Tài liệu Nghiên cứu tạo dõng biểu hiện gen mã hóa chitinase phân lập từ bacillus sp. vào hệ thống vector pqe30

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM KHOA SINH - MÔI TRƢỜNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU TẠO DÕNG BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CHITINASE PHÂN LẬP TỪ BACILLUS SP. VÀO HỆ THỐNG VECTOR pQE30 LÊ THỊ NHẬT ANH Đà Nẵng, năm 2022 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM KHOA SINH - MÔI TRƢỜNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU TẠO DÕNG BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CHITINASE PHÂN LẬP TỪ BACILLUS SP. VÀO HỆ THỐNG VECTOR pQE30 Ngành : Công nghệ sinh học Khóa : 2018-2022 Sinh viên : Lê Thị Nhật Anh Ngƣời hƣớng dẫn : ThS. Vũ Đức Hoàng Đà Nẵng, năm 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả trình bày đề tài là trung thực, khách quan và nghiêm túc. Những tài liệu tham khảo cho đề tài có nguồn gốc rõ ràng. Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm nếu vi phạm bất kì quy định nào về đạo đức khoa học. Sinh viên thực hiện Lê Thị Nhật Anh i LỜI CẢM ƠN Trƣớc hết, tôi xin chân thành cảm ơn mẹ, cảm ơn ngƣời đã giúp đỡ, động viên tôi, là hậu phƣơng vững chắc hỗ trợ tôi có thể tập trung hoàn thành tốt đề tài này. Đặc biệt, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy Vũ Đức Hoàng, ngƣời thầy tâm huyết đã tận tình giúp đỡ tôi, khích lệ tinh thần và dành nhiều thời gian trao đổi với tôi. Cảm ơn thầy đã luôn theo sát, truyền đạt kiến thức chuyên ngành, đƣa ra những góp ý về kinh nghiệm thực tiễn trong ngành cũng nhƣ trong cuộc sống suốt thời gian vừa qua. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các quý thầy cô khoa Sinh - Môi trƣờng đã giúp đỡ, hỗ trợ tôi trong suốt quá trình học tập bốn năm trên giảng đƣờng đại học, luôn tạo điều kiện và cơ hội để sinh viên đƣợc học tập, rèn luyện tốt nhất. Sau cùng, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến những ngƣời bạn, ngƣời anh, ngƣời chị và các bạn sinh viên khóa dƣới đã luôn đồng hành cùng tôi, luôn chia sẻ kiến thức và hỗ trợ giúp đỡ lẫn nhau trong quá trình nghiên cứu, học tập. Tôi xin chân thành cảm ơn! Đà Nẵng, ngày 20 tháng 5 năm 2022 Sinh viên thực hiện ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .................................................................................................................i LỜI CẢM ƠN ..................................................................................................................... ii MỤC LỤC ......................................................................................................................... iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................................... v DANH MỤC BẢNG BIỂU ................................................................................................vi DANH MỤC HÌNH ẢNH ................................................................................................ vii TÓM TẮT ........................................................................................................................ viii MỞ ĐẦU ............................................................................................................................. 1 1. Tính cấp thiết của đề tài ................................................................................................... 1 2. Mục tiêu đề tài ................................................................................................................. 2 3. Ý nghĩa của đề tài ............................................................................................................ 2 3.1. Ý nghĩa khoa học .......................................................................................................... 2 3.2. Ý nghĩa thực tiễn ........................................................................................................... 