Tài liệu Xây dựng quy trình sản xuất sinh khối sợi nấm Ganoderma lucidum

1 Phần 1: MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ en tia l Theo chúng ta đã biết thì Linh chi là một trong được thảo thiên nhiên được xếp vào loại thượng dược. Cách đây hàng ngàn năm, nấm Linh chi đã được dùng để làm thuốc, các sách dược thảo của nhiều triều đại ở Trung Quốc đều ghi nhận Linh chi được sử dụng làm thuốc từ lâu đời. Giá trị dược liệu của Linh chi đã dược ghi chép trong các thư tịch cổ của Trung Quốc, cách nay hơn 4000 năm (Zgao, J.D., 1994). Từ những kinh nghiệm lưu fid truyền trong nhân gian, loài người đã biết sử dụng Linh chi theo nhiều cách khác nhau. Đến nay khoa học kỹ thuật phát triển, nấm Linh chi còn được các nhà khoa học trên thế giới chứng minh được tác dụng hữu ích trong việc điều trị bệnh: ung thư, cao huyết on áp, tiểu đường, tim mạch, HIV, viêm gan siêu vi, suy nhược thần kinh… [3, 9] Hiện nay Linh chi không còn khan hiếm như lúc trước do con người có thể áp C dụng kỹ thuật để nuôi trồng Linh chi trong môi trường nhân tạo và ngày càng phát triển mạnh trên thế giới và đạt đến quy mô công nghiệp. Trong hai thập niên gần đây, các nhà ny khoa học ở nước Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc, Singapore, Hongkong đã tăng cường nghiên cứu sản xuất nấm Linh Chi và mở rộng hiệu quả sử dụng dược liệu này. Tại thị trường Việt Nam, nhu cầu sử dụng nấm Linh chi làm thuốc chữa bệnh ở om pa trong nước cũng như xuất khẩu ngày càng tăng. Nhiều cơ sở đã tiến hành nghiên cứu nuôi trồng, chế biến và thăm dò các hoạt chất sinh học có trong nấm Linh chi. Các thành phần hóa học có trong nấm Linh chi rất phong phú bao gồm các nhóm: acid béo, steroid, alcaloid, protein, polysaccharide… [19]. Trong đó thành phần có tác dụng dược lý quý báu, đặc trưng cho nấm Linh chi phần lớn thuộc nhóm triterpenoid [2]. C Việt Nam với khí hậu nhiệt đới gió mùa và nguồn nguyên liệu cellulose dồi dào, đã tạo điều kiện cho nghề trồng nấm không ngừng phát triển. Hiện nay cả nước có 32/61 tỉnh thành đã có cơ sở nuôi trồng nấm dược liệu (tháng 12/2001) [6]. Dựa vào tình hình ngày càng phát triển của ngành nấm ở Việt Nam và sự cho phép của bộ môn công nghệ sinh học của Trường Cao đẳng Kinh tế – Công nghệ TP. Hồ Chí SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 2 Minh chúng tôi quyết định thực hiện đề tài “Xây dựng quy trình sản xuất sinh khối sợi nấm Ganoderma lucidum”. 1.2 MỤC ĐÍCH l Xây dựng quy trình sản xuất sinh khối tơ nấm Linh chi. en tia 1.3 YÊU CẦU Ø Xác định ảnh hưởng các yếu tố dinh dưỡng đến tốc độ tăng trưởng của sợi nấm Linh chi Ø Xác định ảnh hưởng các yếu tố pH đến tốc độ tăng trưởng của sợi nấm Linh chi Ø Xác định đường cong tăng trưởng của sợi nấm Linh chi fid Ø Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy sợi nấm Linh chi theo quy trình thực nghiệm Ø Phân tích thành phần hoạt chất có trong sợi nấm Linh chi on 1.4 HẠN CHẾ ĐỀ TÀI Chưa khảo sát hết các yếu tố dinh dưỡng ảnh hưởng đến tốc độ tăng sinh khối nấm C om pa ny C Linh chi. SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 3 Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 NẤM LINH CHI [2, 5, 6, 12] en tia l 2.1.1 Khái quát chung Nấm Linh chi có tên khoa học là Ganoderma lucidum, người miền Bắc xưa còn gọi là nấm lim. Trong thư tịch cổ nấm Linh chi còn được gọi với tên khác như Tiên thảo, Nấm trường thọ, Vạn niên nhung… Nấm Linh chi thường phân bố ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, chúng thường fid phát triển trên giá thể là gỗ mục hoặc các nguyên liệu có chất sơ. Hình thái quả thể nấm Linh chi được mô tả như sau: Tai nấm hóa gỗ, hình quạt hoặc thận. Mặt trên mũ có vân đồng tâm và bóng loáng, màu vàng cam cho đến màu đỏ on đậm hoặc nâu đen. Mặt dưới phẳng, có nhiều lổ nhỏ li ti, là cơ quan sinh bào tử. Cuống nấm đặc và cứng, sậm màu và bóng loáng. C Giá trị dược liệu của Linh chi đã được ghi chép trong các thư tịch cổ của Trung Quốc, cách nay hơn 4000 