Tài liệu ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến sự sinh trưởng và hàm lượng prolin của hạt đậu tương nảy mầm trong dung dịch đường saccarôzơ

LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận này, em đã nhận được sự chỉ bảo, hướng dẫn tận tình của thầy giáo PGS.TS Nguyễn Văn Mã, cùng các thầy cô giáo trong khoa Sinh – KTNN, sự động viên, giúp đỡ của gia đình, bạn bè trong suốt thời gian thực hiện khóa luận. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới thầy giáo PGS.TS Nguyễn Văn Mã, Khoa Sinh – KTNN, Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu Khoa học và Chuyển giao công nghệ, Thư viện trường ĐHSP Hà Nội 2 đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất để em có thể hoàn thành tốt khóa luận này. Trong quá trình thực hiện, do còn nhiều hạn chế, đề tài nghiên cứu của em không tránh khỏi những thiếu sót. Rất mong nhận được sự chỉ bảo, đóng góp ý kiến của các thầy cô giáo và các bạn sinh viên để đề tài của em được hoàn thiện hơn. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, Ngày 28 tháng 4 năm 2010. Sinh viên Nguyễn Thị Thanh LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Kết quả nghiên cứu của đề tài này đảm bảo tính chính xác, khách quan, trung thực và không trùng lặp với các tác giả khác. Hà Nội, Ngày 28 tháng 4 năm 2010. Sinh viên Nguyễn Thị Thanh 1 2 MỤC LỤC Mở đầu ........................................................................................................ 1 1. Lí do chọn đề tài............................................................................ 1 2. Mục đích và nhiệm vụ nghiên cứu................................................. 4 2.1. Mục đích nghiên cứu ........................................................... 4 2.2. Nhiệm vụ nghiên cứu........................................................... 4 3. Ý nghĩa lí luận và thực tiễn của đề tài ........................................... 4 Nội dung ...................................................................................................... 5 Chương 1. Cơ sở lí luận của vấn đề nghiên cứu ....................................... 5 1.1. Vai trò của nước đối với thực vật .............................................. 5 1.2. Vai trò của nước đối với sự nảy mầm của đậu tương .................. 6 1.3. Prolin và vai trò của prolin đối với thực vật................................ 8 1.3.1. Bản chất hoá học của prolin .................................................... 8 1.3.2. Vai trò của prolin .................................................................... 9 1.4. Tình hình nghiên cứu về cây đậu tương, prolin và sự ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đối với thực vật ............................................... 10 Chương 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu .................................. 14 2.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................. 14 2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................ 14 2.2.1. Phương pháp xác định các áp suất thẩm thấu........................... 14 2.2.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm ................................................ 15 2.2.3. Phương pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu ........................ 16 2.2.3.1. Xác định tỉ lệ nảy mầm ......................................................... 16 2.2.3.2. Xác định các chỉ tiêu sinh trưởng của mầm .......................... 16 2.2.3.3. Phân tích hàm lượng prolin của mầm ................................... 17 2.2.4. Phương pháp xử lí thống kê kết quả thực nghiệm .................... 18 Chương 3. Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến sự sinh trưởng và hàm lượng prolin của mầm đậu tương...................................................... 19 3.1. Tỉ lệ nảy mầm của đậu tương ..................................................... 19 3.2. Sự sinh trưởng của thân và rễ mầm ............................................ 