọc rải rác dưới tán rừng thưa, rừng thứ sinh nơi ẩm, ở độ cao dưới 300m. Khu vực phân bố hẹp ở các vùng trong nước: Thừa Thiên - Huế (Phú Lộc, Hương Phú), Quảng Nam – Đà Nẵng (Núi Thành, Duy Xuyên, Quế Sơn, Giằng, Tiên Phước). Nơi cư trú thường xuyên bị xâm hại và môi trường sống suy giảm do rừng ở những vùng này vẫn tiếp tục bị chặt đốn. Phân hạng cấp độ bảo tồn là VU B2b,e+3b. Chưa có dẫn liệu về sự có mặt của loài này ở nơi khác trên thế giới. (Bân, Sách đỏ Việt Nam - Phần II - Thực vật, 2007). A C B Hình 1.1. Một số hình ảnh hình thái cây Thuốc Thượng thu tại vườn dược liệu Sơn Trà. A. Hình thái hoa; B. Hình thái quả; C. Hình thái lá 1.3. Giá trị dược liệu Bộ phận sử dụng làm dược liệu của cây thuốc Thượng là vỏ rễ, vỏ thân, và lá. Với công dụng chữa đau mắt đỏ, mụn nhọt sưng tấy; chữa đau bụng, tiêu chảy, kiết lỵ, cầm máu vết thương ngoài da… (Chi, 1997). Thuốc Thượng - Phaeanthus vietnamensis Ban là một cây thuốc nổi tiếng được dùng chữa trị các bệnh viêm nhiễm trong y học cổ truyền Việt Nam. Alkaloid là một trong những hợp chất tự nhiên quan trọng nhất của họ Annonaceae (Lúcio, 2015). Ở loài cây thuốc Thượng, khi chiết cao alkaloid toàn phần cho kết quả kháng tế bào ung thư với giá trị IC50 ở các dòng tế bào MCF –7, NCI H460, HepG2, Hela lần lượt là 26, 71, 32, 28, 11, 68 và 31,19 μg/ml cho thấy tiềm năng cao trong việc hỗ trợ điều trị ung thư (Bùi Thanh Phong, 2016). Một nghiên cứu trước đây đã báo cáo về việc phân lập các alkaloid isoquinoline từ họ này (Bermejo A, 2005). Một số loại alkaloid, chẳng hạn như jerantinine B 4 (Mohannad E Qazzaz, 2015), liriodenine (Nordin, 2015), và vinoreline (A. R Chadegani, 2014), thể hiện khả năng gây ra apoptosis và ngăn chặn chu kỳ tế bào trong pha G1. Các chiết xuất methanolic lá của U. longipes và Dasymaschalon sp. chứa saponin, trong khi chiết xuất methanolic lá từ U. longipes và A. burmanicus chứa alkaloid. Hơn nữa, rutin và squamocin B được báo cáo là flavonoid có hoạt tính sinh học cao như chống viêm, quét gốc tự do, điều hòa miễn dịch và hóa trị liệu ung thư (K. J Aliaga, 2011) (Azevedo, 2013). Các flavonoid có khả năng gây apoptosis, ngăn chặn chu kỳ tế bào (Kuntz, 1999) bằng cách phá hủy cấu trúc của sợi trục (Beutler, 1998), và ức chế hình thành mạch (Mojzis, 2008). Saponin là các glycoside tự nhiên trước đây đã được đề xuất là chất chống viêm, bảo vệ mạch, hạ cholesterol máu, kháng nấm, chống ký sinh trùng và chống ung thư (Podolak, 2010). Các alkaloid có thể được phân lập từ các nguồn thực vật (Lu J. J., 2012) cũng có hoạt tính độc tế bào và chống ung thư. Ví dụ, berberine có thể ức chế sự gia tăng của các dòng tế bào ung thư bằng cách can thiệp vào sự tăng sinh của tế bào (Y. Sun, 2009) và gây chết tế bào apoptotic (Eom, 2010). Evodiamine hay quinolon alkaloid cho thấy các hoạt động chống ung thư bằng cách gây ra sự ngăn chặn chu kỳ tế bào trong dòng tế bào hồng cầu K562 (Sun, 2016), gây ra tổn thương DNA trong các tế bào ung thư vú MCF-7 (Chan, 2009), gây ra quá trình apoptosis ở các tế bào bạch cầu ở người U937 (Lee, 2006), can thiệp với sự hình thành mạch (Shyu, 2006), và can thiệp vào di căn tế bào trong ung thư biểu mô phổi Lewis (LLC) và u ác tính B16-F10 (Ogasawara, 2002). Chiết xuất methanolic và các phần của lá từ A. dioica có tác dụng chống viêm, hạ đường huyết, chống tăng sinh và chống oxy hóa (Formagio A. S., 2013). Tinh dầu từ lá của A. sylvatica thể hiện các hoạt động chống viêm và chống ung thư (Formagio A. S., 2013), và chiết xuất methanolic và phần ethyl acetate (EAF) cho thấy hoạt động chống vi khuẩn mycobacteria (Araujo, 2014). Hơn nữa, các loài Annona có khả năng làm thuốc trừ sâu vì chúng ức chế sự phát triển và sinh sản của Spodoptera ridgiperda (Freitas, 2014). A. crassiflora thu được từ hạt cho thấy tác dụng chống tăng sinh mạnh mẽ. Những chất chiết xuất này rất giàu axit phenolic, đặc biệt là axit caffeic, axit sinapic, 5 axit ferulic và flavonoid, và thể hiện các hoạt động chống ung thư đáng kể, ít nhất là do hàm lượng axit phenolic của chúng. Một số nghiên cứu đã chứng minh tiềm năng gây độc tế bào ung thư, Alzheimer và kháng cholinesterase của các hợp chất này (Li W. L., 2012) (Fang L. K., 2008) (Szwajgier, 2012). Năm 1990, Sedmera P, Nguyen Thi Nghia và cộng sự đã nghiên cứu một alkaloid bisbenzylisoquinoline mới từ Phaeanthus vietnamensis và hoạt tính kháng khuẩn của nó (Sedmera, 1990). Năm 1991, Nguyen Thi Nghia và cộng sự đã phân lập được 7 alcaloid: petalinemethin, doryphornin methyl ether, N-methylcorydaldin, argentinin, atherosperminin, 1S,1'R-7,7'-O,O'-dimethylgrisabin và 1S,1'R-7-Omethylgrisabin. Nhóm nghiên cứu phát hiện alcaloid toàn phần chiết từ lá cây thuốc Thượng có hoạt tính kháng khuẩn. Trong đó alcaloid phân lập được 1S, 1'R- 7,7'-O,O'dimethylgrisabin thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh với nồng độ ức chế tối thiểu đối với Bacillus subtilis là 62,5 ppm (Nghia, 1991). Năm 2017, Nguyen Xuan Nhiem, Sun Yeou Kim và cộng sự đã nghiên cứu các thành phần hóa học từ Phaeanthus vietnamensis với 3 hợp chất mới được xác định có khả năng ức chế mạnh oxit nitric (Nhiem, 2017). Năm 2018, Le Thi Huong, Isiaka A. Ogunwande và cộng sự đã có nghiên cứu về Thành phần tinh dầu từ loài Phaeanthus vietnamensis, trong đó ở lá cây có limonene (31,8%), (Z) -9-octadecamide(20,2%) và α-phellandrene (13,8%), vỏ cây của loài chiếm ưu thế bởi (Z) -9-octadecamit (57,4%) và benzyl benzoat (15,0%) (Huong, 2018). Năm 2012, Võ Duy Lê Sơn nghiên cứu về định tính - định lượng - chiết tách và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của hợp chất alcaloid trong cây thuốc Thượng (Phaeanthus vietnamensis Ban) (Sơn, 2012). Năm 2014, Đào Hùng Cường, Lê Thị Ngọc Ngân đã có nghiên cứu về thành phần hóa học từ cây thuốc Thượng (Phaeanthus vietnamensis Ban) (Ngân, 2014). Năm 2016, Bùi Thanh Phong, Lâm Bích Thảo, Nguyễn Thị Ái Thuận, Trần Công Luận đã nghiên cứu tác dụng gây độc tế bào ung thư của cao chiết từ cây thuốc thượng (Phaeanthus vietnamensis Ban) – Annonaceae (Bùi Thanh Phong, 2016). 6 Năm 2019, Nguyễn Trung Tường, Phạm Thanh Kỳ, Nguyễn Xuân Nhiệm đã có nghiên cứu đặc điểm hình thái và đặc điểm vi học loài Thuốc thượng (Phaeanthus vietnamensis Ban) (Tường, 2019). Năm 2021, Dương Ngọc Tú cùng cộng sự đã nghiên cứu ba hợp chất benzylisoquinoline alkaloid mới từ Phaeanthus vietnamensis bằng nghiên cứu NMR kết hợp với quang phổ CD (Tu, 2021). Dịch chiết cây Thuốc Thượng cho khả năng ức chế tế bào ung thư Hela, Hep G2, MCF-7, NCI-H460 (Tác dụng gây độc tế bào ung thư của cao chiết Từ cây thuốc thượng (phaeanthus vietnamensis ban) – Annonaceae) MCF-7 (ung thư vú), NCIH460 (ung thư phổi), HepG2 (ung thư gan) và Hela (ung thư cổ tử cung). 1.4. Đánh giá đa dạng di truyền dựa trên các chỉ thị phân tử RAPD và ISSR Các chỉ thị phân tử là chỉ thị di truyền chỉ những thay đổi trong phân tử DNA, được chia thành nhiều loại dựa trên sự khác nhau về phương pháp và kỹ thuật xác định sự đa hình. Các chỉ thị phân tử được sử dụng nhiều trong nghiên cứu quan hệ di truyền phát sinh chủng loại và phân loại phân tử; trong lập bản đồ liên kết di truyền, nhận biết gen; và trong chọn giống bao gồm đánh giá đa dạng di truyền, nhận biết giống, chọn lọc các tính trạng kháng bệnh, chống chịu các điều kiện bất lợi của môi trường, năng suất và phẩm chất giống; xây dựng phát triển trong nghiên cứu đa dạng di truyền, phát sinh loài, phân loại, đánh dấu và xác định gen; chọn lọc nguồn gen và chọn giống nhờ chỉ thị phân tử. Chỉ thị phân tử được sử dụng rất rộng rãi do số lượng chỉ thị không hạn chế, không ảnh hưởng bởi yếu tố môi trường và giai đoạn phát triển của cây. Thường nằm ở các vùng không phiên mã, các chỉ thị này được hình thành từ các loại đột biến DNA khác nhau như thay thế (đột biến điểm), sắp xếp lại (thêm vào hay bớt đi nucleotide) hoặc các sai sót trong sao chép các đoạn DNA lặp lại liền kề. 1.4.1. Kĩ thuật RAPD Kỹ thuật đa hình DNA nhân ngẫu nhiên (RAPD) được mô tả lần đầu tiên bởi William và cs năm 1990. Là chỉ thị phân tử đơn giản nhất dựa trên kỹ thuật PCR dựa trên sự nhân bản DNA genome bằng phản ứng PCR với các mồi ngẫu nhiên để tạo ra sự đa hình DNA do sự tái sắp xếp hoặc mất nucleotide ở vị trí bắt mồi. Các 7 oligonucleotide khoảng 10 cặp base ngẫu nhiên sử dụng như các mồi có thể bắt cặp bổ sung với các trình tự trong bộ gen. Kỹ thuật RAPD không cần thông tin về genome của đối tượng nghiên cứu và có thể ứng dụng cho các loài khác nhau với các mồi chung. Hơn nữa, kỹ thuật RAPD đơn giản và dễ thực hiện. Nhưng kỹ thuật RADP có hạn chế là sản phẩm PCR không ổn định do mồi ngắn, nhiệt độ bắt mồi thấp; ngoài ra, kỹ thuật này tạo ra các chỉ thị trội do đó không phân biệt được các cá thể dị hợp tử với các cá thể đồng hợp tử. RADP sử dụng nhiều trong nghiên cứu đa dạng di truyền giữa các loài thực vật, trong nghiên cứu đặc điểm của giống và đánh giá biến đổi di truyền, trong xác định loài và xác định con lai. Hình 1.1. Nguyên lý của kỹ thuật RAPD-PCR (Arif và cs) 8 1.4.2. Kĩ thuật ISSR Hình 1.2. Một biểu diễn sơ đồ của ISSR-PCR với một mồi đơn (Reddy và cs, 2002). Kỹ thuật chuỗi lặp lại đơn giản giữa (InterSimple Sequence Repeat-ISSR) là những chỉ thị được nhân bản bằng PCR, một mồi bổ trợ với tiểu vệ tinh (microsatellite) đích do Zietkiewicz và cộng sự phát hiện năm 1994 (Zietkiewicz E., 1994). Kỹ thuật này nhân bản đoạn DNA nằm giữa hai vùng lặp lại giống hệt và ngược chiều nhau, sử dụng các tiểu vệ tinh như các mồi trong phản ứng PCR với một mồi cho nhiều locus đích để nhân bản chủ yếu các chuỗi lặp lại đơn giản với độ dài khác nhau. Kỹ thuật ISSR sử dụng mồi dài (15 đến 30 nucleotide) vì vậy nhiệt độ bắt mồi cao dẫn đến độ ổn định cao của phản ứng. ISSR-PCR là kỹ thuật đánh giá kiểu gen nhanh, không đắt; sự đa hình dựa trên sự thay đổi trong các vùng nằm giữa các tiểu vệ tinh. Kỹ thuật này không cần thông tin về trình tự, tạo được nhiều locus, có tính đa hình cao và tạo ra chỉ thị trội (Mishra, 2003). 9