Tài liệu Nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu và khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng cảm ứng tạo callus từ cây sói rừng (sarcandra glabra)

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH - MÔI TRƯỜNG KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU TẠO VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU VÀ KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG CẢM ỨNG TẠO CALLUS TỪ CÂY SÓI RỪNG (Sarcandra glabra) TRẦN THỊ ÁNH TUYẾT Đà Nẵng, năm 2022 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA – SINH MÔI TRƯỜNG KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU TẠO VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU VÀ KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG CẢM ỨNG TẠO CALLUS TỪ CÂY SÓI RỪNG (Sarcandra glabra) Ngành : Công nghệ sinh học Khóa : 2018 - 2022 Sinh viên thực hiện : Trần Thị Ánh Tuyết Người hướng dẫn : TS. Bùi Thị Thơ Đà Nẵng, năm 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan các dữ liệu trình bày trong khóa luận đề tài “Nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu và khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng cảm ứng tạo callus từ cây Sói rừng (sarcandra glabra)” này là trung thực, được thực hiện tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học nuôi cấy mô và tế bào thực vật, khoa Sinh – Môi trường, trường Đại học Sư phạm Đà Nẵng. Đây là kết quả nghiên cứu của tác giả và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác trước đây. Ngoài ra, trong bài báo cáo có sử dụng một số nguồn tài liệu tham khảo đã được trích dẫn rõ ràng và được phép công bố. Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm nếu vi phạm bất kì quy định nào về đạo đức khoa học. Tên SV Trần Thị Ánh Tuyết i LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực hiện Khoá luận tốt nghiệp tại Khoa Sinh – Môi trường, Trường Đại học Sư Phạm – Đại học Đà Nẵng, tôi đã học hỏi được rất nhiều kiến thức lý thuyết cũng như thực hành thí nghiệm về phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật. Để hoàn thành được Khoá luận tốt nghiệp này, ngoài sự cố gắng của bản thân, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Bùi Thị Thơ – cô giáo đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô thuộc Khoa Sinh – Môi trường đã truyền dạy cho tôi rất nhiều kiến thức cũng như kĩ năng thực hành thí nghiệm trong quá trình tôi thực hiện đề tài này. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đối với gia đình, bạn bè đã luôn động viên, khích lệ tôi cả về vật chất lẫn tinh thần để tôi có thể đạt kết quả tốt nhất. Đà Nẵng, tháng 5 năm 2022 Sinh viên thực hiện ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .................................................................................................................i LỜI CẢM ƠN ..................................................................................................................... ii MỤC LỤC ......................................................................................................................... iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................................... v DANH MỤC BẢNG...........................................................................................................vi DANH MỤC HÌNH ẢNH ................................................................................................ vii TÓM TẮT ........................................................................................................................ viii MỞ ĐẦU ............................................................................................................................. 1 1. Tính cấp thiết của đề tài ................................................................................................... 