2 4. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................................ 2 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................................. 3 1.1. Tổng quan về Chitinase ................................................................................................ 3 1.1.1. Giới thiệu về chitinase ............................................................................................... 3 1.1.2. Phân loại chitinase ..................................................................................................... 3 1.1.3. Nguồn thu nhận chitinase .......................................................................................... 6 1.1.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp chitinase .................................... 6 1.1.5. Ứng dụng của Chitinase ............................................................................................. 9 1.2. Công nghệ DNA tái tổ hợp ......................................................................................... 12 1.3. Tình hình nghiên cứu chitinase ................................................................................... 13 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................... 17 2.1. Vật liệu nghiên cứu ..................................................................................................... 17 iii 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................................ 17 2.2.1. Tách chiết DNA tổng số từ Bacillus sp. .................................................................. 17 2.2.2. Phân lập gen mã hóa chitinase ................................................................................. 18 2.2.3. Chuẩn bị tế bào E. Coli TOP 10 khả biến ................................................................ 19 2.2.4. Tạo dòng gen mã hóa chitinase vào hệ thống vector pGEM®-T (Promega, Mỹ).... 19 2.2.5. Tách chiết vector tái tổ hợp pGEM®-T-Chitinase và vector pQE30 ....................... 19 2.2.6. Tạo dòng biểu hiện gen mã hóa Chitinase vào hệ thống vector pQE30 .................. 20 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................... 21 3.1. Tách chiết DNA tổng số ............................................................................................. 21 3.2. Phân lập gen mã hóa chitinase .................................................................................... 21 3.3. Tạo dòng gene mã hóa chitinase vào vector pGEM®-T ............................................. 23 3.4. Tinh sạch plasmid pQE30 và pGEM®-T-Chitinase .................................................... 25 3.5. Tạo dòng biểu hiện gen mã hóa chitinase vào hệ thống vector pQE30 ...................... 26 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................................... 31 1. Kết luận .......................................................................................................................... 31 2. Kiến nghị ........................................................................................................................ 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 32 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Bp Base pair Cs Cộng sự DNA Deoxyribonucleic acid EDTA Ethylene diamine tetra - acetic acid Kb Kilobase LB Môi trƣờng Luria bertani PCI Phenol : chloroform : isoamylalcohol PCR Polymerase chain reaction RE Restriction enzyme TBE Tris - Axit axetic - EDTA TE Tris - EDTA v DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng Tên bảng biểu Trang 2.1. Trình tự cặp mồi đƣợc dùng để khuếch đại gen chitinase 18 vi DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình Tên hình vẽ Trang 1.1. Cơ chế thủy phân của chitinase 5 2.1. Hệ thống vector pQE30 17 2.2. Chuẩn bị tế bào khả biến E.Coli TOP 10 19 3.1. DNA tổng số của chủng Bacillus sp. 21 3.2. Sản phẩm khuếch đại PCR gen chitinase 22 3.3. Tinh sạch gen chitinase. 