năm (Zgao, J.D., 1994). Trong sách “Thần nông bản thảo“ cách ny đây khoảng 2000 năm thời nhà Châu và sau đó được nhà dược học nổi tiếng Trung Quốc Lý Thời Trân phân ra thành “Lục Bảo Linh Chi“ thời nhà Minh với các khái quát công dụng dược lý khác nhau, ứng theo từng màu (Lý Thời Trân, 1590). om pa Theo Lý Thời Trân thì nấm Linh chi có 6 màu khác nhau: ü Xích chi (Linh chi đỏ còn gọi Hồng chi) ü Hắc chi (Linh chi đen còn gọi Huyền chi) ü Thanh chi (Linh chi xanh còn gọi Long chi) ü Bạch chi (Linh chi trắng còn gọi Ngọc chi) C ü Hoàng chi (Linh chi vàng còn gọi Kim chi) ü Tử chi (Linh chi tím) Cho đến nay Linh chi không còn giới hạn trong phạm vi đất nước Trung Quốc, mà mang tính toàn cầu. Hiện tại có khoảng 250 bài báo của các nhà khoa học liên quan đến dược tính và lâm sàng của Linh chi đã được công bố. SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 4 Cấu trúc độc đáo của Linh chi chính là thành phần khoáng vi lượng đủ loại, trong đó một số khoáng tố như germanium, vanadium, crôm... Chúng đã được sử dụng là nhân tố quan trọng cho nhiều loại phản ứng chống ung thư, dị ứng, lão hóa, xơ vữa, đông máu l nội mạch, giúp điều chỉnh dẫn truyền thần kinh, bảo vệ cấu trúc của nhân tế bào với hàm en tia lượng rất thấp Ở các nước Châu Á, đặc biệt là Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài Loan…, việc nghiên cứu phát triển và sử dụng Linh chi đang được công nghiệp hóa với quy mô lớn về phân loại, nuôi trồng chủ động, chế biến và bào chế dược phẩm. Đồng thời nghiên cứu được các hoạt chất có tác dụng dược lý và phương pháp điều trị lâm sàng. fid Ở Việt Nam, trong các tài liệu lưu lại của Hải Thượng Lãn Ông, Lê Hữu Trác (1720-1791) cũng thấy đề cập đến Linh chi. Sau đó, Lê Quý Đôn còn khẳng định, đây là on nguồn sản vật quý hiếm của đất rừng Đại Nam. Trong quyển “Cây thuốc và vị thuốc Việt Nam” (1991), giáo sư Đổ Tất Lợi còn mô tả chi tiết và trình bày về đặc tính trị liệu của 2.1.2 Vị trí phân loại [5, 7] C loài nấm này, đồng thời cho rằng đây là loại Siêu thượng dược. Nấm Linh chi có vị trí phân loại được thừa nhận rộng rãi hiện nay: Ngành phụ: Lớp: Basidiomycotina Hymenomycetes Hymenomycetidae om pa Lớp phụ: Eumycota ny Ngành: Bộ: Aphyllophorales Họ: Ganodermataceae Họ phụ: Ganodermoidae Giống: Ganoderma C 2.1.3 Đặc điểm hình thái và chu trình sống của nấm Linh chi 2.1.3.1 Đặc điểm hình thái nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) Linh chi thuộc nhóm nấm lớn và rất đa dạng về chủng loại. Từ khi xác lập thành một chi riêng là Ganoderma Karst (1881), đến nay tính ra có hơn 200 loài được ghi nhận, riêng Ganoderma lucidum đã có 45 loài. [3] SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 5 Nấm Linh chi là một trong những loại nấm phá gỗ, đặc biệt trên các cây thuộc bộ Đậu (Fabales). Nấm xuất hiện nhiều vào mùa mưa, trên thân cây hoặc gốc cây. Ở Việt Nam Nấm Linh chi được gọi là nấm Lim và được phát hiện ở miền Bắc bởi Patouillard fid en tia l N.T (1890 đến 1928). on Hình 2.1: Nấm Linh chi Nấm Linh chi (quả thể) cây nấm gồm 2 phần cuống nấm và mũ nấm (phần phiến đối diện với mũ nấm). Cuống nấm dài hoặc ngắn, đính bên có hình trụ đường kính 0,5- C 3cm. Cuống nấm ít phân nhánh, đôi khi có uốn khúc cong queo. Lớp vỏ cuống màu đỏ, ny nâu đỏ, nâu đen, bóng, không có lông, phủ suốt lên mặt tán nấm. Mũ nấm khi non có hình trứng, lớn dần có hình quạt. Trên mặt mũ có vân gạch đồng tâm màu sắc từ vàng chanh - vàng nghệ - vàng nâu - vàng cam - đỏ nâu - nâu tím om pa nhẵn bóng như láng vecni. Mũ nấm có đường kính 2 - 15cm, dày 0,8 - 1,2cm, phần đính cuống thường gồ lên hoặc hơi lõm. Khi nấm đến tuổi trưởng thành thì phát tán bào tử từ C phiến có màu nâu sẫm. SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 6 2.1.3.2 Chu trình sống của nấm Linh chi Quả thể Đảm en tia l Sợi nấm song nhân Sợi nấm đơn nhân Đảm và bào tử đảm fid Phối nhân trong đảm on Hình 2.2: Chu trình phát triển của nấm Linh chi [5] (GANODERMA LUCIDUM) C 2.