1 2. Mục tiêu đề tài ................................................................................................................. 2 3. Ý nghĩa của đề tài ............................................................................................................ 2 3.1. Ý nghĩa khoa học .......................................................................................................... 2 3.2. Ý nghĩa thực tiễn .......................................................................................................... 2 4. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................................ 2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................................. 3 1.1. Giới thiệu về cây Sói Rừng ........................................................................................... 3 1.1.1. Đặc điểm sinh thái ..................................................................................................... 3 1.1.2. Đặc điểm sinh học...................................................................................................... 3 1.2. Giá trị cây Sói rừng ....................................................................................................... 4 1.2.1. Giá trị dược liệu ......................................................................................................... 4 1.2.2. Giá trị kinh tế ............................................................................................................. 5 1.3. Cơ sở phương pháp nuôi cấy callus ............................................................................. 5 1.4.1. Tình hình nghiên cứu trong nước .............................................................................. 6 1.4.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ............................................................................ 6 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................... 8 2.1. Vật liệu .......................................................................................................................... 8 2.2. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................................. 8 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................... 11 3.1. Nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu in vitro cây Sói rừng .............................................. 11 iii 3.1.1. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1% đến khả năng tạo mẫu vô trùng ............................................................................................................................................ 11 3.1.2. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1% đến khả năng khử trùng mẫu hạt cây Sói rừng ................................................................................................................. 12 3.1.3. Ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng đến khả năng nảy mầm hạt cây Sói rừng ............................................................................................................................................ 13 3.2. Nghiên cứu khả năng tạo callus từ cây Sói rừng ....................................................... 14 3.2.1. Ảnh hưởng của chất ĐHST 2,4-D đến khả năng phát sinh callus của cây Sói rừng ............................................................................................................................................ 14 3.2.2. Ảnh hưởng của chất ĐHST KIN đến khả năng phát sinh callus của cây Sói rừng . 16 3.2.3. Ảnh hưởng của chất ĐHST 2,4-D kết hợp KIN đến khả năng phát sinh callus của Sói rừng .............................................................................................................................. 17 3.2.4. Ảnh hưởng của chất ĐHST 2,4-D kết hợp BA đến khả năng phát sinh callus của cây Sói rừng .............................................................................................................................. 18 Bảng 3.7: Ảnh hưởng của chất ĐHST 2,4-D kết hợp BA đến khả năng phát sinh callus của cây Sói rừng ....................................................................................................................... 18 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................................... 19 1. Kết luận .......................................................................................................................... 19 2. Kiến nghị ........................................................................................................................ 19 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 20 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D : 2,4dichlorophenoxyacetic acid KIN : Kinetin BA : 6-benzylaminopurine NAA : 1-Naphthaleneacetic acid IBA : Indole 3-butyric acid MS : Murashige và Skoog (1962) ĐHST : Điều hòa sinh trưởng v DANH MỤC BẢNG Số hiệu Tên bảng bảng 3.1 3.2 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1% đến khả năng tạo mẫu vô trùng. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1% đến khả năng khử trùng mẫu hạt cây Sói rừng. Số trang 11 12 Ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng đến khả năng nảy mầm 3.3 3.4 hạt cây Sói rừng 13 Ảnh hưởng của chất ĐHST2,4-D đến khả năng phát sinh callus của cây Sói rừng 14 Ảnh hưởng của chất ĐHST KIN đến khả năng phát sinh callus 3.5 3.6 của cây Sói rừng 16 Ảnh hưởng của chất ĐHST 2,4-D kết hợp KIN đến khả năng phát sinh callus của cây Sói rừng 16 Ảnh hưởng của chất ĐHST 2,4-D kết hợp BA đến khả năng phát 3.7 sinh callus của cây Sói rừng 17 vi DANH MỤC HÌNH ẢNH Số hiệu Tên hình hình Số trang Quả, hoa và thân ngoài tự nhiên tại khu bảo tồn thiên nhiên 1.1 4 Sơn Trà, Đà Nẵng Cây Sói rừng ngoài tự nhiên, mẫu thân và lá và Quả Sói rừng 2.1 3.1 8 Hạt Sói rừng sau 2 tuần vào mẫu 12 Hạt Sói rừng nảy mầm sau 8 tuần vào mẫu trên môi trường MS + 3.2 0,5 mg/l BA 13 Mẫu lá Sói rừng nuôi cấy trong môi trường MS bổ sung 2,4-D sau 2 tuần. 3.3 Các nồng độ: (A). 0,5 mg/l, (B). 1,0 mg/l, (C). 2,0 mg/l. 15 Mẫu thân Sói rừng nuôi trong môi trường MS bổ sung 2,4-D sau 3.4 2 tuần 15 Nồng độ 2,4-D 2,0 mg/l Mẫu lá Sói rừng nuôi cấy trong môi trường MS bổ sung KIN sau 2 tuần. 3.5 Các nồng độ: (A). 0,5 mg/l, (B). 1,0 mg/l, (C). 2,0 mg/l. vii 16 TÓM TẮT Cây Sói rừng (Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai) là một loại thảo mộc và dược liệu có tác dụng điều trị một số bệnh như viêm nhiễm, gãy xương, viêm khớp xương do phong thấp, ngoại thương xuất huyết, bỏng, phòng cảm mạo, vết thương loét không liền miệng và hỗ trợ điều trị ung thư. Ngoài ra, loài cây này rất giàu dược tính và theo kết quả nghiên cứu gần đây, Sói rừng chứa ít nhất năm mươi thành phần và có thể được phân thành năm loại: axit hữu cơ, dẫn xuất caffeoyl, flavonoids, coumarin và terpenoid. Nghiên cứu nhân nhanh tạo sinh khối cây Sói rừng nhằm tạo nguồn nguyên liệu chứa các hợp chất có dược tính phục vụ cho nhu cầu sản phẩm thuốc, thực phẩm chức năng đang trở thành xu thế mới và cấp bách. Kết quả nghiên cứu chỉ ra, khử trừng mẫu hạt Sói rừng bằng ethanol 70% trong 30s, HgCl2 0,1% trong 10 phút để khử trùng bề mặt mẫu hạt Sói rừng đều đạt hiệu quả tốt nhất tạo vật liệu khởi đầu in vitro từ hạt Sói rừng. Hạt Sói rừng được cấy vào môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l BA tỷ lệ nảy mầm của hạt 100%. Mẫu lá Sói rừng được khử trùng trong ethanol 70% 30s và HgCl2 0,1% 10 phút cho hiệu quả khử trùng tốt nhất, đói với mẫu thân khử trùng với ethanol 70% 30s và HgCl2 0,1% 10 phút cho hiệu quả cao nhất. Các mẫu lá và thân được cấy trên MS cơ bản có bổ sung 3% succrose, 0,8% agar và chất điều hoà sinh trưởng (2,4-D và KIN) với nồng độ 0,5 – 2,0 mg/l, kết quả cho thấy sau 2 tuần nuôi mẫu lá không có cảm ứng phát sinh hình thái. Tuy nhiên, mẫu lá đang có hiện tượng chuyển thành màu nâu đen. trên môi trường MS cơ bản có bổ sung 2,4-D. Tỷ lệ mẫu thân cảm ứng phát sinh callus cao nhất (75%). Từ khoá: in vitro, callus, Sarcandra glabra viii MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Cây Sói rừng (Sarcandra glabra) là một loài thảo mộc và dược liệu truyền thống của người Trung Quốc, nó được sử dụng như trà thảo dược để bổ sung nhằm nâng cao sức khoẻ. Sói rừng là loại cây giàu dược tính và có nhiều hoạt tính kháng khuẩn, tiêu viêm, chống oxy hoá…, nên thường được khai thác để sử dụng làm thuốc chữa trị nhiều bệnh như: viêm phổi, viêm phế quản, viêm ruột thừa cấp tính, viêm dạ dày ruột cấp tính, nhiễm khuẩn, phong thấp đau nhức, gãy xương, cơ thể hỗ trợ trong việc chống khối u... Chiết xuất ở cây Sói rừng chứa nhiều hợp chất có hoạt tính cao như: acid rosnarinic, isofaxidin, acid fumanic, saponin terpenoid… Hiện nay, cây Sói rừng chủ yếu được tìm thấy ở một số nơi ở các tỉnh miền núi phía Bắc nước ta. Ngoài ra nó cũng được tìm thấy ở bán đảo Sơn Trà, thành phố Đà Nẵng. Do việc phát nương làm rẫy, cháy rừng cùng với việc khai thác bất hợp lí các loại cây thuốc quý trong tự nhiên nhằm mục đính chữa bệnh dẫn đến các loài thực vật có nguồn gen quý đang đối mặt với nguy cơ tuyệt chủng cao trong đó có Sói rừng. Với tiềm năng về giá trị dược liệu và kinh tế mà Sói rừng mang lại nên việc bảo tồn, phát triển và thu dược chất từ loài dược liệu này đang được quan tâm. Nuôi sinh khối tế bào thực vật là kỹ thuật nuôi cấy, duy trì, tạo khối lượng lớn tế bào thực vật trong môi trường dinh dưỡng phù hợp và điều kiện nuôi cấy vô khuẩn mà không phải thâm canh gieo trồng. Từ khối tế bào đó, tách chiết các hoạt chất lấy nguyên liệu cho sản phẩm thuốc, thực phẩm, mỹ phẩm. Quy trình tạo sinh khối tế bào thực vật gồm 5 giai đoạn kế tiếp nhau: tạo callus, duy trì nuôi cấy callus trong môi trường thạch mềm, nuôi cấy tế bào trong môi trường lỏng, khuyếch đại quy mô nuôi cấy, thu hoạch khối tế bào. Việc tạo vật liệu khởi đầu callus từ cây Sói rừng sẽ là bước đầu tiên nhằm tạo nguồn sinh khối tế bào phục vụ cho nghiên cứu chiết tách dược chất từ sinh khối tế bào. Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu tạo callus từ cây Sói Rừng (Sarcandra glabra)” làm cơ sở khoa học cho việc bảo tồn nguồn gen và ứng dụng vào sản xuất dược liệu quý với số lượng lớn. 1 2. Mục tiêu đề tài Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng phát sinh callus từ cây Sói rừng (Sarcandra glabra) bằng kĩ thuật nuôi cấy in vitro. 3. Ý nghĩa của đề tài 3.1. Ý nghĩa khoa học Cung cấp dẫn liệu khoa học về nuôi cấy callus cây Sói rừng, góp phần làm phong phú hơn cơ sở dữ liệu về nhân giống in vitro. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả nghiên cứu là cơ sở cho việc sản xuất nhanh, liên tục nguồn sinh khối tế bào với chất lượng tốt, giá thành rẻ. Có thể đáp ứng nhu cầu chiết tách hoạt chất nhằm sản xuất dược phẩm từ cây Sói rừng với quy mô công nghiệp. Góp phần vào việc bảo vệ nguồn gen thực vật quý tại Việt Nam. 4. Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu in vitro cây Sói rừng Nội dung 2: Nghiên cứu khả năng tạo callus từ mẫu lá và thân của cây Sói rừng 2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về cây Sói Rừng 1.1.1. Đặc điểm sinh thái Sói rừng có tên khoa học Sarcandra glabra. Giới: Plantae; Bộ: Chloranthales; Họ: Chloranthaceae; Chi: Sarcandra ; Loài: Glabra. Ngoài ra còn có tên khác như: Chloranthus brachystachys Blum, Chlorathus glaber (Thunb.) makino, Sarcandra Chloranthus Gardeno, thuộc họ Hoa sói Chloranthaceae. Ở Việt Nam cây Sói rừng còn có một số tên gọi khác như: Sói lãng, Sói nhẵn, Cửu tiết kim túc lan, Cửu tiết trà, Cửu tiết phong, Trúc tiết trà, Tiếp cốt liên, Thảo sách hồ, Tiếp cốt mộc (Zhang et al. 2016). Sói rừng là cây ưa bóng, ưa ẩm nhưng tránh ánh nắng trực tiếp nên thường mọc ở khe núi, thung lũng, nơi ẩm ướt dưới tán các cây lâu năm. Sói rừng thường mọc hoang ở vùng núi đất, ở rìa và ven đồi ẩm lên đến độ cao 1000 m. Có thể trồng xen dưới tán cây lâu năm (Cây ăn quả hoặc cây lấy gỗ) hoặc trồng thâm canh dưới dàn mái che nhân tạo. Có hai phương pháp nhân giống đối với cây Sói rừng, đó là nhân giống bằng hạt và nhân giống bằng hom, giâm thông qua việc sử dụng kỹ thuật giâm cành. Theo Võ Văn Chi Sói rừng phân bố nhiều ở các quốc gia và vùng lãnh thổ như: Trung Quốc, Triều Tiên, Nhật Bản, Ấn Đô, Malaysia và Việt Nam. Tại Việt Nam được tìm thấy ở Lạng Sơn, Bắc Giang, Hoà Bình, Hà Tây đến Kon Tum, Lâm Đồng, cây thường mọc hoang ở những vùng đất bìa rừng và ven đồi ẩm. Thu hái toàn cây vào mùa hạ dùng tươi hay phơi khô trong râm (B. V. Trọng, Viên, and Nguyên 2015). 1.1.2. Đặc điểm sinh học Sói rừng là loại cây bụi thường xanh nhỏ lâu năm với chiều cao 50 – 120 cm. Thân mọc thẳng thân nhẵn có màu tím. Thường phân nhánh, thân và cành có các đốt hơi phình to, giữa các đốt có rãnh và gờ nỗi rõ ràng. Lá mọc đối, 2 mặt nhẵn bóng. Hình dạng của lá hình trứng hoặc bầu dục, dài 7 – 18 cm, rộng 2 – 7 cm, đỉnh nhọn, mép có răng cưa cứng. Cuống lá ngắn 5- 8mm. Gân lá phụ 5 cặp. Cây có hoa nhỏ màu vàng ở đầu cành, không có bao hoa, có mùi thơm. Hoa nở vào tháng 6 – 7, hoa đơn tính cùng gốc, trong đó nhị hoa xếp thành hình trụ, trong khi nhụy hoa hình cầu và không có vòi. Cây ra quả vào tháng 8 – 10. Quả nhỏ, khi chín có màu đỏ gạch, mọng, gần tròn 6 x 4 mm (Vân 2007). 3 A B C Hình 1.1: Quả, hoa và thân ngoài tự nhiên tại khu bảo tồn thiên nhiên Sơn Trà, Đà Nẵng. (A). Quả Sói rừng, (B). Hoa cây Sói rừng, (C). Thân cây Sói rừng. 1.2. Giá trị cây Sói rừng 1.2.1. Giá trị dược liệu Sói rừng được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền Trung Quốc để chống viêm, hạ sốt, điều trị viêm họng, điều trị chấn thương và gãy xương, chống chữa viêm loét dạ dày. Trong thực hành lâm sàng hiện đại, nó cũng đã được áp dụng để điều trị nhiễm trùng đường hô hấp trên, viêm phổi và hỗ trợ điều trị ung thư. Ngoài ra, nó còn giúp chống oxi hoá, kháng khuẩn, kháng virus, bảo vệ gan. Hiện tại, hơn 200 hợp chất hóa học đã được phân lập và xác định từ nó, chẳng hạn như sesquiterpenes, flavonoid, axit phenolic, coumarin,…(Zeng et al. 2021)(W. Liu et al. 2017)(J. Liu et al. 2016). Các nghiên cứu dược lí đã xác nhận rằng chiết xuất các chất từ Sói rừng có nhiều tác dụng như: kháng khuẩn, kháng virus, chống viêm, đặc biệt là chống khối u và chống giảm tiểu cầu. Axit caffeoylquinic, coumarin và dẫn xuất dicaffeoyl được coi là ba loại thành phần hoạt tính sinh học phong phú nhất trong Sói rừng. Kết quả nghiên cứu hiện đại cho thấy, sói rừng có tác dụng ức chế đối với tụ cầu khuẩn vàng staphylococcus aureus, trực khuẩn lỵ, trực khuẩn bacillus coli, trực khuẩn mủ xanh bacillus pyocyaneus; trực khuẩn thương hàn… Lá có tác dụng kháng khuẩn mạnh nhất; rễ và cành tươi có tác dụng mạnh hơn rễ và cành khô (En, Nguyen, and Thanh 2016)(Dung 2012). Một polysaccharide có tính acid được tinh chế từ Sói rừng, p-SGP là chất hỗ trợ lý tưởng cho vaccine khối u, vaccine ung thư có thể tạo ra các phản ứng miễn 4 dịch tế bào và dịch thể mạnh hơn khi được bổ trợ với p-SGP (W. Liu et al. 2021). Uvangoletin là một dihydrochalcone được chiết xuất từ cây Sói rừng. Nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng uvangoletin có thể gây chết tế bào apoptotic và autophagic, ức chế sự tăng sinh tế bào và di căn trên tế bào HepG2 thông qua các con đường tín hiệu Akt / mTOR, MAPK và TGFβ / Smad2, chống ung thư biểu mô tế bào gan (Shen et al. 2022). Tác dụng chống viêm kết hợp của ba thành phần điển hình C + R + I (axit chlorogenic + axit rosmarinic + isofraxidin) từ Sói rừng làm giảm stress oxy hóa và phản ứng viêm bằng cách ức chế sự hoạt hóa của các đại thực bào, nghiên cứu này cung cấp những quan điểm mới về phương pháp điều trị tiềm năng với S. glabra và cho thấy một ứng cử viên đầy hứa hẹn để điều trị ALI / ARDS do viêm phổi, COVID-19, viêm ruột thừa (C.-P. Liu et al. 2021)(Feng et al. 2022). Theo Đông y, cây Sói rừng có vị đắng, tính hơi ấm, có tác dụng hoạt huyết giảm đau, khử phong trừ thấp, tiêu viêm giải độc. Trong dân gian, rễ cây được ngâm rượu, uống chữa đau tức ngực. Lá được sắc uống hỗ trợ trị bệnh lao, hoặc giã đắp hỗ trợ trị rắn cắn, ngâm rượu xoa bóp hỗ trợ trị vết thương, mụn nhọt, phong thấp, đau nhức xương. 1.2.2. Giá trị kinh tế Sói rừng là một loài thảo mộc và cây dược liệu chứa nhiều hợp chất quý giúp cải thiện sức khoẻ, hỗ trợ điều trị bệnh. Vì vậy, Sói rừng rất có tiềm năng về kinh tế. 1.3. Cơ sở phương pháp nuôi cấy callus Phương pháp nuôi cấy mô sẹo: mô sẹo là một khối tế bào vô tổ chức, hình thành từ các mô hoặc cơ quan đã phân hóa dưới các điều kiện đặc biệt (vết thương, xử lý bằng các chất điều hòa sinh trưởng thực vật…). Mẫu cấy ban đầu để tạo mô sẹo có thể lấy từ cây con vô trùng trong ống nghiệm, rẽ, thân, lá của cây bên ngoài đã được vô trùng. Mô sẹo là nguyên liệu khởi đầu cho các nghiên cứu quan trọng như: nuôi cấy tế bào đơn, nuôi cấy phôi soma. Tốc độ phát triển của mô sẹo thường có năm giai đoạn: (1) giai đoạn trễ trong đó tế bào chuẩn bị phân chia; (2) thời kỳ tăng trưởng theo cấp số nhân trong đó quá trình phân chia tế bào là cực đại; (3) một giai đoạn tăng trưởng tuyến tính, trong đó quá trình phân chia chậm lại và các tế bào to ra; (4) thời kỳ tăng trưởng giảm tốc; và (5) thời kỳ đứng yên hoặc không tăng trưởng trong đó số lượng tế bào là không đổi (Park 2021). 5 Nuôi cấy mô sẹo là nuôi cấy các tế bào thực vật chưa biệt hóa được cảm ứng trên môi trường thường chứa nồng độ auxin tương đối cao hoặc sự kết hợp của auxin và cytokinin trong điều kiện in vitro . Các chất điều hoà sinh trưởng thực vật (phytohormone) là thành phần quan trọng nhất của môi trường nuôi cấy. Nhờ những chất này, các nhà nghiên cứu có thể chủ động điều khiển quá trình phát sinh hình thái của thực vật in vitro. Có 2 nhóm chất điều hòa sinh trưởng thường được sử dụng trong nhân giống in vitro là nhóm auxin và cytokinin, trong đó nhóm auxin gồm những chất như 2,4-D, IBA, NAA (Naphthlene acetic acid là những chất có tác dụng kích thích tạo callus, tạo phôi vô tính, tạo rễ. Việc bổ sung một hoặc nhiều hormone đóng vai trò quan trọng trong việc định hướng sự phát triển của mô sẹo. Cảm ứng, nuôi cấy con và duy trì mô sẹo đòi hỏi các quy trình phù hợp để chúng tăng trưởng và phát triển đáng kể (Initiation 2013)(Avenue, Eu, and Pacific n.d.) 1.4. Tình hình nghiên cứu về Sói rừng 1.4.1. Tình hình nghiên cứu trong nước Mai Hoàng Oanh (2016) đã nghiên cứu mẫu Sói rừng thu nhận từ Lạng Sơn, tách chiết và tinh sạch được DNA tổng số. Nhân bản thành công hai vùng gen ITS và rpoC1 bằng phương pháp PCR và tạo dòng thành công hai gen nhân bản được, đã xác định được trình tự nucleotide của 2 đoạn gen rpoC1 và ITS (Oanh 2016) Bùi Văn Trọng và cs (2015) đã nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng tới sự hình thành rễ của hom cây Sói rừng (Sarcandra glaba (Thunb.) Nakai.) tại Lâm Đồng. Nhóm tác giả đã sử dụng NAA ở nồng độ 1% cho kết quả giâm hom Sói rừng tốt nhất đạt 86.67%, hom sống và ra rễ, số lượng rễ trung bình là 5.08 rễ/hom, chiều dài rễ trung bình là 3,68 cm so với đối chứng (66,67%; 3,9; 3,65 cm, tương ứng) (B. V. Trọng, Viên, and Nguyên 2015). Le Hong En và cs (2016) đã nghiên cứu nhân giống Sói rừng bằng giâm hom. Tác giả đã sử dụng IBA, IAA, NAA để nghiên cứu tác dụng của chất kích thích ra rễ. Nồng độ IBA 1-1,5% cho ra rễ tốt nhất. Hom bánh tẻ cho ra rễ tốt hơn các loại hom khác (En, Nguyen, and Thanh 2016). Hoàng Năng Trọng và cs (2018) đã phân lập và xác định cấu trúc của một số hợp chất glucoside -flavonoid từ lá dược liệu sói rừng. Kết quả đã phân lập hai hợp chất là iristectorin A và tectoridin (H. N. Trọng et al. 2018). 1.4.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 6 Trong những thập kỷ gần đây, các nghiên cứu về cây Sói rừng chủ yếu tập trung về dược lý và các hoạt chất có hoạt tính sinh học của loài. (Li et al. 2021) đã nghiên cứu cải thiện sản xuất sesquiternoids của nuôi cấy mô sẹo Sói rừng trên môi trường ½ MS bổ sung 2,4-D (2,0 mg/l) và 6-BA (1,0 mg/l) đối với nuôi cấy tạo mô sẹo. Môi trường ½ MS bổ sung 2,4-D (2,0 mg/l) và 6-BA (0,5 mg/l) có hiệu quả cao cho sự tăng sinh mô sẹo. (Zhu et al. 2011) đã nghiên cứu quy trình khử trùng vi nhân giống cây Sói rừng. Khử trùng bề mặt bằng 120 mg/l rifampicin 2 - 4 ngày và HgCl2 trong 10 phút, môi trường hiệu quả nhất để tạo chồi là môi trường MS có bổ sung 4,0 mg/l 6-BA, nhân nhanh chồi trên môi trường MS chứa 4,0 mg/l 6-BA và 0,2 mg/l NAA, môi trường ra rễ tối ưu MS bổ sung 0,2 mg/l IBA và 30g sucrose. (Liqiong et al. 2020) nghiên cứu môi trường tạo chồi từ đọan thân gốc là B5 + 0,8 mg/l , BA + 0,3 mg/l NAA, môi trường tăng sinh tốt nhất là B5 + 3,0 mg/l 6-BA + 0,5 mg/l NAA, với hệ số tăng sinh trung bình là 6,82. Môi trường tạo rễ tốt nhất là 1 / 2B5 + 0,8 mg/l IBA + 0,1 mg/l NAA, tỷ lệ ra rễ là 100%, số rễ trung bình là 6,51. Với đất mùn: trấu dừa: đá trân châu: đất = 5: 2: 1: 2 làm giá thể cấy, tỷ lệ sống trung bình là 94%, cây cấy mô sinh trưởng tốt, lá xanh dày, cây khỏe. 7 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu Cây Sói rừng (Sarcandra glabra) được thu hái tại khu bảo tồn thiên nhiên Bán đảo Sơn Trà, thành phố Đà Nẵng. Mẫu lá, thân và hạt cây Sói rừng được thu hái ngoài tự nhiên dùng làm nguyên liệu để nuôi cấy in vitro, mẫu được thu tại các toạ độ sau: Toạ độ 1: N 16o 08.125’/ E 108o 15.104’. Toạ độ 2: N 16o 08.033’/ E 108o 15.145’. Toạ độ 3: N 16o 08.133’/ E 108o 15.103’. A B C 2.1: Cây Sói rừng ngoài tự nhiên, mẫu thân và lá và Quả Sói rừng (A) Cây Sói rừng ngoài tự nhiên, (B) Mẫu thân và lá (C) Quả Sói rừng. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu in vitro cây Sói rừng Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu quả khử trùng lá và thân cây Sói rừng Mẫu lá và thân cây Sói rừng được rửa sạch dưới vòi nước chảy trong vòng 30 phút. Sau đó mẫu được ngâm với xà phòng pha loãng 10 phút. Tiếp tục rửa mẫu dưới vời nước chảy sao cho hết bụi bẩn và xà phòng, tráng mẫu với nước cất vô trùng 3 lần trước khi đem vào tủ cấy để tiếp tục khử trùng. Trong tủ cấy, mẫu được lắc trong ethanol 70% trong 30s, sau đó tráng nước cất 3 lần. Khử trùng mẫu với dung dịch HgCl2 0,1% với lần lượt thời 8 gian khác nhau 5 phút, 7 phút,10 phút và 15 phút để khử trùng bề mặt và rửa 5 lần với nước cất. Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mẫu nhiễm, tỷ lệ mẫu sống, tỷ lệ mẫu chết Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu quả khử trùng hạt cây Sói rừng Quả Sói rừng sau khi thu hái về được tách bỏ phần thịt quả và thu phần hạt. Mẫu hạt cây Sói rừng được rửa sạch dưới vòi nước chảy trong vòng 30 phút. Sau đó mẫu được ngâm với xà phòng pha loãng 10 phút. Tiếp tục rửa mẫu dưới vời nước chảy sao cho hết bụi bẩn và xà phòng, tráng mẫu với nước cất vô trùng 3 lần trước khi đem vào tủ cấy để tiếp tục khử trùng. Trong tủ cấy, tiến hành tách vỏ hạt lắc trong ethanol 70% 30s, sau đó tráng nước cất 3 lần. Khử trùng mẫu với dung dịch HgCl2 0,1% với lần lượt thời gian khác nhau 5 phút, 7 phút,10 phút và 15 phút để khử trùng bề mặt và rửa 5 lần với nước cất. Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mẫu nhiễm, tỷ lệ mẫu sống, tỷ lệ mẫu chết Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng đến khả năng nảy mầm hạt cây Sói rừng Cách tiến hành: mẫu hạt đã được khử trùng thành công từ thí nghiệm 2 được cấy vào môi trường MS có bổ sung 3% (w/v) succrose; BA với nồng độ 0 - 2,0 mg/l. Giá trị pH môi trường 5,7 - 5,8. Thời gian theo dõi mẫu: 4 tuần sau khi vào mẫu. Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ nảy mầm, chiều cao chồi, số lá/chồi 2.2.2. Khảo sát khả năng phát sinh callus của lá và thân cây Sói rừng ngoài tự nhiên Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của 2,4-D đến khả năng phát sinh callus của lá và thân cây Sói rừng Cách tiến hành: mẫu lá non 1,5 – 2 cm đã được khử trùng cấy vào môi trường MS có bổ sung 3% (w/v) sucrose; 2,4-D với nồng độ 2,0 mg/l. Giá trị pH môi trường 5,7 - 5,8. Thời gian theo dõi mẫu: từ 2 – 3 tuần sau khi vào mẫu. Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ tạo callus, hình thái callus, kích thước callus Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của KIN đến khả năng phát sinh callus của lá và thân cây Sói rừng Cách tiến hành: mẫu lá non 1,5 – 2 cm đã được khử trùng cấy vào môi trường MS có bổ sung 3% (w/v) succrose; KIN với nồng độ 1,0 mg/l. Giá trị pH môi trường 5,7 - 5,8. Thời gian theo dõi mẫu: từ 2 – 3 tuần sau khi vào mẫu. 9 Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ tạo callus, hình thái callus, kích thước callus Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của sự kết hợp 2,4-D và KIN đến khả năng phát sinh callus của lá và thân cây Sói rừng Cách tiến hành: mẫu lá non 1,5 – 2 cm đã được khử trùng cấy vào môi trường MS có bổ sung 3% (w/v) succrose; 2,4-D với nồng độ 1,5 - 2,0 mg/l và KIN với nồng độ 0,25 – 0,5 mg/l. Giá trị pH môi trường 5,7 - 5,8. Thời gian theo dõi mẫu: từ 2 – 3 tuần sau khi vào mẫu. Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ tạo callus, hình thái callus, kích thước callus. Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của sự kết hợp 2,4-D và 6-BA đến khả năng phát sinh callus của lá và thân cây Sói rừng Cách tiến hành: mẫu lá non 1,5 – 2 cm đã được khử trùng cấy vào môi trường MS có bổ sung 3% (w/v) succrose; 2,4-D với nồng độ 2,0 mg/l và 6-BA với nồng độ 0,5 – 1,5 mg/l. Giá trị pH môi trường 5,7 – 5,8 Thời gian theo dõi mẫu: từ 2 -3 tuần sau khi vào mẫu. Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ tạo callus, hình thái callus, kích thước callus. Hạt Sói rừng được rửa sạch dưới vòi nước chảy trong vòng 30 phút. Sau đó mẫu được ngâm với xà phòng pha loãng 10 phút. Tiếp tục rửa mẫu dưới vời nước chảy sao cho hết bụi bẩn và xà phòng, tráng mẫu với nước cất vô trùng 3 lần trước khi đem vào tủ cấy để tiếp tục khử trùng. Trong tủ cấy, mẫu được lắc trong ethanol 70% trong 30s, sau đó tráng nước cất 3 lần. Khử trùng mẫu với dung dịch HgCl2 0,1% với lần lượt thời gian khác nhau 5 phút, 7 phút, 10 phút và 15 phút để khử trùng bề mặt và rửa 5 lần với nước cất. Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mẫu nhiễm, tỷ lệ mẫu sống, tỷ lệ mẫu chết Cách tiến hành: hạt Sói rừng đã được khử trùng cấy vào môi trường MS0 và MS có bổ sung 3% (w/v) succrose; BA với nồng độ 0,5-1,5 mg/l. Giá trị pH môi trường 5,7 - 5,8. Thời gian theo dõi mẫu: từ 4 tuần sau khi vào mẫu. Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ nảy mầm (%) , chiều cao cây (cm), số lá/cây(lá) 2.2.5. Phương pháp xử lí số liệu Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Kết quả thí nghiệm được tính trung bình và phân tích ANOVA với Duncan’s test (p < 0,05) 10