22 3.4. Thể biến nạp trên môi trƣờng LB rắn có bổ sung Ampicillin 23 3.5. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc 24 3.6. Kết quả ttinh sạch pGEM®-T-Chitinase 24 3.7. Kết quả phản ứng cắt của pGEM®-T-Chitinase 25 3.8. Kết quả điện di tinh sạch pGEM®-T-Chitinase và pQE30 26 3.9. Kết quả phản ứng cắt bằng BamHI của pGEM®-T-Chitinase 27 3.10. Kết quả phản ứng cắt bằng KpnI pGEM®-T-Chitinase 28 3.11. Kết quả của phản ứng cắt pQE30 28 vii TÓM TẮT Kỹ thuật DNA tái tổ hợp là công nghệ then chốt của lĩnh vực công nghệ sinh học, cho phép phân lập, khuếch đại một trình tự gen từ hệ genome của một sinh vật với mục đích nghiên cứu, chỉnh sửa và chuyển nó vào một cơ thể mới nhằm tạo ra các sản phẩm tốt phục vụ cho đời sống con ngƣời. Sử dụng kỹ thuật DNA tái tổ hợp để sản xuất chitinase với chất lƣợng tốt đang nhận đƣợc nhiều sự quan tâm và nghiên cứu. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tạo dòng thành công pGEM®-T-Chitinase từ Bacillus sp. đƣợc cung cấp bởi Khoa Sinh - Môi trƣờng, trƣờng ĐH Sƣ phạm - ĐH Đà Nẵng. Trình tự mồi đƣợc thiết kế cho sản phẩm đặc hiệu với kích thƣớc khoảng 1 kb. Mặc dù đã thành công trong việc tạo dòng nhƣng 2 enzyme đƣợc thiết kế trên mồi không cắt hiệu quả. Kết quả của nghiên cứu là cơ sở cho tối ƣu phản ứng PCR, thiết kế mồi. Từ khóa: Chitinase; tái tổ hợp; tạo dòng; Bacillus sp.; E.Coli TOP 10. viii MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Thủy sản là một trong những mặt hàng sản xuất chủ lực của Việt Nam với đóng góp bình quân 9 - 10%/năm vào tổng kim ngạch xuất khẩu của cả nƣớc (Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu Việt Nam). Trong đó, vị trí “át chủ bài” thuộc về mặt hàng tôm với sản lƣợng đạt trên 900.000 tấn/năm. Riêng sản lƣợng tôm sú đạt trên 250.000 tấn, đứng đầu thế giới, theo thống kê của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn năm 2021. Bên cạnh đó, ngành sản xuất này hằng năm cũng thải ra một lƣợng lớn phế phụ phẩm chiếm khoảng 35% - 45% nguyên liệu (Meyers SP, 1986). Phần lớn, nguồn nguyên liệu này đƣợc sử dụng làm thức ăn gia súc, phân bón hoặc đƣợc thải ra môi trƣờng gây lãng phí tài nguyên, ảnh hƣởng đến sức khỏe con ngƣời và môi trƣờng. Chitin là chất tạo màng sinh học tự nhiên, phong phú đứng thứ hai, chỉ sau xenlulozơ (Shahidi và cs, 2005), chitin đƣợc tìm thấy trong vỏ tôm với hàm lƣợng lớn 15 - 25% (Zhao, J., Huang, 2011). Chitin và các các sản phẩm của chitin đƣợc sử dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp khác nhau nhƣ dƣợc phẩm, ứng dụng y sinh, lọc nƣớc, nông nghiệp, sản xuất sợi và quá trình hoàn thiện sợi dệt nhờ các đặc tính tiêu biểu nhƣ không độc hại, tƣơng thích sinh học, khả năng phân hủy sinh học, ít gây dị ứng. Ngoài ra, với hiệu lực kháng khuẩn và tính sinh miễn dịch thấp của chitin đã mở rộng các khía cạnh nghiên cứu và phát triển về mối quan hệ cấu trúc - chức năng đối với các mô và hoạt động sinh học. Tuy nhiên, chitin không hòa tan trong hầu hết các dung môi thông thƣờng nhƣ nƣớc, dung môi hữu cơ, dung dịch axit loãng và bazơ do liên kết hydro giữa và nội phân tử cao. Tính không hòa tan của chitin ảnh hƣởng đến việc mở rộng quy trình sản xuất các sản phẩm dựa trên chitin. Chitinase (EC 3.2.1.14) là enzyme xúc tác quá trình chuyển hóa cơ chất chitin không hòa tan trong nƣớc thành các sản phẩm chitooligosaccharide hòa tan trong nƣớc thông qua quá trình thủy phân liên kết glucosyl. Chitinase có thể đƣợc tìm thấy ở những loài có thành phần cấu trúc chứa chitin nhƣ nấm, côn trùng, giáp xác, đến những loài không có chitin nhƣ vi khuẩn, thực vật. Tuy nhiên, chitinase thu nhận từ những nguồn này có hàm lƣợng thấp, độ tinh sạch không cao, quy trình phức tạp, chi phí đầu tƣ lớn. 1 Do đó, việc ứng dụng sản xuất ở quy mô công nghiệp