22 3.3. Khối lượng tươi và khối lượng khô của mầm ............................. 28 3.4. Hàm lượng prolin của mầm ........................................................ 33 Kết luận....................................................................................................... 36 Tài liệu tham khảo...................................................................................... 37 3 MỞ ĐẦU 1. Lí do chọn đề tài Đậu tương, đỗ tương hay đậu nành (Glycinemax) là một loại cây thuộc họ Đậu (Fabaceae) bộ Đậu (Fabales) là một cây trồng rất có giá trị. Hàm lượng các chất dinh dưỡng có ở đậu tương khá cao. Trong hạt, hàm lượng protein có thể chiếm tới 40% khối lượng khô của hạt, thành phần của nó chứa rất nhiều axit amin khác nhau, trong đó có một số axit amin không thay thế rất cần thiết đối với cơ thể: lơxin, izolơxin, valin, metionin, triptophan,… Đây là nguồn protein thực vật có giá trị cao cung cấp cho con người và động vật. Trong hạt đậu tương còn chứa nhiều nguyên tố khoáng: Fe, Ca, P, Mg, S và thành phần chất xơ tốt cho tiêu hóa. Vitamin trong đậu tương cũng có nhiều loại khác nhau, trong đó đáng kể nhất là các vitamin nhóm B: B1, B2, B6 ngoài ra còn có vitamin E, axit pholic. So với các loại đậu khác thì đậu tương có chứa các axit béo thiết yếu cao hơn. Tổng số chất béo chiếm khoảng 18%, thành phần cacbonhiđrat chiếm 31%. Ngoài ra, đậu tương còn chứa một số thành phần rất có lợi cho sức khỏe con người như phytosterols, lecithin, isoflavons và phytoestrogen…[19]. Sản phẩm từ cây đậu tương được sử dụng rất đa dạng như dùng trực tiếp hạt thô hoặc chế biến thành đậu phụ, ép thành dầu đậu nành, làm nước tương, sữa đậu nành, bánh kẹo,…[17] đáp ứng nhu cầu về đạm trong khẩu phần ăn hàng ngày của con người cũng như của gia súc. Theo các nghiên cứu của các nhà khoa học Mĩ và Hàn Quốc cho thấy: ăn nhiều sản phẩm từ đậu tương có thể giúp ngăn ngừa được nhiều bệnh ung thư nhất là ung thư do hoocmon gây ra: ung thư vú, ung thư tuyến tiền liệt hay ung thư đường ruột, 4 một số bệnh liên quan đến gan, mật, kiểm soát thể trạng, phòng ngừa bệnh tiểu đường, béo phì và loãng xương [4]. Cũng như các cây họ Đậu khác, bên cạnh giá trị dinh dưỡng cao, cây đậu tương còn có tác dụng rất tốt trong việc cải tạo đất, tạo năng suất cho các cây trồng khác. Điều này có được là do hoạt động cố định nitơ của loài vi khuẩn Rhizobium sống cộng sinh trong các nốt sần của rễ cây. Chúng cung cấp đạm cho đất làm cho đất trở nên tơi xốp, màu mỡ hơn và đồng thời lượng protein trong hạt và các bộ phận khác của cây đậu tương cũng cao hơn những cây trồng khác. Mặt khác, cây đậu tương còn có thời gian sinh trưởng ngắn, lại thích ứng với nhiều phương thức canh tác như: luân canh, xen canh…nên có thể nâng cao được hệ số sử dụng đất trồng và tăng hiệu quả kinh tế trên một đơn vị diện tích canh tác [3]. Về nguồn gốc, đậu tương được coi là một trong những cây trồng cổ nhất của nhân loại, xuất phát từ một loại đậu tương dại thân mảnh dạng cây leo, tên khoa học là G.sofa Sied & Zuc (T. Hymovitz 1970) ở vùng Mãn Châu (Trung Quốc). Sau đó diện tích gieo trồng đậu tương được mở rộng trên phạm vi toàn thế giới. Hiện nay đậu tương được trồng trên 200 quốc gia, chủ yếu tập trung ở một số nước: Hoa Kỳ, Trung Quốc và Ấn Độ [1]. Ở Việt Nam, ngay từ thời vua Hùng ông cha ta đã biết trồng và sử dụng nhiều loại đậu trong đó có đậu tương. Hiện nay, đậu tương được coi là một cây trồng nông nghiệp quan trọng, chỉ đứng sau lúa và ngô. Tuy nhiên, diện tích gieo trồng cũng như năng suất đậu tương của nước ta còn rất hạn chế. Diện tích gieo trồng chỉ dao động trong khoảng vài trăm nghìn ha, năng suất trung bình chỉ bằng khoảng 57% năng suất đậu tương bình quân trên toàn thế giới. Nước ta nằm trong khu vực khí hậu có tiềm năng sản xuất đậu tương cho năng suất cao nhất trên toàn cầu [2]. Tuy nhiên, địa hình nước ta khá 5 phức tạp, 3/4 là đồi núi, diện tích đất canh tác chỉ chiếm 21% tổng diện tích, trong đó diện tích đất màu mỡ không nhiều, diện tích đất bị nhiễm mặn khá lớn (ước tính có khoảng 54 triệu ha đất đai