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐẶC TÍNH DƯỢC LÝ CỦA NẤM LINH CHI ny Các phân tích của G-Bing Lin đã chứng minh các thành phần hóa được tổng quát của nấm Linh chi như sau : [18] 12 – 13% Cellulose: 54 – 56% Lignine: 13 – 14% Lipid: 1.9 – 2.0% Monosaccharide: 4.5 – 5.0% Polysaccharide: 1.0 – 1.2% (chống hoạt động khối u, tăng C om pa Nước: sức đề kháng và hệ miễn dịch cho cơ thể) Sterol: 0.14 – 0.16% Protein: 0.08 – 0.12% Thành phần khác: K, Zn, Ca, Mn, Na, khoáng thiết yếu, nhiều vitamin, amino acid, enzyme và hợp chất alcaloid. SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 7 Từ những năm 1980 đến nay, bằng các phương pháp hiện đại: phổ kế UV (tử ngoại), IR (hồng ngoại), phổ kế khối lượng - sắc ký khí (GC – MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân và đặc biệt là kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp (HPLC) cùng phổ kế plasma (ICP), đã l xác định chính xác gần 100 hoạt chất và dẫn xuất trong nấm Linh chi. [2] lucidum) [19] Thành phần hoạt chất Nucleic acid **(Không xác Alkaloid Bổ tim Glycoprotein Ức chế khối u Nucleotide ny Adenosine om pa Beta – D - glucans Ganoderic Acids Polysaccharide Bào tử Quả thể Quả thể C ** C Kích thích hệ miễn dịch Chống virút mô nấm on định) Loại Hoạt tính dược lý fid ARN Nhóm chất en tia Bảng 2.1: Các hoạt chất sinh học và dẫn xuất trong nấm Linh chi (Ganoderma Tăng sự lưu thông máu Thư giản cơ, giảm đau Quả thể Chống khối u Kích thích hệ miễn dịch Giảm lượng đường huyết Quả thể Bổ tim Chống dị ứng Triterpenoid Bảo vệ gan Ức chế tổng hợp Quả thể cholesterol Ganodermadiol Triterpenoid Adenosine Nucleotide SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh Giảm huyết áp Ức chế ACE Tăng sự lưu thông máu Thư giản cơ, Giảm đau Quả thể Hệ sợi nấm GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 8 Chống khối u Beta – D -glucans Polysaccharide Kích thích hệ miễn dịch Hệ sợi nấm Tăng sản suất kháng thể Nucleoside Phục hồi sự dẻo dai Hệ sợi nấm Chống dị ứng Cyclooctasulpher Protein Ganodosterone Steroid Bảo vệ gan Ganoderic Acids Triterpenoid Bảo vệ gan Triterpenoid Acid béo fid Ức chế tổng hợp cholesterol Chống dị ứng C Oleic Acid Điều hoà huyết áp on –O Hệ sợi nấm Chống dị ứng quang phổ Ling Zhi – 8 Ganodermic Acid T en tia l Uridine, Uracil Hệ sợi nấm Hệ sợi nấm Hệ sợi nấm Hệ sợi nấm Hệ sợi nấm ny Năm 2001, Masao Hattori đã ly trích được 10 triterpene mới, bao gồm lucidumol A và B, các ganoderic acid: A, B, E, F, H, K, Y và R. Trong đó kiểu Lanostane triterpene om pa có thành phần chính là lipophilic. Có khoảng 130 hợp chất được ly trích từ quả thể, hệ sợi và bào tử nấm Linh chi. Thành phần và hàm lượng triterpene phụ thuộc vào nguồn giống, yếu tố môi trường. Vai trò của triterpene có ý nghĩa quan trọng trong phòng chống căn bệnh HIV. [22] Hàng loạt các nghiên cứu của Shufeng Zhou chứng minh rằng polysaccharide và triterpene của nấm Linh chi có khả năng chữa trị bệnh viêm gan mãn tính. Ganopoly ức C chế quá trình dịch mã của ADN polymerase của virút gây bệnh HBV, ngăn chặn sự hoạt động của virút. Ngoài ra polysaccharide và triterpene tác động hữu hiệu trong việc điều trị bệnh đái đường loại 2 (type II diabetes mellitus) cho các bệnh nhân. [14] Năm 1994, Lin Zhibin và Lei Lin Sheng đã xác định được trọng lượng phân tử của Polysaccharide từ G.lucidum là khoảng 7.100 – 9.300. Những tổng kết về vai trò sinh SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 9 dược học của nhóm polysaccharide ở các loài nấm Linh chi đã được giới thiệu tại Hội thảo Bắc Kinh với các báo cáo của các tác giả Đài Loan, Trung Quốc, Hoa kỳ. He, Y. et al (1992) đã khảo cứu các BN3B - gồm 4 polycaccharide đồng nhất có en tia BN3B3 là một arabinogalactan mang các liên kết glycoside. l hoạt tính tăng miễn dịch. Trong đó BN3B1 được xác định là glucan (chỉ chứa glucose) và Hikino, H.et al từ 1985 đến 1989 chứng minh hoạt lực hạ đường huyết của nhiều polysaccharide. Đó là các heteroglycan có cả hoạt tính