Tài liệu Nghiên cứu đa dạng di truyền các dòng sâm ngọc linh (panax vietnamensis ha et. grushv) bằng chỉ thị phân tử est ssr phục vụ cho công tác chọn giống

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC DÒNG SÂM NGỌC LINH (PANAX VIETNAMENSIS HA ET. GRUSHV) BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ EST- SSR PHỤC VỤ CHO CÔNG TÁC CHỌN GIỐNG NGUYỄN YẾN VY Đà Nẵng, năm 2022 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC DÒNG SÂM NGỌC LINH (PANAX VIETNAMENSIS HA ET. GRUSHV) BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ EST- SSR PHỤC VỤ CHO CÔNG TÁC CHỌN GIỐNG Ngành : Công nghệ sinh học Khoá : 2018-2022 Sinh viên : Nguyễn Yến Vy Người hướng dẫn : TS. Nguyễn Minh Lý TS. Đinh Xuân Tú Đà Nẵng, năm 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan các dữ liệu trình bày trong khóa luận này là trung thực. Đây là kết quả nghiên cứu của tác giả và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác trước đây. Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm nếu vi phạm bất kì quy định nào về đạo đức khoa học. Sinh viên Nguyễn Yến Vy i LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận tốt nghiệp, ngoài sự nỗ lực cố gắng của bản thân, tôi đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của nhiều tập thể và cá nhân. Trước hết tôi xin bày tỏ lời cảm ơn đến Ban chủ nhiệm khoa cùng các thầy, cô trong khoa Sinh- Môi trường và môi trường Trường Đại học Sư Phạm Đà Nẵng, cùng Ban lãnh đạo và các cán bộ trong Bộ môn Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện giúp đỡ và có nhiều ý kiến quý báu giúp tôi xây dựng và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Đặc biệt tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Minh Lý và TS. Đinh Xuân Tú đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và chia sẻ nhiều kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình tôi nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Đà Nẵng, ngày tháng 05 năm 2022 Sinh viên Nguyễn Yến Vy ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .................................................................................................................. i LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................................ ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................................. iv TÓM TẮT .............................................................................................................................. v MỞ ĐẦU ............................................................................................................................... 1 1. Tính cấp thiết của đề tài ..................................................................................................... 1 2. Mục tiêu đề tài ................................................................................................................... 2 3. Ý nghĩa của đề tài .............................................................................................................. 2 4. Nội dung nghiên cứu .......................................................................................................... 2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................ 4 1.1. Tổng quan về Sâm Ngọc Linh ........................................................................................ 4 1.1.1. Đặc điểm phân bố ........................................................................................................ 4 1.1.2. Đặc điểm hình thái ....................................................................................................... 4 1.1.3. Giá trị dược liệu của sâm Ngọc Linh ........................................................................... 6 1.2. Chỉ thị phân tử ................................................................................................................ 7 1.2.1. Khái niệm và đặc điểm ................................................................................................ 7 1.2.2. Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeats) .................................................................. 8 1.2.3. Expressed Sequence Tag (EST) ................................................................................... 9 1.3. Một số nghiên cứu đa dạng di truyền Sâm Ngọc Linh bằng chỉ thị phân tử .................. 10 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................... 14 2.1. Vật liệu và phạm vi nghiên cứu ...................................................................................... 