ở Đông Nam Á và Việt Nam bị nhiễm mặn). Ở những vùng đất này, áp lực thẩm thấu rất lớn, làm cho cây trồng khó hút được nước, nên thường không sinh trưởng và phát triển bình thường được. Do đó, việc lựa chọn được những giống cây trồng có khả năng chống chịu tốt và cho năng suất cao trên những vùng đất này gặp rất nhiều khó khăn. Vì vậy, nghiên cứu khả năng chống chịu của cây trồng nói chung và đậu tương nói riêng là một việc làm có ý nghĩa quan trọng trong sản xuất nông nghiệp ở Việt Nam. Điều đó không chỉ góp phần làm tăng năng suất cây trồng mà còn có thể mở rộng được diện tích đất canh tác nông nghiệp ở nước ta. Khả năng chống chịu của cây trồng trong điều kiện khắc nghiệt đã và đang được các nhà khoa học trong và ngoài nước quan tâm nghiên cứu. Trên cơ sở tính mẫn cảm của các loại cây trồng khác nhau với điều kiện ngoại cảnh, trong từng giai đoạn nhất định, các nhà khoa học đã xác định được khả năng chống chịu ở một số cây trồng khác nhau: khả năng chịu nóng, chịu lạnh, chịu hạn, chịu mặn. Trong đó, khả năng chống chịu ở giai đoạn nảy mầm được đặc biệt quan tâm, bởi đây là giai đoạn đầu tiên, giai đoạn tạo tiền đề cho sự sinh trưởng và phát triển của cơ thể cây non mới. Trên đối tượng cây đậu tương, đã có một số nhà khoa học nghiên cứu như: Sheila A.Blackman, Miquel Ribas – Carbo, Finnegan…[29], [33] tìm hiểu ảnh hưởng của sự thiếu nước đến quá trình quang hợp, hô hấp, sinh trưởng. Ở Việt Nam, cũng có một số tác giả đã nghiên cứu về đậu tương như: Nguyễn Huy Hoàng, Trần Đình Long, Nguyễn Văn Mã, Trần Thị Phương 6 Liên…[7],[8], [9], [10], [11], [12], [13], [14] với các vấn đề đánh giá khả năng chịu hạn, quang hợp, chất lượng hạt, chọn tạo giống. Tuy nhiên, số lượng các công trình nghiên cứu về sự ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến cây đậu tương chưa nhiều. Và sự nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở việc đánh giá sự ảnh hưởng của một áp suất thẩm thấu nhất định. Cho đến nay vẫn chưa có công trình nghiên cứu nào đánh giá một cách tổng thể mức độ ảnh hưởng của các áp suất thẩm thấu nhau đến sự sinh trưởng của cây đậu tương. Xuất phát từ những lí do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến sự sinh trưởng và hàm lượng prolin của hạt đậu tương nảy mầm trong dung dịch đường saccarôzơ”. 2. Mục đích và nhiệm vụ nghiên cứu 2.1.Mục đích nghiên cứu Đánh giá được mức độ ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến khả năng sinh trưởng và prolin trong mầm đậu tương. 22. Nhiệm vụ nghiên cứu Xác định các chỉ tiêu sinh trưởng (tỉ lệ nảy mầm, chiều dài thân, rễ mầm, khối lượng tươi, khối lượng khô) và prolin của mầm đậu tương được gieo trong dung dịch đường có các áp suất thẩm thấu khác nhau. 3. Ý nghĩa lí luận và thực tiễn của đề tài - Bổ sung thêm nguồn tư liệu về nghiên cứu các chỉ tiêu sinh trưởng và hàm lượng prolin trong giai đoạn nảy mầm của đậu tương. - Bước đầu đánh giá được mức độ ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến sự sinh trưởng và hàm lượng prolin của đậu tương trong giai đoạn nảy mầm. - Bổ sung thêm nguồn tư liệu nghiên cứu, tạo cơ sở tiền đề để các nhà chọn tạo giống có thể lựa chọn được giống cây trồng thích hợp nhằm nâng 7 cao năng suất cây trồng nông nghiệp, mở rộng diện tích gieo trồng đậu tương trên các vùng đất nhiễm mặn. NỘI DUNG CHƯƠNG 1: CƠ SỞ LÍ LUẬN CỦA VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1. Vai trò của nước đối với thực vật Nước là một chất không thể thiếu trong cấu trúc của tế bào thực vật. Hàm lượng nước của đa số thực vật đạt từ 70 – 80%. Ở các loài rau, nước có thể chiếm 90% khối lượng tươi của cây. Còn ở một số cơ quan như hạt, bào tử thì chứa ít nước như vậy chúng duy trì được khả năng nảy mầm lâu hơn. Sự kết hợp của các phân tử nước và các yếu tố cấu trúc của tế bào quyết định độ bền vững, rắn chắc của mô, duy trì hình dạng cấu trúc của tế bào và toàn bộ cơ thể, tạo điều kiện thuận lợi cho các hoạt động sống của cây. Nước trực tiếp tham gia vào các hoạt động sinh lí, sinh hóa của thực vật, là môi trường cho các phản ứng hóa học diễn ra trong tế bào và cơ thể, là dung môi của nhiều chất, hầu hết các phản ứng hóa sinh trong tế bào thực vật đều xảy ra trong môi trường nước. Trong quá trình trao đổi chất và năng lượng, nước tham gia như một nguyên liệu. Trong quá trình quang hợp, nước cung cấp H+ để NADP+ thành NADPH thông qua phản ứng quang phân li nước. Nước tham gia vào nhiều phản ứng sinh hóa của quá trình hô hấp hiếu khí, sự thủy phân các hợp chất cao phân tử nhất thiết cần sự có mặt của nước. Chính vì vậy, chỉ cần giảm một lượng nước nhỏ trong tế bào cũng có thể gây nên những thay đổi đáng kể các hoạt động trao đổi chất. Từ đó, ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của cây. 8 Bên cạnh đó, nước còn có vai trò hiđrat. Nó được hấp phụ trên bề mặt các hạt keo (protein, axit nucleic) và trên bề mặt màng sinh học (màng sinh chất, màng không bào, màng các bào quan) tạo thành lớp nước mỏng bảo vệ cho các cấu trúc sống của tế bào. Nước còn có vai trò quan trọng trong việc điều hòa và ổn định nhiệt độ của lá giúp quá trình sinh lí, sinh hóa của cơ thể diễn ra bình thường trong điều kiện nhiệt độ cao. Do nước có tỷ nhiệt cao và có thể bay hơi trong bất kỳ nhiệt độ nào kể cả nhiệt độ dưới 00C. Khi thiếu nước cây thường thay đổi về hình thái, mô mất sức căng, cây bị héo, tế bào giảm hàm lượng nước tự do, màng sinh chất chuyển từ sol sang gel, tính thấm của tế bào rễ thay đổi, hoạt động của enzim thủy phân giảm mạnh, sự tổng hợp ADN bị giảm sút, thậm chí bị phân giải. Nhiều khi các phản ứng xảy ra trong điều kiện thiếu ôxi do lỗ khí đóng dẫn tới việc hình thành nhiều sản phẩm độc như: axit lactic, etanol, axetalđehit, amoniac,… và tế bào giảm khả năng tích lũy ATP. Ngoài ra, nước còn góp phần tích cực trong việc đảm bảo mối liên hệ khăng khít giữa cơ thể với môi trường. Sự thiếu nước trong cây làm cho lỗ khí đóng, làm giảm lượng CO2 xâm nhập vào lá khiến cho hoạt động quang hợp giảm sút, hơn nữa sự thiếu nước còn giảm sự vận chuyển các sản phẩm quang hợp từ lá đến cơ quan, bộ phận khác của cây, giảm việc gắn Cacbon vào các hợp chất. Quá trình tổng hợp protein bị giảm còn do tăng cường phân giải axit nucleic khi bị thiếu nước. Đặc biệt, nếu bị thiếu nước đột ngột lại càng nguy hiểm hơn do chúng làm rối loạn quá trình trao đổi chất, gây hậu quả hết sức nghiêm trọng, có thể làm chết cây, ngay cả khi chưa bị héo hoàn toàn. Nhu cầu nước của thực vật thay đổi tùy theo loài, tuỳ vào các giai đoạn sinh trưởng của cây. Và sự sinh trưởng phát triển của cây chỉ diễn ra bình thường khi được cung cấp đủ nước. 9 1.2. Vai trò của nước đối với sự nảy mầm của đậu tương Đậu tương cũng là một cây trồng có nhu cầu nước cao, trong cả quá trình sinh trưởng cây cần một lượng nước mưa vào khoảng 350 – 600 mm. Hệ số phân tán khoảng 600 – 1000 g nước/1 g chất khô. Trong quá trình sinh trưởng nhu cầu nước của cây tăng dần. Hàng loạt các chỉ tiêu sinh trưởng và năng suất như: chiều cao cây, số đốt, kích thước thân, số hoa, tỉ lệ đậu quả, số hạt và trọng lượng hạt…đều có tương quan với độ ẩm đất, đặc biệt là tỉ lệ nảy mầm. Nảy mầm là giai đoạn quan trọng trong chu trình sinh trưởng và phát triển của thực vật nói chung và đậu tương nói riêng. Quá trình nảy mầm diễn ra mạnh mẽ tạo cơ sở thuận lợi cho sự sinh trưởng và phát triển sau này của cây. Quá trình nảy mầm diễn ra với nhiều biến đổi sinh lí, sinh hóa trong hạt với tốc độ cao để chuẩn bị cho sự hình thành cây mới. Đậu tương là cây 2 lá mầm nên sự nảy mầm của hạt đậu tương cũng gồm các pha cơ bản sau: Pha trương hạt Pha hình thành và hoạt hóa enzim Pha tích lũy chất dinh dưỡng Pha động viên chất dinh dưỡng và xác định chất hữu cơ đặc trưng cho cơ thể trong giai đoạn nảy mầm. Sự nảy mầm bắt đầu bằng sự hấp thụ nước nhờ cơ chế hút trương của hạt làm hạt trương lên, hạt chuyển từ trạng thái ngủ nghỉ sang trạng thái sinh trưởng mạnh. Trong hạt, bắt đầu tăng tính thủy hóa của keo nguyên sinh chất, giảm tính ưa mỡ và độ nhớt của keo dẫn đến những biến đổi sâu sắc và đột ngột trong quá trình trao đổi chất của hạt liên quan đến sự nảy mầm. Đặc trưng nhất là sự tăng mạnh mẽ hoạt tính enzim thủy phân phân giải polisaccarit, protein và các chất phức tạp khác thành chất đơn giản, dẫn đến thay đổi hoạt động thẩm thấu. Các sản phẩm thủy phân này dùng làm nguyên 10 liệu cho quá trình hô hấp tăng lên mạnh mẽ của phôi hạt, vừa làm tăng áp suất thẩm thấu trong hạt giúp cho quá trình hút nước vào hạt nhanh chóng. Tiếp theo, là sự sinh trưởng của phôi. Khi hạt nảy mầm phôi bắt đầu sinh trưởng. Đầu tiên, rễ mầm nhô ra để cố định cây hút nước và các chất hòa tan. Trụ dưới lá mầm duỗi ra trước khi cành bắt đầu sinh trưởng. Sau đó các lá mầm được đẩy lên mặt đất nhờ trụ dưới lá mầm. Giai đoạn nảy mầm của hạt đặc biệt mẫn cảm đối với sự thiếu nước. Hạt khô có hàm lượng nước khoảng 10 – 14% và chỉ bắt đầu nảy mầm khi hút được một lượng nước bằng 50 – 70% khối lượng của hạt [24]. Trong giai đoạn này sự sinh trưởng phát triển của mầm dựa trên nguồn dinh dưỡng dự trữ của hạt và phụ thuộc nhiều vào nhiệt độ và độ ẩm của môi trường. Nếu hạt không được cung cấp đủ lượng nước cần thiết thì các enzim thuỷ phân không được hoạt hóa, các quá trình sinh lí, sinh hóa cần thiết cho sự nảy mầm không được diễn ra bình thường. Do đó ảnh hưởng rất lớn tới khả năng nảy mầm của hạt. Và một trong những nguyên nhân dẫn tới sự thiếu nước này là do áp suất thẩm thấu của môi trường quá cao làm hạt không hút đủ lượng nước cần thiết cho sự nảy mầm. 1.3. Prolin và vai trò của prolin đối với thực vật 1.3.1. Bản chất hóa học của prolin Prolin hay α – piroliodin có công thức cấu tạo: COOH H2N C H2C CH2 CH2 11 H Trong phân tử prolin chứa piroliodin được tạo thành do sự kết hợp của nhóm amin bậc 1 với mạch bên, do đó prolin là một axit amin chứa nhóm amin bậc 2. Vì vậy, prolin còn được gọi là iminoaxit [32]. Prolin là một amino axit ưa nước, được tổng hợp từ glutamic bởi enzim chìa khóa là delta 1– pyrroline – 5–carboxylate synthetase (P5CS) [27]. 1.3.2. Vai trò của prolin Prolin là một trong những chất thuộc nhóm có khối lượng phân tử nhỏ và được xem là chất có khả năng tạo áp suất thẩm thấu cao, bên cạnh đó còn có nhóm hợp chất amon bậc 4 và nhóm hợp chất sulfonium 3 – dimethylsulfonio propionate (DMSP) [32] cũng là nhóm có khả năng tạo áp suất thẩm thấu cao và chúng đều là dẫn xuất của các tiền chất axit amin. Các chất này có cùng một tính chất là không tích điện ở pH trung tính và có khả năng tan tốt trong nước mà lại không gây ra sự biến đổi pH. Hơn nữa, khi ở nồng độ cao chúng rất ít hoặc không ảnh hưởng tới sự tương tác giữa các đại phân tử hoà tan [32]. Các chất này được xem là đóng vai trò then chốt trong sự điều chỉnh áp suất thẩm thấu ở tế bào chất của tế bào thực vật. Và prolin cũng có thể có chức năng như protein thẩm thấu, ưa nước và giống như một chất thu nhận hyđroxyl. Khi nghiên cứu chức năng sinh học của prolin, biểu hiện hình thái và chống chịu áp lực thẩm thấu, Nanjo và cộng sự đã phát hiện: những cây bị đột biến về hình dạng (có sự bất bình thường về biểu bì, tế bào mô mềm và hệ mạch) có hàm lượng P5CS thấp, rất mẫn cảm với áp lực thẩm thấu. Nhưng những sự biến đổi kiểu hình đó có thể ức chế được bằng cách tăng cường hàm lượng prolin ngoại bào [31]. Theo Wyn Jones (1977) những chất được coi là tác nhân cạnh tranh thẩm thấu, trong đó đáng kể nhất là prolin, được xem như đóng vai trò chủ 12 đạo trong việc thích ứng thẩm thấu tế bào chất của thực vật, nhằm phản ứng lại áp lực thẩm thấu. Khi bị tác động bởi áp suất thẩm thấu thì sự tích luỹ prolin có thể tăng từ 10 - 100 lần [26]. Kết quả nhiều nghiên cứu khác cũng cho thấy sự tích luỹ prolin là một phản ứng thông thường của thực vật sống ở nơi có nồng độ muối cao (Stewart và Lee 1974; Treichel 1975; Briens và Larther 1982) và trong mô lá, mô phân sinh chồi của thực vật chịu áp lực nước (Barnet và Taylor 1996; Boggess 1976), trong vùng đỉnh của thực vật sống ở nơi có thế năng nước thấp (Voet berg và Sharp 1991) [32]. Nghiên cứu sự thay đổi hàm lượng prolin và axit abxisic của những đối tượng mẫn cảm và chống chịu điều kiện áp suất thẩm thấu của Zheng YiZhi và Li Tian cũng khẳng định rằng: phản ứng với áp lực nước và nồng độ muối, cây đậu tương tích luỹ hàm lượng prolin cao, đó được xem như phản ứng thích nghi với điều kiện khô hạn [35]. Theo những cách thức khác nhau, những nghiên cứu ứng dụng công nghệ gen với tính chống chịu các điều kiện bất lợi về nước, đang tập trung vào nhóm gen thuộc chu trình tổng hợp prolin. Các gen này mã hoá cho enzim P5CS và P5CR (enzim tham gia vào quá trình tổng hợp prolin) đã được Kishor chuyển thành công vào thuốc lá và nhận kết quả tốt, lượng prolin tăng từ 8 - 10 lần so với cây đối chứng [27]. 1.4. Tình hình nghiên cứu về cây đậu tương, prolin và sự ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đối với thực vật Đậu tương là một cây trồng nông nghiệp phổ biến, có giá trị cao cả về mặt dinh dưỡng và kinh tế, nên đã được các nhà khoa học quan tâm, nghiên cứu từ rất sớm. Các công trình nghiên cứu đầu tiên, trên thế giới về cây đậu tương, được biết đến vào khoảng giữa thế kỉ XVII, trong đó hướng nghiên cứu chủ yếu tập trung vào một số vấn đề như: sự sinh trưởng, đặc tính 13 nông sinh học…Trong những năm gần đây, nhờ sự phát triển của khoa học công nghệ, cùng với sự ra đời của các trang thiết bị hiện đại, các nhà khoa học có điều kiện đi sâu tìm hiểu các cơ chế sinh lí liên quan đến khả năng chống chịu của thực vật nói chung và cây đậu tương nói riêng, đặc biệt là khả năng chịu hạn được quan tâm nghiên cứu khá nhiều như: ảnh hưởng của sự thiếu nước đến sự phát triển của hạt [34], quá trình quang hợp [31], quá trình hô hấp… Một số cơ chế hóa sinh và sinh học phân tử cũng đã được nghiên cứu như: xác định vị trí của gen liên quan đến việc điều chỉnh áp suất thẩm thấu (Maitra N, Cushman J, C 1994…), gen tổng hợp một số chất hình thành và tích lũy nhiều khi gặp hạn hán: prolin, nhóm amin bậc 4, một số đường… [15], [21]. Sheila A. Blackman và cộng sự năm 1992 [33] đã nghiên cứu protein sốc nhiệt (HSP – heat shock protein) trong phôi hạt đậu tương đang chín ở điều kiện bình thường và dưới áp suất thẩm thấu cao. Kết quả nghiên cứu khẳng định HSP tăng lên trong quá trình hình thành hạt và giảm khi hạt nảy mầm. HSP hỗ trợ bảo vệ tế bào vào thời điểm oligosaccarit chưa được tổng hợp đủ lượng để thực hiện chức năng. Nhiều nghiên cứu khẳng định có mối liên quan giữa sự tích lũy axit abxisic (ABA) với sự tăng hàm lượng các chất điều chỉnh thẩm thấu khi gặp hạn, các chất này thường là protein hoặc axit amin được điều khiển tổng hợp bởi các gen RAB (responsive to abscisic acid). Bên cạnh đó, cũng có một số chất có khả năng điều chỉnh thẩm thấu không liên quan đến sự tích lũy ABA, sự tăng hàm lượng của chúng độc lập với sự tích lũy ABA. Ở Việt Nam, vào khoảng những năm 60, 70 của thế kỉ trước đậu tương mới bắt đầu được quan tâm nghiên cứu, nội dung nghiên cứu chủ yếu tập trung vào: giống, thời vụ và phân bón. Thí nghiệm tại Trại Sông Lô năm 1953 do Bùi Huy Đáp chỉ đạo được xem là thí nghiệm chính quy đầu tiên về cây 14 đậu tương ở Việt Nam. Về sau, có nhiều công trình nghiên cứu của các tác giả như: Nguyễn Danh Đông, Trần Đình Long, Trần Thượng Tuấn, Trần Thị Lệ Nguyên, Nguyễn Đăng Khoa, chủ yếu nghiên cứu về quá trình sinh trưởng của rễ, thân, hoa, quả của đậu tương [1]. Trong những năm gần đây, số lượng các công trình nghiên cứu về cây đậu tương tăng lên nhiều. Trong đó, hướng nghiên cứu tập trung chủ yếu vào tính chống chịu của cây, đặc biệt là tính chịu hạn: nghiên cứu đặc tính di truyền và khả năng chịu hạn ở con lai đậu tương F1 (Nguyễn Huy Hoàng) [7]. So sánh động thái hình thành nốt sần ở một số giống, dòng đậu tương chịu hạn [9]. Nghiên cứu thành phần điện di protein của một số giống đậu tương có khả năng chịu hạn khác nhau (Trần Thị Phương Liên) [11], khả năng chịu hạn của một số giống đậu tương năng suất cao trên đất bạc màu (Nguyễn Văn Mã) [12], một số chỉ tiêu sinh lí, sinh hóa của cây đậu tương trong điều kiện gây hạn (Nguyễn Văn Mã, Phan Hồng Quân) [14]… Kết