chống ung thư. Các ganoderan B có tác dụng làm tăng mức insuline trong huyết tương, giảm sinh tổng hợp glycogen và giảm hàm lượng glycogen trong gan. Đây chính là cơ sở trị liệu trên các bệnh nhân đái fid tháo đường. Các phức hợp polysaccharide – protein có hoạt tính chống khối u và tăng tính miễn on dịch. Năm 1994, Byong Kak Kim tiến hành lai hệ sợi nấm bằng phương pháp dung hợp Protoplast giữa chủng G.lucidum với G.applanatum, thậm chí với cả nấm hương (Lentinus edodes), qua đó tăng cường hoạt tính chống khối u sarcom 180 của các phức C polysaccharide – protein lên đáng kể. Lei L.S và Lin L.B (1993) đã chứng minh tác dụng tăng sinh tổng hợp IL – 2 ny (Interleukine-2) và hoạt tính ADN polymerase ở chuột già tuổi bởi polysaccharide, càng soi sáng thêm khả năng trẻ hóa, tăng tuổi thọ của các nấm Linh chi. Những nghiên cứu về polysaccharide không tan trong nước cũng chứng tỏ hiệu lực om pa chống khối u rất rõ, thậm chí làm tan khối u với tỷ lệ ¾ ở các loài G.lucidum và G.applanatum (Takashi, 1985; Liu G.T, 1993). [2] Có lẽ đa dạng nhất và có tác dụng dược lý mạnh nhất là nhóm Saponine, triterpenoide và các acid ganoderic. Vai trò của các chất này chủ yếu là ức chế giải phóng histamine, ức chế Angiotensine Conversino emzyme (ACE), ức chế sinh tổng hợp C Cholesterol và hạ huyết áp. [2, 3, 19] 2.3 KHẢ NĂNG CHỮA BỆNH CỦA NẤM LINH CHI Linh chi được dùng như một thượng dược khoảng từ 4000 năm nay ở Trung Quốc và người ta chưa thấy tác dụng xấu hay độc tính của Linh chi. Chúng đã được khẳng định là nhân tố quan trọng cho nhiều loại phản ứng chống ung thư, dị ứng, lão hóa, xơ vữa, SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 10 đông máu nội mạch, giúp điều chỉnh dẫn truyền thần kinh, bảo vệ cấu trúc của nhân tế bào. Tài liệu cổ nhất nói tương đối cụ thể về khả năng trị liệu của nấm Linh chi cũng en tia l của Lý Thời Trân (1595). Theo tác giả trong 6 loại Linh chi thì mỗi loại có đặc tính riêng. Bảng 2.2: Lục bảo Linh chi và tác dụng trị liệu (Lý Thời Trân, 1590) Xanh Hồng chi Đỏ Hoàng chi Vàng Bạch chi Trắng Hắc chi Đen Vị chua, tính bình, không độc chủ trị sáng mắt, bồ gan khí an thần, tăng trí nhớ. Vị đắng, tính bình, không độc, tăng trí nhớ, fid Thanh chi Đặc tính dược lý dưỡng tim, bổ trung, chữa trị tức ngực. Vị ngọt, tính bình, không độc, an thần ích tì khí. on Màu sắc Vị cay, tính bình, không độc, ích phổi, thông mũi, an thần, chữa ho nghịch. Vị mặn, tính bình, không độc, trị chứng bí tiểu C Tên gọi ny Theo cách diễn đạt truyền thống của người phương Đông, các tác dụng lớn của nấm Linh chi như sau: [1, 7, 8] om pa - Kiện não (làm sáng suốt, minh mẫn) - Bảo can (bảo vệ gan) - Cường tâm (thêm sức cho tim) - Kiện vị (củng cố dạ dày và hệ tiêu hoá) - Cường phế (thêm sức cho phổi, hệ hô hấp) C - Giải độc (giải tỏa trạng thái dị cảm) - Trường sinh (tăng tuổi thọ) Qua phân tích các hoạt chất về mặt dược lý và sử dụng nấm Linh chi, người ta thấy Linh chi có tác dụng với một số bệnh: Đối với các bệnh tim mạch: Nấm Linh chi có tác dụng điều hoà, ổn định huyết áp. Khi dùng cho người huyết áp cao, nấm Linh chi không làm tăng mà làm giảm bớt, dùng SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 11 nhiều thì huyết áp ổn định. Đối với những người suy nhược cơ thể, huyết áp thấp thì nấm Linh chi có tác dụng nâng huyết áp lên gần mức dễ chịu nhờ cải thiện, chuyển hoá dinh dưỡng. Đối với bệnh nhiễm mỡ, xơ mạch, dùng nấm Linh Chi có tác dụng giảm cholesterol toàn phần, làm tăng nhóm lipoprotein tỷ trọng cao trong máu, làm giảm hệ số en tia l sinh bệnh. Nấm Linh chi làm giảm xu thế kết bờ của tiểu cầu, giảm nồng độ mỡ trong máu, giảm co tắc mạch, giải tỏa cơn đau thắt tim. Nhiều nghiên cứu đã phát hiện ra vai trò của các nguyên tố khoáng vết hiếm. Vanadium (V) có tác dụng chống tích đọng cholesterol trên thành mạch. Germanium giúp lưu thông khí huyết, tăng cường vận chuyển oxy vào mô. Hiện nay, chỉ số Ge trong các dược phẩm Linh chi được xem như là fid một chỉ tiêu quan trọng, có giá trị trong điều trị tim mạch và giảm đau trong trị liệu ung thư. [2, 3] on Đối với các bệnh về hô hấp: nấm Linh chi đem lại kết quả tốt, nhất là với những ca điều trị viêm phế quản dị ứng, hen phế quản tới 80% có tác dụng giảm và làm nhẹ bệnh theo hướng khỏi hẳn.