14 2.1.1. Vật liệu nghiên cứu ...................................................................................................... 14 2.1.2. Phạm vi nghiên cứu ..................................................................................................... 17 2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................................ 17 2.2.1. Phương pháp thu thập các mẫu Sâm Ngọc Linh.......................................................... 17 2.2.2. Tách chiết DNA tổng số .............................................................................................. 17 2.2.3. Phản ứng PCR (Polymerase chain reaction) ................................................................ 19 2.2.4. Kỹ thuật điện di ............................................................................................................ 20 2.2.5. Phương pháp phân tích kết quả và xử lý số liệu .......................................................... 20 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN............................................... 21 3.1. Kết quả khảo sát nhiệt độ bắt cặp của các đoạn mồi EST- SSR. .................................... 21 3.2. Kết quả xác định allen đa hình DNA và chỉ số PIC của các chỉ thị EST- SSR nghiên cứu. ......................................................................................................................................... 22 3.3. Thiết lập mối quan hệ di truyền giữa các mẫu Sâm Ngọc Linh ..................................... 25 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................................... 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................................... 30 PHỤ LỤC............................................................................................................................... 32 iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism bp Base pair CTAB Cetyl trimethyl ammonium bromide DNA Deoxyribonucleic Acid ISSR Inter- Simple Sequence Repeat Kb Kilobase pair PCR Polymerase chain reaction PIC Polymorphism Information Content RAPD Random Amplified Polymorphic DNA RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism SSR Simple Sequence Repeats TAE Tris-acetate EDTA TE Tris-EDTA iv TÓM TẮT Khảo sát và đánh giá đa dạng di truyền cây trồng có vai trò rất quan trọng trong việc thu thập, bảo tồn nguồn gen và chọn tạo giống. Ở các giống Sâm Ngọc Linh, một số giống có những đặc điểm hình thái gần như giống hệt, chỉ có một vài sự khác biệt nhỏ, thường dẫn đến sự nhầm lẫn về đánh giá nguồn gen ở cấp độ loài. Trong nghiên cứu này, chỉ thị EST- SSR được sử dụng để phân tích đa dạng di truyền ở cấp độ phân tử của 15 mẫu Sâm Ngọc Linh. Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng trong 29 chỉ thị EST- SSR, có 26 chỉ thị biểu hiện sự đa hình, khuếch đại 121 allen, trung bình mỗi chỉ thị cho 4,17 allen, trong đó chỉ thị L149 khuếch đại nhiều nhất 11 allen, chỉ thị Mr2U1, PVM129, VES17 ít nhất với 1 allen đơn hình. 15 mẫu Sâm Ngọc Linh với 29 chỉ thị EST- SSR có hệ số PIC dao động từ 0.36 đến 0.9, trung bình là 0,57; 68,97% chỉ thị có chỉ số PIC > 0,5 (20/29 chỉ thị) có sự khác biệt lớn về tỉ lệ đa hình. Hệ số tương đồng di truyền giữa các cặp mẫu Sâm Ngọc Linh nghiên cứu dao động từ 0,43-0,88. Ở mức độ tương đồng di truyền 0,68 có thể phân chia 15 mẫu Sâm Ngọc Linh thành 4 nhóm chính, có mức độ tương đồng di truyền dao động từ 0,54 đến 0,88. Nhóm I: gồm 1 mẫu S1. Nhóm II: gồm 6 mẫu là S2, S3, S4, S15, S5, S6. Nhóm III: gồm 5 mẫu là S7, S8, S9, S10, S12. Nhóm IV: gồm 3 mẫu là S11, S13 và S14. Trong 15 mẫu Sâm Ngọc Linh nghiên cứu, chọn được 66 cặp mẫu Sâm Ngọc Linh với độ tương đồng di truyền trong khoảng 0,41 đến 0,69, phù hợp với công tác chọn tạo giống ưu thế lai. Từ khóa: Chỉ thị phân tử, đa dạng di truyền, Sâm Ngọc Linh, EST- SSR. v MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Sâm Ngọc Linh có tên khoa học là P.vietnamensis Ha et Grushv., thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae), được gọi với những tên khác như sâm Việt Nam, Sâm khu năm (sâm K5), … (Pua, 2007). Sâm Ngọc Linh được xác định là cây thuốc quý về giá trị sử dụng cũng như giá trị nguồn gen. Từ phần dưới mặt đất của cây sâm Ngọc Linh đã phân lập được 52 hợp chất saponin bao gồm 26 saponin đã biết và 26 saponin có cấu trúc mới. Các saponin được xem là hoạt chất quyết định cho các tác dụng dược tính, sinh học của sâm Ngọc Linh như: ngăn ngừa các tế bào ung thư, bảo vệ gan, kích thích hệ miễn dịch,… (Nguyễn Thượng Dong & cs., 2007). Do khai thác quá mức và nạn chặt