quả nghiên cứu đã được ứng dụng trong sản xuất và chọn tạo được nhiều giống đậu tương mới có năng suất cao, phẩm chất tốt, phù hợp với điều kiện khí hậu, canh tác của Việt Nam. Tại Trung tâm Nghiên cứu và Thực nghiệm đậu đỗ, Viện Khoa học Kĩ thuật Nông nghiệp Việt Nam, nhiều giống đậu tương nhập nội và giống địa phương đã được đánh giá khả năng chịu hạn, chịu nóng bằng một số phương pháp: cho hạt nảy mầm trong dung dịch đường saccarôzơ, phương pháp dùng nhiệt độ cao… [7], [8], [9]. Kết quả là, từ trên 1000 mẫu giống nhập nội đã phân lập được 68 mẫu giống chịu hạn tổng hợp, 14 giống vừa chịu nóng, vừa chịu hạn tốt… Về sự ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu, đã có một số công trình nghiên cứu trên các đối tượng động vật như: lưỡng cư, bò sát… Trên thực vật, các nhà khoa học cũng đã đánh giá được sự ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đối 15 với khả năng hút nước, sự sinh trưởng của bộ rễ, thân và lá. Trong nuôi cấy mô: ảnh hưởng của manitol đến tích lũy prolin và glucose liên quan đến khả năng điều chỉnh thẩm thấu trong nuôi cấy callus cà chua [5]. Trên đối tượng đậu tương cũng đã có một số tác giả nghiên cứu về sự ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu, nhưng sự nghiên cứu mới chỉ dừng lại việc đánh giá sự ảnh hưởng của một áp suất thẩm thấu nhất định (7 hoặc 9 atm), còn việc đánh giá một cách tổng thể mức độ ảnh hưởng của một loạt các áp suất thẩm thấu khác nhau từ thấp đến cao thì hiện nay vẫn chưa có công trình nghiên cứu nào được công bố. Về hàm lượng prolin, trên thế giới đã có khá nhiều công trình nghiên cứu về prolin, tập trung chủ yếu vào một số vấn đề như: sự biến đổi hàm lượng prolin ở điều kiện gây hạn, bản chất hóa sinh của prolin, việc tìm hiểu cơ chế của quá trình tổng hợp prolin cũng như các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình này [26], [27], [31], [32], [35]… Ở nước ta, việc nghiên cứu các chỉ tiêu sinh hóa thông qua việc đánh giá hàm lượng prolin chưa phổ biến trên nhiều đối tượng thực vật. Mới chỉ có một số công trình nghiên cứu về sự biến đổi hàm lượng prolin trên một số đối tượng như: cà chua [5], đậu xanh [6], lúa [15]. Đến nay, số lượng các công trình nghiên cứu về sự biến đổi hàm lượng prolin trên đối tượng cây đậu tương chưa nhiều. 16 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu Chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên đối tượng là 2 giống đậu tương DT96 và AK02 do Viện Khoa học Kĩ thuật Nông nghiệp Việt Nam cung cấp. - DT96: Giống được tạo ra từ tổ hợp lai giữa 2 giống đậu tương DT84 và DT90, giống được công nhận chính thức năm 2004 [16]. Thời gian sinh trưởng là: 90 - 95 ngày. Thân có màu nâu nhạt, lá màu xanh nhạt, hoa tím vỏ quả xám. Hạt màu vàng, rốn hạt màu trắng. Năng suất: 1,8 - 3,2 tấn/ha. Khối lượng 1000 hạt: 190 - 220 g. Giống chịu được nóng, lạnh và chịu hạn tốt. Gieo trồng được 3 vụ trong năm. Vùng đất gieo trồng thích hợp: tất cả các loại đất và vùng sinh thái có trồng đậu tương, thích nghi tốt với vùng núi cao [18]. - AK02: Giống được tạo ra bằng phương pháp chọn lọc cá thể từ giống đậu tương vàng Mường Khương. Được công nhận giống chính thức năm 1987 [20]. Thời gian sinh trưởng là: 75 - 85 ngày. Hạt dạng bầu dục, hơi tròn, màu vàng nhạt. Năng suất trung bình: 1,5-1,6 tấn/ha. Khối lượng 1000 hạt là: 100 – 120 g. Chịu hạn kém. Trồng được 3 vụ trong năm. Vùng đất gieo trồng thích hợp: Đồng bằng, trung du và miền núi phía bắc. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp xác định các áp suất thẩm thấu Áp suất thẩm thấu (P) được xác định theo phương pháp của Schardakov & Grodzinsk (1981) và tính giá trị bằng phương trình Van– Hoff: P = i.C.R.T Trong đó: P: Áp suất thẩm thấu (atm) C: Nồng độ mol/l của dung dịch (M) R: Hằng số khí (R=0,0821) 17 T: Nhiệt độ tuyệt đối (K) i:Hệ số điều chỉnh sự phân ly (Đối với dung dịch saccarozơ i= 1) Sau đó, chúng tôi tiến hành thử khả năng nảy mầm của đậu tương ở các áp suất thẩm thấu khác nhau. Kết quả thử nghiệm cho thấy đậu tương chỉ có khả năng nảy mầm trong môi trường có các áp suất thẩm thấu từ 1 – 11 atm, khi áp suất thẩm thấu ≥ 12 atm thì đậu tương không còn khả năng nảy mầm nữa. Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành các thí nghiệm nghiên cứu sự sinh trưởng và prolin của đậu tương nảy mầm trong dung dịch đường với 12 áp suất thẩm thấu khác nhau từ 1 đến 12 atm. 2.2.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm Chúng tôi tiến hành làm các thí nghiệm tại Trung tâm Hỗ trợ nghiên cứu khoa học và Chuyển giao công nghệ Trường ĐHSP Hà Nội 2. Để xác định các chỉ tiêu nghiên cứu, chúng tôi tiến hành thí nghiệm gieo hạt trong dung dịch đường theo phương pháp xác định khả năng chịu hạn của Volcova [34]. Hạt đậu tương được gieo trên các khay nhựa, đánh số thứ tự, có lót giấy thấm và chia thành 2 lô: lô thí nghiệm được tưới bằng dung dịch đường saccarôzơ đã được pha tương ứng với các áp suất thẩm thấu từ 1 đến 12 atm, lô đối chứng được tưới bằng nước cất. Khi bắt đầu gieo, mỗi khay được tưới một lượng nước hoặc dung dịch đường vừa đủ, làm ướt đều giấy thấm và tương đương nhau ở tất cả các mẫu. Sau đó, mỗi ngày bổ sung thêm ở mỗi mẫu 50 ml nước hoặc dung dịch đường. Vì hạt nảy mầm trong dung dịch đường rất dễ bị nhiễm khuẩn nên hạt giống và các dụng cụ đều được khử trùng trước khi gieo. Hạt giống: chọn hạt giống đều, khỏe, có phôi sáng và không sâu mọt. Khay nhựa, bình, tay…được rửa sạch, sau đó khử trùng bằng cồn. 18 Các dụng cụ thí nghiệm khác: Cốc thủy tinh, ống nghiệm, panh, kẹp,…rửa sạch, sấy ở 106º trong 10 phút. Dung dịch đường sau khi pha được hấp khử trùng ở 110ºC trong 15 phút, sau đó bổ sung thêm thuốc kháng sinh nistatin để chống nấm (1 viên/1lit dung dịch) Các mẫu thí nghiệm được đặt trong buồng cấy vô trùng. 2.2.3. Phương pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu 2.2.3.1. Xác định tỉ lệ nảy mầm Đếm số hạt nảy mầm trong các mẫu từ khi xuất hiện hạt nảy mầm đầu tiên cho đến khi không còn có thêm hạt nảy mầm mới. Hạt được coi là đã nảy mầm khi có chiều dài rễ mầm đạt từ 2 mm trở lên [32]. Tỉ lệ nảy mầm được tính theo công thức: T= a .100 b Trong đó: T: tỉ lệ nảy mầm a: số hạt nảy mầm b: tổng số hạt đem gieo 2.2.3.2. Xác định các chỉ tiêu sinh trưởng của mầm - Chiều dài thân, rễ mầm (mm): sử dụng thước có chia đơn vị đến mm để đo chiều dài của thân mầm, rễ mầm vào các ngày 3, 5, 7 sau khi hạt nảy mầm. - Khối lượng tươi của mầm (g/mầm): mầm được rửa sạch bằng nước cất, sau đó cân khối lượng của mầm vào ngày đầu tiên, ngày thứ 7 sau khi hạt nảy mầm. - Khối lượng khô của mầm (g/mầm): mầm được rửa sạch bằng nước cất, đem sấy khô ở 1050C cho đến khi khối lượng không đổi (3h). Sau đó, cân 19 khối lượng khô, thời gian cân vào ngày đầu tiên và ngày thứ 7 sau khi hạt nảy mầm. 2.2.3.3. Phân tích hàm lượng prolin Hàm lượng prolin của mầm được xác định theo phương pháp của Bates và cộng sự (1973) [22] đã được Đinh Thị Phòng cải tiến (2001) [15] Cân 0,5 g mầm/1 mẫu, nghiền kĩ, thêm 10ml dung dịch axit sulfosalicylic 3% li tâm 4000 vòng trong 30 phút, lọc lấy dịch trong. Lấy 2 ml dịch chiết cho vào bình (hoặc ống nghiệm) thêm 2 ml axit axetic và 2 ml dung dịch ninhyđrin (dung dịch này gồm 30 ml dung dịch axit axetic + 1,25 g nyhiđrin), đậy kín. Đem ủ trong nước nóng 1000C trong 1h. Sau đó ủ đá 5 phút. Tiếp theo, bổ sung vào bình phản ứng 4 ml toluen, lắc đều. Lấy phần dịch mầu hồng ở bên trên, đo mật độ quang học ở bước sóng 520 nm trên máy quang phổ UV - Spectrophotometer. Tất cả các α - axit amin của protein đều phản ứng màu với ninhyđrin tạo hợp chất màu xanh tím, riêng imino axit như prolin tạo thành màu vàng với cơ chế phản ứng phức tạp. Tính chất này có cực đại hấp thụ ở bước sóng λ= 520 nm. Hàm lượng axit amin prolin được tính theo công thức sau: (công thức suy ra từ việc lập đường chuẩn prolin) (R2= 1) Y= 0,0179X + 0,095 Trong đó : Y: Hàm lượng prolin (mg/l) X: Giá trị mật độ quang học đo được ở bước sóng 520nm R2: Hệ số tương quan Sau đó hàm lượng prolin được đổi ra đơn vị mg/g theo công thức: A= Y .V P.1000 20