Tài liệu Tối ưu hóa môi trường dinh dưỡng nuôi vi tảo thalassiosira weissflogii (grunow) fryxell hasle 1977

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG -------- KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TỐI ƯU HÓA MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG NUÔI VI TẢO THALASSIOSIRA WEISSFLOGII (GRUNOW) FRYXELL & HASLE 1977 HOÀNG THỊ MỸ DUYÊN Đà Nẵng, năm 2022 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG -------- KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TỐI ƯU HÓA MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG NUÔI VI TẢO THALASSIOSIRA WEISSFLOGII (GRUNOW) FRYXELL & HASLE 1977 Ngành: Công nghệ sinh học Khóa: 2018-2022 Sinh viên: Hoàng Thị Mỹ Duyên Người hướng dẫn: TS. Trịnh Đăng Mậu Đà Nẵng, năm 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan các dữ liệu trình bày trong khóa luận này là trung thực. Đây là kết quả nghiên cứu của tác giả và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác trước đây. Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm nếu vi phạm bất kỳ quy định nào về đạo đức khoa học. Đà Nẵng, tháng 5 năm 2022 Tác giả luận văn i LỜI CẢM ƠN Ðể có thể hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy TS. Trịnh Đăng Mậu giảng viên khoa Sinh - Môi trường, trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng đã hướng dẫn, trực tiếp truyền đạt kinh nghiệm quý báu và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô Khoa Sinh - Môi trường - Đại học Sư Phạm - Đại học Đà Nẵng đã tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Tôi xin chân thành cảm ơn anh Phan Nhật Trường, anh Đinh Công Duy Hiệu, chị Trần Thị Tường Vy và các thành viên trong nhóm nghiên cứu ABR đã hỗ trợ và động viên tôi trong quá trình hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Cảm ơn các bạn ở tập thể lớp 18CNSH đã luôn đồng hành, hỗ trợ và nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã luôn giúp đỡ động viên tôi, tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi có thể hoàn thành khóa luận này . Xin chân thành cảm ơn! Sinh viên thực hiện ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................................. i LỜI CẢM ƠN ......................................................................................................................ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................................... v DANH MỤC BẢNG .......................................................................................................... vi DANH MỤC HÌNH ẢNH .................................................................................................vii TÓM TẮT........................................................................................................................ viii MỞ ĐẦU ............................................................................................................................. 1 1. Tính cấp thiết của đề tài................................................................................................... 1 2. Mục tiêu đề tài ................................................................................................................. 2 3. Ý nghĩa của đề tài ............................................................................................................ 3 3.1. Ý nghĩa khoa học .......................................................................................................... 3 3.2. Ý nghĩa thực tiễn .......................................................................................................... 3 4. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................................... 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................. 4 1.1. Giới thiệu chung về tảo Thalassiosira weissflogii (Grunow) Fryxell & Hasle 1977 ... 4 1.1.1.Hệ thống phân loại và phân bố ................................................................................... 4 1.1.2. Đặc điểm hình thái cấu tạo ........................................................................................ 4 1.1.3. Đặc điểm sinh sản ...................................................................................................... 5 1.2. Tổng quan về hấp thụ và trao đổi Nitơ, Photpho và Silic trong tảo cát ....................... 5 1.2.1. Cơ chế hình thành lipid và protein ............................................................................ 5 1.2.2. Vai trò của lipid và protein đối với vi tảo Thalassiosira weissflogii và trong nuôi trồng thủy sản ...................................................................................................................... 7 a. Vai trò của lipid và protein đối với vi tảo Thalassiosira weissflogii ............................... 7 b. Vai trò của lipid và protein trong nuôi trồng thủy sản .................................................... 7 1.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước .................................................................. 8 1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ............................................................................ 8 1.3.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam ............................................................................. 9 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................... 11 2.1. Vật liệu ....................................................................................................................... 11 2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................................ 11 2.2.1. Bố trí thí nghiệm ...................................................................................................... 11 a. Nghiên cứu ảnh hưởng của Nitơ, Photpho, Silic đến sinh trưởng và tích lũy các hợp chất của vi tảo Thalassiosira weissflogii. .......................................................................... 11 b. Tối ưu hóa môi trường nuôi vi tảo Thalassiosira weissflogii bằng phương pháp bề mặt đáp ứng (Response surface method - RSM) ...................................................................... 12 iii 2.2.2. Phương pháp xác định tốc độ sinh trưởng ............................................................... 12 2.2.3. Phương pháp xác định nồng độ chlorophyll a ......................................................... 12 2.2.4. Phương pháp định lượng lipid tổng số .................................................................... 13 2.2.5. Phương pháp định lượng protein tổng số ................................................................ 14 2.2.6. Phương pháp bề mặt đáp ứng .................................................................................. 15 2.2.7. Phương pháp xử lý số liệu ....................................................................................... 16 2.2.8. Thành phần môi trường ........................................................................................... 16 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................... 18 3.1. Ảnh hưởng của nitơ đến sinh trưởng và tích lũy các hợp chất của vi tảo T. weissflogii ........................................................................................................................................... 18 3.1.1. Ảnh hưởng của nitơ đến sinh trưởng của vi tảo T. weissflogii ................................ 18 3.1.2. Ảnh hưởng của nitơ đến nồng độ chlorophyll a, protein và lipid trong vi tảo T. weissflogii. ......................................................................................................................... 20 3.2. Ảnh hưởng của photpho đến sinh trưởng và tích lũy các hợp chất của vi tảo T. weissflogii .......................................................................................................................... 21 3.2.1. Ảnh hưởng của photpho đến sinh trưởng của vi tảo T. weissflogii ......................... 21 3.2.2. Ảnh hưởng của photpho đến nồng độ chlorophyll a, protein và lipid trong vi tảo T. weissflogii .......................................................................................................................... 23 3.3. Ảnh hưởng của Silic đến sinh trưởng và tích lũy các hợp chất của vi tảo T. weissflogii .......................................................................................................................... 24 3.3.1. Ảnh hưởng của Silic đến sinh trưởng của vi tảo T. weissflogii ............................... 24 3.3.2. Ảnh hưởng của Silic đến nồng độ chlorophyll a, protein và lipid trong vi tảo T. weissflogii .......................................................................................................................... 26 3.4. Tối ưu hóa tỷ lệ nồng độ Nitơ, Photpho, Silic trong môi trường nuôi cấy vi tảo T. weissflogii .......................................................................................................................... 27 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................................... 32 1. Kết luận.......................................................................................................................... 32 2. Kiến nghị ....................................................................................................................... 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 33 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT T. weissflogii Thalassiosira weissflogii N Nitơ P Photpho Si Silic TAGs Triacylglycerols FA Acid béo LPA Lysophosphatidic PA Axit phosphatidic BBD Box-Behnken Design SPV Sulpho-phospho-vanillin RSM Response surface methodology v DANH MỤC BẢNG Bảng Tiêu đề bảng Trang 2.1 Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ N, P, Si đến sinh trưởng và tích lũy các hợp chất của vi tảo T. weissflogii 11 2 2.2 Nồng độ các chất trong xây dựng đường chuẩn protein theo biure 15 3 2.3 Thành phần môi trường ESAW 17 4 3.1 Các nghiệm thức trong thí nghiệm tối ưu hóa 27 3.2 Thể hiện giá trị ước tính và mức độ ý nghĩa của các hằng số hồi quy trong mô hình dự đoán tốc độ sinh trưởng của vi tảo T. weissflogii dựa trên các biến dinh dưỡng của môi trường là N, P và Si 28 STT 1 5 vi DANH MỤC HÌNH ẢNH Tiêu đề Số trang STT Hình 1 1.1 Hình thái ngoài loài vi tảo Thalassiosira weissflogii 5 2 2.1 Quy trình tách chiết chlorophyll a 13 3 3.1 Tốc độ sinh trưởng của vi tảo T. weissflogii ở các nghiệm thức N khác nhau 18 4 3.2 Đường cong sinh trưởng vi tảo T. weissflogii ở các nồng độ N khác nhau. 19 5 3.3 Nồng độ chlorophyll a (a), protein (b) và lipid (c) trong tế bào ở các nồng độ N khác nhau. 20 6 3.4 Tốc độ sinh trưởng của vi tảo T. weissflogii ở các nồng độ P khác nhau 21 7 3.5 Đường cong sinh trưởng vi tảo T. weissflogii ở các nồng độ P khác nhau 22 8 3.6 Nồng độ chlorophyll a (a), protein (b) và lipid (c) trong tế bào ở các nồng độ photpho khác nhau 23 9 3.7 Tốc độ sinh trưởng của vi tảo T. weissflogii ở các nghiệm thức Silic 24 10 3.8 Đường cong sinh trưởng vi tảo T. weissflogii ở các nồng độ Si khác nhau 25 11 3.9 Nồng độ chlorophyll a (a), protein (b), lipid (c) trong tế bào ở các nồng độ Silic khác nhau 26 3.10 Đường đồng mức (a), (b), (c) và mô hình đáp ứng bề mặt 3D (d), (e), (f) biểu diễn sự phụ thuộc của tốc độ sinh trưởng của vi tảo T. weissflogii bởi các biến độc lập: nồng độ N, P, Si bằng phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM) 30 12 vii TÓM TẮT Vi tảo Thalassiosira weissflogii là đối tượng đang được quan tâm nhờ kích thước nhỏ và giàu dinh dưỡng. Việc sản xuất sinh khối loài vi tảo này có ý nghĩa quan trọng và không thể thể thiếu trong quá trình sản xuất tôm giống. Nghiên cứu này khảo sát ảnh hưởng đồng thời của ba yếu tố là Nitơ, Photpho và Silic đến sinh trưởng và tích lũy các hợp chất của vi tảo Thalassiosira weissflogii nhằm tìm ra nồng độ tối ưu cho năng suất và nồng độ dinh dưỡng cao. Kết quả nghiên cứu cho thấy Tốc độ tăng trưởng tối đa của T. weissflogii được ghi nhận lần lượt là 0,21/ngày trong môi trường ESAW chứa 7,68 mgN/L; 0,28 ± 0,02 /ngày trong môi trường chứa 0,7 mgP/L và 0,25 ± 0,01/ngày trong môi trường chứa 8,88 mgSi/L. Nồng độ chlorophyll a tích lũy cao nhất khi nuôi trong môi trường ESAW chứa 0,7 mgP/L, nồng độ protein tích lũy cao nhất khi nuôi trong môi trường chứa 2,96 mgSi/L và nồng độ lipid tích lũy cao nhất khi nuôi trong môi trường chứa 3,84 mgN/L. Mô hình tối ưu hóa mô tả mối quan hệ giữa tốc độ sinh trưởng với các biến nồng độ N, P, Si được xây dựng bằng phương pháp bề mặt đáp ứng được dự đoán theo phương trình: Y (tốc độ sinh trưởng) = 0.2593 + 0.0303x1 +0.0053x2 + 0.0074x3 + 0.0139x1x2 - 0.0064 x1x3 + 0.0061x2x3 - 0.0165x12 - 0.0256 x22 - 0.0225 x32 với bộ điều kiện tối ưu là x1= 1,077, x2= 0,403 và x3=0,066, tương ứng với nồng độ N = 11,815 mg/L, nồng độ P = 0,841 mg/L và nồng độ Si = 9,173 mg/L. Với các giá trị này, tốc độ sinh trưởng tối đa được dự đoán đạt 0,276 /ngày. Từ khóa: Thalassiosira weissflogii, dinh dưỡng, chlorophyll a, protein, lipid, RSM. viii MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Tảo cát là một lớp đặc biệt của các sinh vật thủy sinh đơn bào, nhân chuẩn cực nhỏ, phát triển tự nhiên trong các vùng nước như sông, đại dương, hồ,... Chúng chuyển đổi ánh sáng mặt trời, nước và carbon dioxide (CO2) thành năng lượng sinh hóa bằng cách quang hợp và hóa tổng hợp (Cheirsilp & cs., 2020). Chúng có thể tích lũy một lượng đáng kể carbohydrate, protein, lipid, sắc tố so với các lớp vi tảo khác (Jensen & cs., 2019)). Tảo cát ngày càng thu hút sự chú ý vì tiềm năng của chúng trong việc sản xuất nhiều loại hợp chất có hoạt tính sinh học và hóa chất trong công nghiệp (Vinayak & cs., 2015). Ví dụ, tảo cát rất giàu sắc tố như chlorophyll, carotenoid, fucoxanthin, đã được ứng dụng rộng rãi làm thực phẩm bổ sung và thức ăn chăn nuôi, thành phần dược phẩm và mỹ phẩm, vitamin và các acid amin thiết yếu,... (Fu & cs., 2015; Vílchez & cs., 2011). Trong công nghệ nano, tảo cát được ứng dụng làm cảm biến và chẩn đoán hóa học, sinh học (Bismuto & cs., 2008); trong công nghiệp, tảo cát được ứng dụng trong sản xuất phân bón sinh học cố định nitơ, năng lượng tái tạo, sản xuất nhiên liệu lỏng, nguyên liệu thô,...(Bozarth & cs., 2009).Chính vì những ứng dụng to lớn mà vi tảo T. weissflogii mang lại cho nên nó đã được các nhà khoa học quan tâm và nghiên cứu. Các nghiên cứu trước đây cũng đã chứng minh rằng vi tảo T. weissflogii có tiềm năng lớn trong sản xuất diesel sinh học (d’Ippolito & cs., 2015). Thành phần sinh hóa thô của vi tảo chiếm 9095% trọng lượng khô của tế bào (gồm 30-55% protein, 10-30% carbohydrate, 10-25% lipid và 10-40% khoáng). Phần còn lại chủ yếu là acid nucleic (chiếm từ 5-20%) (Brown, 1991). Chính vì thế, tảo cát đặc biệt được chọn làm thức ăn cho ngành chăn nuôi thủy hải sản, điển hình là giống tảo cát T. weissflogii rất giàu dinh dưỡng, nồng độ DHA + EPA đạt 7,2 mg/mL (Brown & cs., 1989)..., cùng với kích thước nhỏ, loại vi tảo này trở thành một trong những loài vi tảo được ưa chuộng sử dụng trong các trại sản xuất giống cá biển, nhuyễn thể và ấu trùng tôm (Hasle và Fryxell, 1977; Kiatmetha & cs., 2011). Nghề nuôi các đối tượng thủy sản nước mặn, đặc biệt là tôm thẻ chân trắng đang ngày càng phát triển mạnh mẽ. Do đó, nhu cầu về con giống có chất lượng tốt và đảm bảo được số lượng là vấn đề đang được quan tâm. Trong sản xuất giống nhân tạo, thức ăn tự nhiên đóng vai trò rất quan trọng, nó ảnh hưởng đến tỷ lệ sống, sự sinh trưởng và phát 1 triển, chất lượng con giống trong ương nuôi ấu trùng. Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng vi tảo là loại thức ăn tươi sống đặc biệt tốt cho ấu trùng thủy sinh. Bên cạnh việc cung cấp đầy đủ các chất dinh dưỡng có giá trị như protein, lipid, carbohydrate, vi tảo còn là nguồn cung cấp các loại vitamin B1, B2, B6, B12, C, các loại vitamin tan trong mỡ như vitamin A, D, E và K và muối khoáng,...Ngoài vai trò làm thức ăn, vi tảo còn đóng vai trò điều hòa khí hòa tan trong nước, cân bằng độ đục và pH trong nước. Trong nuôi tảo nói chung, nguồn tảo giống, chất dinh dưỡng và điều kiện nuôi là những yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng và thành phần sinh hóa của tảo. Các thành phần dinh dưỡng đa lượng và vi lượng ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng của tảo, đặc biệt trong điều kiện nuôi với mật độ cao (Costa & cs., 2003). Trong các nguyên tố đa lượng thì nitơ (N) và photpho (P) có vai trò quan trọng hơn cả. N có vai trò trong thành phần và cấu trúc của protein, thành phần cấu tạo nên bộ máy quang hợp và hệ enzyme (Giordano, 2013). Thiếu hụt N là nguyên nhân làm giảm tốc lượng, sinh tổng hợp lipid, axit nucleic, DNA, RNA (Juneja & cs., 2013; Wang & cs., 2013). Ngoài ra, khả năng sinh trưởng của nhóm tảo cát còn phụ thuộc khá lớn vào nồng độ silic (Si) có trong môi trường vì nó tham gia vào quá trình hình thành thành tế bào độ sinh trưởng, sinh khối, nồng độ sắc tố, protein, lipid, vitamin,...(Cohen, 2002). P là chất dinh dưỡng không thể thiếu đối với vi tảo, P tham gia vào cấu trúc tế bào, có vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất của tế bào cũng như chuyển giao năng lượng. Hiện nay, vi tảo T. weissflogii được xem là một trong số những loài tảo dễ nuôi, đã được nghiên cứu và ứng dụng nuôi trên nhiều loại môi trường dinh dưỡng khác nhau nhưng hiệu quả chưa cao do năng suất sinh khối và giá trị dinh dưỡng thấp,.. Nguyên nhân do nguồn dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy chưa phù hợp,...Vấn đề đặt ra ở đây là trước hết phải nghiên cứu tìm ra được chế độ dinh dưỡng tối ưu để sản xuất vi tảo T. weissflogii cho năng suất và nồng độ dinh dưỡng cao. Nhận thấy được tiềm năng và giá trị kinh tế trong việc nuôi vi tảo này để phục vụ sản xuất giống thủy sản và xuất phát từ thực tiễn trên tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Tối ưu hóa môi trường dinh dưỡng nuôi vi tảo Thalassiosira weissflogii (Grunow) Fryxell và Hasle 1977”. 2. Mục tiêu đề tài Tìm ra được nồng độ N, P, Si tối ưu trong môi trường dinh dưỡng cho sinh trưởng và tích lũy các hợp chất của vi tảo Thalassiosira weissflogii. 2 3. Ý nghĩa của đề tài 3.1. Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học về ảnh hưởng của N, P, Si và nồng độ tối ưu của chúng trong môi trường dinh dưỡng nuôi cấy vi tảo Thalassiosira weissflogii làm cơ sở cho các nghiên cứu sau này. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả của đề tài là cơ sở để xây dựng quy trình nhân nuôi, bảo quản và cải tiến giống vi tảo Thalassiosira weissflogii cho năng suất và nồng độ dinh dưỡng cao ứng dụng làm thức ăn trong nuôi trồng thủy sản và sản xuất các hợp chất sinh học. 4. Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu ảnh hưởng của N đến sinh trưởng và tích lũy các hợp chất của vi tảo Thalassiosira weissflogii. - Nghiên cứu ảnh hưởng của P đến sinh trưởng và tích lũy các hợp chất của vi tảo Thalassiosira weissflogii. - Nghiên cứu ảnh hưởng của Si đến sinh trưởng và tích lũy các hợp chất của vi tảo Thalassiosira weissflogii. - Tối ưu hóa tỷ lệ nồng độ N, P, Si trong môi trường nuôi cấy vi tảo Thalassiosira weissflogii. 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu chung về tảo Thalassiosira weissflogii (Grunow) Fryxell & Hasle 1977 1.1.1.Hệ thống phân loại và phân bố Giới: Plantae (Thực vật) Ngành: Bacillariophyta Lớp: Mediophyceae Bộ: Thalassiosirales Họ: Thalassiosiraceae (Lebour 1930) Hasle 1973 Chi: Thalassiosira (Cleve 1873) Hasle 1973 Loài: Thalassiosira weissflogii (Grunow) Fryxell & Hasle 1977 Thalassiosira weissflogii phân bố rộng rãi trong môi trường nước mặn, lợ, ngọt, trên đất đá, trong các thủy vực chúng có thể sống trôi nổi hoặc ở đáy. Loài tảo này chủ yếu sống trong môi trường nước mặn và đặc biệt là chúng phát triển tốt nhất ở những nơi có độ mặn cao. Chúng được biết đến từ vùng nước ven biển Châu Âu và Châu Á và một số con sông nội địa và các hồ chứa ở Bắc Mỹ, Nam Mỹ, Hawaii và quần đảo Solomon (Lowe và Busch, 1975). T. weissflogii lần đầu tiên được tìm thấy vào năm 1962 từ sông Detroit, từ hồ Michigan vào năm 1967 và Lake Erie trong những năm 1970. 1.1.2. Đặc điểm hình thái cấu tạo T. weissflogii là tảo cát lớn đơn bào, chủ yếu sống đơn độc, đôi khi các tế bào liên kết với nhau thành tập đoàn (dạng bản) hoặc trong khối chất nhầy. Tế bào có dạng hình trụ, kích thước từ 6-20µm x 8-15µm. Mặt vỏ hình chữ nhật và có đường kính dài hơn trục vỏ tế bào. Đai vỏ không đều, mép đai có 2-28 mấu nhỏ. Một mẫu có dạng hình môi để liên kết với tế bào bên cạnh. Thể sắc tố nhiều, nhỏ, có hình hạt. Tế bào có một nhân hình cầu và nằm ở trung tâm của tế bào tảo. 4 Hình 1.1. Hình thái ngoài loài vi tảo Thalassiosira weissflogii. 1.1.3. Đặc điểm sinh sản Theo Trương Ngọc An (1993) tất cả các loài tảo cát đều có 2 hình thức sinh sản: - Sinh sản bằng cách phân đôi tế bào : Mỗi tế bào con nhận 1 mảnh vỏ của tế bào mẹ và tự tạo 1 mảnh vỏ mới bé hơn lồng vào mảnh vỏ cũ . Do đó sau nhiều lần phân chia kích thước tế bào giảm dần. - Sinh sản bằng bào tử: • Hình thành bào tử nghỉ (bào tử bảo vệ): Trong điều kiện môi trường ngoài bất lợi, chất nguyên sinh co lại tích trữ chất dự trữ, tế bào mất nước và hình thành 1 vỏ mới dày cứng gồm 2 mảnh, đôi khi có thêm nhiều gai. • Hình thành bào tử sinh trưởng: Sau nhiều lần phân chia kích thước tế bào bị nhỏ đi, tảo silic dùng hình thức này để khôi phục kích thước tế bào bằng cách nội chất tế bào thoát ra, lớn lên và hình thành vỏ mới. - Sinh sản vô tính bằng đồng bào tử. • Sinh sản hữu tính theo kiểu tiếp hợp: Hai cá thể ở gần nhau tách nắp ra, chất nguyên sinh kết hợp với nhau tạo thành hợp tử. Sau đó phân chia giảm nhiễm tạo vỏ mới bao bọc bên ngoài. 1.2. Tổng quan về hấp thụ và trao đổi Nitơ, Photpho và Silic trong tảo cát 1.2.1. Cơ chế hình thành lipid và protein Con đường sinh tổng hợp và chuyển hóa lipid trong tảo cát vẫn còn rất hạn chế khi so sánh với động vật, thực vật hoặc vi tảo lục (Guschina & Harwood, 2006). Các lipid có giá trị trong tảo cát là axit béo (FA), Triacylglycerols (TAGs), PUFA,... 5 Sự tổng hợp FA trong tảo cát với acetyl-CoA là tiền chất, nguồn gốc của acetylCoA được tìm thấy ở các tế bào khác nhau, bao gồm ty thể, peroxisomes và plastids (Leonardi & cs., 2005). Plastids được coi là vị trí chính của quá trình sinh tổng hợp FA và acetyl-CoA được tổng hợp từ ty thể hoặc peroxisome cần được vận chuyển đến các bào quan này. Đầu tiên, acetyl-CoA được chuyển đổi thành malonyl-CoA, phản ứng này được thúc đẩy bởi quá trình carboxyl hóa acetyl-CoA phụ thuộc ATP và được xúc tác bởi acetyl-CoA carboxylase (ACCase). Các bước tiếp theo của quá trình tổng hợp FA trong plastids bao gồm sự ngưng tụ tuần tự của hai đơn vị cacbon, được xúc tác bởi các enzyme của phức hợp FA synthase (FAS) với malonyl-ACP làm chất nền. Những phản ứng này được bắt đầu bằng các quá trình tổng hợp ketoacyl-ACP (KAS) và dẫn đến sự hình thành 16: 0-ACP trong tảo cát (Dolch & cs., 2017). Quá trình này được coi là bước cuối cùng của quá trình tổng hợp FA. Ngoài việc được kết hợp vào lipid màng, FAs cũng có thể được sử dụng làm năng lượng hoặc lưu trữ carbon dưới dạng TAGs. Quá trình sinh tổng hợp TAG trong tảo cát có thể xảy ra thông qua hai con đường khác nhau, đó là con đường phụ thuộc acyl-CoA và con đường không phụ thuộc acyl-CoA (Cagliari & cs., 2011). Con đường phụ thuộc acyl-CoA, còn được gọi là con đường Kennedy và bắt đầu bằng việc acyl hóa G-3-P bởi GPAT. Điều này dẫn đến sự hình thành axit lysophosphatidic (LPA), có thể được acyl hóa thêm để tạo ra axit phosphatidic (PA) bởi enzyme acyl-CoA (Blatti & cs., 2012; Nakamura & Li-Beisson, 2016; Yu & cs., 2011). PA có thể được khử phosphoryl bởi phosphatase acid phosphatidic (PAP) để tạo ra DAG. Trong bước acyl hóa cuối cùng, acyl-CoA: DAG acyltransferase (DGAT) tạo thành TAG từ DAG bằng cách kết hợp acyl-CoA thứ ba (Yu & cs., 2011; Blatti & cs., 2012; Liu & Benning, 2013). Trong con đường sinh tổng hợp TAG không phụ thuộc acyl-CoA, enzyme acyltransferase PDAT sử dụng phosphatidylcholine (PC) như một chất cho acyl để hình thành TAG từ DAG. Sau khi được tổng hợp, các TAG được tập hợp thành các giọt lipid tại lưới nội chất chuyên biệt và cuối cùng chúng được giải phóng vào tế bào chất. Con đường sinh tổng hợp protein ở vi tảo được thực hiện bằng cách cố định N, đồng hóa N theo phản ứng khử nhờ enzyme nitrogenase xúc tác khi có ATP. Kết quả N được tổng hợp thành protein của chúng. 6 1.2.2. Vai trò của lipid và protein đối với vi tảo Thalassiosira weissflogii và trong nuôi trồng thủy sản a. Vai trò của lipid và protein đối với vi tảo Thalassiosira weissflogii Các thành phần chính của tế bào tảo là các protein, carbohydrate và lipid. Trong đó, lipid là nguồn năng lượng dự trữ hiệu quả nhất. Lipid có vai trò như chất cách điện của các cơ quan, đồng thời là thành phần cấu trúc của hầu hết màng tế bào. Nó cũng có vai trò quan trọng đối với khả năng chịu stress sinh lý của các vi sinh vật bao gồm tảo cát. Lipid dự trữ ở dạng TAG là chủ yếu, có thể dễ dàng cung cấp năng lượng chuyển hóa cho tế bào. TAG chủ yếu được tổng hợp dưới ánh sáng, lưu trữ trong tế bào chất, và sau đó dùng tổng hợp lipid phân cực trong bóng tối (Cagliari & cs., 2011). Lipid phân cực (phospholipid) và sterol là thành phần cấu trúc quan trọng của màng tế bào có vai trò như một hàng rào thấm có chọn lọc cho các tế bào và bào quan. Những lipid này duy trì chức năng màng sinh học, tham gia một loạt các quá trình trao đổi chất. Ngoài chức năng cấu trúc, một số lipid phân cực đóng vai trò trung gian trong con đường tín hiệu của tế bào (ví dụ: lipid inositol, sphingolipids, các sản phẩm oxy hóa) và đóng một vai trò trong việc đáp ứng với những thay đổi của môi trường. Sự sẵn có của các chất dinh dưỡng, tốc độ phản ứng enzyme đều có thể hạn chế sự tổng hợp lipid. Protein là thành phần rất quan trọng của sự sống, có vai trò rất lớn trong việc xây dựng các tổ chức tế bào. Protein tham gia vào quá trình xúc tác hầu hết các phản ứng sinh học từ đơn giản đến phức tạp, điều hòa quá trình trao đổi chất. Ngoài ra, protein còn đóng vai trò dự trữ chất dinh dưỡng cho tế bào vi tảo. b. Vai trò của lipid và protein trong nuôi trồng thủy sản Trong nuôi trồng thủy sản, nhiệm vụ chính của protein là xây dựng nên cấu trúc của cơ thể. Protein trong thức ăn cung cấp các amino acid nhờ quá trình tiêu hóa và thủy phân. Trong ống tiêu hóa, các amino acid được hấp thu vào máu và đi đến các mô, cơ quan, tham gia vào quá trình sinh tổng hợp protein, phục vụ cho quá trình sinh trưởng, sinh sản và duy trì cơ thể. Do đó, nếu thức ăn không cung cấp đủ nhu cầu protein cho động vật thủy sản sẽ dẫn đến chậm lớn, hoặc ngừng tăng trưởng, sức sinh sản giảm, thậm chí có thể giảm trọng lượng. Lipid đóng vai trò quan trọng như nguồn cung cấp năng lượng (8-9 kcal/gam) và các acid béo cần thiết cho quá trình sinh trưởng và phát triển của động vật thủy sản. Việc bổ sung lượng lipid thích hợp sẽ giảm nhu cầu protein. 7 Triglyceride là thành phần chính và chủ yếu cung cấp nguyên liệu cho quá trình oxy hóa tạo năng lượng ở động vật thủy sản. Lipid trong thức ăn còn là dung môi hòa tan các vitamin tan trong dầu như A, D, E, K và hydrocarbon. Trong thành phần của lipid có phospholipid và sterol ester tham gia vào quá trình sinh tổng hợp màng tế bào. Ngoài ra, phospholipid còn giữ vai trò quan trọng trong sự vận chuyển và hấp thụ lipid và tham gia vào các quá trình biến dưỡng trung gian trong cơ thể sinh vật. Phospholipid như chất nhũ tương hóa giúp các acid béo, muối mật và các chất hòa tan trong chất béo gắn vào các hạt micelle nhỏ li ti. Sự vận chuyển các hạt micelle qua màng tế bào nhờ liên kết của các hạt micelle với hai lớp phospholipid của các màng cơ bản nên các sản phẩm thủy phân của lipid được đưa qua màng tế bào và hấp thụ vào hệ bạch huyết (Hardy & Kaushik, 2021). 1.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu liên quan đến ảnh hưởng của các thành phần môi trường dinh dưỡng đến sự sinh trưởng và tích lũy các hợp chất của vi tảo T. weissflogii. Lin và cộng sự (2018) đã khảo sát ảnh hưởng của sự thiếu hụt chất dinh dưỡng đến cấu trúc tích lũy lipid ở loài tảo cát T. weissflogii. Thí nghiệm được tiến hành trong môi trường bán nhân tạo F/2 ở nhiệt độ 20℃ với cường độ ánh sáng 150 µmol photon m− 2s− 1, chu kỳ sáng tối 14:10. Kết quả chỉ ra rằng, tổng nồng độ lipid ở các môi trường thiếu hụt N, P, Si là gần bằng nhau, tuy nhiên, sự tích tụ lipid trung tính và năng suất lipid cao nhất ở môi trường thiếu hụt P (năng suất 14.28 mg/L/ngày). Bên cạnh đó, chỉ ở môi trường thiếu hụt P và Si mới quan sát được tổng lượng năng suất lipid cao hơn so với môi trường đối chứng. Ở môi trường thiếu hụt N, năng suất lipid thấp nhất do sự ức chế quá trình sản xuất sinh khối và sự gia tăng không đáng kể của lipid trung tính và tổng nồng độ lipid. Việc thiếu hụt chất dinh dưỡng thông thường có thể làm tăng tổng nồng độ lipid, nhưng không thể làm năng suất lipid cao hơn trong một số trường hợp. Marella và cộng sự (2020) đã báo cáo rằng vi tảo T. weissflogii tăng trưởng tối đa khi được nuôi cấy trong môi trường F/2 với nồng độ N, P, Si lần lượt là 75 mg/L, 10 mg/L và 280 mg/L. Một nghiên cứu khác của Qiao và cộng sự (2021) về sự thiếu hụt N và ánh sáng cao đến các phản ứng sinh lý của hai loài tảo T. weissflogii và T. pseudonana cho thấy, thiếu 8 hụt N làm cho nồng độ của chlorophyll a và protein D1 bị suy giảm, do đó ảnh hưởng đến hiệu suất hấp thụ và chuyển đổi năng lượng ánh sáng. Tảo cát có kích thước lớn T. weissflogii có thể duy trì hoạt động quang hợp trong một thời gian dài hơn trong điều kiện thiếu N so với tảo cát có kích thước nhỏ T. pseudonana. Bên cạnh đó T. weissflogii có khả năng chịu ánh sáng cao hơn nhưng khả năng chống chịu bị giảm nghiêm trọng khi thiếu N, trong khi ánh sáng cao lại ít ảnh hưởng đến T. pseudonana. Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy khi thiếu Si thì sự phát triển tế bào tảo cát không ngừng trệ nhưng tế bào bị thay đổi cấu trúc nên khó xác định được loài. Si có vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất, bởi vì quá trình phân chia của tế bào sinh dưỡng không thể diễn ra mà không có sự hình thành thành (valve) của các tế bào con và sự phát triển tế bào không thể xảy ra nếu không hình thành dãy đai nối (girdle band) (Pickett-Heaps, 1991; Volcani, 1981). 1.3.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam Năm 2014, Nguyễn Văn Công và Nguyễn Kim Đường đã khảo sát ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng AGP, độ mặn, mật độ ban đầu và cường độ ánh sáng lên sự phát triển của vi tảo T. weissflogii và thử nghiệm nuôi sinh khối. Theo tác giả, để thu được vi tảo có chất lượng tốt nhất thì nên dùng môi trường dinh dưỡng AGP 10% có bổ sung vitamin, vì với mức môi trường này, vi tảo phát triển đồng đều và đạt mật độ cực đại cao nhất, quá trình suy vong xảy ra chậm và giảm chi phí thấp nhất về môi trường dinh dưỡng đem nuôi sinh khối. Mật độ đầu vào thích hợp nhất để nuôi sinh khối vi tảo T. weissflogii là 200 x 104 tế bào/mL, mật độ ban đầu càng cao thì vi tảo đạt mật độ cực đại càng cao trong thời gian càng ngắn, quá trình tàn lụi xảy ra càng nhanh. Trong 5 mức độ mặn thì vi tảo T. weissflogii phát triển tốt nhất ở mức độ mặn 30‰, kém nhất ở độ mặn 15‰, từ đó có thể thấy, vi tảo có xu hướng ưa độ mặn cao, phát triển tối ưu ở độ mặn 25-30‰, độ mặn thấp quá vi tảo sẽ kém phát triển và dẫn tới mật độ cực đại cũng thấp. Vi tảo T. weissflogii phát triển tốt nhất ở cường độ chiếu sáng 5000 lux, đạt mật độ cực đại sau 9 ngày nuôi cấy ở chế độ chiếu sáng 24/24 giờ (Van Và Kim, 2014). Năm 2017, Nguyễn Văn Công và cộng sự tiếp tục khảo sát ảnh hưởng của mật độ ban đầu và pH đối với sự tăng trưởng của T. pseudonana. Kết quả quan sát được vi tảo T. pseudonana đựng trong bình thủy tinh 250mL với mật độ ban đầu là 2.0 × 104 tế bào/mL có mật độ tối đa cao nhất là 52.25 × 104 tế bào/mL với tốc độ tăng trưởng 1.63/ngày; kích thước tế bào trung bình từ 30-31 µm vào lúc 48 giờ. Giá trị pH nằm trong khoảng từ 7.0 đến 9.0 cho 9 thấy vi tảo đạt tốc độ tăng trưởng nhanh nhất, mật độ tối đa cao nhất và thời gian đạt được pha tĩnh ngắn nhất so với các mức pH dưới 7.0 và trên 9.0. Nhìn chung, giá trị pH = 8 là điều kiện thích hợp nhất để nuôi cấy vi tảo T. pseudonana (Van Cong và Quang, n.d.). Trần Thị Lê Trang (2015) nghiên cứu ảnh hưởng của độ mặn đến sinh trưởng và thành phần sinh hóa của tảo T. pseudonana. Thí nghiệm được bố trí với 6 độ mặn khác nhau gồm 25, 30, 35, 40, 45 và 50‰ trong môi trường F/2, mật độ tảo ban đầu là 5 vạn tb/mL ở nhiệt độ phòng 25oC, pH = 8, chế độ chiếu sáng 12 sáng: 12 tối, sục khí liên tục, cường độ ánh sáng 3.000 lux. Kết quả cho thấy, vào này nuôi thứ 5, tảo được nuôi ở độ mặn 30 và 35‰ cho mật độ cực đại cao nhất (76,90 và 78,83 vạn tế bào/mL), còn ở độ mặn 25‰ (67,87 vạn tế bào/mL) và thấp nhất là ở độ mặn 40, 45 và 50‰ tương ứng là 65,33; 60,60 và 55,67 vạn tế bào/mL ở ngày nuôi thứ 6 (p-value<0,05). Trong khi đó, thành phần sinh hóa của tảo, cụ thể là hàm lượng protein, carbohydrate và lipid đạt cao nhất khi nuôi ở 25‰ tương ứng là 305; 264,33 và 219,33 mg/g, các giá trị này thấp nhất ở 50‰ có giá trị tương ứng là 181; 177,33; 139,67 mg/g. Lưu Thị Tâm và cộng sự (2020) cũng đã nghiên cứu điều kiện nuôi cấy tối ưu đến sự phát triển của vi tảo T. weissflogii để sản xuất sinh khối làm thức ăn tươi sống cho tôm thẻ chân trắng. Kết quả cho thấy, T. weissflogii phát triển tốt nhất ở môi trường APG 20%, mật độ tế bào ban đầu là 0.2×106 tế bào/mL ở nhiệt độ nằm trong khoảng 25-280C với cường độ ánh sáng là 100 μmol photon m-2s-1, pH = 7.0, độ mặn vừa phải ở 30‰, độ kiềm 145-190 ppm và sục khí liên tục 24/24 giờ. Sau 6 ngày nuôi cấy, mật độ tế bào cao nhất đạt được là 1.6×106 tế bào/mL. Sinh khối thu được có giá trị dinh dưỡng cao bao gồm nồng độ protein, lipid và carbohydrate lần lượt là 13.2%, 20.8% và 10% (trọng lượng khô) (Tam & cs., 2021). 10