phá rừng làm cho trữ lượng của loài cây thuốc bị suy giảm. Từ nhiều năm nay, Sâm Ngọc Linh đã được đưa vào Sách Đỏ Việt Nam, danh lục Đỏ cây thuốc Việt Nam và là đối tượng được ưu tiên bảo tồn (Nguyễn Tiến Bân & cs., 2007; Nguyễn Tập, 2006; Đỗ Huy Bích & cs., 2003). Đối với các loài cây thuốc, một trong những yêu cầu hàng đầu hiện nay của nền công nghiệp dược phẩm dựa trên dược liệu tự nhiên là yêu cầu tiêu chuẩn hóa nguồn nguyên liệu ban đầu. Việc lựa chọn được nguồn gen có chất lượng phục vụ công tác chọn tạo giống các loài cây thuốc có vai trò hết sức quan trọng (Phạm Thanh Huyền, Đinh Đoàn Long, 2017). Với sự phát triển của công nghệ sinh học, các công cụ phân tử ra đời đã tỏ rõ ưu thế trong công tác phân loại, bảo tồn, chọn, tạo và nhân giống các loài thực vật, bởi chúng không chịu ảnh hưởng từ điều kiện nuôi trồng, đồng thời có thể thao tác trên một số lượng lớn mẫu nhất định với độ chính xác cao để đáp ứng yêu cầu của quá trình phát triển một nền công nghiệp chế biến dược liệu bền vững. Các chỉ thị phân tử khác nhau được nghiên cứu và phát triển đã trở thành công cụ để phân tích đa dạng di truyền và xác định các mối quan hệ giữa các giống cây trồng như RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA), SSR (Simple Sequence Repeats), ISSR (Inter-Simple Sequence Repeats),… Trong đó, chỉ thị SSR là một loại chỉ thị được sử dụng khá phổ biến, chính xác và hữu hiệu giúp phân loại các giống cây trồng khác nhau trong cùng một loài thực vật vì có những ưu điểm vượt trội hơn so với những chỉ thị khác do khả năng phát hiện đa hình cao. 1 Dựa theo nguồn gốc, chỉ thị SSR được chia thành 2 loại: SSR từ thư viện bộ gen và SSR từ cơ sở dữ liệu EST. Các dấu hiệu lặp lại trình tự đơn giản có nguồn gốc từ thẻ biểu hiện (EST-SSRs) là các dấu hiệu được lựa chọn sử dụng trong nghiên cứu này bởi vì chúng rất phong phú, có tính đồng trội, đa hình cao và dễ dàng lập bản đồ di truyền giữa các loài có mối quan hệ gần gũi với nhau. Hiện nay nhu cầu sử dụng Sâm Ngọc Linh ở Việt Nam là rất lớn. Vấn đề đặt ra là làm thế nào để khai thác và phát triển bền vững loài cây thuốc này đáp ứng nhu cầu thị trường trong nước. Để có cơ sở cho công tác bảo tồn và chọn lọc nguồn nguyên liệu làm giống để phát triển nguồn nguyên liệu làm thuốc thì việc đánh giá mức độ đa dạng nguồn gen Sâm Ngọc Linh là thực sự cần thiết. Trên cơ sở đó, tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu đa dạng di truyền các dòng Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) bằng chỉ thị phân tử EST-SSR phục vụ cho công tác chọn giống”. 2. Mục tiêu đề tài Đánh giá được mức độ đa dạng di truyền của các mẫu Sâm Ngọc Linh trong bộ giống gốc bằng chỉ thị phân tử EST-SSR phục vụ công tác chọn giống. 3. Ý nghĩa của đề tài a. Ý nghĩa khoa học Kết quả của đề tài sẽ đóng góp đáng kể vào các nghiên cứu về xác định tính đa dạng di truyền của các giống sâm Ngọc Linh nói chung và các loài dược liệu quý ở Việt Nam nói riêng. Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ bổ sung những tư liệu khoa học về đặc điểm di truyền của sâm Ngọc Linh, góp phần làm phong phú thêm kho tư liệu về sâm và làm cơ sở cho các nhà chọn tạo giống nghiên cứu. b. Ý nghĩa thực tiễn Đề tài đánh giá đa dạng di truyền ở cấp độ phân tử của 15 mẫu giống Sâm Ngọc Linh, cho phép phân loại các mẫu giống cùng hệ số tương đồng di truyền với nhau cùng 1 nhóm, từ đó chọn cặp để lai tạo giống Sâm Ngọc Linh có ưu thế lai cao phục vụ cho công tác chọn giống. 4. Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Khảo sát nhiệt độ bắt cặp của các đoạn mồi EST- SSR. 2 Nội dung 2: Xác định mức độ đa hình của các chỉ thị phân tử EST- SSR. Nội dung 3: Đánh giá mức độ đa dạng di truyền của các dòng sâm Ngọc Linh. 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về Sâm Ngọc Linh 1.1.1. Đặc điểm phân bố Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) là một loài cây thuộc họ Cam tùng (Araliaceae), còn gọi là sâm Việt Nam, sâm Khu Năm (sâm K5), sâm trúc (sâm đốt trúc, trúc tiết nhân sâm) củ ngải rọm con hay cây thuốc giấu, là loại sâm quý được tìm thấy tại miền Trung Trung Bộ Việt Nam. Sâm Việt Nam (Sâm Ngọc Linh) hiện đang phân bố trên vùng sinh thái hẹp, quanh đỉnh núi Ngọc Linh, dưới các tán rừng nguyên sinh thuộc địa phận của 3 huyện là: Nam Trà My (Quảng Nam), Đắk Glei và Tu Mơ Rông (Kon Tum). Vùng sinh trưởng và phát triển của sâm Ngọc Linh nằm hoàn toàn trên dãy núi Ngọc Linh, có tọa độ địa lý trong khoảng từ 14° 44’ đến 15° 13’ vĩ độ Bắc và từ 107° 45’ đến 108° 10’ kinh độ Đông, đây cũng là giới hạn xa nhất về phía Nam (trong khoảng 