còn gặp nhiều khó khăn và hạn chế. Kỹ thuật DNA tái tổ hợp là công nghệ then chốt của lĩnh vực công nghệ sinh học, cho phép phân lập, khuếch đại một trình tự gen từ hệ genome của một sinh vật với mục đích nghiên cứu, chỉnh sửa và chuyển nó vào một cơ thể mới nhằm tạo ra các sản phẩm tốt phục vụ cho đời sống con ngƣời. Sử dụng kỹ thuật DNA tái tổ hợp để sản xuất chitinase với chất lƣợng tốt đang nhận đƣợc nhiều sự quan tâm và nghiên cứu. Các nghiên cứu đã mang lại nhiều kết quả khả quan khi tạo dòng và biểu hiện thành công gen chitinase ở các vi sinh vật nhƣ Bacillus (Montarop Yamabhai và cs, 2008), Chromobacterium (Marina Duarte và cs, 2013), Thermomyces (Ruth và cs, 2018). Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn, tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tạo dòng biểu hiện gen mã hóa chitinase phân lập từ Bacillus sp. vào hệ thống vector pQE30”. Đề tài đóng vai trò quan trọng cho các nghiên cứu tiếp theo trong việc sản xuất chitinase phục vụ công tác kiểm soát, phòng trừ các bệnh hại ở thực vật, xử lý môi trƣờng ô nhiễm, sản xuất dƣợc phẩm phục vụ cho con ngƣời. 2. Mục tiêu đề tài Phân lập gen mã hóa chitinase từ vi khuẩn Bacillus sp. Tạo dòng biểu hiện gen mã hóa chitinase vào hệ thống vector pQE30. 3. Ý nghĩa của đề tài 3.1. Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học về việc phân lập và tạo dòng biểu hiện gen mã hóa chitinase từ Bacillus sp. vào hệ thống vector pQE30. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả của đề tài là cơ sở để biểu hiện chitinase tái tổ hợp và nghiên cứu ứng dụng sản xuất chitinase tái tổ hợp ở quy mô phòng thí nghiệm. 4. Nội dung nghiên cứu Phân lập gen mã hóa chitinase từ Bacillus sp. Tạo dòng gen mã hóa chitinase vào vector pGEM®-T. Tạo dòng biểu hiện gen mã hóa chitinase vào hệ thống vector biểu hiện pQE30. 2 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về Chitinase 1.1.1. Giới thiệu về chitinase Chitinase (EC 3.2.1.14) là enzyme thuộc nhóm glycosyl hydrolase, thuỷ phân liên kết 1,4-N-acetyl-β-glucosamine của chitin (C H O N) (Purwani. E Yuli và cs, 2004). Sự 8 13 5 n tổng hợp chitinase có ở nhiều loài sinh vật, từ những loài có thành phần cấu trúc chứa chitin nhƣ nấm, côn trùng, giáp xác, đến các loài không có cấu tạo chứa chitin nhƣ vi khuẩn, thực vật,... Chitinase tham gia vào quá trình lột xác, ở các loài giáp xác (Siok Hwee Tan và cs, 2000) và côn trùng (Yasuyuki Arakane và cs, 2010). Đối với những loài không chứa thành phần chitin, chitinase đƣợc tổng hợp với nhiều mục đích khác nhau. Các loài vi khuẩn tổng hợp chitinase để sử dụng nguồn năng lƣợng cacbon, nitơ có trong chitin (Cohen và cs, 1998). Ở động vật và thực vật, chitinase chủ yếu đóng vai trò chống lại sự tấn công của mầm bệnh (Cohen-Kupiec và cs, 1998; Patil và cs, 2000; Hamel và cs, 1995). Chitinase là một nhóm đa dạng các enzyme có cấu trúc và cơ chế riêng, điều đó quyết định hoạt tính và mức độ hoạt động của enzyme đối với các ứng dụng khác nhau nhƣ: kiểm soát bệnh thực vật và côn trùng gây hại (Patil và cs, 2000); tổng hợp chitooligosaccharides (COS) (Yang S và cs, 2016) để sử dụng trong công nghiệp thực phẩm, dƣợc phẩm; quản lý chất thải biển và sản xuất nhiên liệu sinh học (Swiontek B.M. và cs, 2014; Ramírez M.V và cs, 2016). Cơ chất của chitinase là chitin và các dẫn xuất của chitin. Chitin là một polysaccharide trắng, cứng, không đàn hồi và là nguyên nhân chính dẫn đến ô nhiễm môi trƣờng ven biển (Zikakis JP, 1984). Chitinase đƣợc tăng cƣờng khi môi trƣờng nuôi cấy có mặt sự hiện diện của pepton, chitin và bị kìm hãm bởi glucose (Maiza Alves Lopes và cs, 2008). 