[7, 8] C Hiệu quả chống ung thư: Bằng việc kết hợp các phương pháp xạ trị, hoá trị, giải phẫu với trị liệu nấm trên các bệnh nhân ung thư phổi, ung thư vú và ung thư dạ dày có ny thể kéo dài thời gian sống trên 5 năm cao hơn nhóm không dùng nấm. Nhiều thông tin ở Đài Loan cho biết nếu dùng nấm Linh chi trồng trên gỗ long não điều trị cho các bệnh nhân ung thư cổ tử cung đạt kết quả tốt - khối u tiêu biến hoàn toàn. Các nhà khoa học ở om pa Đại học Haifa, Israel khẳng định nấm Linh chi - một loài nấm dại thường dùng trong Đông Y ở Trung Quốc (và Việt Nam) - có thể chữa ung thư tuyến tiền liệt. Ung thư tiền liệt tuyến là một trong những dạng ung thư phổ biến nhất ở đàn ông, với hơn 543.000 người được chẩn đoán mỗi năm trên toàn thế giới. Khả năng kháng HIV: Để khảo sát khả năng kháng HIV của các hợp chất trong C nấm Ganoderma lucidum, người ta đã sử dụng dịch chiết từ quả thể trong thử nghiệm kháng virút HIV – 1 trên các tế bào lympho T ở người. Sự nhân lên của virút được xác định qua hoạt động phiên mã ngược trên bề mặt các tế bào lympho T đã được gây nhiễm HIV – 1. Kết quả cho thấy có sự ức chế mạnh mẽ hoạt động sinh sản của loại virút này (Gau J.P, 1990; Kim, 1996). Do đó, nhiều quốc gia đã đưa Linh chi vào phác đồ điều trị SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 12 tạm thời, nhằm tăng cường khả năng miễn dịch và nâng đỡ thể trạng cho các bệnh nhân trong khi AZT, DDI, DDC, còn hiếm và rất đắt. Các nghiên cứu tại Nhật Bản đã chứng minh các hoạt chất từ nấm Linh chi có tác dụng như sau: (Masao Hattori, 2001) ü Ganoderiol F và ganodermanontirol có hoạt tính chống HIV – 1 en tia l ü Ganoderderic acid B và lucidumol B có tác động ức chế hữu hiệu protease HIV – 1 ü Ganodermanondiol và lucidumol A ức chế phát triển tế bào Meth – A (mouse sarcoma) và LLC (mouse lung carcinoma). Ngoài ra các ganoderma alcohol là lanostane triterpene với nhóm hydroxol (-OH) fid ở vị trí C25 có khả năng chống HIV – 1, Meth – A và LLC ở chuột. [2, 22] Khả năng antioxydant: Nhiều thực nghiệm chỉ ra vai trò của các saponine và on triterpenoid, mà trong đó Ganoderic acid được coi là hiệu quả nhất (Wang C.H, 1985). Những nghiên cứu gần đây đang đẩy mạnh theo hướng làm giàu Selenium - một yếu tố khoáng có hoạt tính antioxydant rất mạnh – vào nấm Linh chi. Chính vì vậy con người có chi Việt Nam nói riêng. [2] C thể chờ đợi vào một dược phẩm tăng tuổi thọ, trẻ hoá từ nấm Linh chi nói chung và Linh ny Các hoạt chất sinh học trong nấm Linh chi có khả năng khử một số gốc tự do trong cơ chế chống não hóa, chống ung thư. Bảo vệ và chống ảnh hưởng của các tia chiếu xạ. Linh chi cũng có tác dụng giúp cơ thể thải loại nhanh các chất độc, kể cả các kim loại om pa năng như: Chì, Germanium. 2.4 MỘT SỐ ỨNG DỤNG LÂM SÀN Trị suy nhược thần kinh: Bệnh viện Hoa Sơn thuộc Viện Y học số 1 Thượng Hải báo cáo: Dùng cả 2 loại Linh chi nhân tạo và Linh chi hoang dại chế thành viên ( mỗi viên C tương đương 1g thuốc sống), mỗi lần uống 3 viên, ngày 3 lần, một liệu trình từ 10 ngày đến 2 tháng. Trị 225 ca, tỷ lệ kết quả 83,5 - 86,3%, nhận xét thuốc có tác dụng an thần, điều tiết thần kinh thực vật và tăng cường thể lực ( theo báo Tân y học, số phụ chuyên đề về bệnh hệ thống thần kinh 1976,3:140). SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 13 Trị chứng cholesterol máu cao: Báo cáo của Sở nghiên cứu kháng khuẩn tố công nghiệp Tứ Xuyên, dùng liên tục từ 1 đến 3 tháng cho 120 ca thuốc có tác dụng hạ cholesterol huyết thanh rõ rệt, tỷ lệ kết quả 86% ( theo báo cáo đăng trên báo thông tin Trung thảo dược 1973,1:31). en tia l Trị viêm phế quản mạn tính: Tổ nghiên cứu Linh chi tỉnh Quảng Đông báo cáo dùng siro Linh chi và đường Linh chi, trị 1.110 ca có kết quả và có nhận xét là thuốc có tác dụng đối với thể hen và thể hư hàn ( theo tờ báo cáo tư liệu Y dược Quảng Đông 1979,1:1). Trị viêm gan mạn tính: Tác giả dùng polysaccarit Linh chi chiết xuất từ Linh chi fid hoang dại chế thành thuốc bột hòa nước uống, trị các loại bệnh viêm gan mạn hoạt động, viêm gan mạn kéo dài và xơ gan gồm 367 ca, có nhận xét phần lớn triệu chứng chủ quan on được cải thiện, men SGOT, SGPT giảm tỷ lệ 67,7% ( Tạp chí Bệnh gan mật 1985,4:242). Trị chứng giảm bạch cầu: dùng polysaccarit chế thành viên (mỗi viên có 250mg thuốc sống) cho uống, theo dõi 165 ca, ghi nhận tỷ lệ có kết quả 72,57% ( Báo cáo của C Lưu Chí Phương đăng trên tạp chí Trung hoa huyết dịch bệnh 1985,7:428). Trị bệnh xơ cứng bì, viêm da cơ, bệnh liput ban đỏ, ban trọc: dùng Linh chi chế ny thành dịch, tiêm bắp và viên uống. Trị xơ cứng bì 173 ca, tỷ lệ kết quả 79,1%, viêm da cơ 43 ca, có kết quả 95%, Liput ban đỏ 84 ca có kết quả 90%, ban trọc 232 ca, có kết quả 78,88% ( Thông tin nghiên cứu Y học 1984,12:22). om pa Theo sách Trung dược ứng dụng lâm sàng: thuốc có tác dụng đối với bệnh loét bao tử, rối lọan tiêu hóa kéo dài, thường dùng phối hợp với Ngũ bội tử, Đảng sâm, Bạch truật, Trần bì, Kê nội kim, Sa nhân, Sinh khương. Trị xơ cứng mạch, cao huyết áp, tai biến mạch não: thường phối hợp với Kê huyết đằng, Thạch xương bồ, Đơn bì, Cẩu tích, Đỗ trọng, Thỏ ty tử, Hoàng tinh. Thuốc C còn dùng chữa bệnh động mạch vành, đau thắt ngực. Dùng giải độc các loại khuẩn: phối hợp với cam thảo, gừng, táo. Ngoài ra sách Những cây thuốc và vị thuốc Việt nam của Đỗ Tất Lợi có ghi: Thuốc chữa bệnh phụ nữ thời kỳ mãn kinh, giúp thông minh và trí nhớ, dùng lâu ngày SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 14 giúp cho nhẹ người, tăng tuổi thọ. Nhiều người mua nấm Linh chi về nấu canh, nấu súp làm món ăn cao cấp. l 2.5 GIỚI THIỆU SƠ LƯỢC VỀ HOẠT CHẤT CÓ TRONG NẤM LINH CHI en tia 2.5.1 Ganoderma polysaccharide (GLPs) [15, 16] Có trên 200 loại polysaccharide được ly trích và thu nhận từ nấm Linh chi nhưng polysaccharid gồm 2 loại chính: GL-A: Gal: Glu: Rham: Xyl (3,2: 2,7: 1,8; 1,0) M= 23.000 Da GL-B: Glu: Rham: Xyl (6,8: 2,0: 1,0) M= 25.000 Da fid GL-A có thành phần chính là Gal, nên gọi là Galactan, còn GL-B có thành phần chính là Glu, nên gọi là Glucan. on b (1-3) -D-glucan, khi phức hợp với một protein, có tác dụng chống ung thư rõ rệt (Kishida & al., 1988). . Hầu hết các GLPs hình thành từ 3 chuỗi monosaccharide, có cấu trúc xoắn ốc 3 C chiều, giống cấu trúc của ADN và ARN. Cấu trúc xoắn này tựa trên khung sườn cacbon, lượng khung sườn từ 100,000 – 1000,000, đa số chúng tồn tại phía trong vách tế bào trong nước nóng. ny (CWM). Một phần polysaccharide phân tử nhỏ không tan trong cồn cao độ, nhưng tan Ngoài polysaccharide từ quả thể, polysaccharide cũng được thu nhận từ quá trình nuôi om pa cấy trong môi trường dịch lỏng và rắn, chúng vẫn có hoạt tính sinh học trong việc chữa trị. Polysaccharid có nguồn gốc từ Linh chi dùng điều trị ung thư đã được công nhận sáng chế (patent) ở Nhật. Năm 1976, Cty Kureha Chemical Industry sản xuất chế phẩm trích từ Linh Chi có tác dụng kháng carcinogen. Năm 1982, Cty Teikoko Chemical C Industry sản xuất sản phẩm từ Linh chi có gốc glucoprotein làm chất ức chế neoplasm. Bằng sáng chế Mỹ 4051314, do Ohtsuka & al. (1977), sản xuất từ Linh chi chất mucopolysaccharid dùng chống ung thư. 2.5.2 Ganoderic Acid SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 15 Ganoderic acid được định hướng là một cyclopropene hoặc cyclopentene. Hàm lượng G.acid thay đổi theo giống Linh chi, môi trường nuôi trồng, giai đoạn bào tử ganodermal. Chính sự thay đổi này làm cho mức độ đắng bị ảnh hưởng. Hàm lượng G.acid cao thì có nhiều vị đắng. [18, 19] en tia l Triterpenoid là những hợp chất được tổng hợp từ 6 đơn vị isopren. Các triterpen có bộ khung chính từ 27 – 30 nguyên tử carbon (C38H48) rất thường gặp trong thực