15° vĩ Bắc) của bản đồ phân bố chi Panax L. trên thế giới. Ngoài Ngọc Linh, sâm còn phân bố tại núi Ngọc Lum Heo thuộc xã Phước Lộc, huyện Phước Sơn và còn có thể có ở đỉnh Ngọc Am tỉnh Quảng Nam, Đắc Glây thuộc Kontum, núi Langbian ở Lạc Dương tỉnh Lâm Đồng (Dương Tấn Nhựt, 2016). Sâm Ngọc Linh được phát hiện ở độ cao từ 1.200m trở lên (có tài liệu cho biết cao độ tìm thấy sâm Ngọc Linh là khoảng 1.500m), tập trung nhiều nhất từ 1.700- 2.000 m dưới tán rừng già thuộc núi Ngọc Linh ở hai tỉnh Kon Tum và Quảng Nam. Sâm mọc tập trung dưới chân núi Ngọc Linh cao 2.598m với lớp đất vàng đỏ trên đá granit dày trên 50cm, có độ mùn cao, tơi xốp và rừng nguyên sinh còn rộng, nên được gọi là sâm Ngọc Linh (Dương Tấn Nhựt, 2014). Hiện tại, sâm Ngọc Linh đã được đưa vào danh mục sách đỏ của Liên minh Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế (IUCN) năm 2003 và danh sách các loài hạn chế khai thác và sử dụng vì mục đích thương mại (nghị định 32/2006/NĐ-CP ngày 31/03/2006 về quản lý thực vật rừng, động vật rừng nguy cấp quý hiếm). Đến nay, sâm Ngọc Linh chỉ còn tập trung tại 2 điểm bảo tồn là Chốt Sâm (xã Măng Ri, huyện Tu Mơ Rông, tỉnh Kon Tum) và Trạm Dược liệu Trà Linh (xã Trà Linh, huyện Nam Trà My, tỉnh Quảng Nam) với tổng diện tích trồng khoảng 10 hecta (Đỗ Hữu Bích, 2003; Hà Thị Dụng & cs., 1983). 1.1.2. Đặc điểm hình thái 4 Sâm Ngọc Linh là loài cây thân thảo sống lâu năm, cao khoảng 40 - 100 cm. Cây mọc dưới tán rừng ẩm, nhiều mùn, thích hợp với nhiệt độ ban ngày 25°C, ban đêm 15°C - 18°C, sâm Ngọc Linh có thể sống rất lâu, thậm chí trên 100 năm, sinh trưởng khá chậm. Bộ phận dùng làm thuốc chủ yếu là thân rễ, ngoài ra cũng có thể dùng lá và rễ con (Dương Tấn Nhựt, 2014). Thân: Sâm Ngọc Linh có dạng thân khí sinh thẳng đứng, màu lục hoặc hơi tím, nhỏ, có đường kính thân 4-8mm, thường tàn lụi đi hàng năm tuy thỉnh thoảng cũng tồn tại một vài thân trong vài năm. Thân rễ: có đường kính 1 - 3,5 cm, chiều dài tuỳ theo số năm sinh trưởng, màu vàng nhạt hay vàng đất, có nhiều đốt, mang những vết sẹo do thân lụi hàng năm để lại, mỗi vết tương đương với 1 năm tuổi. Thân rễ mang nhiều rễ con và những vết nhăn dọc, mùi thơm nhẹ, vị đắng hơi ngọt. Thân rễ có thể phân nhánh nhiều lần và hình thành một bụi sâm nhưng rất hiếm. Rễ củ: rễ củ nằm cuối thân rễ, dạng con quay, hình trụ, đôi khi có dạng hình người, màu vàng nhạt, mang nhiều rễ con và có vân ngang. Cây sâm trồng có rễ củ phát triển hơn và thường có 3 dạng: dạng củ cà rốt, dạng con quay và phổ biến nhất là dạng một bó củ. Lá: Các thân mang lá và tương ứng với mỗi thân mang lá là một đốt dài khoảng 0,5-0,7cm, sâm chỉ có một lá duy nhất không rụng suốt từ năm thứ 1 đến năm thứ 3 và chỉ từ năm thứ 4 trở đi mới có thêm 2 đến 3 lá. Lá kép hình chân vịt mọc vòng với 3-5 nhánh lá ở đỉnh thân. Cuống lá kép dài 6-12 mm, mang 5 lá chét, lá chét ở chính giữa lớn hơn cả với độ dài 12-15 cm, rộng 3-4 cm. Gân lá hình lông chim, thường có 10 cặp, gân phụ hình mạng. Lá chét phiến hình bầu dục, màu xanh lục, mảnh, dễ rách, mép khía răng cưa, chóp nhọn, lá có lông ở cả hai mặt. Hoa: Hoa dạng cụm, thường xuất hiện ở cây có 3 lá kép trở lên. Mỗi cụm hoa có 50 - 120 hoa, cuống dài 1 - 1,5 cm. Hoa màu vàng lục nhạt, đường kính 3 - 4 mm, gồm 5 lá đài hợp thành hình chuông, 5 cánh hoa, 5 nhị màu trắng. Bao phấn hình xoan, đính lưng, đĩa hoa hơi lồi. Bầu cao 1- 1,5 mm, có 2 lá noãn, nhưng thường chỉ có 1 lá noãn phát triển. Mùa hoa thay đổi theo vùng nhưng thường bắt đầu từ tháng 4 đến tháng 6. Quả: Quả mọc tập trung ở trung tâm của tán lá, dài độ 0,8cm- 1cm và rộng khoảng 0,5cm- 0,6cm, sau hai tháng bắt đầu chuyển từ màu xanh đến xanh thẫm, vàng lục, khi chín ngả màu đỏ cam với một chấm đen không đều ở đỉnh quả. 5 Hạt: Mỗi quả chứa một hạt, một số quả chứa 2 hạt và số quả trên cây bình quân khoảng 10 đến 30 quả. Chủ yếu hạt dạng hình thận, một số ít quả hình cầu dẹt chứa 2 hạt (Dong N.T. và cs., 2007). Vào đầu tháng 1 hàng năm, sâm xuất hiện chồi mới sau mùa ngủ đông, thân khí sinh lớn dần lên thành cây sâm trưởng thành có 1 tán hoa. Từ tháng 4 đến tháng 6, cây nở hoa và kết quả. Tháng 7 bắt đầu có quả chín và kéo dài đến tháng 9. Cuối tháng 10, phần thân khí sinh tàn lụi dần, lá rụng để lại một vết sẹo ở đầu củ sâm và cây bắt đầu giai đoạn ngủ đông hết tháng 12. Chính căn cứ vào vết sẹo trên đầu củ mỗi mùa đông đến mà người ta có thể nhận biết cây sâm bao nhiêu tuổi, phải ít nhất 3 năm tuổi tức trên củ có một sẹo (sau 3 năm đầu sâm chỉ rụng một lá) nên khai thác khi sâm được bảy năm tuổi trở lên. Mùa đông cũng là mùa thu hoạch tốt nhất phần thân rễ của sâm (Dương Tấn Nhựt, 2014). 1.1.3. Giá trị dược liệu của sâm Ngọc Linh Sâm Ngọc Linh là một loài sâm đặc hữu của Việt Nam được biết đến từ năm 1973, qua nghiên cứu, các nhà khoa học đã nhận thấy sâm Ngọc Linh không chỉ có các tác dụng dược lý đặc trưng của chi Sâm mà còn có những tác dụng dược lý điển hình như chống stress, chống trầm cảm, tác dụng lên sự chống oxi hóa (Nguyễn Thượng Dong & cs., 2007) , chống ung thư (Huong N. T. T & cs., 1998). Tác dụng dược lý của Sâm đã được nhiều nhà khoa học ở Việt Nam cũng như trên thế giới nghiên cứu và chứng minh, như tăng lực, tăng trí nhớ, bảo vệ cơ thể chống stress, tác động lên hệ miễn dịch, tăng sức đề kháng cho cơ thể, giúp chống viêm, ngăn cản sự lão hóa, v.v. (Duc N.M. & cs., 1996). Chính vì vậy mà sâm được xem là vị thuốc quý, đứng đầu các vị thuốc bổ theo thứ tự Sâm, Nhung, Quế, Phụ trong y học cổ truyền, đã được sử dụng từ rất lâu đời ở các nước trên thế giới cũng như ở Việt Nam (Đỗ Tất Lợi, 2006). Tác dụng chống ung thư: Các thử nghiệm dược lý cho thấy majonosid-R2, saponin chủ yếu của sâm Ngọc Linh, có tác dụng chống stress và là một chất xúc tác chống ung thư (anti-cancer promoting agent) quan trọng (Lê Tấn Đức et al., 1997). Tác dụng chống trầm cảm: sâm Ngọc Linh có tác dụng chống trầm cảm ở liều uống một lần 200 mg/kg hoặc liều 50 - 100 mg/kg dùng trong 7 ngày ở chuột trắng; majonosid-R2 tiêm màng bụng có tác dụng chống trầm cảm ở cả 3 liều 3,1; 6,2 và 12,5 mg/kg (Dong N.T. và cs., 2007). 6 Tác dụng kích thích miễn dịch: Bột chiết sâm Ngọc Linh liều uống 500 mg/kg và majonosid-R2 tiêm trong màng bụng có tác dụng làm tăng chỉ số thực bào trong thí nghiệm in vitro và in vivo ở chuột trắng. Dùng liều E. coli gây chết chuột trắng. Nếu kết hợp dùng sâm và majonosid-R2 với liều như trên sẽ làm tăng tỷ lệ chuột sống sót. Có lẽ do thuốc có tác dụng làm tăng đại thực bào đối với E. Coli (Yobimoto và cs., 2000). Tác dụng phục hồi máu: Trong thí nghiệm làm giảm hồng cầu và bạch cầu ở động vật thí nghiệm, sâm Ngọc Linh có tác dụng làm phục hồi số lượng hồng cầu và bạch cầu đã bị giảm (Đỗ Hữu Bích, 2006). Trong stress cô lập, chuột trắng được nuôi riêng từng con trong 4 tuần, thời gian ngủ khi tiêm natri barbital giảm đi 30%. Sâm Ngọc Linh liều uống 50 - 200 mg/kg hoặc hoạt chất majonosid-R2 tiêm màng bụng liều 3,1 - 12,5 mg/kg làm cho thời gian ngủ trở lại bình thường (Dong N.T. và cs., 2007). Tác dụng chống oxy hóa: Trên thí nghiệm in vivo dùng dịch nổi của mô não, gan và phân đoạn vi thể gan của chuột trắng, saponin sâm Ngọc Linh ở nồng độ 0,05 - 0,5 mg/kg có tác dụng chống oxy hóa, ức chế sự hình thành MDA (malonyl dialdehyde) là sản phẩm của quá trình oxy hóa lipid màng sinh học (Yobimoto và cs., 2000). Tác dụng dược lý khác: Sâm Ngọc Linh còn có tác dụng tăng cường nội tiết tố sinh dục, điều hòa hoạt động của tim, tác dụng chống tăng cholesterol máu, tác dụng bảo vệ gan khỏi các yếu tố gây độc đối với gan (Đỗ Hữu Bích, 2006). 1.2. Chỉ thị phân tử 1.2.1. Khái niệm và đặc điểm Hiện nay, có nhiều phương pháp giúp phân loại, kiểm định và nghiên cứu đa dạng di truyền các loài thực vật nhằm mục đích bảo tồn và chọn giống. Bên cạnh phương pháp truyền thống là xác định và đánh giá các loài thực vật bằng nhận dạng hình thái và phân tích hóa sinh, kỹ thuật chẩn đoán bằng chỉ thị phân tử được xem là một trong những cách tiếp cận hiện đại, nhanh chóng và chính xác nhất (Jo et al., 2017). Cách tiếp cận truyền thống còn gặp rất nhiều vấn đề do ảnh hưởng của yếu tố môi trường. Sự ra đời của công cụ chỉ thị phân tử đã tỏ rõ ưu thế trong công tác phân loại, bảo tồn, chọn, tạo và nhân giống các loài thực vật, bởi chúng không chịu ảnh hưởng từ điều kiện nuôi trồng, đồng thời có thể thao tác trên một số lượng lớn mẫu nhất định với độ chính xác cao để đáp ứng yêu cầu của quá trình phát triển một nền công nghiệp chế biến dược liệu bền vững. 7 Chỉ thị phân tử DNA là những chỉ thị có bản chất đa hình DNA, nó có thể là một đoạn gen hoặc một đoạn DNA có vị trí xác định trên nhiễm sắc thể (NST) di truyền theo quy luật Menden. Các chỉ thị phân tử khác nhau được nghiên cứu và phát triển đã trở thành công cụ để phân tích đa dạng di truyền và xác định các mối quan hệ giữa các giống cây trồng như RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA), SSR (Simple Sequence Repeats), … Trong đó, chỉ thị SSR là một loại chỉ thị được sử dụng khá phổ biến, chính xác và hữu hiệu giúp phân loại các giống cây trồng khác nhau trong cùng một loài thực vật Những ưu thế của chỉ thị phân tử so với chỉ thị hình thái: + Chỉ thị phân tử có thể xác định kiểu gen của các locus tại bất kỳ giai đoạn nào và bất cứ mức độ nào (tế bào, mô hay toàn bộ cơ thể). + Số lượng các chỉ thị DNA là rất lớn, trong khi đó số lượng các chỉ thị hình thái rất hạn chế. + Các alen khác nhau thường không liên kết với các hiệu ứng có hại, trong khi việc đánh giá các chỉ thị hình thái thường hay đi kèm với những hiệu ứng kiểu hình không mong muốn. + Các alen của các chỉ thị phần lớn là đồng trội, vì thế cho phép phân biệt mọi kiểu gen ở bất kỳ thế hệ phân ly nào. Các alen của các chỉ thị hình thái thường tương tác theo kiểu trội – lặn, do đó bị hạn chế sử dụng trong nhiều tổ hợp lai. + Đối với chỉ thị hình thái các hiệu ứng lấn át thường làm sai lệch việc đánh giá các cá thể trong quần thể phân ly. Trong khi đó, chỉ thị phân tử hiệu ứng lấn át hoặc cộng tính rất ít gặp. 1.2.2. Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeats) Kỹ thuật SSR là kỹ thụât khuếch đại các trình tự lặp lại đơn giản còn được gọi là phương pháp vi vệ tinh (Microsattellite). Kỹ thuật này được Litt và Luty phát triển năm 1989 dựa trên nguyên tắc của phản ứng PCR. Trong cấu trúc hệ gen của sinh vật nhân chuẩn tồn tại một loạt các trình tự nucleotide lặp lại, chúng đặc trưng cho loài. Do sự khác nhau về số lượng nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại mà sự đa hình về độ dài của SSR được nhân bản sẽ được phát hiện sau quá trình điện di trên gel agarose hay polyacrylamide. Kỹ thuật SSR (microsatellite) được đánh giá là kỹ thuật hữu hiệu nhất trong việc nghiên cứu đa dạng di truyền ở cấp độ loài và quần thể do các chỉ thị SSR có tính đa hình 8 cao và đặc hiệu cho từng loài nghiên cứu. SSR gồm các đoạn từ 2 đến 6 cặp nucleotit được lặp đi lặp lại nhiều lần trong hệ gen. Đoạn SSR điển hình là đoạn trình tự gồm 2 - 3 cặp nucleotit, lặp lại từ 9 - 30 lần. Các đoạn trình tự bảo thủ thường dùng trong kỹ thuật SSR là ATT, AT, CTT, CT... Các đoạn lặp lại có kích thước dài ngắn khác nhau tuỳ theo từng loài, từng giống cây trồng và vật nuôi. Ưu điểm của SSR là chỉ thị đồng trội, có tính đặc hiệu và khả năng phát hiện đa hình rất cao, giúp tránh được các nhầm lẫn trong phân tích genome. SSR là công cụ hữu ích trong phân tích hệ gen và chọn giống cây trồng, do khả năng phát hiện tính đa hình rất cao. Chỉ thị này có nhược điểm là sự phức tạp trong thiết kế mồi và giá thành thiết kế mồi cao. SSR thường được dùng trong các nghiên cứu về đa dạng di truyền ở cấp độ loài và quần thể, các nghiên cứu về trao đổi di truyền, cấu trúc di truyền và mối quan hệ sinh sản trong các quần thể. Trong thực tế, chỉ thị này đã được sử dụng để phân tích quan hệ di truyền, lập bản đồ gen… 1.2.3. Expressed Sequence Tag (EST) Khái niệm: EST là một phần nhỏ của trình tự DNA (thường dài từ 200 – 500 nucleotide) được tạo ra từ một hoặc cả hai đầu của một gen biểu hiện (từ đầu 5’ hay 3’ của cDNA). Một EST có thể sử dụng giúp cho việc xác đinh những gen chưa biết và lập bản đồ của chúng trong một bộ gen (genome). EST-SSR: Các dấu hiệu lặp lại trình tự đơn giản có nguồn gốc từ thẻ biểu hiện (EST-SSRs) là các dấu hiệu được lựa chọn, bởi vì chúng rất phong phú, có tính đồng trội, đa hình cao và dễ dàng lập bản đồ di truyền giữa các loài có mối quan hệ gần gũi với nhau. Dựa theo nguồn gốc, SSR được chia thành 2 loại: SSR từ thư viện bộ gen và SSR từ cơ sở dữ liệu EST. Việc phát triển dấu hiệu SSR từ thư viện bộ gen tốn nhiều thời gian, xác suất thành công nhỏ nên sự phát triển của chỉ thị SSR bị hạn chế rất nhiều, việc phân tích và sàng lọc thường dựa vào thông tin liên quan từ các loài có quan hệ họ hàng gần gũi với nhau. Cùng với sự phát triển của công nghệ giải trình tự, dữ liệu liên quan đến EST ngày càng tăng, điều này làm phong phú thêm dấu hiệu EST-SSR. SSR có nguồn gốc từ cơ sở dữ liệu EST không chỉ có những ưu điểm tương tự như dấu hiệu SSR từ thư viện bộ gen như tính đa hình cao, tính đồng trội và độ lặp lại tốt, mà còn có tính tổng quát tốt giữa các loài. 9 Khả năng di truyền giữa các loài của chỉ thị SSR có nguồn gốc từ cơ sở dữ liệu EST (Expressed Sequence Tag) cao hơn so với các SSR có nguồn gốc từ các thư viện bộ gen DNA vì chúng có nguồn gốc từ các vùng biểu hiện và do đó chúng được sử dụng để bảo tồn nhiều hơn trên một số loài có mối quan hệ gần nhau so với các vùng không mã hóa (Varshney RK & cs., 2005). SSR từ EST đã được chứng minh là hữu ích cho việc lập bản đồ so sánh giữa các loài, so sánh hệ gen và các nghiên cứu về tiến hóa, chúng cũng được chứng minh là có tiềm năng di truyền giữa các loài cao hơn so với các chỉ thị SSR từ thư viện bộ gen DNA (Gupta PK & cs., 2003; Decroocq V& cs., 2003; Cordeiro GM &CS., 2001; Zhang LY & cs., 2006). SSR là những trình tự nucleotide ngắn, được lặp lại nhiều lần. Ưu điểm của SSR là chỉ thị đồng trội, có tính đặc hiệu thường được dùng trong các nghiên cứu về đa dạng di truyền ở cấp độ loài (Nguyễn Đức Thành & cs., 2014). Các SSR phát triển từ hệ gen phiên mã (EST-SSRs) có thể giúp tăng cường khả năng nhận dạng loài. Ngoài ra, các chỉ thị EST-SSR được thiết kế dành riêng cho một loài thường biểu thị mức độ đa hình đặc trưng do vị trí của chúng trong các vùng gen được xác định là đặc thù. Với tính đặc hiệu ưu việt đó mà đã có một số lượng lớn các EST-SSR được phát triển để giúp đánh giá cho công tác chọn giống, phân loại ở nhiều loài có giá trị kinh tế/xuất khẩu như khoai lang (Ipomoea batatas), củ cải (Raphanus sativus), địa lan (Cymbidium sinense), sâm Nga (Panax ginseng)… 1.3. Một số nghiên cứu đa dạng di truyền Sâm Ngọc Linh bằng chỉ thị phân tử 1.3.1. Nghiên cứu trên thế giới Kỹ thuật sử dụng các tiểu vệ tinh ISSR được sử dụng để nghiên cứu đa dạng di truyền như Lee & cs. (2011) đã phát triển một chỉ thị SCAR dẫn xuất từ ISSR để nhận dạng các chủng giống sâm P. ginseng nhằm phân biệt các chủng nông nghiệp có đặc tính tốt phục vụ cho chọn giống; nhóm tác giả nghiên cứu sử dụng 81 mồi dựa trên trình tự ISSR đã được áp dụng để phát hiện mức độ đa hình giữa 6 giống nhân sâm chính của Hàn Quốc, P. quinquefolius và P. notoginseng; kết quả cho thấy 3 loài thuộc chi Panax bao gồm 6 giống nhân sâm Hàn Quốc, P. quinquefolius và P. notoginseng có thể dễ dàng phân biệt bằng cách sử dụng hầu hết các loại mồi đã được thử nghiệm. Kỹ thuật RAPD dựa trên cơ sở chuỗi phản ứng polymerase PCR cũng được sử dụng cho một số nghiên cứu thuộc chi Panax phục vụ cho đánh giá đa dạng di truyền và sự khác biệt giữa các giống ở một số quần thể khác nhau như RAPD hoặc SSR. Kỹ thuật 10 phân tích DNA đa hình nhân bản ngẫu nhiên (RAPD) vào năm 2001 đã được Um et al. sử dụng để nghiên cứu trên chi Panax nhằm phân biệt rễ P. ginseng khô thu thập từ 4 vùng sinh thái khác nhau tại Trung Quốc và Hàn Quốc. Một số lượng lớn chỉ thị RAPD đã được sử dụng để đánh giá các quần thể sâm P. quinquefolius tại Canada (Bai et al., 1997) và Trung Quốc (Shao et al., 2004). Ngoài ra, Shim & cs. (2003) cũng đã tiến hành phân biệt P. ginseng (Hàn Quốc) với các loài khác trong chi Panax gồm Nhân sâm SheoAn (Trung Quốc), P. notoginseng (Trung Quốc), P. japonicus (Nhật Bản) và hai loại nhân sâm thuộc loài P. quinquefolius từ Mỹ và Canada được thu thập từ 6 vùng khác nhau. Còn đối với kỹ thuật sử dụng các chuỗi lặp lại đơn giản SSR, Choi & cs. (2011) sử dụng dựa trên các chỉ thị EST-SSR để đánh giá đa dạng truyền ở các loài Panax Ginseng và các loài liên quan, nhóm tác giả đã thử nghiệm 70 chỉ thị SSR trên 140 cặp mồi. Tất cả 70 chỉ thị đều cho thấy sự đa hình giữa bốn loài thuộc chi Panax và 19 trong số 70 chỉ thị là đa hình trong 6 giống P. ginseng. Liên quan đến vấn đề bảo hộ sản phẩm sâm Hàn Quốc, kỹ thuật này được Kim & cs. (2012) sử dụng để phát triển 19 chỉ thị EST-SSR phục vụ cho kiểm định 9 giống sâm trồng tại Hàn Quốc; kết quả cho thấy 9 giống sâm không đồng nhất và có nguồn gốc từ ba chủng khác nhau. 1.3.2. Nghiên cứu trong nước Nghiên cứu sử dụng chỉ thị DNA bằng trình tự vùng gen ITS-rDNA để đánh giá đa dạng di truyền có nhiều nghiên cứu, trong đó có các nghiên cứu như vào năm 2011, Trang & cs. đã phân tích mối quan hệ di truyền của P. vietnamensis var. vietnamesis với các loài trong chi Panax dựa trên kết quả phân tích thông tin di truyền đoạn gen ITSrDNA, kết quả cho thấy P. vietnamensis có mối quan hệ di truyền gần gũi với loài P. notoginseng và chúng khác nhau ở 18 nucleotide. 3 năm sau, Phan Kế Long & cs. (2014) đã tiến hành thực hiện trên 7 mẫu cây không có cơ quan sinh sản thuộc chi Panax thu thập được ở núi Phu Xai Lai Leng (Kỳ Sơn, Nghệ An); kết quả cho thấy các mẫu nghiên cứu có trình tự giống hệt nhau và có mối quan hệ gần gũi với loài Tam thất hoang - P. stipuleanatus H.T. Tsai et K.M. Feng. Trần Ngọc Lân & cs. (2016) cũng sử dụng chỉ thị DNA của các mẫu "Sâm puxailaileng" thu thập ở địa điểm trên; kết quả của nghiên cứu đã cho thấy các mẫu này có mối quan hệ gần gũi với Sâm Việt Nam (P. vietnamensis), khác xa với Tam thất hoang (P. stipuleanatus) và Sâm vũ diệp (P. bipinnatifidus) và kết luận "Sâm phu xai lai leng" thuộc loài P. vietnamensis Ha et Grushv. Năm 2020, Vũ Đình Duy & cs. đã sử dụng vùng gen ITS-rDNA và matK để xác định loài sâm thuộc chi 11 sâm (Panax) ở vùng núi Phu Xai Lai Leng, Kỳ Sơn, Nghệ An, cho kết quả mối quan hệ di truyền của các loài/thứ trong chi Panax có cùng nguồn gốc tiến hóa và ghi nhận Tam thất hoang có phân bố tại núi Phu Xai Lai Leng, xã Na Ngòi, Kỳ Sơn, Nghệ An, trên cở sở đó chính thức mở rộng vùng phân bố của loài này ở Việt Nam. Kỹ thuật dựa trên trình tự vùng gen ITS-rDNA cũng được nghiên cứu ở mức độ loài vào năm 2018, Phạm Quang Tuyến & cs. đã thực hiện đề tài để đánh giá đa dạng di truyền một số mẫu giống sâm thu thập tại Lai Châu bằng cách lấy đoạn trình tự gen của 24 mẫu sâm Lai Châu thu thập tại Mường Tè, Lai Châu giải trình tự và nghiên cứu sự đa dạng di truyền. Kết quả thể hiện mức tương đồng di truyền của 24 mẫu sâm Lai Châu dao động trong khoảng 96,27 đến 100%. Không chỉ dựa trên trình tự vùng gen ITS-rDNA để phân tích đa dạng di truyền mà còn có phương pháp dựa trên phân tích trình tự hệ gen cũng được sử dụng. Dựa vào trình tự hệ gen lục lạp có B. Nguyen & cs. (2015) và Kim & cs. (2017) đã giải hệ gen lục lạp Sâm Ngọc Linh của Việt Nam một cách hoàn chỉnh; kết quả xây dựng cây phân loại cho thấy trong các bộ gen lục lạp được phân tích Sâm Ngọc Linh có nguồn gốc tiến hóa gần với P. notoginseng và P. japonicus hơn P. ginseng và P. quinquefolius. Ngoài ra, chỉ thị phân tử gen nhân cũng được Lê Hùng Lĩnh & cs. (2019) sử dụng để phân tích đa dạng di truyền các loài sâm Việt Nam. Trong nghiên cứu này, 17 chỉ thị phân tử gen nhân đã được thiết kế và sử dụng để phân tích di truyền kiểu gen 19 mẫu sâm Ngọc Linh thu thập tại Kon Tum và Quảng Nam, 03 mẫu sâm Lai Châu, 01 mẫu tam thất hoang và 01 mẫu sâm Vũ Diệp của Việt Nam; kết quả cho thấy, các chỉ thị thể hiện sự đa hình cao và hệ số tương đồng di truyền của 24 mẫu sâm nghiên cứu dao động từ 48% đến 93%, kết quả chỉ ra rằng các mẫu sâm Ngọc Linh nghiên cứu không đồng nhất, rất đa dạng về kiểu gen. Năm 2016, Lê Ngọc Triệu & cs. đã sử dụng chỉ thị phân tử ISSR để đánh giá đa dạng di truyền và biến dị ở mức độ loài của 46 cá thể thuộc quần thể Sâm Lai Châu phân bố tự nhiên ở Việt Nam; kết quả đã đánh giá được độ da dạng quần thể cao, nhóm cá thể trưởng thành có mức độ đa dạng di truyền cao hơn so với nhóm cá thể có tuổi nhỏ. Nghiên cứu đã đánh giá được sự suy giảm mạnh về sự đa dạng di truyền và biến dị của quần thể Sâm Lai Châu. Cũng vào năm 2016, Trần Văn Tiến & cs. nghiên cứu về đa dạng di truyền quần thể loài tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai) và sâm Lai Châu (Panax vietnamensis var. fuscidiscus) cũng sử dụng chỉ thị ISSR ở 2 vùng Lào Cai và Lai 12 Châu; kết quả cho thấy sự đa dạng di truyền ở hai quần thể không bằng nhau, sự đa dạng di truyền của quần thể ở vùng Lào Cai cao hơn so với vùng ở Lai Châu. Ngoài kỹ thuật dựa trên các chỉ thị phân tử ISSR, dựa vào trình tự vùng gen ITSrDNA thì chỉ thị RAPD cũng đã được sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền vào năm 2020, Sâm Ngọc Linh được Trương Thị Hồng Hải & cs. phân tích đa dạng di truyền ở mẫu Sâm 4 và 5 tuổi trồng tại trại sâm Tăk Ngo của xã Trà Linh, huyện Nam Trà My, tỉnh Quảng Nam bằng chỉ thị RAPD, kết quả cho thấy sự đa dạng di truyền của các cá thể trong quần thể sâm nghiên cứu khá cao, hệ số tương đồng di truyền giữa các mẫu biến động từ 0,000-0,950 và chia thành hai nhóm chính ở hệ số tương đồng di truyền 0.700. Một số chỉ thị khác như RFLP và RAMS cũng được Thuận & cs. (2010) sử dụng để xác định 4 loài thuộc chi Panax là P. ginseng, P. quinquefolius, P. notoginseng và P. vietnamensis; kết quả của nghiên cứu cho thấy các mẫu thuộc chi Panax đã được xác định loài và phân biệt nguồn gốc nhờ các kỹ thuật sinh học phân tử. Hoặc gần đây, Huỳnh Nhật Tân & cs. (2021) cũng đã phân biệt tam thất hoang (Panax stipuleanatus) với tam thất bắc (Panax notoginseng) bằng cặp primer PCR chuyên biệt; kết quả nghiên cứu đã thiết kế được một cặp primer chuyên biệt và quy trình PCR có khả năng phân biệt hai loại tam thất này trong mẫu thực tế, ngoài ra có thể ứng dụng kỹ thuật PCR trong việc nhận dạng và phân loại các loại dược liệu có nguồn gốc từ tam thất hoang và tam thất bắc. Qua các công trình nghiên cứu vừa trình bày trên, có thể nhận thấy nhiều chỉ thị phân tử khác nhau đã và vẫn đang được sử dụng trong nghiên cứu phân tích đa dạng di truyền trong cùng chi Panax hoặc giữa các loài thuộc chi Panax. Tuy nhiên, các nghiên cứu sử dụng chỉ thị EST-SSR ở quần thể Sâm Ngọc Linh không nhiều, đa số là sử dụng các chỉ thị dựa vào trình tự vùng gen, trình tự hệ gen, RAPD,… để góp phần làm nhanh chóng và thuận tiện hóa việc xác thực mẫu, phân biệt các loài cũng như phân tích đa dạng di truyền . 13