1.1.2. Phân loại chitinase a. Phân loại dựa trên trình tự amino acid Dựa vào trình tự đầu amin (N), sự định vị của enzyme, điểm đẳng điện, peptide nhận biết và vùng cảm ứng, ngƣời ta phân loại enzyme chitinase thành 5 nhóm: 3 Nhóm I: là những đồng phân enzyme trong phân tử có đầu N giàu cystein nối với tâm xúc tác thông qua một đoạn giàu glycin hoặc prolin ở đầu carboxyl (C) (peptide nhận biết). Vùng giàu cystein có vai trò quan trọng đối với sự gắn kết enzyme và cơ chất chitin nhƣng không cần cho hoạt động xúc tác (Flach và cs, 1992). Nhóm II: là những đồng phân enzyme trong phân tử chỉ có tâm xúc tác, thiếu đoạn giàu cystein ở đầu N và peptid nhận biết ở đầu C, có trình tự amino acid tƣơng tự chitinase ở nhóm I. Chitinase nhóm II có ở thực vật, nấm và vi khuẩn. Chúng đƣợc cảm ứng bởi các tác nhân bên ngoài (Patil và cs, 2000). Nhóm III: trình tự amino acid hoàn toàn khác với chitinase nhóm I và II (Patil và cs, 2000). Nhóm IV: là những đồng phân enzyme chủ yếu có ở lá cây hai lá mầm, 41 - 47% trình tự amino acid ở tâm xúc tác của chúng tƣơng tự nhƣ chitinase nhóm I, phân tử cũng có đoạn giàu cystein nhƣng kích thƣớc phân tử nhỏ hơn đáng kể so với chitinase nhóm I (Collinge và cs, 1993). Nhóm V: dựa trên những dữ liệu về trình tự, ngƣời ta nhận thấy vùng gắn chitin (vùng giàu cystein) có thể đã giảm đi nhiều lần trong quá trình tiến hóa ở thực vật bậc cao (Patil và cs, 2000). b) Phân loại dựa trên cơ chế xúc tác Enzyme phân giải chitin bao gồm: endochitinase, chitin-1,4-β-chitobiosidase, Nacetyl-β-D-glucosaminidase (exochitinase). Endochitinase (EC 3.2.1.14): phân cắt ngẫu nhiên trong nội mạch của chitin và chitodextrin, sản phẩm tạo thành là một hỗn hợp các polymer có trọng lƣợng phân tử khác nhau nhƣ chitotriose, chitotetraose, nhƣng chiếm đa số là các diacetylchitobiose. Chitin-1,4-β-chitobiosidase: phân cắt chitin ở mức trùng hợp lớn hơn hay bằng 3 [(GlcNAc) với n ≥ 3] từ đầu không khử và chỉ phóng thích diacetylchitobiose (GlcNAc) . n 2 N-acetyl-β-D-glucosaminidase (exochitinase): phân cắt các chitooligomer (sản phẩm của sự thủy phân bởi endochitinase và chitobiosidase) hay chitin một cách liên tục từ đầu không khử và chỉ phóng thích các đơn phân N-acetyl glucosamine (GlcNAc) (Thomas và cs, 2000). 4 Hình 1.1. Cơ chế thủy phân của chitinase c) Phân loại dựa vào cấu trúc phân tử Chitinase thuộc ba họ Glycohydrolase 18, Glycohydrolase 19 và Glycohydrolase 20. Họ Glycohydrolase 18: Là họ lớn nhất với khoảng 180 chi, đƣợc tìm thấy ở hầu hết các loài thuộc Eukaryote, Prokaryote và virus. Họ này bao gồm chủ yếu là chitinase, ngoài ra còn có chitodextrinase, chitobiase và N-acetyl glucosaminidase. Các enzyme chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 có cấu trúc xác định gồm 8 xoắn α/β cuộn tròn, hoạt động thông qua một cơ chế kiểm soát mà trong đó các đoạn β-polymer bị phân cắt tạo ra sản phẩm là β-anomer. Chúng thủy phân các liên kết GlcNAc - GlcNAc, GlcNAc GlcN bằng cơ chế giữ nguyên cấu hình anomeric. Hoạt tính của các chitinase thuộc họ 18 bị ức chế bởi allosamidin (Ho Seong và cs, 1994). Các chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 bao gồm những chitinase từ thực vật (Arabidosis, dƣa leo, cây họ đậu, thuốc lá…), nấm (Aphanocladium, Rhizopus, Saccharomyces…), vi khuẩn (Alteromonas, Bacillus, Serratia, Streptomyces…), virus và động vật. Họ Glycohydrolase 19: Họ này gồm hơn 130 chi, thƣờng thấy chủ yếu ở thực vật nhƣ cà chua (Solanum tuberosum), cải (Arabidopsis thaliana), đậu Hà Lan (Pisum sativum)… ngoài ra còn có ở xạ khuẩn Streptomyces griceus, vi khuẩn Haemophilus influenzae… Chúng có cấu trúc hình cầu với một vòng xoắn và hoạt động thông qua cơ chế nghịch chuyển. Họ Glycohydrolase 20: bao gồm β-N-acetyl-D-Glucosamine acetylhexosaminidase từ vi khuẩn, Streptomyces và ngƣời. 5 1.1.3. Nguồn thu nhận chitinase Chitinase đƣợc tìm thấy ở nhiều loài sinh vật khác nhau: virus, vi khuẩn, nấm, côn trùng, thực vật bậc cao và động vật (Hamid và cs, 2013). Ở vi sinh vật, chitinase đƣợc tổng hợp để phục vụ cho quá trình ký sinh trên các vật chủ nhƣ: nấm, trứng các loài giun, côn trùng; chuyển hóa chitin thành nguồn cung cấp dinh dƣỡng giàu nitơ và carbon (Itoh và Kimoto, 2019). Ngoài vai trò trung tâm là tạo ra nguồn cacbon và năng lƣợng trong quá trình thủy phân chitin, chitinase từ vi sinh vật còn đóng vai trò bảo vệ thực vật trƣớc các bệnh lý gây ra bởi vi nấm. Tình trạng héo vàng trên dƣa chuột đƣợc gây ra bởi Fusarium oxysporum đã đƣợc ngăn chặn khi sử dụng kết hợp 2 chủng vi sinh vật có khả năng sinh chitinase: Paenibacillus sp. 300 và Streptomyces sp. 385 với hiệu quả đạt đƣợc là 71,4% (PP Singh và cs, 1999). Chitinase của nấm, giống nhƣ chitinase của vi khuẩn, có nhiều chức năng vì chúng đóng một vai trò quan trọng trong quá trình dinh dƣỡng, hình thành và phát triển của nấm. Chitinase đƣợc sinh tổng hợp ở các chi nấm sợi nhƣ Trichoderma, Aspergillus, Gliocladium, Calvatia... và cả ở các nấm lớn nhƣ Lycoperdon, Coprinus... (Haran và cs, 1996). Đối với thực vật, chitinase nằm trong hệ thống chống lại các tác nhân gây bệnh nhƣ nấm bằng cách phá vỡ thành tế bào chứa chitin của nấm. Đối với các tác nhân gây bệnh nhƣ nấm hay côn trùng chứa chitin, phản ứng tự vệ chính của thực vật là tạo ra chitinase. Ngoài ra, có thể thu nhận chitinase từ các mô, tuyến khác nhau trong hệ tiêu hóa ở một số loài động vật không xƣơng sống nhƣ: ruột khoang, giun tròn, thân mềm, chân đốt. Đối với động vật có xƣơng sống, chitinase đƣợc tiết ra từ các tuyến tụy, dịch vị dạ dày của các loài cá, lƣỡng cƣ, bò sát ăn sâu bọ, trong dịch của chim, thú ăn sâu bọ (Matsumiya và cs, 1998). Tuy nhiên, hoạt tính của chitinase thu từ thực vật, động vật còn chƣa cao, vì vậy việc thu nhận chitinase chủ yếu vẫn từ vi sinh vật. 1.1.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp chitinase Nguồn Cacbon Nguồn cacbon là nhân tố chính ảnh hƣởng tới sinh tổng hợp chitinase từ các loài vi sinh vật (Hao. Z và cs, 2012; Singh và cs, 2009). Khi bổ sung glucose, tinh bột, lamanarin, β-glucan và glycerol vào môi trƣờng lên men thì sinh tổng hợp chitinase từ vi 6 khuẩn bị ức chế. Nhƣng đối với nấm mốc, sinh tổng hợp chitinase lại tăng do thêm pectin, tinh bột, lamanarin, β-glucan. Sinh tổng hợp chitinase ngoại bào từ Fusarium chlamydosporum với hoạt độ lớn nhất khi sử dụng saccharose 10 mM (Marcum F và J. Seanor, 2007). Streptomyces viridifaciens sinh tổng hợp chitinase gấp 2 khi môi trƣờng chứa arabinose (trong số các loại đƣờng pentose và hexose), nhƣng việc bổ sung glucose lại gây ức chế sự sinh tổng hợp chitinase (Gupta. R và cs, 1995). Nếu môi trƣờng chỉ chứa nguồn cacbon dễ hấp thụ nhƣ glucose, tinh bột tan thì vi sinh vật phát triển về mặt sinh khối, nghĩa là lƣợng sinh khối thu đƣợc nhiều nhƣng lƣợng chitinase mà vi sinh vật tiết ra môi trƣờng là rất ít. Để thu đƣợc chitinase với hàm lƣợng cao hơn thì cần bổ sung chất cảm ứng (chitin) hoặc các dẫn xuất của chitin. Alcaligenes denitrificans, B. amyloliquefaciens, B. megaterium và B. subtilis sinh tổng hợp chitinase ở hoạt độ lần lƣợt 1,9 mU/l; 3,9 mU/l, 3,6 mU/l và 1,7 mU/l khi sử dụng chất cảm ứng 1% chitin từ phế phẩm vỏ tôm; ngoài ra các chủng này sinh tổng hợp chitinase với hoạt độ cao lần lƣợt là 2,7 mU/l; 3,4 mU/l; 2,2 mU/l và 4,3 mU/l ở chất cảm ứng 1% chitin thƣơng mại (Sabry. S.A, 1992). Nguồn Nitơ Nitơ chiếm 10 - 15% trọng lƣợng khô. Nitơ, thành phần cấu trúc nên axit amin, hormone, enzyme. Vì thế sự hiện diện của nitơ ảnh hƣởng rất nhiều đến quá trình tổng hợp chitinase. Các hợp chất nitơ mà vi sinh vật có thể đồng hóa đƣợc thƣờng là cao nấm men (CNM), cao malt, cao ngô, và các nguồn nitơ vô cơ nhƣ NH4NO3, (NH4)2SO4, NaNO3, ure… Trong đó nguồn cao nấm men, pepton là thành phần mà các loài nấm dễ phân giải và ƣa sử dụng nhất. Sinh tổng hợp chitinase cao nhất ở Myrothecium verrucaria tại môi trƣờng (g/l): cao nấm men 0,5; pepton 0,5. Đặc biệt bổ sung 0,03% urea thì tổng hợp chitinase tăng gấp 4 (Vyas. P.D và cs, 1989). Fusarium chlamydosporum sinh tổng hợp chitinase lớn nhất khi môi trƣờng chứa NaNO3 15 mM (Mathivanan. N và cs, 1997). Aspergillus carneus sinh tổng hợp chitinase lớn nhất ở môi trƣờng chứa cao nấm men 3 g/l (Sherief và cs, 1991). Aeromonas sp. GJ-18 sinh tổng hợp chitinase ngoại bào cao nhất trong môi trƣờng lên men chứa 1% tryptone (Ku. J.H và cs, 2005). Nguyên tố khoáng Các nguyên tố vi lƣợng có ảnh hƣởng không nhỏ đến sự sinh trƣởng và phát triển của vi sinh vật, chúng cần thiết cho sự duy trì cân bằng sinh lý tế bào. Các nguyên tố khoáng bao gồm các nguyên tố vi lƣợng nhƣ Mn, Cu, Fe, Zn…đƣợc bổ sung dạng muối 7 vô cơ nhƣ KH2PO4, MgSO4… Các ion kim loại đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì cấu trúc và cấu hình của enzyme. Ảnh hƣởng của các ion kim loại lên sinh tổng hợp chitinase của Aeromonas hydrophia HS4 và A. punctata HS6 đã đƣợc công bố bởi Saima và cộng sự (2013). Khi bổ sung một số ion kim loại vào môi trƣờng nuôi cấy nhƣ Co2+ và Mn2+ thì Aeromonas hydrophia HS4 và A. punctata HS6 sinh tổng hợp chitinase tăng đáng kể; nhƣng Ca2+ và Mg2+ lại gây ức chế Aeromonas hydrophia HS4 sinh tổng hợp chitinase; Fe2+, Mg2+ , và Hg2+ ức chế A. punctata HS6 sinh tổng hợp chitinase (Saima và cs, 2013). Tƣơng tự MnSO4 và FeSO4 đều đóng vai trò quan trọng để sinh tổng hợp chitinase từ Aspergillus terreus (Ghanem và cs, 2010). Trong môi trƣờng lên men, ở nồng độ Mg2+ và PO43- thấp, Streptomyces sinh tổng hợp chitinase tăng nhƣng ở nồng độ Mg2+ và PO43- cao thì ngƣợc lại (Nawani và cs, 2005). PO43- đóng vai trò quan trọng sinh tổng hợp chitinase từ Paenibacillus sp. D1 (Singh và cs, 2009). pH pH môi trƣờng lên men ảnh hƣởng lớn đến sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật vì ion H+ và OH- tác động trực tiếp lên màng nguyên sinh chất, làm thay đổi sự vận chuyển chất cảm ứng vào tế bào và vận chuyển enzyme ra ngoài môi trƣờng. Những biến đổi dù nhỏ nhất của pH trong môi trƣờng cũng gây những biến đổi rõ rệt về khả năng sinh trƣởng và phát triển sinh vật. Mặt khác ion H+ và OH- cũng ảnh hƣởng đến hệ enzyme trong vi sinh vật, tham gia hoạt động sống của vi sinh vật. pH thích hợp cho sinh tổng hợp chitinase từ vi sinh vật thƣờng trong vùng axit yếu (từ 4,0 - 6,5); vùng trung tính (pH 7,0); một số ở vùng kiềm yếu (từ 7,5 - 9,0). Môi trƣờng bán rắn sinh tổng hợp chitinase hoạt tính cao nhất từ nấm sợi ở khoảng pH 4 - 6. P. oxalicum sinh chitinase có hoạt tính cao nhất tại pH = 4,1 ( Nguyễn Thị Hà, 2000); P. chrysogenum tại pH = 4 (Patidar và cs, 2005); Aspergillus protuberus tại pH = 5,5 (Hao và cs, 2012). Ở môi trƣờng lỏng, lên men sinh tổng hợp chitinase hoạt tính lớn nhất đối với chủng vi sinh vật ƣa axit nhẹ pH = 3,5 - 6, Aspergillus sp. tại pH= 3,5 (Settha Kaset và cs, 2008); Nocardia orientalis tại pH = 5 (Usui. T.H và cs, 1984). Một số chủng sinh tổng hợp chitinase lớn nhất ở môi trƣờng trung tính nhƣ; Bacillus licheniformis (Takayanagi và cs, 1991), Cellulosimicrobium cellulans tại pH = 7 (Saima và cs, 2013). Nhiệt độ 8 Nhiệt độ ảnh hƣởng lớn đến tốc độ sinh trƣởng và khả năng sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật. Nhiệt độ từ 28 - 32ºC là tối ƣu cho sự sinh trƣởng của hầu hết vi sinh vật (Felse và cs, 1999), nhiệt độ tối đa là dƣới 50ºC. Nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp có thể kìm hãm sự sinh trƣởng, thậm chí gây chết sợi nấm từ đó quá trình tổng hợp enzyme sẽ bị ức chế. Sinh tổng hợp chitinase cao nhất ở khoảng nhiệt độ 25 - 35ºC. Fusarium chlamydosporum ở 28ºC đƣợc đánh giá có hàm lƣợng chitinase cao nhất (Mathivanan và cs, 1997), tƣơng tự với Trichoderma harzianum nhiệt độ phù hợp là 28ºC (Kapat và cs, 1996) và ở 30ºC (Felse và cs, 1999), đối với Streptomyces lividans (Mahadevan. B.C và D. L, 1997), S. viridifaciens ở 30ºC (Gupta và cs, 1995). Thời gian Khi thực hiện lên men, hầu hết vi khuẩn tổng hợp ra chitinase lớn nhất tại giờ thứ 72, nhƣng nấm mốc và xạ khuẩn tổng hợp chitinase lớn nhất ở khoảng giờ thứ 144 (Felse và cs, 1999). Lên men trong môi trƣờng lỏng ở điều kiện tối ƣu, các vi khuẩn thu đƣợc hàm lƣợng chitinase nhƣ sau: Talaromyces emersonii CBS81470 sinh tổng hợp lần lƣợt chitinase 1,5 mU/L trong bình tam giác nuôi lắc 96 giờ và 2,3 mU/L ở bồn lên men 48 giờ (McCormack và cs, 1991). Pseudomonas stutzeri YPL-1 sinh tổng hợp chitinase lớn nhất đạt đƣợc sau 84 giờ lên men (Ho-Seong L. và K. Sang-Dal, 1994). Serratia marcescens lên men theo mẻ sinh tổng hợp chitinase cao nhất đạt 0,027 mU/mL sau thời gian 100 giờ (Young và cs, 1985). Aeromonas sp. PTCC1691 sinh tổng hợp chitinase cao nhất đạt 9,2 U/mL tại 48 giờ lên men, sau đó khả năng sinh tổng hợp chitinase giảm khi thời gian lên men kéo dài hơn 48 giờ (Jamialahmadi và cs, 2011). Aeromonas hydrophila HS4 sinh tổng hợp chitinase cao nhất sau thời gian lên men 24 giờ và duy trì không đổi đến tận 48 giờ lên men đạt 80,9 U/mL. Aeromonas sp. GJ-18 sinh tổng hợp chitinase ngoại bào cao nhất sau 120 giờ lên men với 1,44 U/mL, sau thời gian 120 giờ lên men khả năng sinh tổng hợp chitinase giảm (Kuk và cs, 2005). 1.1.5. Ứng dụng của Chitinase 1.1.5.1. Trong lĩnh vực y dược Với khả năng phân hủy chitin trực tiếp thành các chitooligomer, chitinases có tiềm năng rất lớn trong lĩnh vực y tế và dƣợc phẩm. AMCase, axit chitinase của động vật có vú đóng vai trò quan trọng trong điều trị các phản ứng viêm do chitin gây ra ở cả viêm bẩm sinh và viêm do dị nguyên. Chitinase 9 cũng có thể đƣợc sử dụng nhƣ một chất phụ gia tiềm năng trong các loại kem dƣỡng da chống nấm, hỗ trợ điều trị kháng khuẩn (Rhoades và cs, 2006), tác nhân cầm máu trong băng vết thƣơng (Aam và cs, 2010) và hạ đƣờng huyết ở bệnh nhân tiểu đƣờng (Lee và cs, 2003). Điều chế glucosamin từ chitin làm thuốc chống đau xƣơng khớp là một vấn đề có ý nghĩa quan trọng trong y dƣợc (Trần Đình Toại và cs, 2008). Chitinase có thể phân hủy chitin thành các chitooligosaccharide nhƣ chitohexaose và chitoheptaose, cả hai đều đƣợc báo cáo là có hoạt tính chống khối u (Patil và cs, 2000). Chitinase thu nhận ở Vibrio alginolyticus phân cắt chitin thành chitopentaose và chitotriose (Murao và cs, 1992). Chitinase chống lại ký sinh trùng gây bệnh nhƣ nấm Candida albicans gây bệnh ở ruột, âm đạo, hoặc ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum gây bệnh sốt rét, giảm hoạt tính của virus nucleopolyhedro Autographa californi (Barboza-Corona và cs, 2003; Thomas và cs, 2000). Các chitinase ở ngƣời và các protein giống nhƣ chitinase đóng vai trò là chất chỉ thị cho chứng viêm và ung thƣ (Kzhyshkowska và cs, 2007). Theo nghiên cứu Pan và cs, bề mặt tế bào của các tế bào ung thƣ đƣợc nuôi cấy khi điều trị bằng chitinase sẽ bị tổn thƣơng. Vì chitin không có trong tế bào động vật có vú bình thƣờng nên việc điều trị bằng chitinase sẽ không gây ra bất kỳ tổn thƣơng hay tác dụng phụ nào cho chúng (Pan và cs, 2005; Abu-Tahon và cs, 2020). 1.1.5.2. Nghiên cứu thuốc bảo vệ thực vật Trong nông nghiệp, chitinase đƣợc sử dụng nhƣ một biện pháp kiểm soát sinh học đối với nấm bệnh và côn trùng. Đây đƣợc đánh giá là một giải pháp thay thế tiềm năng vì nó không gây ô nhiễm môi trƣờng cũng nhƣ khả năng kháng mầm bệnh, là tác dụng phụ của các chất chống nấm tổng hợp (W.T. Chang và cs, 2003; Dahiya và cs, 2005). Năm 2002, Karasuda đã nghiên cứu và nhận thấy một loại chitinase thực vật có thể đƣợc sử dụng nhƣ một tác nhân kiểm soát sinh học thay vì thuốc diệt nấm hóa học. Chitinase thu nhận từ khoai mỡ (Dioscorea opposita) đƣợc sử dụng độc lập hay kết hợp với β-1,3-glucanase bằng cách phun trực tiếp lên bề mặt quả dâu tây và lá bị nhiễm bệnh phấn trắng. Kết quả cho thấy việc sử dụng chitinase trong điều trị bệnh phấn trắng đạt hiệu quả trong việc hồi phục sức khỏe của các cây dâu tây bị nhiễm nấm mốc và bệnh không tái xuất hiện trong hơn hai tuần (Karasuda và cs, 2003). 10