Tài liệu Cô lập và nhận danh các hợp chất từ cao ethyl acetate của địa y roccella sinensis (nyl.) hale thu hái ở bình thuận

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HCM KHOA HÓA BỘ MÔN HÓA HỮU CƠ ______ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: CÔ LẬP VÀ NHẬN DANH CÁC HỢP CHẤT TỪ CAO ETHYL ACETATE CỦA ĐỊA Y ROCCELLA SINENSIS (NYL.) HALE THU HÁI Ở BÌNH THUẬN Người hướng dẫn Sinh viên thực hiện Mã số sinh viên : ThS. Hồ Xuân Đậu : Võ Như Nguyện : 35106035 Tp. Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2013 LỜI MỞ ĐẦU Địa y là một loài thực vật bậc thấp với nhiều công dụng quý báu. Từ thời trung đại nhiều thầy thuốc đã sử dụng địa y làm thuốc trị các bệnh về phổi và sọ não[3]... Ngày nay địa y vẫn được sử dụng rộng rãi tại các nước, ở Trung Quốc dùng địa y để bào chế nhiều loại thuốc, đặc biệt là thuốc long đờm[3], ở Thụy Điển dùng để bào chế thuốc điều trị bệnh đái tháo đường, bệnh phổi và bệnh viêm mũi[3], còn ở Ấn Độ, được dùng làm thuốc giảm đau[3]... Ngoài ra, nhờ vào mùi hương hấp dẫn từ các hợp chất của mình địa y còn được dùng trong lĩnh vực hóa mỹ phẩm như sản xuất xà phòng, nước hoa... Tuy có nhiều công dụng nhưng ở nước ta, địa y lại ít được nghiên cứu và biết đến. Trong số các chi của địa y thì các nghiên cứu hóa học về chi Roccella tương đối ít, đặc biệt loài địa y Roccella sinensis (Nyl.) Hale thì vẫn chưa được nghiên cứu. Qua sự giới thiệu của Thầy Hồ Xuân Đậu và Thầy Dương Thúc Huy cùng sự tìm hiểu của bản thân, em cảm thấy khảo sát, cô lập các hợp chất từ địa y là một đề tài hay, bổ ích vì thế em đã quyết định chọn “Cô lập và nhận danh các hợp chất từ cao Ethyl acetate của loài địa y Roccella sinensis (Nyl.) Hale thu hái ở Bình Thuận” làm đề tài khóa luận tốt nghiệp của mình. MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN LỜI MỞ ĐẦU .................................................................................................................1 MỤC LỤC .......................................................................................................................2 DANH MỤC HÌNH ẢNH ...............................................................................................4 DANH MỤC BẢNG .......................................................................................................4 DANH MỤC SƠ ĐỒ .......................................................................................................4 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .......................................................................................5 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ...........................................................................................6 1.1. KHÁI QUÁT VỀ ĐỊA Y ..........................................................................................6 1.1.1. Định nghĩa và phân loại địa y ............................................................................ 6 1.1.2. Vai trò của các hợp chất tự nhiên trong địa y [4]................................................ 6 1.1.3. Một số ứng dụng của địa y ................................................................................ 6 1.2. HOẠT TÍNH CỦA CÁC HỢP CHẤT TỪ ĐỊA Y ..................................................7 1.2.1. Hoạt tính điều tiết tăng trưởng đối với thực vật bậc cao[1] ................................ 7 1.2.2. Hoạt tính đối với động vật[1] .............................................................................. 7 1.2.3. Hoạt tính kháng virus của các hợp chất địa y[1]................................................. 8 1.2.4. Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của các hợp chất địa y[1] ....................... 8 1.2.5. Hoạt tính kháng ung thư và kháng đột biến của các hợp chất địa y[1] ............... 9 1.2.6. Các loại enzyme bị ức chế bởi các hợp chất của địa y[1] ................................... 9 1.3. NGHIÊN CỨU HÓA HỌC VỀ CÁC HỢP CHẤT CÓ TRONG ĐỊA Y ..............10 1.4. MÔ TẢ THỰC VẬT ROCCELLA SINENSIS (NYL.) HALE (ROCCELLACEACE) ..................................................................................................10 1.5. CÁC NGHIÊN CỨU HÓA HỌC TRONG CHI ROCCELLA ..............................11 1.5.1. Các acid béo..................................................................................................... 11 1.5.2. Các hợp chất aliphatic vòng ............................................................................ 11 1.5.3. Các carbohydrate ............................................................................................. 11 1.5.4. Các hợp chất carotenoid .................................................................................. 11 1.5.5. Các hợp chất Chromane và Chromone ............................................................ 11 1.5.6. Các hợp chất depside ....................................................................................... 12 1.5.7. Các hợp chất dibenzofurane ............................................................................ 12 1.5.8. Các hợp chất chứa N: ...................................................................................... 12 1.5.10. Công thức hóa học các hợp chất .................................................................... 12 CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM.....................................................................................14 2.1. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ ...................................................................................14 2.1.1. Hóa chất ........................................................................................................... 14 2.1.2. Thiết bị ............................................................................................................. 14 2.2. KHẢO SÁT NGUYÊN LIỆU ................................................................................14 2.3. ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO ................................................................................14 2.3.1. Sắc ký cột cao EA2.......................................................................................... 16 2.3.3. Sắc ký cột cao EA1.......................................................................................... 16 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................18 3.1. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỌC CỦA HỢP CHẤT RS-C7 ...................................18 3.2. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT RS-C6a ....................................................19 3.3. SỰ THAY ĐỔI GIÁ TRỊ δ C CỦA CÁC CARBON PHẦN ĐƯỜNG KHI LIÊN KẾT VỚI PHẦN AGLYCON TẠI CÁC VỊ TRÍ KHÁC NHAU ...............................21 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN .............................................................................................22 4.1. KẾT LUẬN ............................................................................................................22 4.2. HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO ..................................................................22 TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................23 PHỤ LỤC DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1: Ba dạng chính của địa y ..................................................................................... 5 Hình 2: Sinh tổng hợp của các hợp chất từ địa y............................................................. 9 Hình 3: Địa y Roccella sinensis (Nyl.) Hale ................................................................. 10 Hình 4: Các tương quan HMBC của hợp chất RS-C7 .................................................. 19 Hình 5: Các tương quan HMBC của hợp chất RS-C6a ................................................. 20 DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Số liệu phổ NMR của hợp chất RS-C7 và RS-C6a ......................................... 20 DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 1: Sơ đồ điều chế các cao của địa y Roccella sinensis (Nyl.) Hale .................... 14 Sơ đồ 2: Sắc ký cột cao EA2 ......................................................................................... 16 Sơ đồ 3: Sắc ký cột cao EA1 ......................................................................................... 17 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT s : Mũi đơn (Singlet) d : Mũi đôi (Doublet) t : Mũi ba (Triplet) m : Mũi đa (Multiplet) brs : Mũi đơn rộng m/z : Mass to charge ratio Transfer NMR : Cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resonance) HSQC : Heteronuclear Single Quantum Correlation HMBC : Heteronuclear Multiple Bond Coherence 1H-NMR : Proton Nuclear Magnetic Resonance 13C-NMR : Carbon Nuclear Magnetic Resonance DEPT : Distortionless Enhancement by Polarization Transfer J : Hằng số tương tác spin-spin Ppm : Part per million UV : Tia cực tím (ultra violet) HR-ESI-MS : Hight Resolution- Electro Spray Ionization- Mass Spectrometry ED : Ether dầu hỏa EA : Ethyl acetate C : Chloroform Me : Methanol Ac : Acid acetic H : Hexan CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. KHÁI QUÁT VỀ ĐỊA Y 1.1.1. Định nghĩa và phân loại địa y Địa y là một dạng thực vật bậc thấp đặc biệt, nó là kết quả cộng sinh của nấm (mycobiont) và một thành phần quang hợp (photobiont) thường là tảo (green alga) hay vi khuẩn lam (cyanobacterium). Hiện nay có khoảng 17000 loài địa y đã được tìm thấy. Địa y thường được chia làm ba dạng chính: dạng khảm (crustose), dạng phiến (foliose) và dạng sợi (frucose). Thành phần tảo của địa y sản sinh các carbohydrate bằng quá trình quang hợp, còn thành phần nấm sản sinh các hợp chất tự nhiên (để chống tia UV, ngăn chặn sâu bọ và các loài động vật ăn cỏ, …), cung cấp nước và khoáng chất. Kết quả từ sự cộng sinh này giúp địa y có thể sinh trưởng và sống sót trong những điều kiện khắc nghiệt, chủ yếu ở vùng vĩ độ cao, vùng nhiệt đới, và có thể hiện diện ở khắp mọi nơi như trên đá, đất, lá cây, thân cây, kim loại, thủy tinh [2]. Địa y dạng khảm Địa y dạng phiến Địa y dạng sợi Hình 1: Ba dạng chính của địa y 1.1.2. Vai trò của các hợp chất tự nhiên trong địa y [4] − Bảo vệ đối với cây trồng bậc thấp và bậc cao. − Các hợp chất thơm hấp thụ tia UV, bảo vệ địa y chống lại bức xạ có hại. − Các carboxylic acid từ địa y là tác chất tạo phức mạnh và giúp cho địa y lấy được các khoáng chất từ vật chủ nơi địa y bám vào (substrate). − Giúp xua đuổi thú ăn thịt và côn trùng. 1.1.3. Một số ứng dụng của địa y Địa y đã được sử dụng làm thực phẩm, làm phẩm nhuộm, nguyên liệu thô trong sản xuất nước hoa và trong y học cổ truyền. 1.2. HOẠT TÍNH CỦA CÁC HỢP CHẤT TỪ ĐỊA Y Địa y sản sinh ra một lượng lớn các hợp chất hữu cơ, đa số có hoạt tính sinh học và nhiều loại trong chúng là đặc hiệu của địa y trong hoá học các hợp chất tự nhiên. Tuy vậy, các khảo sát hoá học trên địa y bị hạn chế do nguồn cung có hạn, vì các địa y phát triển rất chậm. Những nghiên cứu gần đây cho thấy việc nuôi cấy địa y trong phòng thí nghiệm cũng không dễ dàng, chỉ khoảng 10% địa y được nuôi cấy thành công, tuy nhiên chúng lại chứa các hợp chất hữu cơ khác hẳn với các hợp chất có trong cùng loại địa y tự nhiên [1]. Lê Hoàng Duy [2] đã nghiên cứu nuôi cấy thành công 10 % trên khoảng 50 loài địa y lấy từ Việt Nam. Tuy đạt thành công về mặt cô lập hợp chất mới nhưng hầu như các hợp chất cô lập từ địa y nuôi cấy đều khác so với các hợp chất địa y tự nhiên. Khoảng gần 1000 hợp chất địa y đã được cô lập cho đến nay. Nghiên cứu về hoạt tính sinh học và khả năng dược học của các hợp chất tự nhiên từ địa y được thống kê đầy đủ của Boustie (2007) [5], Huneck (1999) [6], Muller (2001) [7] về kháng khuẩn, kháng virus, chống oxy hóa, kháng ung thư, kháng viêm, kháng enzyme … 1.2.1. Hoạt tính điều tiết tăng trưởng đối với thực vật bậc cao[1] Địa y hoặc các hợp chất của địa y Hoạt tính Barbatic acid, 4-O-demethylbarbatic acid, diffractaic acid, evernic acid, lecanoric acid, β-orcinolcarboxylic acid, orsellinic acid Ức chế sự tăng trưởng của cây rau diếp Ergochrome AA (secalonic acid A) Gây độc cho thực vật Evernic acid Giảm các nồng độ chất diệp lục trong lá rau bina Lecanoric acid Nguyên nhân gây bất thường cho gốc của cây Allium cepa Các hợp chất phenol đơn vòng Hoạt tính ức chế của độc chất thực vật Các quinone từ Pyxine sp. Ức chế sự nguyên phân của rễ cây Allium cepa Usnic acid Ức chế sự nẫy mầm và phát triển của Lepidium sativum 1.2.2. Hoạt tính đối với động vật[1] − Acid caperatic và các cao chiết xuất từ địa y Flavoparmelia baltimorensis và Xanthoparmelia cumberlandia kìm hãm sự tăng trưởng của loài ốc Pallifera varia. − Các hợp chất phenol đơn vòng gây độc ấu trùng của loài giun Toxocara canis. − Atranorin, acid pulvinic dilactone, calycin, parietin, acid evernic, acid psoromic, acid physodic, acid 3-hydroxyphysodic, acid fumarprotocetraric, acid stictic, acid norstictic, acid salazinic, acid vulpinic, acid rhizocarpic và acid usnic làm giảm sự tăng trưởng của ấu trùng ăn tạp Spodoptera littoralis nhưng không ảnh hưởng đến sự sống còn của chúng. 1.2.3. Hoạt tính kháng virus của các hợp chất địa y[1] Hợp chất Virus và enzyme của virus Depsidone: virensic acid và dẫn xuất Hệ enzyme đặc hiệu đính thể nguyên thực khuẩn vào nhiễm sắc thể virus HIV. Butyrolactone acid: protolichesterinic acid Sao chép ngược HIV (+)-Usnic acid và 4 depside khác Virus Epstein-Barr (EBV) Emodin, 7-Cloroemodin, 7-Chloro-1O-methylemodin, 5,7-Dichloroemodin, Hypericin HIV, cytomegalovirus và các virus khác 1.2.4. Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của các hợp chất địa y[1] Hợp chất Vi khuẩn Usnic acid và các dẫn xuất Vi khuẩn gram (+), Bacteroides spp., Clostridium perfringens, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus spp., Enterococcus spp., Mycobacterium aurum Protolichesterinic acid Helicobacter pylori Methyl orsellinate, Ethyl orsellinate, Methyl β-orsellinate, Methyl haematommate Epidermophyton floccosum, Microsporum canis, M. gypseum, Trichophyton rubrum, T. mentagrophytes, Verticillium achliae, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Candida albicans Alectosarmentin Staphylococcus aureus, Mycobacterium smegmatitis 1´-Chloropannarin, Pannarin Leishmania spp Emodin, Physcion Bacillus brevis Pulvinic acid và dẫn xuất Drechslera rostrata, Alternaria alternata Vi khuẩn hiếu khí và vi khuẩn kỵ khí Leprapinic acid và dẫn xuất Vi khuẩn Gram (+) và Gram (-) 1.2.5. Hoạt tính kháng ung thư và kháng đột biến của các hợp chất địa y[1] Hợp chất Hoạt tính trên loại tế bào (-)-Usnic acid Kháng ung thư phổi Lewis, ung thư bạch cầu P388, ức chế phân bào, có hoạt tính chống lại tế bào sừng hóa HaCaT Protolichesterinic acid Có hoạt tính chống lại tế bào ung thư bạch cầu K562 và khối u rắn Ehrlich Pannarin, 1-Chloropannarin, Sphaerophorin Gây độc cho quá trình tái tạo các lympho bào Naphthazarin Có hoạt tính chống lại dòng tế bào sừng hóa Scabrosin ester và dẫn xuất, Euplectin Gây độc chống lại tế bào murine P815 mastocytoma và các dòng tế bào khác Hydrocarpone, Salazinic acid, Stitic acid Có hoạt tính với sự nhân bản của tế bào gan chuột Psoromic acid, Chrysophanol, Emodin và dẫn xuất Có hoạt tính chống lại tế bào ung thư bạch cầu 1.2.6. Các loại enzyme bị ức chế bởi các hợp chất của địa y[1] Hợp chất của địa y Enzyme bị ức chế Atranorin Trypsin, Pankreaselastase, Phosphorylase Baeomycesis acid 5-Lipoxygenase Bis-(2,4-dihydroxy-6-npropylphenyl)methane, Divarinol, cao chiết từ Cetraria juniperina, Hypogymnia physodes và Letharia vulpina Tyrosinase Chrysophanol Glutathione reductase Confluentic acid, 2β-O-Methylperlatolic acid Monoaminoxidase B 4-O-Methylcryptochlorophaeic acid Prostataglandinsynthetase (+)-Protolichesterinic acid 5-Lipoxygenase (Sao chép ngược HIV) Vulpinic acid Phosphorylase Norsolorinic acid Monoamino oxidase Physodic acid Arginine decarboxylase Usnic acid Ornithine decarboxylase 1.3. NGHIÊN CỨU HÓA HỌC VỀ CÁC HỢP CHẤT CÓ TRONG ĐỊA Y Có nhiều hệ thống phân loại các hợp chất hóa học từ địa y, trong đó hệ thống phân loại được sử dụng nhiều nhất là hệ thống phân loại do Shibata và cộng sự đề nghị[3]. Các hợp chất hóa học trong địa y được chia làm ba nhóm chính dựa theo nguồn gốc sinh tổng hợp của chúng (hình 2). • Nguồn gốc polyketide: depside, depsidone, quinones, xanthones, chromones, aliphatic acid … • Nguồn gốc shikimic acid: terphenylquinone và dẫn xuất của tetronic acid. • Nguồn gốc mevalonic acid: terpenoid, steroid. Tảo Nấm Hình 2: Sinh tổng hợp của các hợp chất từ địa y[1] 1.4. MÔ TẢ THỰC VẬT ROCCELLA SINENSIS (NYL.) HALE (ROCCELLACEACE) Tên khoa học: Roccella sinensis (Nyl.) Hale. Họ: Rocellaceae. Mô tả thực vật: là loại địa y dạng sợi thường mọc trên các thân cây cao, sợi dài, mảnh, có màu xanh xám. Hình 3: Địa y Roccella sinensis (Nyl.) Hale 1.5. CÁC NGHIÊN CỨU HÓA HỌC TRONG CHI ROCCELLA 1.5.1. Các acid béo Năm 1967, Huneck S. và các cộng sự đã cô lập được roccellaric acid (1) từ Roccella mollis[8]. Năm 1994, Huneck đã cô lập được roccellic acid (2) từ Roccella phycopis[9]. 1.5.2. Các hợp chất aliphatic vòng Năm 1970, Ferguson G., Mackey I. R. tìm ra acetylportentol (3) từ Roccella fuciformis[10]; cũng trong năm đó Aberhart D. J.,Overton K. H., Huneck S., đã phân lập được prortentol (4) từ Roccella galapagones[11]. 1.5.3. Các carbohydrate Năm 1969, C. F. Culberson đã cô lập được hợp chất meso-erythitol (5) từ Roccella phycopis[12] và D-tagatose (6) từ Roccella fuciformis[12]. Năm 1945, Anker R. M., Cook A. H. đã cô lập được ethyl orsellinate (7) từ Roccella fuciformis[13]. Sau đó hợp chất này cũng được tìm ra bởi Dyke H. J., Elix J. A., Marcuccio S. M.,Whitton A. A. (1987); Gavin J., Tabacchi R. (1975); Hase T. A., Suokas E,, McCoy K. (1978). Năm 1969, C.F Culberson và các cộng sự đã cô lập được (+)-montagnetol (8) từ Roccella montagnei[12]. 1.5.4. Các hợp chất carotenoid Năm 1988, Czeczuga đã cô lập được các β-carotene (9) từ Roccella fuciformis[14] và γ-carotene (10) từ Roccella montagnei Bell[14]. 1.5.5. Các hợp chất Chromane và Chromone Năm 1969, Alberhart D. J., Overton K. H., Huneck S. đã cô lập lepraric acid (11) từ Roccella fuciformis[15]. Năm 1972, Hucneck S., Follmann G. đã tìm được lobodirin (12) từ Roccella cerebriformis[16]. Cũng trong năm đó Huneck và các cộng sự của mình cô lập được 5- hydroxy-2-methyl-4-oxo-4H-chromene-6,7-dicarboxylic acid(13) từ Roccella [16] fuciformis . Năm 1992, Huneck S., Jakupovic J., Follmann G. đã cô lập được mollin (14) và roccellin (15) từ Roccellaria mollis[17]. Năm 1992, Huneck S., Jakupovic J., Follmann G. đã công bố hợp chất galapagin (16) từ Roccella galapagoensis Follm[17]. 1.5.6. Các hợp chất depside Năm 1980, Sundholm E. G. và Huneck S. đã cô lập được erythrin (17) từ Roccella phycopsis Ach[18]. 1.5.7. Các hợp chất dibenzofurane Năm 1991, Huneck S.và cộng sự đã cô lập được 9-methyl pannarate (18) từ Roccella capesis Follm [19]. Năm 1993, Huneck S. và cộng sự của mình đã tìm thấy 3-O-demethylschizopeltic acid (19) từ Roccella hypomecha Bory[20]. 1.5.8. Các hợp chất chứa N: Năm 1983, Marcuccio S. M., Elix J. A. đã cô lập được picroroccellin (20) từ Roccella fuciformis[21]. Năm 1972, Bohman-Lindgren G., Ragnarsson U., tìm ra roccanin (21) từ Roccella canariensis[22]. 1.5.10. Công thức hóa học các hợp chất Me HOOC H3 C Me O H CO2H O H3 C Roccellaric acid (1) (H2C)11 H CO2H Roccellic acid (2) H O O O O H3 C CH3 O OH CH3 H CH2OH CH H CH 3 3 O O OH OH O OH H O CH3 CH3 CH2OH OH H OH H3 C O HO3C H H CH2OH HO H3 C C H3 C H3C meso- Erythitol (5) D-tagatose (6) Actylportentol (3) Portentol (4) H3 C Me O Me COOC2H5 HO OH Ethyl orsellinate (7) CH2 O H OH H HO OH CH2OH (+)- Montagnetol (8) OH O AcO HO OAc O OAc O Lobodirin (12) Me Me Me Me β-Carotene (9) Me Me Me Me Me Me Me Me Me Me Me Me Me Me γ- Carotene (10) Me Me O CH3 O HOOC Me O O H3CO Me Leprapic acid (11) OH O HOOC HOOC O Me 5-hydroxy-2-methyl-4-oxo-4H-chromene-6,7-dicarboxylic acid (13) OH Me COOMe OH O Me OH O OAc O O HO HO Me HOOC Me 9-Methyl pannarate (18) OH O Me Mollin (14) OAc O Me HO HO OH O HO HO O O Me O OAc Galapagin (16) OMe Me COOMe Me OH O CH2 HOOC OH CH3 O HC OH Erythrin (17) HC OH 3-O-Demethylschizopeltic acid (19) CH2OH O O HO O Me or OMe Me Picrorocellin (20) NH N NH H H H H N OMe O O HO N HN O Me OH O HO O OH O OAc O Roccellin (15) CH3 O OH O N O O Roccanin (21) CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2.1. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 2.1.1. Hóa chất Dung môi dung trong sắc ký cột và sắc ký điều chế, sắc ký lớp mỏng gồm ether dầu hỏa (60-90oC), ether dầu hỏa thắp sáng (40-60oC), ethyl acetate, acid acetic, chloroform, acetone, methanol điều là hóa chất của hãng Chemsol-Việt Nam và được làm khan bằng Na 2 SO 4 nếu sử dụng lại và nước cất. Thuốc thử: để hiện hình các vết hữu cơ bằng sắc ký lớp mỏng, phun xịt bằng dung dịch acid sulfuric 30%, vanillin/H 2 SO 4 , soi đèn UV. Sắc ký cột thường dùng silica gel sắc ký cột 70- 30, cỡ hạt: 0.04-0.06 mm, Ấn Độ. 2.1.2. Thiết bị Các thiết bị dùng để ly trích (lọ thủy tinh, becher, bình lóng). Máy cô quay chân không. Cột sắc ký: cột cổ điển. Sắc ký lớp mỏng 25DC-Alufolien 20 x 20 cm Kiesel gel F 254 Merck. Các thiết bị ghi phổ: Phổ 1H-NMR, 13C-NMR, phổ DEPT- NMR 135 và 90: Ghi trên máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker ở tần số 500 MHz cho phổ 1H-NMR và 125 MHz cho phổ 13C-NMR. Tất cả phổ được ghi tại: Phòng Phân Tích Trung Tâm Trường đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh, số 227, Nguyễn Văn Cừ, Quận 5, thành phố Hồ Chí Minh. − − − − − 2.2. KHẢO SÁT NGUYÊN LIỆU Tên khoa học: Roccella sinensis (Nyl.) Hale. Họ: Rocellaceae. Địa y mọc trên thân cây chín tầng ở chùa Hang, ở độ cao 300 mét so với mực nước biển, huyện Liên Hương, tỉnh Bình Thuận. Mẫu ký hiệu US-B028, được lưu trong quyển tiêu bản thực vật, bộ môn Hóa hữu cơ, khoa Hóa, trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên TP.HCM. Tên khoa học của địa y được xác định bởi tiến sĩ Harrie J. M. Sipman, Khoa Thực vật học, Đại Học Freie, Berlin, Đức. 2.3. ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO Từ địa y khô và sạch tiến hành ngâm dầm bằng dung môi methanol trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Lấy dịch chiết cô quay thu hồi dung môi dưới áp suất thấp. Trong khi dịch methanol bay hơi một kết tủa tách ra và được lọc ra khỏi dịch. Dịch còn lại được tiếp tục làm khô thu được cao methanol thô. Sử dụng phương pháp sắc ký cột trên cao methanol thô, giải ly bằng dung môi hexan 100% thu được Cao He và một phân đoạn khác. Phân đoạn còn lại tiếp tục sử dụng dung môi giải ly He:EA lần lượt từ 9:1 đến 0:10 thu được 4 phân đoạn từ cao EA1 đến EA4 và phần còn lại, phần này được tăng hệ giải ly bằng dung môi methanol 100% thu được cao Me. Sơ đồ 1: Sơ đồ điều chế các cao của địa y Roccella sinensis (Nyl.) Hale 2.3.1. Sắc ký cột cao EA2 Cao EA2 được rửa lần lượt bằng ethyl acetate và methanol thu được 2 phân đoạn mới là EA2.1 và EA2.2. Tiếp theo sử dụng sắc ký cột với phân đoạn EA2.1 bằng hệ dung môi ED:EA tăng dần từ 2:8 đến 100% EA và EA:Me (9:1). Phần dung dịch thu được được chứa vào các bình tam giác 250ml, cứ mỗi 2 bình sẽ đem đi cô quay thu phần hồi dung môi. Các phân đoạn thu được sau khi cô quay tiến hành so sánh bằng sắc ký bản mỏng sau đó những phân đoạn có vết giống nhau được gom lại. Sau khi xả cột ta thu được 4 phân đoạn (như sơ đồ 2). Chọn phân đoạn EA2.1.2 khảo sát bằng sắc ký cột với hệ dung môi giải ly như bảng 1 thu được RS C6 (0.8g) ở phân đoạn II. Sơ đồ 2: Sắc ký cột cao EA2 2.3.3. Sắc ký cột cao EA1 Dùng sắc ký cột với hệ dung môi ED:EA (8:2) để khảo sát, dung dịch được thu vào các bình tam giác 250ml, cứ mỗi 2 bình sẽ cô quay thu hồi dung môi. Các phân đoạn thu được sau khi cô quay tiến hành so sánh bằng sắc ký bản mỏng sau đó những phân đoạn có vết giống nhau được gom lại. Sau khi xả cột thu được 3 phân đoạn. Chọn phân đoạn EA1.2 để khảo sát với cùng hệ dung môi ED:EA (8:2) thu được 4 phân đoạn. Tiếp tục khảo sát phân đoạn EA1.2.2 với hệ dung môi ED:EA:Ac (6:4:0.25ml) ta thu được 2 phân đoạn (như sơ đồ 3) trong đó một phân đoạn là RS C7 ( 0.21g). Sơ đồ 3: Sắc ký cột cao EA1 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Sau khi tiến hành đo và khảo sát phổ đã xác định được các tín hiệu của RS C6 và RS C7 là hoàn toàn giống nhau nhưng RS C6 là hỗn hợp của RS C7 và một hợp chất khác tạm gọi là RS C6a. 3.1. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỌC CỦA HỢP CHẤT RS-C7 RS-C7 là hợp chất dạng bột màu trắng được cô lập từ phân đoạn EA1.2.2 của bột địa y Roccella sinensis (Nyl.) Hale. • Phổ 1H-NMR: phụ lục 1, phổ 1H-NMR mở rộng: phụ lục 1a. • Phổ 13C-NMR: phụ lục 2. • Phổ HSQC: phụ lục 3. • Phổ HMBC: phụ lục 4. Phổ 1H-NMR cho thấy 1 nhóm methyl vòng thơm (δ H = 2.51 ppm) và 2 proton vòng thơm ghép cặp meta với nhau tại δ H = 6.27ppm, 6.23 ppm (dd, J= 2 Hz. Những tín hiệu này đặc trưng cho 1 đơn vị orcinol. Bên cạnh đó, 1H-NMR cũng cho thấy tín hiệu của hệ thống ABX: 2 proton không tương đương của nhóm methylene liên kết với O (–CH 2 -O-) (H A-1’ , δ H = 4.61 ppm, dd, J 1 = 3 Hz, J 2 = 11.5 ppm), (H B-1’ , δ H = 4.45 ppm, dd, J= 6.5 Hz, J= 11.5 Hz) ghép cặp với 1 proton của nhóm methine liên kết với O (>CH-O-) (δ H = 4 ppm, dt, J=7 Hz, J= 2.5 Hz (3 Hz)). Phổ 1H-NMR còn cho thấy 3 proton khác gồm 1 nhóm methylen (-CH 2 -O-) và 1 nhóm methine (>CH-O-) (δ H = 3.84 ppm, 3.74ppm, 3.72 ppm). Phổ 13C-NMR cho thấy có 12 carbon, gồm có 8 carbon đặc trưng của đơn vị orcinol (nhóm methyl vòng thơm (δ C = 24.4 ppm)), các carbon vòng thơm gắn O (δ C = 165.88 ppm, 163.07 ppm), carboxyl (δ C = 172.34 ppm), carbon methine vòng thơm và các carbon tứ cấp vòng thơm khác. Phổ 13C-NMR cho thấy sự xuất hiện của 4 carbon sp3 có liên kết với O (73.06 ppm, 70.96 ppm, 67.77 ppm, 64.32 ppm) của hợp chất RS-C7. Khảo sát phổ HSQC, HMBC của hợp chất RS-C6 (hỗn hợp của RS-C7 và RSC6a) xác định được các tương quan của RS-C7: − Phổ HSQC tái khẳng định cấu trúc của đơn vị orcinol. Bên cạnh đó, phổ HSQC tái khẳng định hệ thống ABX –CH 2 -CH- của hợp chất RS-C7. − Ngoài ra phổ HSQC còn chỉ ra rằng 3 proton ở vùng từ trường (δ H = 3.84 ppm, 3.74 ppm, 3.72 ppm) là 1 nhóm methylene liên kết với O (δ H = 3.84 ppm, δ H = 3.74 ppm, m, và 1 nhóm methine liên kết với O (δ H = 3.72 ppm, m). − Phổ HMBC tái khẳng định cấu trúc của đơn vị orcinol nhờ tương quan của proton nhóm methyl vòng thơm với C-1, C-5, C-6. − Ngoài ra, phổ HMBC cho thấy 1 tương quan quan trọng của nhóm methylene tại δ H = 4.62 ppm và δ H = 4.45 ppm với carbon carboxyl (-COO-). Từ đó, suy ra phần đường liên kết với phần aglycon ở nhóm -COO-. Từ tất cả dữ liệu phổ trên suy ra cấu trúc của hợp chất RS-C7 được đề nghị là 2,3,4-trihydroxybutyl 2,4-dihyroxy-6-methylbenzoate: 8 CH3 O 1' H 7 CH 5 2' O 1 HC OH 3' HC OH OH HO 3 H24'C OH Hình 4: Các tương quan HMBC của hợp chất RS-C7 Để xác định cấu hình tương đối của 2 tâm bất đối C-2’, C-3’, thực hiện phản ứng thủy phân bằng dung dịch NaOH 1N/ CH 3 OH. 3.2. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT RS-C6a RS-C6a là hợp chất dạng bột màu trắng, là hỗn hợp của hợp chất RS-C7 được xác định khi giải phổ của RS-C6 và RS-C7. • Phổ 1H-NMR: phụ lục 5, phổ 1H-NMR mở rộng: phụ lục 5a, 5b. • Phổ 13C-NMR: phụ lục 6, phổ 13C-NMR mở rộng: phụ lục 6a. • Phổ HSQC mở rộng: phụ lục 3a. • Phổ HMBC mở rộng: phụ lục 4a. Phổ 1H-NMR cho thấy RS-C6a chứa các tín hiệu tương đồng với RS-C7. Tuy nhiên, trên phổ 1H-NMR cũng xuất hiện những mũi phụ ở δ H 5.26 ppm, δ H 4.01 ppm. Tỷ lệ tích phân của RS-C6a so với RS-C7 là: 1:6 cho thấy đây là hỗn hợp của RS-C6a và RS-C7 với tỷ lệ tương ứng. Phổ 13C-NMR cũng cho thấy đây là hỗn hợp của 2 hợp chất. So sánh với dữ liệu phổ 13C-NMR của RS-C7, một số mũi ở (δ C = 77.23 ppm, δ C = 72 ppm, δ C = 64 ppm, δ C = 61 ppm) sẽ là tín hiệu của hợp chất RS-C6a. Phổ HSQC cho thấy tương quan của proton ở 5.26 ppm với carbon ở δ C = 77.23 ppm, proton ở 4.04 ppm với carbon ở δ C = 72 ppm. Đây là 2 nhóm methine. Mặt khác, phổ HSQC còn cho thấy 2 nhóm methylene của đồng phân RS-C6a ở δ C = 64.1 ppm tương quan với proton 3.75 ppm, 3.65 ppm và δ C = 61.3 ppm tương quan với proton 3.93 ppm. Ngoài ra, độ dịch chuyển hóa học của proton ở δ H = 5.26 ppm dịch về vùng từ trường thấp, chứng tỏ phần orcinol phải liên kết với phần đường ở nhóm >CH- bằng liên kết ester. Trong khi đó, độ dịch chyển hóa học của 2 nhóm methylene của RS-C6a dịch về vùng từ trường cao hơn so với RS-C7. Phổ HMBC chỉ ra tương quan chìa khóa giữa nhóm >CH- (δ H = 5.26 ppm) với nhóm carbon carboxyl, tái khẳng định liên kết giữa phần aglycon và phần đường là liên kết ester ở C-2’a. Dựa trên những dữ liệu trên công thức hợp chất RS-C6a được đề nghị là 1,3,4trihydroxybutan-2-yl 2,4-dihyro-6-methylbenzoate: