Tài liệu Nghiên cứu xác định tỷ lệ nhiễm và độc tố đường ruột (enterotoxin) của vi khuẩn listeria, salmonella spp., staphylococcus aureus ô nhiễm trong thịt lợn ở một số tỉnh phía bắc

BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN ĐẶNG THỊ MAI LAN NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH TỶ LỆ NHIỄM VÀ ĐỘC TỐ ĐƢỜNG RUỘT (ENTEROTOXIN) CỦA VI KHUẨN Listeria, Salmonella spp., Staphylococcus aureus Ô NHIỄM TRONG THỊT LỢN Ở MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC LUẬN ÁN TIẾN SĨ THÚ Y Thái Nguyên, năm 2017 BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN ĐẶNG THỊ MAI LAN NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH TỶ LỆ NHIỄM VÀ ĐỘC TỐ ĐƢỜNG RUỘT (ENTEROTOXIN) CỦA VI KHUẨN Listeria, Salmonella spp., Staphylococcus aureus Ô NHIỄM TRONG THỊT LỢN Ở MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC Chuyên ngành: Ký sinh trùng & VSV học thú y Mã số: 62.64.01.04 LUẬN ÁN TIẾN SĨ THÚ Y Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Đặng Xuân Bình 2. PGS.TS. Nghiêm Ngọc Minh Thái Nguyên, năm 2017 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi được thực hiện với sự giúp đỡ của: - Ths. Phạm Thị Phương Lan cùng các anh, chị, em Bộ môn Công nghệ vi sinh - Viện Khoa học sự sống - Đại học Thái Nguyên. - Ths. Nguyễn Thị Hoài Thu cùng toàn thể các anh, chị, em phòng Công nghệ sinh học môi trường và phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen - Viện Công nghệ sinh học. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận án đều đã được chỉ rõ nguồn gốc. Thái Nguyên, ngày tháng Tác giả Đặng Thị Mai Lan năm 2017 ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án này, cùng với sự nỗ lực, cố gắng của bản thân, tôi xin được đặc biệt bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy: PGS.TS. Đặng Xuân Bình và PGS.TS. Nghiêm Ngọc Minh, người đã trực tiếp hướng dẫn và truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu cho tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án. Tôi xin được chân thành cảm ơn tới Ths. Phạm Thị Phương Lan cùng các anh, chị, em Bộ môn Công nghệ vi sinh - Viện Khoa học sự sống - Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành luận án này. Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn tới Ths. Nguyễn Thị Hoài Thu cùng toàn thể các anh, chị, em phòng Công nghệ sinh học môi trường và phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen - Viện Công nghệ sinh học cũng đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện để cho tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thiện luận án. Nhân dịp này tôi cũng xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu nhà trường, Ban Chủ nhiệm Khoa Chăn nuôi Thú y, các thầy cô, các anh chị em đồng nghiệp khoa Chăn nuôi Thú y, Lãnh đạo Chi cục Thú y, Trạm thú y các tỉnh Thái Nguyên, Bắc Giang, Hà Tây - Hà Nội, Vĩnh Phúc đã luôn tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành luận án. Lời sau cùng, xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới những người bạn, người thân trong gia đình và nhất là bố, mẹ đã luôn kịp thời động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất để tôi hoàn thành luận án. Xin cảm ơn người chồng thân yêu đã luôn giúp đỡ, chia sẻ với tôi trong suốt những năm tháng qua. Xin trân trọng cảm ơn tất cả sự giúp đỡ quý báu này. Thái Nguyên, ngày tháng năm 2017 Đặng Thị Mai Lan iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................................. i LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................... ii MỤC LỤC........................................................................................................................ iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................... viii DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU ................................................................................... x DANH MỤC CÁC HÌNH .............................................................................................. xii MỞ ĐẦU .......................................................................................................................... 1 1. Tính cấp thiết của đề tài ................................................................................................ 1 2. Mục tiêu nghiên cứu ..................................................................................................... 2 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ..................................................................... 2 3.1. Ý nghĩa khoa học ............................................................................................... 2 3.2. Ý nghĩa thực tiễn ................................................................................................ 2 4. Điểm mới của đề tài ...................................................................................................... 2 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................... 3 1.1. Tình hình ngộ độc thực phẩm do nhiễm vi khuẩn Listeria, Salmonella spp. và Staphylococcus aureus thế giới và Việt Nam........................................................... 3 1.1.1. Tình hình ngộ độc thực phẩm do nhiễm vi khuẩn Listeria, Salmonella spp. và S. aureus trên thế giới....................................................................................... 3 1.1.2. Tình hình ngộ độc thực phẩm do nhiễm vi khuẩn Listeria, Salmonella spp. và S. aureus tại Việt Nam ..................................................................................... 5 1.2. Ngộ độc thực phẩm do nhiễm Listeria, Salmonella spp., S. aureus và nguyên nhân gây nhiễm khuẩn vào thịt lợn ........................................................................... 9 1.2.1. Khái niệm ngộ độc và phân loại tình trạng ngộ độc ....................................... 9 1.2.2. Ngộ độc thực phẩm do Listeria, Salmonella spp. và S. aureus .......................... 9 1.2.3. Nguyên nhân gây nhiễm khuẩn vào thịt........................................................ 11 1.3. Đặc điểm sinh vật, hóa học của một số vi khuẩn gây ô nhiễm trên thịt lợn .......... 14 1.3.1. Sơ đồ phân lập vi khuẩn Listeria, Salmonella spp. và S. aureus .................. 14 1.3.2. Đặc điểm sinh vật, hóa học của vi khuẩn Listeria ........................................ 18 1.3.3. Đặc điểm sinh vật, hóa học của vi khuẩn Salmonella spp. ........................... 20 1.3.4. Đặc điểm sinh vật, hóa học của vi khuẩn S. aureus ...................................... 25 iv 1.4. Các yếu tố độc lực của vi khuẩn Listeria, Salmonella spp. và S. aureus............... 29 1.4.1. Các yếu tố độc lực của vi khuẩn Listeria ...................................................... 29 1.4.2. Các yếu tố độc lực của vi khuẩn Salmonella spp. ......................................... 30 1.4.3. Các yếu tố độc lực của vi khuẩn S. aureus ................................................... 35 1.5. Gen sản sinh độc tố đường ruột của vi khuẩn Salmonella spp. và S. aureus......... 39 1.5.1. Gen sản sinh độc tố đường ruột của Salmonella spp. ................................... 39 1.5.2. Gen sản sinh độc tố đường ruột của S. aureus .............................................. 41 1.6. Biện pháp phòng chống ngộ độc thực phẩm........................................................... 44 1.6.1. Giải pháp trước mắt ....................................................................................... 44 1.6.2. Giải pháp lâu dài ........................................................................................... 46 Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................................................................................... 47 2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ........................................................................... 47 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu.................................................................................... 47 2.1.2. Địa điểm nghiên cứu ..................................................................................... 47 2.1.3. Thời gian nghiên cứu: Từ năm 2012 đến năm 2015 ..................................... 47 2.2. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................................. 47 2.2.1. Động vật thí nghiệm ...................................................................................... 47 2.2.2. Các loại môi trường, hóa chất và thiết bị sử dụng trong quá trình nghiên cứu .... 47 2.3. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................... 49 2.3.1. Xác định tỷ lệ nhiễm và đặc tính sinh học của vi khuẩn Listeria, Salmonella spp. và S. aureus trong thịt lợn tươi bán tại chợ Trung tâm của một số tỉnh phía Bắc .......................................................................................................... 49 2.3.2. Xác định serovar các chủng Salmonella spp. phân lập được bằng phương pháp ngưng kết nhanh trên phiến kính ....................................................................... 49 2.3.3. Xác định khả năng sản sinh độc tố đường ruột của vi khuẩn Salmonella spp. và S. aureus bằng “Phản ứng khuếch tán trong da thỏ”................................. 49 2.3.4. Xác định gen sản sinh độc tố enterotoxin của vi khuẩn Salmonella spp. và S. aureus phân lập được ..................................................................................... 49 2.4. Phương pháp nghiên cứu ......................................................................................... 49 2.4.1. Phương pháp lấy mẫu .................................................................................... 49 v 2.4.2. Phương pháp xác định chỉ tiêu vi khuẩn Listeria, Salmonella spp. và S. aureus nhiễm trong thịt lợn ............................................................................ 50 2.4.3. Phương pháp nhuộm Gram xác định hình thái vi khuẩn .............................. 52 2.4.4. Phương pháp xác định các đặc tính sinh hóa của các chủng Listeria, Salmonella spp. và S. aureus đã phân lập được ............................................. 52 2.4.5. Phương pháp xác định độc lực của các chủng vi khuẩn Listeria, Salmonella spp. và S. aureus phân lập được trên chuột thí nghiệm ................................. 55 2.4.6. Phương pháp xác định tính mẫn cảm với một số loại kháng sinh của chủng vi khuẩn Listeria, Salmonella spp. và S. aureus phân lập được .................... 56 2.4.7. Phương pháp xác định serovar của vi khuẩn Salmonella spp. phân lập được ...... 57 2.4.8. Phương pháp xác định khả năng sản sinh độc tố đường ruột của vi khuẩn Salmonella spp. và S. aureus bằng “Phản ứng khuếch tán trong da thỏ” ...... 57 2.4.9. Phương pháp xác định gen sản sinh độc tố đường ruột enterotoxin của vi khuẩn Salmonella spp. và S. aureus bằng phương pháp PCR ....................... 58 2.4.10. Phương pháp đọc trình tự ADN trên máy đọc tự động và phân tích kết quả bằng phần mềm chuyên dụng đối với vi khuẩn S. aureus ....................... 61 2.4.11. Phương pháp biểu hiện và tinh sạch gen seb 534 của vi khuẩn S. aureus .. 61 2.5. Phương pháp xử lý số liệu ....................................................................................... 62 Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ...................................... 63 3.1. Tình hình tiêu thụ và tỷ lệ nhiễm khuẩn trong thịt lợn ở một số tỉnh phía Bắc ..... 63 3.1.1. Khảo sát tình hình giết mổ lợn trên địa bàn một số tỉnh phía Bắc ................ 63 3.1.2. Xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Listeria, Salmonella spp. và S. aureus trong thịt lợn bán tại chợ Trung tâm của tỉnh Thái Nguyên, Bắc Giang, Hà Tây Hà Nội và Vĩnh Phúc .................................................................................... 64 3.2. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Listeria, Salmonella spp., S. aureus trong thịt lợn bán tại chợ Trung tâm của tỉnh Thái Nguyên, Bắc Giang, Hà Tây - Hà Nội, Vĩnh Phúc 66 3.2.1. Kết quả tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Listeria trong thịt lợn ..................................... 66 3.2.2. Kết quả tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella spp. trong thịt lợn........................ 67 3.2.3. Kết quả tỷ lệ nhiễm vi khuẩn S. aureus trong thịt lợn .................................. 68 3.3. Xác định chỉ tiêu vi khuẩn Listeria, Salmonella spp., S. aureus nhiễm trong thịt lợn bán tại các chợ ................................................................................................... 69 3.3.1. Xác định chỉ tiêu vi khuẩn Listeria nhiễm trong thịt lợn .............................. 69 vi 3.3.2. Xác định chỉ tiêu vi khuẩn Salmonella spp. nhiễm trong thịt lợn ................. 70 3.3.3. Xác định chỉ tiêu vi khuẩn S. aureus nhiễm trong thịt lợn ........................... 71 3.4. Xác định tỷ lệ vi khuẩn Listeria, Salmonella spp., S. aureus nhiễm trong thịt lợn theo thời gian lấy mẫu sau bán hàng....................................................................... 73 3.4.1. Xác định tỷ lệ vi khuẩn Listeria nhiễm trong thịt lợn theo thời gian lấy mẫu .. 73 3.4.2. Xác định tỷ lệ vi khuẩn Salmonella spp. nhiễm trong thịt lợn theo thời gian lấy mẫu ......................................................................................................................... 75 3.4.3. Xác định tỷ lệ vi khuẩn S. aureus nhiễm trong thịt lợn theo thời gian lấy mẫu.... 78 3.5. Tỷ lệ và cường độ nhiễm vi khuẩn Listeria, Salmonella spp., S. aureus trong thịt lợn theo mùa ............................................................................................................ 80 3.5.1. Tỷ lệ và cường độ nhiễm vi khuẩn Listeria trong thịt lợn theo mùa...................... 80 3.5.2. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella spp. trong thịt lợn theo mùa .................... 83 3.5.3. Tỷ lệ và cường độ nhiễm vi khuẩn S. aureus trong thịt lợn theo mùa .......... 86 3.6. Giám định đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng vi khuẩn Listeria, Salmonella spp. và S. aureus phân lập được.............................................................................. 90 3.6.1. Giám định đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng vi khuẩn Listeria phân lập được .................................................................................... 90 3.6.2. Giám định đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng vi khuẩn Salmonella spp. phân lập được.......................................................................................... 91 3.6.3. Giám định đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng vi khuẩn S. aureus phân lập được ................................................................................................. 92 3.7. Thử độc lực của các chủng vi khuẩn Listeria, Salmonella spp. và S. aureus phân lập được trên chuột thí nghiệm ...................................................................... 93 3.7.1. Kết quả thử độc lực của các chủng vi khuẩn Listeria phân lập được trên chuột thí nghiệm ............................................................................................. 93 3.7.2. Kết quả thử độc lực của các chủng vi khuẩn Salmonella spp. phân lập được trên chuột thí nghiệm ............................................................................ 94 3.7.3. Kết quả thử độc lực của các chủng vi khuẩn S. aureus phân lập được trên chuột thí nghiệm ............................................................................................. 95 3.8. Kiểm tra tính mẫn cảm với kháng sinh của các chủng Listeria, Salmonella spp. và S. aureus phân lập được ..................................................................................... 97 vii 3.8.1. Kết quả kiểm tra tính mẫn cảm với kháng sinh của các chủng Listeria phân lập được ................................................................................................. 97 3.8.2. Kết quả kiểm tra tính mẫn cảm với kháng sinh của các chủng Salmonella spp. phân lập được.......................................................................................... 98 3.8.3. Kết quả kiểm tra tính mẫn cảm với kháng sinh của các chủng S. aureus phân lập được ................................................................................................. 99 3.9. Kết quả xác định khả năng sản sinh độc tố đường ruột của vi khuẩn Salmonella spp. và S. aureus bằng “Phản ứng khuếch tán trong da thỏ” ............................... 100 3.9.1. Kết quả xác định khả năng sản sinh độc tố đường ruột của vi khuẩn Salmonella spp. bằng “Phản ứng khuếch tán trong da thỏ” ......................... 100 3.9.2. Kết quả xác định khả năng sản sinh độc tố đường ruột của vi khuẩn S. aureus bằng “Phản ứng khuếch tán trong da thỏ”.................................................... 102 3.10. Kết quả xác định serovar các chủng Salmonella spp. phân lập được bằng phương pháp ngưng kết nhanh trên phiến kính theo sơ đồ của Kauffmann - White ........ 103 3.11. Xác định gen sản sinh độc tố đường ruột enterotoxin của chủng Salmonella spp. và S. aureus phân lập được ................................................................................... 104 3.11.1. Gen sản sinh độc tố đường ruột enterotoxin của vi khuẩn Salmonella spp. ..... 105 3.11.2. Gen sản sinh độc tố đường ruột enterotoxin nhóm B của vi khuẩn S. aureus . 107 3.12. Đề xuất một số biện pháp phòng ngừa ................................................................ 118 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................... 120 1. Kết luận ..................................................................................................................... 120 2. Kiến nghị ................................................................................................................... 121 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN.............. 122 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 123 I. Tài liệu tiếng Việt ...................................................................................................... 123 II. Tài liệu Tiếng Anh ................................................................................................... 129 III. Tài liệu Internet ....................................................................................................... 137 PHỤ LỤC ..................................................................................................................... 139 viii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT APS: Ammoniumpersulfate AOAC: Association of Official Agricultural Chemists bp: base pair (cặp base) C. perfringens: Clostridium perfringens DBB: Denaturing Binding Buffer DEB: Denaturing Elution Buffer ADN: Acid deoxyribonucleic dNTPs: deoxynucleotide triphosphate E. coli: Escherichia coli EDTA: Ethylene Diamine Tetraacetic Acid Epp: Eppendorf IPTG: Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside LB: Luria and Bertani MHC II: Histocompatibility complex class II MRSA: Methicillin-resistant Staphylococcus aureus MSSA: Methicillin‐ sensitive Staphylococcus aureus NCBI: Ngân hàng gen NĐTP: Ngộ độc thực phẩm PCR: Polymerase Chain Reaction PBS: Phosphate buffer saline S. aureus: Staphylococcus aureus SCC: Staphylococcal chromosomal cassette SDS: Sodium dodecyl sulfate se: Staphylococcal enterotoxin sea: Staphylococcal enterotoxin A seb: Staphylococcal enterotoxin B sec: Staphylococcal enterotoxin C sed: Staphylococcal enterotoxin D see: Staphylococcal enterotoxin E ses: Staphylococcal enterotoxin S ix set: Staphylococcal enterotoxin T seb 534 Staphylococcal enterotoxin B 534 SMX/TMP: Sulfamethoxazole - Trimethoprim RNA: Ribonucleic Acid R. equi Rhodococcus equi PFGE: Pulsed-field gel electrophoresis PGN: Peptidoglycan TEMED: N, N, N‟, N‟- tetramethylethylenediamine TRL: Toll-like receptor TSST: Toxic shock syndrome toxin v/p: Vòng/phút UBND: Ủy ban nhân dân x DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU Bảng 1.1. Tình trạng ngộ độc thực phẩm ở Việt Nam từ 2007 - 2012 ............................... 8 Bảng 1.2. Đặc điểm sinh hóa của một số loài Listeria ...................................................... 19 Bảng 1.3. Các tính chất sinh hóa cơ bản của Salmonella spp. .......................................... 22 Bảng 1.4. Những đặc tính của S. aureus, S. epidermidis và Micrococci .......................... 26 Bảng 1.5. Cấu trúc kháng nguyên của một vài Salmonella spp. thường gặp ................... 30 Bảng 2.1. Cặp mồi sử dụng để nhân gen đối với Salmonella spp..................................... 48 Bảng 2.2. Cặp mồi sử dụng để nhân gen đối với S. aureus ............................................... 48 Bảng 2.3. Cặp mồi sử dụng biểu hiện đoạn gen seb tự nhiên của S. aureus .................... 48 Bảng 2.4. Đánh giá mức độ mẫn cảm của vi khuẩn với .................................................... 56 Bảng 3.1. Tình hình giết mổ và tiêu thụ thịt lợn bán tại chợ Trung tâm ở Thái Nguyên, Bắc Giang, Hà Tây - Hà Nội và Vĩnh Phúc ............................. 63 Bảng 3.2. Kết quả tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Listeria, Salmonella spp. và S. aureus trong thịt lợn bày bán tại các chợ trung tâm thuộc Thái Nguyên, Bắc Giang, Hà Tây Hà Nội, Vĩnh Phúc ............................................................................................. 65 Bảng 3.3. Kết quả tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Listeria trong thịt lợn ......................................... 66 Bảng 3.4. Kết quả tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella spp. trong thịt lợn ........................... 67 Bảng 3.5. Kết quả tỷ lệ nhiễm vi khuẩn S. aureus trong thịt lợn ...................................... 68 Bảng 3.6. Cường độ nhiễm vi khuẩn Listeria trong thịt lợn ............................................. 69 Bảng 3.7. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella spp. trong thịt lợn ........................................ 70 Bảng 3.8. Cường độ nhiễm vi khuẩn S. aureus trong thịt lợn ........................................... 72 Bảng 3.9. Kết quả xác định tỷ lệ vi khuẩn Listeria nhiễm trong thịt lợn theo thời gian lấy mẫu ................................................................................................................ 74 Bảng 3.10. Kết quả xác định tỷ lệ vi khuẩn Salmonella spp. nhiễm trong thịt lợn theo thời gian lấy mẫu ................................................................................................ 76 Bảng 3.11. Kết quả xác định tỷ lệ vi khuẩn S. aureus nhiễm trong thịt lợn theo thời gian lấy mẫu ................................................................................................................ 78 Bảng 3.12. Tỷ lệ và cường độ nhiễm vi khuẩn Listeria trong thịt lợn theo mùa .................. 81 Bảng 3.13. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella spp. trong thịt lợn theo mùa ..................... 84 Bảng 3.14. Tỷ lệ và cường độ nhiễm vi khuẩn S. aureus trong thịt lợn theo mùa........... 87 xi Bảng 3.15. Kết quả giám định một số đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng Listeria phân lập được ....................................................................................... 90 Bảng 3.16. Kết quả giám định một số đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng Salmonella spp. phân lập được .......................................................................... 91 Bảng 3.17. Kết quả giám định một số đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng S. aureus phân lập được ..................................................................................................... 92 Bảng 3.18. Kết quả thử độc lực của các vi khuẩn Listeria phân lập được ....................... 93 Bảng 3.19. Kết quả thử độc lực của các chủng vi khuẩn Salmonella spp. phân lập được ..................................................................................................... 94 Bảng 3.20. Kết quả thử độc lực của các chủng vi khuẩn S. aureus phân lập được ......... 96 Bảng 3.21. Kết quả thử tính mẫn cảm của vi khuẩn Listeria với một số loại kháng sinh. 97 Bảng 3.22. Kết quả thử tính mẫn cảm của vi khuẩn Salmonella spp. với một số loại kháng sinh ........................................................................................................... 98 Bảng 3.23. Kết quả thử tính mẫn cảm của vi khuẩn S. aureus với một số loại kháng sinh ........................................................................................................... 99 Bảng 3.24. Khả năng sản sinh độc tố đường ruột của vi khuẩn Salmonella spp. bằng “Phản ứng khuếch tán trong da thỏ” ............................................................... 100 Bảng 3.25. Khả năng sản sinh độc tố đường ruột của vi khuẩn S. aureus bằng “Phản ứng khuếch tán trong da thỏ” .................................................................................. 102 Bảng 3.26. Kết quả xác định serovar của các chủng vi khuẩn Salmonella spp. phân lập được bằng kháng huyết thanh chuẩn............................................................... 103 Bảng 3.27. Kết quả tách chiết ADN tổng số của các chủng vi khuẩn Salmonella spp. 105 Bảng 3.28. Kết quả tách chiết ADN tổng số của các chủng vi khuẩn S. aureus............ 107 Bảng 3.29. Độ tương đồng của gen seb ở chủng S. aureus nghiên cứu với một số chủng vi khuẩn trên ngân hàng gen thế giới (NCBI) ................................................ 112 xii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Các độc tố quyết định của S. aureus .................................................................. 35 Hình 2.1. Sơ đồ đường cấy S. aureus và R. equi trong phản ứng CAMP ........................ 55 Hình 2.2: Chu trình phản ứng PCR đối với Salmonella spp. để nhân gen đích ............... 60 Hình 2.3. Chu trình phản ứng PCR đối với S. aureus để nhân gen đích .......................... 60 Hình 2.4. Chu trình phản ứng PCR đối với S. aureus để khuếch đại đoạn gen ............... 61 Hình 3.1. Biểu đồ tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Listeria, Salmonella spp. và S. aureus trong thịt lợn bày bán tại các chợ trung tâm thuộc Thái Nguyên, Bắc Giang, Hà Tây Hà Nội, Vĩnh Phúc ............................................................................................ 65 Hình 3.2. Biểu đồ tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Listeria trong thịt lợn theo thời gian lấy mẫu ... 74 Hình 3.3. Biểu đồ tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella spp. trong thịt lợn theo thời gian lấy mẫu ............................................................................................................... 76 Hình 3.4. Biểu đồ tỷ lệ nhiễm vi khuẩn S. aureus trong thịt lợn theo thời gian lấy mẫu 79 Hình 3.5. Biểu đồ về tỷ lệ và cường độ nhiễm vi khuẩn Listeria trong thịt lợn theo mùa ............................................................................................................ 82 Hình 3.6. Biểu đồ về tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella spp. trong thịt lợn theo mùa ...... 85 Hình 3.7. Biểu đồ về tỷ lệ và cường độ nhiễm vi khuẩn S. aureus trong thịt lợn theo mùa ............................................................................................................. 88 Hình 3.8. Biểu đồ khả năng sản sinh độc tố đường ruột enterotoxin của vi khuẩn Salmonella spp. ................................................................................................ 101 Hình 3.9. Biểu đồ khả năng sản sinh độc tố đường ruột enterotoxin của vi khuẩn S. aureus ........................................................................................................... 102 Hình 3.10: Sản phẩm điện di ADN tổng số của các chủng vi khuẩn Salmonella spp. .. 105 Hình 3.11: Điện di đồ sản phẩm nhân gen độc tố của các mẫu Salmonella................... 106 Hình 3.12. Sản phẩm điện di ADN tổng số của các chủng vi khuẩn S. aureus ............. 107 Hình 3.13: Điện di đồ sản phẩm nhân gen độc tố của các mẫu S. aureus ..................... 108 Hình 3.14: Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR ................................................................... 109 Hình 3.15: Điện di đồ sản phẩm cắt pJET1.2/wtSEB bằng hai enzym hạn chế EcoRI và HindIII (A); sản phẩm cắt pET21a(+)/wtSEB bằng hai enzym hạn chế EcoRI và HindIII (B); M: Thang DNA chuẩn 1 kb (Fermentas). ................ 111 Hình 3.16: Trình tự gen seb 534 của chủng S. aureus ..................................................... 112 xiii Hình 3.17: Protein tổng số từ chủng tái tổ hợp E. coli BL21 (DE3) Mr: Thang protein chuẩn của GE; 1: Protein wtSEB tổng số không cảm ứng IPTG; 2: Protein wtSEB tổng số sau 5 giờ cảm ứng IPTG. ...................................................... 113 Hình 3.18: Điện di đồ protein wtSEB thu được ở pha tan và pha không tan Mr: Thang protein chuẩn của GE; 1: protein wtSEB thu được trong pha tan ở 37oC; 2: protein wtSEB thu được trong pha không tan ở 37oC; 3: protein wtSEB thu được trong pha tan ở 28oC; 4: protein wtSEB thu được trong pha không tan ở 28oC; 5: protein wtSEB thu được trong pha tan ở 20oC; 6: protein wtSEB thu được trong pha không tan ở 20oC ................................................................... 114 Hình 3.19: Điện di đồ ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy cảm ứng đến hiệu suất và chất lượng protein tái tổ hợp Mr là thang protein chuẩn của GE ......................... 115 Hình 3.20: Điện di đồ ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng IPTG lên hàm lượng protein wtSEB. Mr là thang protein chuẩn của GE ....................................... 116 Hình 3.21: Điện di đồ ảnh hưởng của thời gian nuôi cảm ứng lên hàm lượng protein wtSEB Mr: thang protein chuẩn của GE ....................................................... 117 Hình 3.22: Điện di đồ sản phẩm tinh sạch protein wtSEB 1: Phân đoạn rửa với đệm rửa; 2: Protein wtSEB sau tinh sạch; Mr: Thang protein chuẩn của GE .... 118 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Thực phẩm nói chung và thực phẩm có nguồn gốc động vật nói riêng phục vụ cho nhu cầu của con người ngày nay đang là vấn đề được toàn xã hội quan tâm. Khi xã hội càng phát triển thì nhu cầu cuộc sống con người ngày càng nâng cao, người tiêu dùng không những đòi hỏi nguồn thực phẩm đủ về số lượng và chất lượng mà còn phải hợp vệ sinh, đạt tiêu chuẩn về vệ sinh an toàn thực phẩm. Để có được thịt an toàn thì cả một dây chuyền sản xuất bắt nguồn từ con giống, thức ăn, nước uống, thực hiện quy trình vệ sinh thú y trong chăn nuôi đến khi đưa gia súc đến nơi giết mổ, điều kiện vệ sinh thú y ở cơ sở giết mổ, quy trình thực hiện trong giết mổ, quá trình bảo quản pha lóc, vận chuyển đến nơi chế biến và tiêu thụ phải được đảm bảo. Trong những năm gần đây, ngộ độc thực phẩm xảy ra thường xuyên và với số lượng vụ ngộ độc thực phẩm (NĐTP) rất lớn làm ảnh hưởng không nhỏ đến sức khoẻ con người và kinh tế của người dân. Nguyên nhân là do thức ăn không đảm bảo vệ sinh, nhiều tạp chất, chất hoá học…, đặc biệt do thức ăn nhiễm một số loại vi khuẩn như: E. coli, Campylobacter jejuni, Salmonella spp., Staphylococcus aureus và Listeria monocytogenes… Ngộ độc thức ăn do vi khuẩn có thể do ăn, uống phải số lượng lớn các vi khuẩn gây bệnh hoặc độc tố của chúng. Điều đáng chú ý ở đây là một số độc tố của chúng bền với nhiệt và khó bị phân hủy ở nhiệt độ cao như độc tố ruột Staphylococcal enterotoxin B (seb) của vi khuẩn S. aureus và độc tố chịu nhiệt (ST) của vi khuẩn Salmonella spp.. Hơn nữa các vi khuẩn này còn có khả năng kháng kháng sinh methicillin, penicillin,… khi gặp điều kiện thuận lợi có thể lây lan và gây những bệnh nguy hiểm. Có rất nhiều tác giả đã cho rằng: vi khuẩn Salmonella spp. nhiễm vào thân thịt lợn trong quá trình giết mổ chủ yếu liên quan đến sự nhiễm trùng Salmonella spp. ở ruột (Berends B. R và cs., 1997 [70]; Borch E. và cs., 1996 [73]). Theo Lâm Quốc Hùng (2009) [148], thì ngộ độc thực phẩm do S. aureus có thể xảy ra với bất kỳ đối tượng nào nhưng ở người già, trẻ em và những người có hệ miễn dịch kém sẽ dễ mắc và biểu hiện triệu chứng nhiễm độc nặng nề hơn. Xuất phát từ thực tiễn của tình hình thịt lợn bị nhiễm khuẩn, đặc biệt là độc tố của vi khuẩn Salmonella spp., Staphylococcus aureus gây ngộ độc thực phẩm cho 2 con người, với mục đích cung cấp tư liệu khoa học có liên quan để từ đó lựa chọn những biện pháp phòng bệnh phù hợp, từng bước khống chế bệnh chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu xác định tỷ lệ nhiễm và độc tố đường ruột (enterotoxin) của vi khuẩn Listeria, Salmonella spp., Staphylococcus aureus ô nhiễm trong thịt lợn ở một số tỉnh phía Bắc”. 2. Mục tiêu nghiên cứu - Xác định một số chỉ tiêu vi khuẩn Listeria, Salmonella spp., S. aureus nhiễm trên thịt lợn bán tại chợ ở các tỉnh khu vực phía Bắc. - Nghiên cứu và xác định khả năng sản sinh độc tố đường ruột của các chủng vi khuẩn Salmonella spp. và S. aureus phân lập được. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3.1. Ý nghĩa khoa học - Cung cấp tư liệu khoa học về loài Salmonella spp. và trình tự gen độc tố enterotoxin type B của S. aureus phục vụ nghiên cứu tiếp theo nhằm phòng, chống hiệu quả NĐTP. - Là cơ sở khoa học từ đó đề xuất biện pháp khống chế ô nhiễm thịt lợn do Salmonella spp. và S. aureus gây ra. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn - Bổ sung tư liệu về tình hình nhiễm khuẩn nói chung, ô nhiễm Listeria, Salmonella spp. và S. aureus nói riêng trên thịt lợn. - Bổ sung tư liệu về độc lực và khả năng sản sinh độc tố enterotoxin của vi khuẩn Salmonella spp., S. aureus và giải trình tự gen sản sinh độc tố của chúng. 4. Điểm mới của đề tài - Xác định được khả năng sản sinh độc tố đường ruột của vi khuẩn Salmonella spp., S. aureus ô nhiễm trên thịt lợn. - Đã nhân dòng và xác định trình tự của gen seb dạng tự nhiên kích thước 534 bp của S. aureus và gen sản sinh độc tố enterotoxin của Salmonella. Đồng thời, đã nhân, biểu hiện và tinh sạch thành công protein tổ hợp seb 534 của vi khuẩn S. aureus ở dạng tự nhiên làm nguồn nguyên liệu cho việc tạo Kit phát hiện nhanh NĐTP do độc tố của tụ cầu vàng ở các giai đoạn sau. 3 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tình hình ngộ độc thực phẩm do nhiễm vi khuẩn Listeria, Salmonella spp. và Staphylococcus aureus thế giới và Việt Nam 1.1.1. Tình hình ngộ độc thực phẩm do nhiễm vi khuẩn Listeria, Salmonella spp. và S. aureus trên thế giới Trên thế giới, các vụ ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật chiếm khoảng 70 % tổng số ca ngộ độc thực phẩm. Tại các nước châu Á, vi khuẩn Salmonella spp. và S. aureus là nguyên nhân hàng đầu gây ra các vụ ngộ độc, chủ yếu ở các nước Nhật Bản, Trung Quốc và trong khu vực Đông Nam Á. Ở Nhật Bản, từ năm 1994 - 1998 số trường hợp ngộ độc do tụ cầu chiếm 3,1 11,9 % tổng số các vụ NĐTP do vi khuẩn. Ngày 17/6/1999, 21 trong số 53 công nhân sau khi ăn trưa tại căng tin công ty ở Shizuoka Prefecter thì có biểu hiện bệnh, trong đó có 8 trường hợp phải nhập viện (Norinaga Miwa và cs., 2000) [115]. Từ năm 1988 - 1996, ở Đức xảy ra nhiều vụ ngộ độc thực phẩm do tụ cầu. Năm 2000 lại xảy ra một vụ dịch làm 297 người bị ngộ độc cũng do tác nhân là tụ cầu (Viktoria Atanassova và cs., 2001) [140]. Ở Đài Loan, S. aureus chiếm 30 % trong số các vụ dịch từ năm 1986 - 1995. Vào tháng 6 năm 2000, vụ ngộ độc thực phẩm do tụ cầu tại một trường Trung học ở thành phố Taichung làm 10 trong số 356 học sinh có biểu hiện ngộ độc 2 - 3 giờ sau khi ăn sáng (Wei H. L. và Chiou C. S., 2001) [144]. Tại Pháp, năm 1997 người ta tìm thấy S. aureus là tác nhân gây ra 569 trong tổng số 1.142 vụ ngộ độc thực phẩm (Rosec J. P. và Gigaud O., 2002) [126]. Tại Brazil, vào tháng 2 và tháng 5 năm 1999 đã xảy ra hai vụ dịch làm 378 người bị ngộ độc do dùng phomai và sữa tươi có nhiễm tụ cầu (Simeão do Carmo L. và cs., 2002) [131]. Năm 2003 tại Bỉ có tới 12.849 trường hợp ngộ độc do vi khuẩn Salmonella spp., 6.556 trường hợp nhiễm do vi khuẩn Campylobacter và một số vi khuẩn khác mà nguyên nhân chủ yếu là chế biến thực phẩm chưa kỹ trong đó thịt nhiễm bẩn chiếm tới 20 % (Bộ y tế, 2005) [3]. Theo tài liệu của Dương Đình Thiện (2006) [47], thì tỷ lệ NĐTP do tụ cầu khuẩn ở Liên Xô (trước kia) và Mỹ chiếm vị trí hàng đầu trong số các bệnh ngộ độc thức ăn. 4 Hồng Lê Thọ (2007) [150] cho biết: Ở Nhật Bản, năm 1955 đã xảy ra sự kiện ngộ độc tập thể vào sáng ngày 1/3/1955 khi hơn 1.936 em học sinh của 5 trường tiểu học ở Tokyo bị đau bụng và tiêu chảy do nhiễm tụ cầu vàng (S. aureus). Ngày 26/6/2000 xảy ra vụ ngộ độc tập thể ở vùng Kansai làm 14.780 người bị ngộ độc do dùng sữa đã bị nhiễm tụ cầu khuẩn vàng từ độc tố ruột nguy hiểm nhất (Enterotoxin A). Ở Anh, 53 % các trường hợp ngộ độc thực phẩm từ 1969 - 1990 do nhiễm độc tố của S. aureus ở thịt và sản phẩm từ thịt, trong đó 22 % các trường hợp là do thịt gia cầm, 8 % là do sản phẩm sữa, 7 % từ gà và 3,5 % từ trứng. Ở Pháp, trong 2 năm từ 1999 - 2000 các vụ ngộ độc thực phẩm được xác định do S. aureus và độc tố se là 32 % các trường hợp là do các sản phẩm từ sữa và phomat, 22 % từ thịt, 12 % từ nước chấm, cá; các sản phẩm từ cá là 11 %, trứng và sản phẩm từ trứng là 11 % và 9,5 % từ gia cầm (Haeghebaert S. và cs., 2002) [85], (Đậu Ngọc Hào, 2010) [17]. Meyer C. và cs. (2011) [107] khi thu thập 985 mẫu thịt bò và thịt lợn để xác định tỷ lệ nhiễm khuẩn Listeria spp. cho thấy: có 14 % mẫu dương tính với vi khuẩn Listeria spp. và 4 % dương tính với Listeria monocytogenes. Akya A. và cs. (2013) [66] cũng đã thu thập 185 mẫu sữa, 187 mẫu thịt và 158 mẫu thức ăn đã chế biến tại Kermanshah, Iran để xác định tỷ lệ ô nhiễm của thực phẩm với Listeria spp. đã cho biết: có 12,5 % số mẫu dương tính, trong đó tỷ lệ nhiễm cao nhất là thịt (27,2 %) và thấp nhất là sữa (3,8 %). Tuy nhiên, chỉ có 3 mẫu (0,6 %) nhiễm Listeria monocytogenes. Lai J. và cs. (2014) [102] khi xác định sự phân bố serotype, mối quan hệ di truyền và kháng kháng sinh của Salmonella spp. từ thực phẩm có nguồn gốc động vật ở tỉnh Sơn Đông - Trung Quốc trong năm 2009 và 2012 cho thấy 50 trong số 692 mẫu thịt lợn dương tính với vi khuẩn Salmonella spp.. Các type huyết thanh phổ biến nhất là Salmonella derby 29 mẫu chiếm 58 %, Salmonella typhimurium 9 mẫu chiếm 18 % và Salmonella enteriditis 6 mẫu chiếm 12 %. Hơn 99 % các vi khuẩn Salmonella spp. phân lập được kháng với ít nhất một thuốc kháng sinh và mức kháng kháng sinh của vi khuẩn trong năm 2012 cao hơn so với năm 2009. Mihaiu L. và cs. (2014) [108] khi tiến hành thu thập 650 mẫu thịt gà và thịt lợn từ các đơn vị sản xuất và thị trường bán lẻ trong các khu vực khác nhau của Romania trong năm 2011 cho biết có 149 mẫu phân lập Salmonella spp. (22,92 %) đã được thu hồi với 13 serovar khác nhau, các serovar chủ yếu là Salmonella infantis, Salmonella typhimurium, Salmonella derby và Salmonella colindale. 5 Li Y. C. và cs. (2014) [104] đã tiến hành thu thập 1096 mẫu thịt lợn từ 20 chợ ở 4 thành phố của tỉnh Tô Giang - Trung Quốc từ tháng 8 năm 2010 đến năm 2012. Kết quả cho thấy có 154 mẫu dương tính với Salmonella spp. trong tổng số 163 mẫu phân lập Salmonella spp. đã được thu hồi, với 14 serovar được xác định trong đó Salmonella derby là phổ biến nhất (47,9 %); tiếp theo là Salmonella typhimurium (10,4 %); Salmonella meleagridis (9,2 %), Salmonella anatum (8,6 %) và Salmonella london (6,7 %). Có 134 (82,2 %) các chủng kháng với ít nhất với một tác nhân kháng khuẩn và 41 (25,2 %) kháng với hơn 3 kháng sinh. Từ 8/2012 đến 3/2013, Schoder D. và cs. (2014) [129] đã thu thập 600 mẫu sản phẩm động vật nhập khẩu tại sân bay quốc tế Vienna - Áo để kiểm tra sự ô nhiễm vi sinh vật. Kết quả cho thấy có 2,5 % số mẫu dương tính với Listeria monocytogenes; 1,3 % dương tính với E. coli và 1,2 % với Salmonella spp. Tadee P. và cs. (2014) [135] đã xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella spp tại 3 lò mổ đại diện của các tỉnh Chiang Mai và Lamphun của Thái Lan từ tháng 5 đến tháng 10 năm 2013 cho thấy mức độ lây nhiễm và ô nhiễm tổng thể là 11,85 % và 0,34 MPN/cm2 tương ứng. Vally H. và cs. (2014) [138] tiến hành xác định tỷ lệ bệnh lây truyền qua thực phẩm trong năm 2010 tại Australia đã kết luận: có 98 % số ca nhiễm Clostridium perfringens là truyền qua thực phẩm, tương tự với Listeria monocytogenes là 98 %, Salmonella spp. là 72 % và Campylobacter spp. là 77 %. 1.1.2. Tình hình ngộ độc thực phẩm do nhiễm vi khuẩn Listeria, Salmonella spp. và S. aureus tại Việt Nam Ở Việt Nam, tình trạng ngộ độc thực phẩm xảy ra ở hầu hết các địa phương trong cả nước. Số ca ngộ độc ngày càng gia tăng và mức độ nghiêm trọng cũng gia tăng, số người ngộ độc thực phẩm dẫn đến tử vong không phải là hiếm. Năm 1974, tỷ lệ nhiễm S. aureus là 2 % trong tổng số các vụ ngộ độc thực phẩm thì đến năm 1995 con số này đã tăng lên 22 %, năm 2004 lên đến 63 %. Theo số liệu từ Cục Quản lý chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm, những vụ NĐTP được tổng kết từ năm 1997 - 2002 thì ngộ độc thực phẩm do tác nhân vi sinh vật chiếm tỷ lệ cao từ 40 - 45 %, trong số đó có nhiều vụ được xác định tác nhân là S. aureus (Nguyễn Đỗ Phúc và cs., 2002) [36]. Tuy thời gian gây bệnh ngắn nhưng những vụ ngộ độc thực phẩm do tụ cầu để lại hậu quả không nhỏ. Theo đánh giá của tổ chức Y tế thế giới, hàng năm Việt Nam