vật. Các triterpenoid tồn tại dưới dạng tự do (không có phần đường), có cấu trúc vòng, mang một số nhóm chức như: -OH; -Oac; eter -O-; Carbanil C=O; nối đôi C=C. Đặc tính chung là có tính thân dầu (tan tốt trong eter dầu hỏa, hexan, eter ethyl, cloroform), ít tan trong nước fid ngoại trừ khi chúng kết hợp với đường để tạo thành glycosid. [10, 11] on Bảng 2.3: Các hoạt chất triterpenoid có tác dụng chữa bệnh trong nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) (Lê Xuân Thám, 1996) Ganoderic acid R,S Hoạt tính Ức chế giải phóng histamin C Hoạt chất ny Ganoderic acid B, D, F, H, K, S, Y Hạ huyết áp Hạ huyết áp Ganodermic acid Mf Ức chế tổng hợp cholesterol om pa Ganodermaldiol Ganodermic acid T.O Ức chế tổng hợp cholesterol Ganodermic acid Ức chế tổng hợp cholesterol Triterpenoid đặc biệt là acid ganoderic có tác dụng chống dị ứng, ức chế sự giải C phóng histamin, tăng cường sử dụng oxy và cải thiện chức năng gan. Hiện nay, đã tìm thấy trên 80 dẫn xuất từ acid ganoderic. Trong đó ganodosteron được xem là chất kích thích hoạt động của gan và bảo vệ gan. 2.5.3 Ganoderma Adenosine [18, 19] SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 16 Adenosine thuộc nhóm purine và là thành phần chính trong cấu trúc nucleic acid. Nấm Linh chi có nhiều dẫn xuất adenosine, tất cả chúng đều có hoạt tính dược liệu mạnh. Chức năng của adenosine: ü Giảm độ nhớt máu ü Ngăn chặn hình thành cục nghẽn en tia l ü Ức chế kết dính tiểu cầu ü Tăng lượng lipoprotein 2 – 3 phosphricglycerin ü Gia tăng khả năng vận chuyển oxygen, tăng lượng máu cung cấp cho não ü Lọc máu và tăng tuần hoàn máu trong cơ thể fid 2.5.4 Alcaloid [10, 11] Alcaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ, đa số có nhân dị vòng, có phản on ứng kiềm, chúng có cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học rất đa dạng. Các alcaloid ở dạng tự do hầu như không tan trong nước, thường tan trong dung môi hữu cơ: cloroform, eter diethyl, alcol bậc thấp. Các muối của alcaloid thì tan trong C nước, alcol và hầu như không tan trong dung môi hữu cơ như: cloroform, eter, benzen. Chính vì thế, tính hòa tan của các alcaloid đóng vai trò quan trọng trong việc ly trích ny alcaloid ra khỏi nguyên liệu và trong kỹ nghệ dược phẩm điều chế dạng thuốc để uống. Alcaloid là những chất có hoạt tính sinh học, nhiều ứng dụng trong ngành y dược và nhiều chất rất độc. Các alcaloid có tác dụng rất khác nhau phụ thuộc vào cấu trúc của om pa alcaloid. ü Tác dụng lên hệ thần kinh ü Tác dụng lên huyết áp ü Tác dụng trị ung thư 2.5.5 Hợp chất Saponin [21, 23] C Saponin là một loại glycosid, có cấu trúc gồm hai phần: phần đường gọi là glycon và phần không đường gọi là aglycon. - Saponin triterpenoid: Phần aglycon của saponin triterpenoid có 30 cacbon, cấu tạo bởi 6 đơn vị hemiterpen và chia làm 2 nhóm: SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 17 ü Saponin triterpenoid pentacyclic: phần aglycon của nhóm này có cấu trúc gồm 5 vòng và phân ra thành các nhóm nhỏ: olean, ursan, lupan, hopan. Phần lớn các saponin triterpenoid trong tự nhiên đều thuộc nhóm olean. en tia thành 3 nhóm chính: dammanran, lanostan, cucurbitan. l ü Saponin triterpenoid tetracyclic: phần aglycon có cấu trúc 4 vòng và phân - Saponin steroid: Gồm các nhóm chính: spirostan, furostan, aminofurostan, spiroalan, solanidan. Hợp chất Saponin có nhiều công dụng trong y học như: ü Trị long đờm, chữa ho ü Tác dụng thông tiểu 2.5.6 Germanium hữu cơ [18, 19] on ü Tác dụng kháng viêm, chống khối u fid ü Là chất phụ gia trong một số vắc xin Gemanium là nguyên tố hiếm, do nhà khoa học người Đức khám phá vào năm C 1885. Germanium có thể cung cấp một lượng lớn oxygen và thay thế chức năng của oxygen. Nó kích thích khả năng vận chuyển oxygen tuần hoàn máu trong cơ thể lên đến ny 1,5 lần. Vì thế, làm tăng mức độ trao đổi chất và ngăn chặn quá trình lão hóa. Cơ thể con người là thành phần của các electron. Khi mức năng lượng tăng hoặc giảm thấp, dẫn đến sự xáo trộn cân bằng và biểu lộ tình trạng bệnh lý. Gemanium hữu cơ om pa sẽ duy trì mức năng lượng một cách bình thường trong cơ thể và bảo vệ sức khoẻ. Khi tế bào ung thư xuất hiện, chúng làm xáo trộn quá trình trao đổi chất. Gemanium sẽ điều hoà và kiểm soát quá trình này, từ đó ngăn chặn tế bào ung thư phát triển. Chức năng của Germanium: ü Tăng cường khả năng mang oxygen và giảm nguy cơ xuất hiện ung thư C ü Giảm nguy hiểm từ kết quả trị liệu phóng xạ ü Ngăn chặn bệnh thiếu máu cục bộ SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 18 Phần 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM LÀM THÍ NGHIỆM en tia l THÍ NGHIỆM Đề tài được thực hiện từ 27/09/2008 đến 1/1/2009 tại Phòng Thí nghiệm Vi sinh thực phẩm, Khoa Sinh học Ứng dụng - Trường Cao đẳng Kinh tế – Công nghệ TP. Hồ Chí Minh fid 3.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) được nuôi trồng tại Phòng thí nghiệm khoa sinh học ứng dụng, Trường Cao Đẳng Kinh Tế - Công Nghệ Tp.HCM. on 3.3 VẬT LIÊU THÍ NGHIỆM 3.3.1 Thiết bị Kính hiển vi C Cân phân tích ny Máy chụp ảnh kỹ thuật số Tủ cấy vô trùng Nồi hấp thanh trùng om pa Tủ sấy 3.3.2 Hóa chất Các hóa chất bao gồm: MgSO4, KH2PO4, Glucose, Agar. 3.3.3 Môi trường sử dụng 3.3.3.1 Môi trường dinh dưỡng C Môi trường PGA (Potato glucose agar) Khoai tây: 200 (g) Glucose: 20 (g) Agar: 20 (g) Nước cất vừa đủ: 1000 (ml) Các môi trường đều được khử trùng ở 1210C trong 15 phút. SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 19 3.3.3.2 Môi trường nhân giống Chọn loại lúa gạo tốt, nấu cho lúa vừa nứt nanh, vớt ra để ráo, sau đó phối trộn với cám bắp. en tia l 3.4 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.4.1 Quan sát hình thái quả thể nấm Ganoderma lucidum 3.4.1.1 Hình thái quả thể 3.4.1.2 Phương pháp quan sát hệ sợi nấm [9] ü Lấy một ít sợi nấm dàn đều vào 1 giọt nước có trên lam kính trên ngọn lửa đèn cồn fid ü Cố định sợi nấm trên lam kính bằng cách hơ nhẹ mặt dưới lam kính qua lại ü Nhuộm bằng dung dịch fuchsin trong 5 – 10 phút on ü Rửa thuốc nhuộm bằng cồn 95% ü Rửa ngay với nước cất để chấm dứt công đoạn tẩy màu C ü Quan sát mẫu vật dưới vật kính x100 3.4.1.3 Phương pháp quan sát bào tử nấm Linh chi [13, 17] ny ü Lấy quả thể nấm Linh chi trong giai đoạn phóng thích bào tử, đặt lên 1 tờ giấy trắng để thu bào tử ü Dùng khuyên cấy lấy ít bào tử rồi dàn đều vào 1 giọt nước trên lam kính om pa ü Cố định bào tử trên lam kính bằng cách hơ nhẹ mặt dưới của lam kính qua ngọn lửa đèn cồn đến khô ü Quan sát bào tử nấm dưới vật kính x100 3.4.2 Khảo sát sinh trưởng hệ sợi nấm Linh chi trên các môi trường lỏng Cách tiến hành: Các môi trường đều được pha với nồng độ khác nhau. và được hấp khử trùng ở 121oC/15 phút, để nguội và cấy giống. Sau 9 ngày ta thu sinh khối và sấy C ở nhiệt độ 500C và tiến hành cân trọng lượng khô. Tổng số chai cấy: 52 chai SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 20 3.4.2.1 Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO4 đến tốc độ tăng sinh khối trong môi trường lỏng Thí nghiệm được bố trí 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 4 chai, mỗi chai chứa Môi trường nuôi cấy 1 PG + 1 g/l MgSO4 2 PG + 2 g/l MgSO4 3 PG + 3 g/l MgSO4 4 PG + 4 g/l MgSO4 fid en tia Nghiệm thức l 20ml môi trường 3.4.2.2 Ảnh hưởng của hàm lượng KH2PO4 đến tốc độ tăng sinh khối trong on môi trường lỏng Thí nghiệm được bố trí 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 4 chai, mỗi chai chứa Nghiệm thức 1 C 20ml môi trường Môi trường nuôi cấy PG + 0,5 g/l KH2PO4 PG + 1g /l KH2PO4 3 PG + 1,5 g/l KH2PO4 4 PG + 2 g/l KH2PO4 om pa ny 2 3.4.2.3 Ảnh hưởng của hàm lượng Glucose đến tốc độ tăng sinh khối trong môi trường lỏng Thí nghiệm được bố trí 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 4 chai, mỗi chai chứa C 20ml môi trường Nghiệm thức Môi trường nuôi cấy 1 P + 10 g/l Glucose 2 P + 15 g/l Glucose 3 P + 20 g/l Glucose SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang