,V
NU
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
dP
ha
rm
BÙI THỊ THANH VÂN
ac
y
KHOA Y DƯỢC
of
M
ed
ic
ine
an
CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP STIPULEANOSID R2 TỪ
SÂM VŨ DIỆP (Panax bipinnatifidus Seem.)
LÀM NGUYÊN LIỆU XÂY DỰNG CHẤT CHUẨN
CHO DƯỢC LIỆU
Co
py
rig
ht
@
Sc
ho
ol
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC
Hà Nội - 2019
KHOA Y DƯỢC
dP
ha
rm
ac
y
Người thực hiện: Bùi Thị Thanh Vân
,V
NU
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
ed
ic
ine
an
CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP STIPULEANOSID R2 TỪ
SÂM VŨ DIỆP (Panax bipinnatifidus Seem.)
LÀM NGUYÊN LIỆU XÂY DỰNG CHẤT CHUẨN
CHO DƯỢC LIỆU
M
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Co
py
rig
ht
@
Sc
ho
ol
of
(NGÀNH DƯỢC HỌC)
Khóa
: QH.2014.Y
Người hướng dẫn: TS. NGUYỄN HỮU TÙNG
Hà Nội - 2019
,V
NU
LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thiện khóa luận này, bên cạnh tôi
luôn có sự giúp đỡ vô cùng quý giá đến từ các thầy cô giáo của Khoa Y Dược – Đại
ac
y
học Quốc gia Hà Nội cùng với bạn bè và gia đình thân yêu của tôi. Thời điểm hoàn
thành khóa luận cũng là lúc tôi dành những lời tri ân chân thành nhất đến những
rm
người đã chỉ dạy, dìu dắt và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.
Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến giáo viên hướng dẫn của mình
– TS. Nguyễn Hữu Tùng – Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội - thầy đã dành
dP
ha
nhiều thời gian hướng dẫn, dạy dỗ và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xin cảm chị Đặng Thị Ngần – Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã nhiệt
tình chỉ dạy, đóng góp ý kiến để khóa luận của tôi được hoàn thiện.
of
M
ed
ic
ine
an
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới chị Nguyễn Thị Thu Thủy và anh Nguyễn Hoàng
Việt – Đại học Dược Hà Nội; cùng PGS.TS Dương Thị Ly Hương – Khoa Y Dược
Đại học Quốc gia Hà Nội chủ nhiệm đề tài Tây Bắc đã giúp tôi có được kết quả để
tiếp bước thực hiện nghiên cứu này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban chủ nhiệm Khoa, các thầy cô trong
Khoa Y Dược, đặc biệt là bộ môn Hóa dược và Kiểm nghiệm thuốc đã luôn tạo điều
kiện cho tôi thực hiện khóa luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể Dược học khóa QH.2014.Y, đặc biệt là
các bạn Hà, Hoa, Nhung, Thảo đã đồng hành cùng tôi suốt thời gian nghiên cứu.
Cuối cùng, tôi xin dành lời tri ân sâu sắc nhất tới gia đình thân yêu của tôi,
Co
py
rig
ht
@
Sc
ho
ol
đã nuôi nấng và tạo động lực để tôi có kết quả như ngày hôm nay.
Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2019
Sinh viên
Bùi Thị Thanh Vân
MỤC LỤC
,V
NU
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ
ac
y
ĐẶT VẤN ĐỀ
CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN ................................................................................ 2
rm
1.1. CHẤT CHUẨN, CHẤT ĐỐI CHIẾU ............................................................ 2
1.1.1. Khái niệm ................................................................................................ 2
dP
ha
1.1.2. Ứng dụng ................................................................................................. 2
1.1.3. Phân loại .................................................................................................. 3
1.1.4. Sự cần thiết của việc thiết lập chất chuẩn đối chiếu .................................. 4
an
1.1.5. Phương pháp thiết lập chất chuẩn............................................................. 4
ine
1.2. TỔNG QUAN VỀ SÂM VŨ DIỆP ................................................................ 6
1.2.1. Đặc điểm thực vật và phân bố .................................................................. 6
ed
ic
1.1.2. Thành phần hóa học ................................................................................. 7
1.1.3. Tác dụng dược lý ..................................................................................... 8
1.1.4. Công dụng ............................................................................................... 9
M
1.2. TỔNG QUAN VỀ STIPULEANOSID R2 ..................................................... 9
of
1.2.1. Công thức hóa học và đặc điểm ............................................................... 9
1.2.2. Tác dụng sinh học .................................................................................. 10
ol
1.2.3. Các nghiên cứu về stipuleanosid R2 ....................................................... 10
Sc
ho
CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 11
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU ................................................................................. 11
2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu ......................................................................... 11
@
2.1.2. Dung môi, hóa chất ................................................................................ 11
2.1.3. Thiết bị, dụng cụ .................................................................................... 12
ht
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ........................................................................ 12
py
rig
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................ 13
2.3.1. Nghiên cứu chiết xuất, phân lập và tinh chế, xác định cấu trúc hóa học
của stipuleanosid R2 ........................................................................................ 13
Co
2.3.2. Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng chất ...................................................... 14
,V
NU
2.3.3. Phương pháp định tính, định lượng stipuleanosid R2 trong SVD bằng
HPLC .............................................................................................................. 14
2.3.4. Phương pháp xử lý số liệu...................................................................... 15
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................................... 16
3.1. Chiết xuất, phân lập và tinh chế Stipuleanosid R2 trong Sâm vũ diệp .......... 16
ac
y
3.1.1. Chiết xuất .............................................................................................. 16
3.1.2. Phân lập ................................................................................................. 17
rm
3.1.3. Kiểm tra độ tinh khiết của stipuleanosid R2 phân lập được bằng SKLM 18
3.2. Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng stipuleanosid R2 ........................................ 19
dP
ha
3.2.1. Đặc điểm cảm quan................................................................................ 19
3.2.2. Điểm chảy.............................................................................................. 19
3.2.3. Kết quả đo phổ....................................................................................... 19
an
3.3. Phân tích định tính, định lượng stipuleanosid R2 tinh chế được bằng HPLC 22
3.3.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký .................................................... 22
ine
3.3.2. Nhận dạng pic trên sắc ký đồ của stipuleanosid R2 phân lập được ........ 23
ed
ic
3.3.3. Định lượng stipuleanosid R2 phân lập được ........................................... 24
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN ................................................................................... 29
4.1. Về chiết xuất, phân lập và tinh chế .............................................................. 29
M
4.2. Bước đầu xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng .................................................... 30
of
4.3. Phân tích định tính, định lượng stipuleanosid R2 phân lập được bằng HPLC30
4.3.1. Xây dựng phương pháp .......................................................................... 30
ol
4.3.2. Phân tích định tính và định lượng stipuleanosid R2 phân lập được ......... 30
Sc
ho
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................. 32
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Co
py
rig
ht
@
PHỤ LỤC
CCĐC
Chất chuẩn đối chiếu
EtOH
Ethanol
GC
Sắc ký khí
HPLC
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
MeOH
Methanol
MS
Khối phổ
NRM
Phổ cổng hưởng từ proton
LOD
Giới hạn phát hiện
LOQ
Giới hạn định lượng
RDS
Độ lệch chuẩn tương đối
SKĐ
Sắc ký đồ
SKLM
Sắc ký lớp mỏng
SVD
Sâm vũ diệp
UV
Tử ngoại
dP
ha
an
ine
ed
ic
M
of
ol
Sc
ho
@
ht
ac
y
n-Butanol
rm
BuOH
py
rig
Co
,V
NU
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
,V
NU
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
So sánh 2 loại chất chuẩn
3
Bảng 3.1.
Hàm lượng cắn các phân đoạn chiết xuất từ Sâm vũ diệp
17
Bảng 3.2.
Kết quả đo điểm chảy của stipuleanosid R2
20
Bảng 3.3.
Số liệu phổ 1H và 13C-NMR, DEPT của stipuleanosid R2
21
Bảng 3.4.
Chương trình dung môi
25
Bảng 3.5.
Sự phù hợp hệ thống xác định độ tinh khiết
Bảng 3.6.
Kết quả định lượng nguyên liệu thiết lập chất chuẩn
dP
ha
an
ine
ed
ic
M
of
ol
Sc
ho
@
ht
py
rig
Co
rm
ac
y
Bảng 1.
26
28
Hình 1.1
Hình ảnh sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.)
Hình 1.2. Các hợp chất tách được từ rễ cây sâm vũ diệp
ac
y
Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của stipuleanosid R2
,V
NU
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ
6
8
9
Cai
Hình 3.1. Quy trình chiết xuất stipuleanosid R2
rm
Hình 2.1. Mẫu sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái tại Sa Pa, Lào 11
dP
ha
Hình 3.2. Sơ đồ phân lập stipuleanosid R2 từ phân đoạn n-butanol
18
19
Hình 3.3. Sắc ký đồ của stipuleanosid R2 phân lập được sau khi phun TT H2SO4 20
10% /EtOH
an
Hình 3.4. Cấu trúc hóa học của stipuleanosid R2
24
ine
Hình 3.5. SKĐ HPLC của stipuleanosid R2 phân lập được (A), cao BuOH (B) và 26
chất chuẩn đối chiếu (C)
Co
py
rig
ht
@
Sc
ho
ol
of
M
ed
ic
Hình 3.6. Sắc ký đồ xác định độ tinh khiết của stipuleanosid R2
27
ĐẶT VẤN ĐỀ
,V
NU
Đất nước Việt Nam ta luôn tự hào được thiên nhiên ưu đãi, tạo hóa ban cho
chúng ta một nguồn dược liệu “giàu có” so với các nước trong khu vực và trên thế
giới. Thống kê của Viện Dược liệu cho thấy, cả nước đã ghi nhận 5.117 loài thực
ac
y
vật và nấm, 408 loài động vật và 75 loại khoáng có công dụng làm thuốc, trong đó
có nhiều loài dược liệu quý hiếm, đặc hữu như: sâm vũ diệp, sâm ngọc linh, ba
dP
ha
rm
kích, ngân đằng, thông đỏ…
Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem., họ Nhân sâm – Araliaceae) là một
trong những dược liệu quý, phân bố ở Trung Quốc và dãy núi Hoàng Liên Sơn, Tây
Bắc nước ta. Về mặt y học, sâm vũ diệp được sử dụng làm thuốc bổ và là thành
phần trong một số bài thuốc truyền thống của các dân tộc vùng núi Tây Bắc có tác
dụng chống ung thư, chống oxy hóa, bổ dưỡng, tăng trí nhớ... Theo như các tài liệu
Sc
ho
ol
of
M
ed
ic
ine
an
đã được công bố về sâm vũ diệp cho thấy các saponin là thành phần hoạt chất chính
mang lại tác dụng dược lý và giá trị sử dụng của dược liệu quý này trong y học, đặc
biệt nói đến là stipuleanosid R2 – một saponin quan trọng có trong sâm vũ diệp.
Để nâng cao chất lượng nghiên cứu về stipuleanosid R2 nói riêng và các hợp
chất nói chung, việc kiểm tra, kiểm soát chất lượng dược liệu là vô cùng quan trọng.
Song thực tế nước ta còn gặp khó khăn trong việc phân tích, kiểm nghiệm do thiếu
các chất chuẩn cần thiết. Phần lớn chất chuẩn đang sử dụng phải nhập từ nước ngoài
với giá cao và thời gian đặt hàng kéo dài. Nhằm khắc phục nhược điểm này, cùng
với mục tiêu phát triển tiềm năng của vị dược liệu quý sâm vũ diệp, chúng tôi đã
tiến hành nghiên cứu đề tài: “Chiết xuất, phân lập stipuleanosid R2 từ Sâm Vũ Diệp
(Panax bipinnatifidus Seem.) làm nguyên liệu xây dựng chất chuẩn cho dược liệu”.
Mục tiêu đề tài:
py
rig
ht
@
Chiết xuất, phân lập và tinh chế stipuleanosid R2 có độ tinh khiết trên 95%
từ dược liệu sâm vũ diệp.
Bước đầu xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng stipuleanosid R2: nhiệt độ nóng
chảy, dữ liệu phổ.
Phân tích định tính, định lượng stipuleanosid R2 phân lập được.
Kết quả của đề tài sẽ góp phần xây dựng cơ sở dữ liệu thành phần hóa học,
Co
xây dựng tiêu chuẩn dược liệu sâm vũ diệp làm cơ sở cho các nghiên cứu hoạt tính
sinh học của stipuleanosid R2, nền tảng cho việc phát triển sâm vũ diệp trong điều
trị.
1
CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN
,V
NU
1.1. CHẤT CHUẨN, CHẤT ĐỐI CHIẾU
1.1.1. Khái niệm
Chất chuẩn (standard subtances) hay chất chuẩn đối chiếu (reference
ac
y
standards) là chất cần thiết để đánh giá các nguyên liệu, bán thành phẩm, thành
phẩm… theo các quy trình đã xác định nhằm đảm bảo kết quả phân tích đạt độ
chính xác, đáng tin cậy [28].
rm
Chất chuẩn đối chiếu là một phần quan trọng của đo lường và thiết lập tính
khả thi trong so sánh (comparability) và có thể truy nguyên được (traceability)[6].
dP
ha
Theo dược điển Việt Nam V: Chất đối chiếu là chất đồng nhất đã được xác
định là đúng để dùng trong các phép thử đã được quy định về hóa học, vật lý và
sinh học. Trong các phép thử đó các tính chất của chất đối chiếu được so sánh với
of
standards) [19].
M
ed
ic
ine
an
các tính chất của chất thử. Chất đối chiếu phải có độ tinh khiết phù hợp với mục
đích sử dụng [3].
Theo định nghĩa FDA: “Chất chuẩn đối chiếu (reference standards) là một lô
hay mẻ của hợp chất làm thuốc được điều chế đặc biệt bằng cách tổng hợp độc lập
hoặc bằng cách tinh chế bổ sung của nguyên liệu điều chế và được chứng minh
bằng một loạt các thử nghiệm phân tích sâu rộng để xác định nó là nguyên liệu xác
thực có độ tinh khiết tối đa, có thể đạt được một cách hợp lý. Nó thường được dùng
cho việc phân giải cấu trúc và chất làm chuẩn cho các chất chuẩn làm việc (working
Co
py
rig
ht
@
Sc
ho
ol
1.1.2. Ứng dụng
Chất đối chiếu được dùng trong các phép thử sau:
- Định tính bằng phương pháp quang phổ hấp thụ hồng ngoại.
- Định lượng bằng phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại và khả kiến,
quang phổ huỳnh quang.
- Các phép thử định tính và định lượng bằng phương pháp sắc ký.
- Định lượng bằng phương pháp vi sinh vật.
- Các phép chuẩn độ đo thể tích, phân tích khối lượng.
- Các phép thử sinh học.
- Một số phép thử khác có hướng dẫn trong các chuyên luận riêng [3].
Ngoài ra chất đối chiếu còn dùng để:
- Thẩm định một phương pháp mới.
- Chuẩn hóa các chất đối chiếu khác.
2
Khẳng định giá trị pháp lý của một phương pháp đã chuẩn hóa [15].
,V
NU
-
1.1.3. Phân loại
Chất chuẩn được phân loại theo nhiều cách khác nhau, trong lĩnh vực khoa
ac
y
học dược phẩm, chất chuẩn được phân làm hai loại: chất chuẩn sơ cấp (primary
standards) và chất chuẩn thứ cấp (secondary standards).
- Chất chuẩn sơ cấp (primary standards): là các hợp chất với những chất lượng
rm
và độ tinh khiết được thiết lập độc lập, được chấp nhận mà không cần tham khảo
các tiêu chuẩn khác.
dP
ha
- Chất chuẩn thứ cấp (secondary standards): là các hợp chất mà chất lượng và
độ tinh khiết được thiết lập dựa trên sự so sánh với chất chuẩn phân tích.
So sánh 2 loại chất chuẩn:
ine
Chất chuẩn sơ cấp
an
Bảng 1. So sánh 2 loại chất chuẩn [18]
Chất chuẩn thứ cấp
Chất chuẩn phòng thí nghiệm,
chất chuẩn làm việc
Chất chuẩn gốc
Độ tinh khiết
99.5%
95%
Cao
Kém hơn chất chuẩn sơ cấp
ed
ic
Tên gọi khác
M
Chất lượng
Được chấp nhận mà không cần so Yêu cầu phải so sánh với chất
sánh
chuẩn phân tích
Mục đích sử
dụng
- Dùng trong mục đích công
nghiệp:
+ Quá trình phát triển thuốc
Dùng trong phòng thí nghiệm
+ Nghiên cứu và phát triển (R&D)
và kiểm tra chất lượng (QC)
+ Chuẩn hóa dụng cụ, phương
pháp và vật liệu.
+ Chuẩn hóa chất chuẩn thứ cấp
ht
@
Sc
ho
ol
of
Đặc tính
py
rig
Không sử
dụng
Co
Tính sẵn có
Như thuốc hoặc mỹ phẩm cho
người tiêu dùng
Cho mục đích nghiên cứu yêu
cầu độ tinh khiết trên 95%
Được cung cấp từ nhà máy
Tổng hợp độc lập và lượng sẵn có
Bulk hoặc bào chế trong phòng
vô cùng ít
thí nghiệm
3
Thấp hơn
Rất cao
,V
NU
Giá cả
1.1.4. Sự cần thiết của việc thiết lập chất chuẩn đối chiếu
Hiện nay, trên thế giới đã có một số chất chuẩn là những hợp chất đặc trưng
của dược liệu được sản xuất đạt mức độ tinh khiết nhất định. Trong số đó, chỉ có
ac
y
một số ít chất chuẩn được tiếp cận mua được, nhưng thường có giá rất đắt. Hoạt
động nghiên cứu thiết lập và sản xuất các chất chuẩn giúp cho công tác kiểm tra,
rm
giám sát chất lượng thuốc và nguyên liệu làm thuốc được dễ dàng và thuận tiện.
Nguồn chất chuẩn ở Việt Nam hiện nay đã có hơn 500 chất chuẩn bao gồm
dP
ha
chất chuẩn Quốc tế, chuẩn khu vực, chuẩn Dược điển Việt Nam, chuẩn phòng thí
nghiệm, chuẩn chính. Tuy nhiên chủ yếu trong đó là chất chuẩn hóa học, rất ít chất
chuẩn có nguồn gốc từ dược liệu. Sự thiếu hụt này đã và đang gây nhiều khó khăn
ed
ic
ine
an
cho ngành Dược như:
- Không kiểm tra, giám sát Dược liệu và các dạng bào chế có nguồn gốc từ
dược liệu đang lưu hành trên thị trường một cách đầy đủ và toàn diện.
- Không tiêu chuẩn hóa được các thuốc sản xuất trong nước bào chế từ dược
liệu hoặc chiết xuất từ dược liệu về hàm lượng dược chất. Do đó khó có thể bào chế
các thuốc có chất lượng cao phục vụ nhu cầu phòng bệnh và chữa bệnh.
M
Do vậy nghiên cứu thiết lập chất chuẩn các hợp chất chiết xuất Dược liệu là
nhiệm vụ khoa học công nghệ cấp thiết, đòi hỏi nhu cầu thực tiễn khách quan.
Co
py
rig
ht
@
Sc
ho
ol
of
1.1.5. Phương pháp thiết lập chất chuẩn
1.1.5.1 Thiết lập, bảo quản và phân phối chất chuẩn sơ cấp
Quy trình thiết lập chất chuẩn sơ cấp bao gồm các bước như sau [34]:
- Đánh giá nhu cầu thiết lập chất chuẩn đối chiếu (CCĐC)
- Lựa chọn nguồn nguyên liệu dùng để thiết lập CCĐC từ nhà cung cấp
- Đánh giá chất chuẩn đối chiếu:
+ CCĐC dùng cho phép thử định tính: Thông thường chỉ cần kết quả đánh giá
từ một phòng thí nghiệm đủ tiêu chuẩn.
+ CCĐC dùng cho phép thử độ tinh khiết: Yêu cầu mô tả đặc tính rộng hơn so
với phép thử định tính, đặc biệt khi sử dụng trong các phép thử giới hạn. Nếu sử
dụng kĩ thuật SKLM, thường đề nghị độ tinh khiết tối thiểu (≥ 90%), nhưng yêu cầu
độ tinh khiết cao hơn (≥ 95%) đối với kỹ thuật HPLC hoặc GC. Thông thường chỉ
cần một phòng thí nghiệm tham gia đánh giá CCĐC dùng cho phép thử độ tinh
khiết. Nếu CCĐC được phân lập hoặc điều chế lần đầu tiên thì cần tiến hành một số
phép thử hóa lý như phổ NMR, phổ MS và phân tích nguyên tố để mô tả đặc tính.
4
+ Các CCĐC dùng cho phép định lượng: Phạm vi các phép thử rất rộng, sử
,V
NU
dụng nhiều kỹ thuật đã được thiết lập và thẩm định, bao gồm các phương pháp đã
được sử dụng để đánh giá tiêu chuẩn chất lượng trong dược điển. Khi định lượng
các CCĐC bằng các phương pháp không đặc hiệu, như đo quang phổ UV hay so
ac
y
màu, cần phải xác định hàm lượng nước và lượng dung môi tồn dư. Khi định lượng
bằng các phương pháp đặc hiệu, cần phải xác định hàm lượng tạp chất. Trong
rm
trường hợp này, khuyến khích sử dụng thêm các phương pháp tuyệt đối để định
lượng chất chính.
+ Các CCĐC dùng để hiệu chuẩn thiết bị: Yêu cầu phạm vi các test đánh giá
dP
ha
như đối với định lượng.
- Phân tích định tính, định lượng để đánh giá chất chuẩn sơ cấp.
Xác định giá trị ấn định.
-
Xác định thông tin cần cung cấp kèm theo chất chuẩn sơ cấp.
Đóng gói, bảo quản, nghiên cứu độ ổn định.
an
-
Sc
ho
ol
of
M
ed
ic
ine
1.1.5.2. Thiết lập, bảo quản và phân phối chất chuẩn thứ cấp
Trên cơ sở tham khảo quy trình thiết lập chất chuẩn sơ cấp, các hội đồng
dược điển quốc gia hay khu vực hoặc các phòng thí nghiệm được ủy quyền của cơ
quan quản lý dược quốc gia xây dựng quy trình thiết lập chất chuẩn thứ cấp hay
chất chuẩn làm việc của cơ sở đó. Việc thiết lập chất chuẩn làm việc dựa trên chất
chuẩn sơ cấp thường được tiến hành do nhu cầu thực tế, khi nguồn chất chuẩn sơ
cấp không đủ cung cấp cho nhu cầu sử dụng trong công tác nghiên cứu và đảm bảo
chất lượng thuốc.
Việc phân loại chất chuẩn làm việc mang ý nghĩa tương đối. Một chất chuẩn
làm việc của khu vực hay quốc gia có thể được coi là chất chuẩn sơ cấp để thiết lập
py
rig
ht
@
chất chuẩn phòng thí nghiệm hoặc các nhà sản xuất dược phẩm. Trong trường hợp
này, các chất chuẩn khu vực hay quốc gia được gọi là chuẩn liên kết.
Theo quy định của ASEAN, chương trình đánh giá lại chất chuẩn đối chiếu
ASEAN (ACRS) được thiết kế để phát hiện các dấu hiệu sớm của quá trình phân
hủy bằng các kỹ thuật phân tích phù hợp. Các kỹ thuật này phải đáp ứng được các
yêu cầu: sử dụng lượng mẫu ít, tiến hành nhanh, độ nhạy cao. Tần suất và cỡ mẫu
Co
dùng cho đánh giá lại phụ thuộc một số yếu tố như độ ổn định của CCĐC, đồ bao
gói, nút đóng của đồ bao gói, điều kiện bảo quản, độ ẩm, tính chất vật lý và mục
đích sử dụng của CCĐC. Đối với ACRS tần suất đánh giá lại được quy định như
sau: 3 năm đối với CCĐC dùng cho phép thử hóa học, 2 năm đối với CCĐC dùng
5
giá lại thường bao gồm một số thử nghiệm sau:
- Xác định hàm lượng nước, mất khối lượng khi sấy khô.
- Xác định tạp chất bằng HPLC hoặc SKLM.
Xác định hàm lượng chất chính.
Xác định độ tinh khiết bằng đo nhiệt vi sai, nếu thích hợp.
ac
y
-
,V
NU
cho phép thử vi sinh, 1 năm đối với các chất đặc biệt nhạy cảm. Chương trình đánh
dP
ha
rm
1.2. TỔNG QUAN VỀ SÂM VŨ DIỆP
1.2.1. Đặc điểm thực vật và phân bố
Sâm vũ diệp có tên khoa học là Panax bipinnatifidus Seem. [2,12], thuộc chi
Nhân sâm (Panax. L), họ Ngũ gia bì (Araliaceae), bộ Hoa tán (Apiales) [1].
đều, mép có răng cưa, có lông.
ed
ic
ine
an
SVD là cây thân thảo sống nhiều năm, ưa bóng và rất ưa ẩm [2,12]. Thân rễ
dài có nhiều đốt và những vết sẹo do thân rụng hàng năm để lại. Thân khí sinh
mảnh, cao 20 - 30 cm, thường đơn độc, mọc thẳng, rỗng giữa, có vạch dọc, thường
lụi vào mùa đông, mọc chồi thân mới từ giữa tháng 2 đến đầu tháng 3 dương lịch.
Lá kép chân vịt, gồm 2 - 3 chiếc mọc vòng. Lá chét gồm 5 - 7 (ít khi 3) lá thuôn, dài
2,5 - 14 cm, rộng 1,5 - 4 cm, gốc tròn, đầu thuôn thành mũi nhọn, xẻ thùy không
Co
py
rig
ht
@
Sc
ho
ol
of
M
Cụm hoa tán đơn, mọc ở ngọn; cuống cụm hoa 5 – 10 cm; cụm hoa có từ 20
– 90 hoa; cuống hoa mảnh dài 1 – 1,5 cm. Hoa màu trắng đục, mọc thành tán đơn ở
ngọn thân, 5 cánh hoa, bầu 2 - 3 ô [2]. Quả hình cầu đến hình cầu dẹt; đường kính
0,6 – 1,2 cm; khi chín màu đỏ, có chấm đen ở đầu, chứa 1 – 2 hạt. Hạt hình cầu
hoặc gần cầu, màu xám trắng; vỏ cứng, có rốn hạt [2,11].
Hình 1.1. Hình ảnh sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.)
6
SVD là loài sâm mọc tự nhiên và được phát hiện tương đối sớm ở nước ta.
,V
NU
Trên thế giới, SVD được tìm thấy ở Trung Quốc, Ấn Độ và Nepan (vùng cận
Hymalaya), tại Việt Nam dược liệu này phân bố ở dãy núi Hoàng Liên Sơn: huyện
Sa Pa, Bát Xát - Lào Cai và huyện Than Uyên - Lai Châu Tây Bắc [2,11-12] ở độ
ac
y
cao 1900-2400 m, trong rừng ẩm.
rm
1.1.2. Thành phần hóa học
Saponin là thành phần chính của lá và rễ cây SVD, trong đó bao gồm
saponin khung oleanan với hàm lượng tương đối cao cùng với một số saponin
dP
ha
khung dammaran với hàm lượng thấp hơn [8,13]. Saponin bao gồm: ginsenoside,
notoginsenoside và chikusetsusaponin là các hợp chất có hoạt tính chính trong
nhóm dược liệu này [35].
ed
ic
ine
an
Năm 1989, các nhà khoa học Trung Quốc đã công bố phân lập được 13
saponin khung dammaran từ lá của dược liệu này ở Trung Quốc trong đó bao gồm
một số ginseng saponin đặc trưng như ginsenosid F1, F2, F3, Rg2, Rb, Rd, Re và
Rb3 [31].
Năm 2002, nghiên cứu của Trần Công Luận cho thấy kết quả định tính sơ bộ
trong thân rễ và rễ củ SVD có chứa hai nhóm chất chính là polyacetylen và saponin
Co
py
rig
ht
@
Sc
ho
ol
of
M
cùng với acid béo, acid amin [12].
Năm 2003, đã xác định thành phần saponin ở thân rễ SVD chủ yếu là
saponin triterpen thuộc nhóm oleanan gồm những chất như chikusetsusaponin IV,
zingibrosid R1, ginsenosid Ro. Ngoài ra còn có các saponin triterpen nhóm
dammaran như Rb1, Rd, Re, Rg1 và Rg2 [11].
Năm 2018, nhóm nghiên cứu của Đại học Quốc gia Hà Nội đã phân lập được
hai saponin từ rễ của SVD: stipuleanosid R2 và aralosid A methyl este [30].
Như vậy, tổng cộng có 28 hợp chất saponin đã được xác định từ các phần
của cây SVD.
7
Methyl
,V
NU
Me
Ara(f) α- L-arabinofuranosyl
Ara(p) α-L-arabinopyranosyl
Glc
β-O-xylopyranosyl
dP
ha
rm
ac
y
Xyl
β-D-glucopyranosyl
R1
R2
R3
R4
R5
1:
2:
Ara(p)
H
H
Xy (16)glc
H
H
Me
Me
H
H
3:
4:
Xy
H
Ara(p)
H
Me
Me
Glc
H
5:
6:
H
Xy
H
H
H
H
Me
Me
Glc
H
7:
8:
H
Xy
Glc
H
Arara(f)
H
H
Me
H
Glc
9:
10:
Xy
H
Ara(p)
Glc
H
Ara(f)
H
Me
Glc
Glc
an
Compoud
M
ed
ic
ine
H
Ara(p)
ol
of
Hình 1.2. Các hợp chất tách được từ rễ cây sâm vũ diệp [24]
@
Sc
ho
1.1.3. Tác dụng dược lý
Năm 2016, nhóm nghiên cứu Trung Quốc đã công bố kết quả sàng lọc hoạt
tính diệt tế bào ung thư từ 57 cây trong cơ sở dữ liệu y học cổ truyền Trung Quốc,
Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) là một trong số những loài thể hiện hoạt
tính ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư [21].
ht
Năm 2017, nghiên cứu về SVD có tác dụng ức chế ngưng tập tiểu cầu trên in
py
rig
vitro ở các phân đoạn và các mức liều: phân đoạn tổng, phân đoạn n-butanol, phân
đoạn ethylacetat có tác dụng ở các mức liều: 0,5-1-2-5 mg/mL, phân đoạn ether ở
Co
các mức liều 1-2-5 mg/mL [10].
8
tạo sắc tố da, nếu thừa enzyme này sẽ làm da đen, sạm và nám.
,V
NU
Ngoài ra, các nhà nghiên cứu khám phá ra SVD nhờ các thành phần
ginsenoside Rh1, Rh2, Rg1, Rg2 và chikusetsusaponin L5 có khả năng ức chế hoạt
động enzyme tyrosinase trên 50% [35] – một enzyme có tác dụng tổng hợp melanin
ac
y
1.1.4. Công dụng
Rễ cây SVD ngâm rượu rồi chiết dưới dạng tinh sâm dùng rất tốt cho sức
rm
khỏe đặc biệt là chức năng sinh dục. Ngoài ra nhân dân ở vùng trồng còn tận dụng
cả thân và lá nấu cao rồi dùng để pha với nước hoặc rượu để uống cũng có tác dụng
dP
ha
như rễ. Ở Trung Quốc, SVD còn được dùng làm thuốc chữa lao, chảy máu cam, thổ
huyết, đòn ngã tổn thương [5,11].
ine
an
1.2. TỔNG QUAN VỀ STIPULEANOSID R2
Stipuleanosid R2 là một hợp chất saponin quan trọng chiếm tỷ lệ lớn nhất
trong SVD tính đến thời điểm nghiên cứu hiện nay, thành phần mang hoạt tính,
đang tiếp tục được sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học, hợp chất này
ed
ic
được phân lập trong một số dược liệu như: sâm vũ diệp, tam thất hoang, Aralia
taibaiensis [29], Aralia elata [27] ...
Co
py
rig
ht
@
Sc
ho
ol
of
M
1.2.1. Công thức hóa học và đặc điểm
Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của stipuleanosid R2 [37]
9
,V
NU
Tên khoa học theo hệ thống IUPAC:
(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[[(3S,4aR,6aR,6bS,8aS,12aS,14aR,14bR)-4,4,6a,6b,11,11,14bheptamethyl-8a-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2yl]oxycarbonyl-1,2,3,4a,5,6,7,8,9,10,12,12a,14,14a-tetradecahydropicen-3-yl]oxy]3-[(2S,3R,4R,5S)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-5-hydroxy-4-
rm
ac
y
[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxane-2carboxylic acid [33].
Công thức phân tử: C53H84O23 [37].
dP
ha
Phân tử lượng: 1089,232 g/mol [38].
Tính chất lý hóa: Chất bột màu trắng, độ tan: 0,57 g/l [38], điểm nóng chảy 210 2150C [22].
ed
ic
ine
an
1.2.2. Tác dụng sinh học
Theo kết quả của một số nghiên cứu in vitro trên thế giới, các nhà khoa học
đã chứng minh rằng stipuleanosid R2 có tác dụng gây độc tế bào ung thư [27]; ức
chế sự gia tăng các tế bào ung thư bạch cầu đặc biệt là đối với dòng tế bào K562 và
U937 [22]; có tác dụng chống oxy hóa [32]; hạ đường huyết, điều hòa miễn dịch và
hạ lipid máu [31].
M
1.2.3. Các nghiên cứu về stipuleanosid R2
Hiện nay trên thế giới và trong nước vẫn chưa có nhiều các nghiên cứu công
Co
py
rig
ht
@
Sc
ho
ol
of
bố về hợp chất stipuleanosid R2 trong dược liệu. Các nghiên cứu đang dừng lại ở
việc phân lập hợp chất này trong các dược liệu và xây dựng được phương pháp định
lượng hợp chất stipuleanosid R2 trong thân rễ SVD [9]. Chính vì vậy để nâng cao
chất lượng nghiên cứu cần phải có những tiêu chuẩn cho chất chuẩn stipuleanosid
R2…
10
CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
,V
NU
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU
2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu
Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) được trồng và thu hái ở Sa Pa,
Lào Cai là dược liệu được nghiên cứu trong đề tài này.
ac
y
Mô tả đối tượng nghiên cứu: thân rễ SVD có nhiều đốt và những vết sẹo,
cong ngoằn ngoèo, dài 7-12 cm, đường kính 1,2-1,8 cm. Thể chất cứng chắc, giòn,
dP
ha
rm
dễ bẻ, mặt bẻ lởm chởm, màu vàng nâu nhạt. Mùi thơm nhẹ, vị đắng, hơi ngọt.
Xử lí mẫu: thân rễ SVD rửa sạch, để khô, thái lát mỏng, sấy khô ở 500C đến
of
M
ed
ic
ine
an
hàm ẩm đạt dưới 10%, bảo quản trong túi nilong kín, để nơi khô ráo, thoáng mát để
sử dụng trong nghiên cứu.
Sc
ho
ol
Hình 2.1. Mẫu sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái tại Sa Pa, Lào
Cai
Co
py
rig
ht
@
2.1.2. Dung môi, hóa chất
- Dung môi công nghiệp được cất lại trước khi dùng (chiết xuất dược liệu, sắc
ký lớp mỏng, sắc ký cột) gồm:
+ Ethanol (EtOH)
+ Methanol (MeOH)
+ n-Hexan
+ Dicloromethan (CH2Cl2)
+ Cloroform (CHCl3)
+ Ethylacetat (EtOAc)
+ n-butanol (BuOH)
- Chất chuẩn liên kết stipuleanosid R2 (Wako Chemicals, Nhật Bản, độ tinh
11
khiết 98%, mã sản phẩm 155-01701)
Dung môi chạy sắc ký HPLC (Methanol, acetonitril) của Merck, Đức
Hạt nhồi dùng cho sắc ký cột loại:
+ Pha thường silica gel 60 (230-400 mesh, Nacalai Tesque, Nhật Bản)
,V
NU
-
ac
y
+ Pha đảo YMC ODS-A (50 μm, YMC Co. Ltd., Nhật Bản)
- Bản mỏng tráng sẵn trên đế nhôm loại pha thường Kieselgel 60 F254 và pha
dP
ha
rm
đảo TLC Silica gel 60 RP-18 F254S (Merck, Damstadt, Đức). Phát hiện chất bằng
đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch
H2SO4 10% hơ nóng để phát hiện vết chất.
2.1.3. Thiết bị, dụng cụ
Trong quá trình nghiên cứu đề tài, chúng tôi đã sử dụng các thiết bị, dụng cụ
Sc
ho
ol
of
M
0,0001g, Precisa - Thụy Sĩ)
Cân xác định hàm ẩm Prescisa HA 60
Máy siêu âm Power sonic 405 (Powersonic - Hàn Quốc)
Máy cất quay Rotavapor R-220, Rotavapor R-200 (Buchi, Thụy Sĩ)
Máy đo điểm nóng chảy BUCHI 535
Bếp điện, bếp đun cách thủy
Cột sắc ký các loại kích cỡ
Màng lọc 0,45 µm
Dụng cụ thủy tinh: bình gạn, bình nón, phễu lọc, cốc có mỏ, bình định mức,
bình cầu dung tích 50 - 2000 mL, ống nghiệm, pipet chính xác
@
-
ed
ic
ine
an
đáp ứng tiêu chuẩn ISO/IEC 17025 và GLP tại Khoa Y Dược, ĐH Quốc gia Hà
Nội:
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Agilent 1260 Infinity (Agilent
Technologies, Mỹ) với detector DAD và bộ phận bơm mẫu tự động
- Tủ sấy Memmert (Memmert – Đức), tủ hút
- Cân kĩ thuật Precisa BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SMA-FR (sai số
Co
py
rig
ht
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Nghiên cứu chiết xuất, phân lập và tinh chế stipuleanosid R2 từ dược liệu
sâm vũ diệp.
Bước đầu xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng stipuleanosid R2: nhiệt độ nóng
chảy, dữ liệu phổ.
- Phân tích định tính, định lượng stipuleanosid R2 tinh chế được.
12
- Xem thêm -