Tài liệu Nghiên cứu chiết tách hợp chất polyphenol trong lá chè xanh trồng tại tỉnh bà rịa vũng tàu và nghiên cứu ứng dụng trong dược mỹ phẩm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÀ RỊA - VŨNG TÀU BÁO CÁO ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH HỢP CHẤT POLYPHENOL TRONG LÁ CHÈ XANH TRỒNG TẠI TỈNH BÀ RỊA VŨNG TÀU VÀ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG TRONG DƯỢC MỸ PHẨM GVHD: TS. Tống Thị Minh Thu đồng hướng dẫn TS. Nguyễn Thị Tuyết BÀ RỊA - VŨNG TÀU, tháng 07, năm 2019 1. Tên đề tài: Nghiên cứu chiết tách hợp chất polyphenol trong lá chè xanh trồng tại tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu và nghiên cứu ứng dụng trong Dược Mỹ Phẩm. 2. Chủ nhiệm đề tài: sinh viên lớp DH15HC, Viện: Kỹ thuật – Kinh Tế biển, Trường: Đại học Bà Rịa – Vũng Tàu. 3. Nội dung chính: - Chiết tách polyphenol trong lá chè xanh bằng dung môi, Enzym và kỹ thuật khác. - Định tính thành phần hóa học trong polyphenol bằng Thuốc thử, sắc ký lớp mỏng (TLC), UV-VIS. - Định lượng bằng phương pháp Folin-Denis và Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). - Hoạt tính chống oxi hóa được xác định dựa theo mô hình phospho molybdenum. - Xác định hoạt tính kháng khuẩn của polyphenol theo phương pháp xác định đường kính vòng vô khuẩn. 4. Kết quả đạt được: - Đã tìm được điều kiện tối ưu cho quá trình chiết polyphenol từ lá chè xanh là: Nồng độ dung môi ethanol 70%, tỉ lệ Nguyên liệu/Dung môi là 1/25, nhiệt độ chiết 65 OC, thời gian: 35 phút. - Hàm lượng polyphenol tổng cao nhất trong lá chè (Loại lá thứ 2, 3, 4) là 20,79%, có hỗ trợ enzym Cenlulozo 2,5% v/w thì hàm lượng polyphenol tổng là 22,07% với hiệu suất chiết tăng 1,1 lần; pectinase 3% thì hàm lượng polyphenol tổng là 20,79% và hiệu suất tăng 1,04 lần. Hàm lượng polyphenol cao nhất ở nụ lá 21,94% và thấp nhất ở lá chè già 17%. Khi sấy cao chiết lá chè ở nhiệt độ 120 oC thì hàm lượng polyphenol còn rất thấp 1,41% - Sử dụng phương pháp sấy thăng hoa nhằm hạn chế sự ảnh hưởng của nhiệt độ cao tới hàm lượng polyphenol tổng và đồng thời giữ được mà và mùi vị ban đầu của lá chè. - Hoạt tính oxy hóa của dịch chiết polyphenol lá chè cao hơn rất nhiều so với các loại lá khác (Lá neem, lá lô hội, lá xoài) và tăng dần theo nồng độ. - Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết lá chè kháng được cả 5 chủng vi khuẩn Escherichia coli, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa và Salmonella typhi dù ở nồng độ rất thấp (100 – 800 mg/ml). - Sau khi mẫu chiết được đo bằng HPLC ta nhận thấy dịch chiết lẫn tạp chất không đáng kể, vì vậy chúng ta nên tách Polyphenol trong chế phẩm ở dạng tinh khiết để ứng dụng nó trong một số lĩnh vực nhằm đạt được giá trị cao về mặt kinh tế. - Xây dựng được quy trình điều chế Kem dưỡng da từ Cao polyphenol (quy mô phòng thí nghiệm). 5. Thời gian nghiên cứu: Từ 12/03/2018 đến 12/06/2019. 6. Chữ ký của CNĐT:……………………. MỤC LỤC DANH MỤC VIẾT TẮT................................................................................................... i DANH MỤC BẢNG......................................................................................................... ii DANH MỤC HÌNH......................................................................................................... iii DANH MỤC SƠ ĐỒ........................................................................................................ iv MỞ ĐẦU...................................................................................................................1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.................................................................5 1.1. Giới thiệu chung về cây chè................................................................................... 5 1.1.1. Nguồn gốc và sự phân bố của cây chè............................................................... 5 1.1.2. Phân loại............................................................................................................ 5 1.1.3. Tình hình sản xuất chè ở Việt Nam................................................................... 6 1.1.4. Thành phần hóa học cơ bản của lá chè............................................................... 6 1.1.5. Dược tính của chè.............................................................................................. 8 1.2. Polyphenol trong chè.............................................................................................. 9 1.2.1. Nguồn gốc chuyển hóa và phân loại các hợp chất phenolic thực vật.................9 1.2.2. Các hợp chất Polyphenol có trong chè............................................................. 10 1.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng polyphenol/catechin trong lá chè.........16 1.2.4. Phương pháp định tính, định lượng polyphenol trong lá chè...........................17 1.2.5. Hoạt tính sinh học của polyphenol chè............................................................ 22 1.3. Một số khái niệm về trích ly và các phương pháp trích ly polyphenol trong chè................................................................................................................................. 24 1.3.1. Bản chất của quá trình trích ly......................................................................... 24 1.3.2. Các phương pháp trích ly................................................................................. 24 1.4. Ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ đến hiệu suất trích ly và chất lượng của sản phẩm............................................................................................................... 28 1.4.1. Ảnh hưởng của dung môi và nồng độ dung môi............................................. 28 1.4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly...................................................................... 30 1.4.3. Ảnh hưởng của thời gian trích ly..................................................................... 30 1.4.4. Ảnh hưởng của pH........................................................................................... 31 1.4.5. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu..................................................... 31 1.4.6. Quy trình trích ly polyphenol từ chè xanh....................................................... 32 1.5. Giới thiệu một số loài vi khuẩn và các phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn................................................................................................................ 33 1.5.1.Giới thiệu một số loài vi khuẩn......................................................................... 33 1.5.2. Các phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn.......................................... 42 1.5. Phương pháp Sấy thăng hoa................................................................................ 44 CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM............................................................................ 46 2.1. Nguyên vật liệu nghiên cứu.................................................................................. 46 2.1.1. Nguyên liệu chè............................................................................................... 46 2.1.2. Chủng vi sinh vật............................................................................................. 46 2.1.3. Hóa chất, thiết bị.............................................................................................. 46 2.2. Định lượng polyphenol tổng số theo phương pháp Folin-Denis........................47 2.2.1. Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol tổng số.................................... 47 2.2.2. Phương pháp xây dựng đường chuẩn axit gallic.............................................. 48 2.3. Khảo sát quy trình chiết tách polyphenol từ lá chè............................................ 49 2.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của các thông số công nghệ............................................. 49 2.3.2. Một số quy trình khảo sát khác........................................................................ 52 2.3.3. Khảo sát quy trình chiết tách polyphenol lá chè bằng dung môi có hỗ trợ enzym........................................................................................................................ 52 2.3.4. Ảnh hưởng của độ ẩm và độ già của lá............................................................ 53 2.3.5. Quy trình tinh chế polyphenol từ cao chiết lá chè............................................ 53 2.4. Định tính, định lượng polyphenol trong cao chiết lá chè...................................54 2.4.1. Định tính một số hợp chất hữu cơ có trong dịch chiết lá chè bằng thuốc thử...54 2.4.2. Định tính polyphenol bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)...................56 2.4.3. Định tính bằng UV-VIS................................................................................... 56 2.4.4. Định tính và định lượng polyphenol bằng HPLC............................................. 57 2.5. Xác định hoạt tính sinh học của dịch chiết chè................................................... 57 2.5.1. Xác định hoạt tính kháng oxi hóa của dịch chiết chè....................................... 57 2.5.2. Xác định hoạt tính kháng khuẩn...................................................................... 58 2.6. Khảo sát các quy trình quy trình sấy.................................................................. 61 2.6.1. Sấy nhiệt độ cao............................................................................................... 61 2.6.2. Sấy thăng hoa................................................................................................... 61 2.7. Nghiên cứu ứng dụng cao lá chè trong sản phẩm kem dưỡng da.....................62 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN........................................................64 3.1. Kết quả tối ưu hóa điều kiện chiết tách polyphenol của lá chè........................64 3.1.1. Xây dựng phương trình đường chuẩn gallic khảo sát các yếu tố công nghệ....64 3.1.2. Xây dựng phương trình đường chuẩn gallic khảo sát ảnh hưởng của enzym...65 3.1.3. Xây dựng phương trình đường chuẩn gallic khảo sát hoạt tính oxy hóa..........65 3.2. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ đến hiệu suất thu hồi polyphenol.................................................................................................................... 66 3.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hàm lượng polyphenol tổng...............66 3.2.2. Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng polyphenol tổng..............................67 3.2.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến hàm lượng polyphenol tổng . 68 3.2.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng polyphenol tổng...............................69 3.2.5. Ảnh hưởng của PH đến hàm lượng polyphenol tổng....................................... 70 3.3. Ảnh hưởng của độ ẩm và độ non già của lá tới hàm lượng polyphenol tổng trong cao chiết lá chè................................................................................................... 71 3.4. Ảnh hưởng của một số quy trình chiết khác....................................................... 72 3.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của enzym đối với hiệu quả chiết tách polyphenol.................................................................................................................... 73 3.5.1. Ảnh hưởng của enzym cenlulozo đối với quá trình chiết tách polyphenol.......73 3.5.2. Ảnh hưởng của enzym pectinase đối với quá trình chiết tách polyphenol.......74 3.6. Ảnh hưởng của quá trình tinh chế polyphenol đến hàm lượng polyphenol tổng............................................................................................................................... 75 3.7. Kết quả định tính, định lượng polyphenol trong lá chè.....................................76 3.7.1. Định tính các hợp chất trong lá chè bằng thuốc thử......................................... 76 3.7.2. Định tính bằng TLC......................................................................................... 77 3.7.3. Định tính bằng UV – VIS................................................................................ 78 3.7.4. Định lượng polyphenol lá chè bằng HPLC...................................................... 79 3.8. Kết quả khảo sát hoạt tính sinh học của lá chè.................................................. 80 3.8.1. Kết quả hoạt tính oxy hóa................................................................................ 80 3.8.2. Hoạt tính kháng khuẩn..................................................................................... 82 3.9. Kết quả khảo sát quy trình lưu mẫu và sấy cao chiết lá chè.............................85 3.9.2. Ảnh hưởng của sấy ở nhiệt độ cao tới hàm lượng polyphenol tổng trong cao chiết lá chè................................................................................................................. 86 3.9.3. Sấy thăng hoa cao chiết lá chè...................................................................... 87 3.10. Ứng dụng sản phẩm kem dưỡng da.................................................................. 89 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ........................................................92 4.1. Kết luận................................................................................................................. 92 4.2. Kiến nghị............................................................................................................... 93 TÀI LIỆU THAM KHẢO.....................................................................................94 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT C Catechin CG Catechingallate CK Chất Khô DPPH 2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl EC Epicatechin ECG Epicatechingallate EGC Epigallocatechin EGCG Epigallocatechingallate GC Gallocatechin GCG Gallocatechingallate HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao MIC Minimum inhibitory concentration TLC Sắc ký lớp mỏng UV Vùng tử ngoại VIS Khả kiến i DANH MỤC BẢNG Bảng 1. 1: Sự hấp thụ của dung dịch theo màu............................................................ 21 Bảng 3. 1: Phương trình đường chuẩn axit gallic......................................................... 64 Bảng 3. 2: Phương trình đường chuẩn axit gallic......................................................... 65 Bảng 3. 3: Phương trình đường chuẩn axit gallic......................................................... 65 Bảng 3. 4: Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hàm lượng polyphenol tổng..........66 Bảng 3. 5: Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng polyphenol tổng.........................67 Bảng 3. 6: Ảnh hưởng của tỷ lệ Nguyên liệu/Dung môi đến hàm lượng polyphenol tổng.............................................................................................................................. 68 Bảng 3. 7: Ảnh hưởng của tỷ lệ nhiệt độ đến hàm lượng polyphenol tổng..................69 Bảng 3. 8: Ảnh hưởng của PH đến hàm lượng polyphenol tổng..................................70 Bảng 3. 9: Khảo sát Ảnh hưởng của độ ẩm và độ non già của lá................................. 71 Bảng 3. 10: Khảo sát một số quy trình chiết khác........................................................ 72 Bảng 3. 11: Khảo sát Ảnh hưởng của enzym cenlulozo đối với quá trình chiết tách polyphenol................................................................................................................... 73 Bảng 3. 12: Khảo sát Ảnh hưởng của enzym pectinase đối với quá trình chiết tách polyphenol................................................................................................................... 74 Bảng 3. 13: Khảo sát Ảnh hưởng của quá trình tinh chế polyphenol...........................76 Bảng 3. 14: Kết quả khảo sát định tính các nhóm chất................................................ 77 Bảng 3. 15: Biểu đồ ảnh hưởng của quá trình tinh chế polyphenol..............................78 Bảng 3. 16: Kết quả đo bước sóng của dịch chè sau khi tinh chế................................. 78 Bảng 3. 17: Hàm lượng các chất trong polyphenol...................................................... 79 Bảng 3. 18: Kết quả sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC................................................ 80 Bảng 3. 19: Độ hấp thụ quang của cao các loại lá ở cùng nồng độ..............................81 Bảng 3. 20: Kết quả lực kháng oxy hoá theo nồng độ.................................................. 81 Bảng 3. 21: Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết lá chè.............................................. 83 Bảng 3. 22: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng polyphenol................................ 86 Bảng 3. 23: Chỉ tiêu đánh giá cảm quan kem dưỡng da............................................... 90 DANH MỤC HÌNH Hình 1. 1: Lá chè tại Xã Suối Nghệ, Tân Thành, tỉnh BR-VT.......................................5 Hình 1. 2: Công thức cấu tạo của catechin................................................................... 11 Hình 1. 3: Công thức cấu tạo của (-)-EGCG................................................................ 11 Hình 1. 4: Công thức cấu tạo của ECG........................................................................ 13 Hình 1. 5: Công thức cấu tạo của C(A) và EC(B)........................................................ 13 Hình 1. 6: Công thức cấu tạo của Anthoxanthin.......................................................... 14 Hình 1. 7: Công thức cấu tạo hợp chất Leucoanthocyanin........................................... 16 Hình 1. 9: Vi khuẩn Escherichia coli dưới kính hiển vi............................................... 34 Hình 1. 10: Vi khuẩn Bacillus cereus dưới kính hiển vi.............................................. 35 Hình 1. 11: Vi khuẩn Salmonella dưới kính hiển vi..................................................... 37 Hình 1. 12: Vi khuẩn Staphylococcus aureus dưới kính hiển vi..................................38 Hình 1. 13: Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa dưới kính hiển vi..............................41 Hình 2. 1: Lá chè sau khi xử lý.................................................................................... 50 Hình 2. 2: Thiết bị chiết tách........................................................................................ 51 Hình 2. 3: Mẫu đo UV - VIS........................................................................................ 51 Hình 2. 4: Hệ thống cô quay chân không..................................................................... 51 Hình 2. 5: Mẫu chè được ủ với enzyme....................................................................... 53 Hình 2. 6: Thiết bị phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao.............................................. 57 Hình 2. 7: Mẫu chè thử hoạt tính oxy hoá.................................................................... 58 Hình 2. 8: Cao chè thử hoạt tính kháng khuẩn............................................................. 59 Hình 2. 9: Tủ sấy nhiệt độ cao..................................................................................... 61 Hình 2. 10: Thiết bị sấy thăng hoa............................................................................... 62 Hình 3. 1: Biểu đồ phương trình đường chuẩn axit gallic............................................ 64 Hình 3. 2: Đường chuẩn axit gallic.............................................................................. 64 Hình 3. 3: Biểu đồ phương trình đường chuẩn axit gallic............................................ 65 Hình 3. 4: Biểu đồ phương trình đường chuẩn axit gallic............................................ 66 Hình 3. 5: Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ tới hàm lượng polyphenol tổng................66 iii Hình 3. 6: Biểu đồ ảnh hưởng của thời gian tới hàm lượng polyphenol tổng..............68 Hình 3. 7: Biểu đồ ảnh hưởng của tỷ lệ Nguyên liệu/Dung môi đến hàm lượng polyphenol tổng........................................................................................................... 69 Hình 3. 8: Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng polyphenol tổng..............70 Hình 3. 9: Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ PH đến hàm lượng polyphenol tổng........71 Hình 3. 10: Biểu đồ ảnh hưởng của độ non già của lá.................................................. 72 Hình 3. 11: Biểu đồ ảnh hưởng của một số quy trình chiết khác đến hàm lượng polyphenol tổng........................................................................................................... 73 Hình 3. 12: Biểu đồ ảnh hưởng của enzym cenlulozo đến hàm lượng polyphenol tổng .......................................................................................................................................74 Hình 3. 13: Biểu đồ ảnh hưởng của enzym pectinase đến hàm lượng polyphenol tổng .......................................................................................................................................74 Hình 3. 14: Cao chiết lá chè được tinh chế với clorofom và etylaxetat........................75 Hình 3. 15: Biểu đồ ảnh hưởng của quá trình tinh chế polyphenol.............................. 76 Hình 3. 16: Định tính polyphenol bằng TLC hiện bản UV: 254 nm............................77 Hình 3. 17: Phổ quét bước sóng UV VIS của dịch chè trước và sau tinh chế..............79 Hình 3. 18: Phổ sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC....................................................... 80 Hình 3. 19: Biểu đồ khả năng oxy hoá các loại lá........................................................ 81 Hình 3. 20: Biểu đồ lực kháng oxy hoá theo nồng độ.................................................. 82 Hình 3. 21: Biểu đồ thể hiện hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết lá chè....................83 Hình 3. 22: Khả năng kháng 5 chủng vi khuẩn của cao chiết lá chè............................84 Hình 3. 24: Biểu đồ ảnh hưởng của thời gian lưu mẫu đến hàm lượng polyphenol.....85 Hình 3. 23: Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ sấy đến hàm lượng polyphenol..............86 Hình 3. 25: Bột chiết lá chè sau khi sấy thăng hoa...................................................... 87 Hình 3. 25: Kem dưỡng da từ cao chiết lá chè............................................................. 90 DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 1. 1: Phân loại polyphenol................................................................................. 10 Sơ đồ 1. 2: Quy trình tinh chế polyphenol................................................................... 32 Sơ đồ 2. 1: Quy trình chiết tách polyphenol................................................................. 49 Sơ đồ 2. 2: Sơ đồ tinh chế polyphenol......................................................................... 54 iv Trường Đại Học Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành Công Nghệ KTHH MỞ ĐẦU 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Cây chè là sản phẩm nông nghiệp chủ yếu của đất nước ta, theo thống kê của Hiệp hội Chè Việt Nam, khối lượng xuất khẩu chè tháng 8 năm 2017 ước đạt 13 nghìn tấn đưa khối lượng xuất khẩu chè 8 tháng đầu năm 2017 ước đạt 90 nghìn tấn. Đối với tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu có thuận lợi về khí hậu và địa hình nương rẫy, phù hợp cho diện tích trồng chè lớn.[77] Ngành công – nông nghiệp và thương mại chè đã giải quyết công ăn việc làm cho hàng triệu lao động, đặc biệt ở các vùng khó khăn, vùng trung du đồi núi. Theo thống kê của Tổng cục hải quan, trong khoảng 5 năm gần đây, kim ngạch xuất khẩu chè bình quân của Việt Nam vào khoảng 150 triệu USD. Điều này cho thấy, sản phẩm chè Việt Nam đã có chỗ đứng trên thị trường thế giới và đã có đóng góp không nhỏ vào nền kinh tế nước nhà. Tuy nhiên, sự phát triển của cây chè và các sản phẩm từ chè Việt Nam hiện nay chưa tương xứng với tiềm năng của nó, đời sống người trồng và chế biến chè vẫn khó khăn do giá trị sản phẩm thấp. Do vậy, cần đẩy mạnh việc đầu tư nghiên cứu nâng cao chất lượng, đa dạng hóa sản phẩm chế biến, đồng thời cần nghiên cứu chiết tách các chất có hoạt tính sinh học cao (polyphenol) nhằm ổn định, phát triển sản xuất và nâng cao giá trị của cây chè Việt Nam. Nhiều kết quả ngiên cứu cho thấy hợp chất trong chè xanh có hoạt tính sinh học như: hoạt tính chống oxy hóa, chống xơ vữa động mạch, chống các bệnh về tim mạch, ngăn chặn sự phát triển của khối u, đặc biệt là ung thư da, bảo quản thực phẩm.[78] Liên quan đến hoạt tính sinh học, Fumio và cộng sự [35] đã chỉ ra rằng, khả năng quét gốc tự do DPPH của các catechin chè cao gấp 6 đến 16,4 lần α – tocopherol hay từ 4,3 đến 11,8 lần vitamin C. Ngoài ra, hoạt tính này của chè xanh cũng cao gấp 1,4 lần so với hương thảo, 4,02 lần với sả, 7,3 lần với hoa nhài và 15,4 lần so với oải hương. [70] Gần đây, khi so sánh khả năng quét gốc tự do DPPH của chè vàng (một loại chè bán lên men) với một số đối tượng khác, Barhe và Tchouya [23] cũng chỉ ra rằng, hoạt tính này của chất chiết chè vàng > chất chiết đỗ tương > vang đỏ > hibiscus. Bên cạnh hoạt tính kháng oxi hóa, nhiều nghiên cứu trên thế giới cũng chỉ ra rằng, polyphenol (chất chiết chè) có khả năng kháng được nhiều chủng vi khuẩn gây ngộ độc và gây thối hỏng thực phẩm.[21][49] Điều này cho thấy, đối tượng này không chỉ có tiềm năng ứng dụng cao trong mỹ phẩm, dược phẩm mà còn mở ra những ứng dụng quan trọng trong GVHD: Tống Thị Minh Thu 1 chè như một chất bảo quản tự nhiên không độc hại. Điều này đặc biệt có ý nghĩa trong bối cảnh hiện nay,khi tình trạng vệ sinh an toàn thực phẩm đang ngày càng trở lên trầm trọng, mất kiểm soát ở các nước đang phát triển, trong đó có Việt Nam. Có thể thấy, mặc dù việc nghiên cứu chiết xuất polyphenol trong lá chè xanh cũng như việc nghiên cứu các hoạt tính sinh học của chúng đã được báo cáo. Tuy nhiên những nghiên cứu này thường giới hạn hoặc với dung môi nước nên hiệu quả chiết tách còn hạn chế, hoặc sử dụng các kỹ thuật hiện đại chi phí đầu tư cao, khó áp dụng trong điều kiện Việt Nam hiện nay như trích ly có hỗ trợ vi sóng hay trích ly dùng sóng siêu âm, nhiều công trình nghiên cứu và khai thác hoạt tính sinh học của Polyphenol từ chè xanh, nhưng ở Việt Nam vấn đề này còn khá mới mẻ, nhất là hoạt tính kháng khuẩn. Để khai thác lợi ích của chúng một cách tối ưu, các thành phần hóa học có hoạt tính sinh học có trong lá chè xanh vẫn cần phải được nghiên cứu sâu hơn và hướng tới thương mại hóa sản phẩm ra thị trường, đặc biệt đối với những khu vực có trữ lượng trà xanh lớn như các nước Việt Nam, Trung Quốc, Ấn Độ.... Vì vậy; trong nghiên cứu này này, chúng tôi chọn đề tài “Nghiên cứu chiết tách hợp chất POLYPHENOLS ứng dụng trong Dược - Mỹ Phẩm và Thực phẩm từ lá Chè Xanh được trồng tại xã Suối Nghệ - huyện Châu Đức - tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu” nhằm tìm ra phương pháp chiết tách polyphenol phù hợp ở điều kiện Việt Nam và khảo sát hoạt tính sinh học của chúng với nguồn chè trồng tại tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu. Từ đó nghiên cứu ứng dụng của chúng làm mặt nạ dưỡng da nhằm giải quyết các vấn đề: Lợi ích kinh tế cho người trồng chè, khai thác triệt để hoạt tính sinh học của polyphenol, tạo ra sản phẩm đẹp da, chất lượng tốt và an toàn. 2. MỤC TIÊU - Xây dựng được quy trình chiết tách các hợp chất polyphenol từ lá chè xanh. - Tính chất hóa lý, định tính, định lượng polyphenol trong lá chè. - Đánh giá được khả năng oxy hóa và kháng khuẩn của polyphenol trong lá chè - Ứng dụng cao polyphenol trong các sản phẩm làm đẹp da. 3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU Trong nghiên cứu này các nội dung được giới hạn như sau: - Đối với lá chè khảo sát: chúng tôi sử dụng chè trồng tại xã Suối Nghệ, huyện Tân Thành, tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu. - Đối với nghiên cứu chiết tách polyphenol: phương pháp trích ly bằng dung môi được chúng tôi sử dụng. Do đây là phương pháp khá đơn giản, có khả năng cho hiệu suất thu hồi cao. Bên cạnh đó, phương pháp này cũng chỉ đòi hỏi đầu tư vừa phải, dễ áp dụng cho các cơ sở sản xuất vừa và nhỏ, phù hợp với điều kiện Việt Nam. - Đối với xác định hoạt tính oxy hóa: Xác định lực kháng oxy hoá tổng (total antioxydant capacity) theo mô hình phospho molybdenum.[56] - Đối với hoạt tính kháng khuẩn: Khả năng kháng khuẩn của dịch chiết được xác định bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch trên 5 chủng vi khuẩn Escherichia coli, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa và Salmonella typhi được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Đại Học Công Nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh. - Đối với nghiên cứu ứng dụng chất chiết polyphenol chè trong dược mỹ phẩm: Nghiên cứu trên 2 dòng sản phẩm Mặt nạ dưỡng da và kem dưỡng da từ trà xanh. Các thí nghiệm được thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm Đại Học Bà Rịa Vũng Tàu. 4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - Chiết tách polyphenol trong lá chè xanh bằng dung môi, Enzym và kỹ thuật khác. - Định tính thành phần hóa học trong polyphenol bằng Thuốc thử, sắc ký lớp mỏng (TLC), UV-VIS. - Định lượng bằng phương pháp Folin-Denis và Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). - Hoạt tính chống oxi hóa được xác định dựa theo mô hình phospho molybdenum. - Xác định hoạt tính kháng khuẩn của polyphenol theo phương pháp xác định đường kính vòng vô khuẩn. 5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN 5.1. Ý nghĩa khoa học - Kết quả của đề tài tạo ra bộ dữ liệu khoa học tương đối toàn diện về hàm lượng các hợp chất có hoạt tính sinh học cao (định tính, định lượng hàm lượng polyphenol tổng số, các catechin thành phần) cũng như hoạt tính sinh học (khả năng kháng oxi hóa, kháng khuẩn), so sánh hàm lượng polyphenol tổng số của các loại chè non, chè già..của giống chè trồng tại tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu. Các dữ liệu khoa học này là nguồn tư liệu hữu ích cho công tác đào tạo, nghiên cứu và khai thác chè ở tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu nói riêng và Việt Nam nói chung. - Kết quả nghiên cứu công nghệ trích ly polyphenol từ lá chè đã bổ sung thêm các thông tin khoa học quan trọng cho biết ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ đến hiệu suất thu hồi polyphenol lá chè. Đây là nguồn thông tin khoa học hữu ích trong việc nghiên cứu và triển khai sản xuất bột chiết polyphenol từ chè xanh nguyên liệu. - Kết quả nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của enzym cenlulozo, pectinase tới hiệu suất chiết tách polyphenol trong lá chè. 5.2. Ý nghĩa thực tiễn - Đề tài góp phần nâng cao giá trị của cây chè ở nước ta, đồng thời góp phần cải thiện đời sống người nông dân. - Sản phẩm của luận án tinh chế polyphenol tạo ra các sản phẩm thực phẩm, thực phẩm chức năng, dược phẩm và mỹ phẩm. 6. TÍNH MỚI CỦA ĐỀ TÀI - Nghiên cứu tổng thể và đánh giá về hàm lượng các hợp chất có hoạt tính sinh học là polyphenol tổng số của giống chè ở Suối Nghệ, Bà Rịa Vũng Tàu. - Việc sử dụng hệ dung môi etanol nước trong trích ly polyphenol từ lá chè, đã đề xuất được quy trình công nghệ chiết tách chế phẩm polyphenol cho hiệu suất thu hồi và chất lượng chế phẩm cao (bao gồm độ tinh sạch và khả năng kháng oxy hóa, kháng khuẩn). Với quy trình này, việc chuyển giao cho các cơ sở sản xuất vừa và nhỏ ở Việt Nam là hoàn toàn khả thi và thuận lợi, không phải đầu tư lớn, tận dụng được nguồn phụ phẩm chế biến chè. - Bước đầu khảo sát ảnh hưởng của 2 loại enzym cenlulozo và pectinase đối với hiệu suất chiết tách polyphenol trong lá chè. - Nghiên cứu ứng dụng trong các sản phẩm làm đẹp có nguồn gốc tự nhiên. Thúc đẩy nền công nghiệp Mỹ phẩm sản xuất hàng Việt Nam chất lượng cao. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu chung về cây chè 1.1.1. Nguồn gốc và sự phân bố của cây chè Cây chè có tên khoa học Camellia sinensis (L) O. Kuntze được phát hiện bởi người Trung Quốc vào khoảng 2700 TCN. Hiện nay, nhiều nghiên cứu cho rằng, cây chè có nguồn gốc phát sinh ở miền núi phía Nam Trung Quốc, Bắc Ấn Độ và miền núi phía Bắc Việt Nam [6]. Chè phân bố khá rộng, trong những điều kiện tự nhiên rất khác nhau, từ 30 độ vĩ nam (Natan - Nam Phi) đến 43 độ vĩ bắc (Grudia), tập trung ở vùng nhiệt đới và á nhiệt đới. [9] Hình 1. 1: Lá chè tại Xã Suối Nghệ, Tân Thành, tỉnh BR-VT 1.1.2. Phân loại Cây chè thuộc: Ngành hạt kín (Angiospermae), Lớp song tử diệp (Dicotyledonae), Bộ chè (Theales), Họ chè (Theaceae), Chi chè (Camellia) và Loài (Camellia (Thea) sinensis). Hiện nay, chè được chia thành 4 giống chính:[9] * Chè Trung Quốc lá nhỏ (Camellia sinensis var. bohea) Thuộc loại cây bụi thấp, phân cành nhiều, lá nhỏ (dài 3,5 – 6,5 cm), dày nhiều gợn sóng, màu xanh đậm, răng cưa nhỏ, không đều. Giống này có đặc điểm năng suất thấp, chất lượng trung bình nhưng khả năng chịu rét tốt. Phân bố chủ yếu ở miền Đông, Đông nam Trung Quốc, Nhật Bản và một số vùng khác. * Chè Trung Quốc lá to (Camellia sinensis var. macrophylla) Cây thuộc loại thân gỗ nhỡ, cao tới 5 m trong điều kiện sinh trưởng tự nhiên. Lá to trung bình, màu xanh nhạt, bóng, răng cưa sâu không đều, đầu lá nhọn. Giống có đặc điểm năng suất cao, chất lượng tốt. Nguyên sản ở Vân Nam, Tứ Xuyên (Trung Quốc). * Chè Shan (Camellia sinensis var. shan) Cây thuộc loại thân gỗ, cao từ 6 đến 10 m. Lá to, màu xanh nhạt, đầu lá dài, răng cưa nhỏ và dày. Tôm chè có nhiều lông tơ, trắng và mịn trông như tuyết nên còn gọi là chè tuyết. Giống có đặc điểm năng suất cao, chất lượng tốt, có khả năng thích ứng trong điều kiện ấm ẩm, phát triển tốt ở vùng có địa hình cao. Nguyên sản ở Vân Nam - Trung Quốc, miền bắc của Miến Điện và Việt Nam. * Chè Ấn Độ (Camellia sinensis var. assamica): Thân gỗ cao tới 17 m, phân cành thưa, lá dài tới 20 - 30 cm, mỏng, mềm, thường có màu xanh đậm, dạng lá hình bầu dục, phiến lá gợn sóng, đầu lá dài. Giống này thuộc loại có năng suất cao, phẩm chất tốt nhưng không chịu được rét hạn. Giống được trồng nhiều ở Ấn Độ, Miến Điện, Vân Nam (Trung Quốc) và một số vùng khác. 1.1.3. Tình hình sản xuất chè ở Việt Nam Năm 2012, Việt Nam đã vươn lên hàng thứ sáu thế giới về diện tích (115.964 ha), thứ năm về sản lượng chè (216.900 tấn), chỉ đứng sau Trung Quốc, Ấn Độ, Srilanka, Kenya và tương đương Indonesia. Trong 15 năm, từ 1995 – 2010, diện tích chè của nước ta đã tăng 2,2 lần từ 52.100 ha lên 113.200 ha, sản lượng tăng 4,94 lần từ 40.200 tấn lên 198.466 tấn.[79] Theo ước tính của Hiệp hội chè Việt Nam, cả nước hiện có khoảng 6 triệu lao động sống dựa vào ngành công – nông nghiệp trồng và chế biến chè, và 116 doanh nghiệp tham gia xuất khẩu chè, hàng năm thu về gần 200 triệu đô la, đóng góp không nhỏ vào sự phát triển chung của nền kinh tế nước nhà. Về các giống chè ở Việt Nam, bên cạnh giống truyền thống (Trung du), hiện chúng ta đã chọn lọc và lai tạo được khá nhiều giống mới. 1.1.4. Thành phần hóa học cơ bản của lá chè 1.1.4.1. Nước Nước là thành phần chủ yếu trong búp chè, thường chiếm từ 75 - 82% trọng lượng búp. Hàm lượng nước trong búp thay đổi tùy theo giống, tuổi cây, đất đai, kỹ thuật canh tác và tiêu chuẩn thu hái.. .[4] 1.1.4.2. Tannin chè Tannin thiên nhiên đều là hỗn hợp của gallic acid và digallic acid ở dạng tự do cũng như kết hợp với glucose. Đây là sản phẩm chuyển hóa thứ cấp của thực vật và được chia làm hai dạng: tannin thủy phân (tannin pyrogallic) và tannin không bị thủy phân (tannin pyrocatechin). Tannin trong chè tồn tại ở cả hai dạng trên nhưng chủ yếu là dạng pyrocatechin. Pyrocatechin là hỗn hợp polymer của catechin và leucoanthocyanidin.[10] Hàm lượng tannin trong chè vào khoảng 32-40% CK, phụ thuộc vào giống, độ non già của lá, mùa vụ thu hoạch và chế độ canh tác.[9] 1.1.4.3. Polyphenol Polyphenol là thành phần quan trọng nhất, quyết định chính đến màu sắc, hương vị và tính chất dược lý của nước chè pha. Thành phần chính của polyphenol chè là các hợp chất catechin. Tỷ lệ các chất trong thành phần hỗn hợp của polyphenol chè không giống nhau mà thay đổi theo từng giống, tiêu chuẩn và mùa vụ thu hái, điều kiện vĩ độ, thổ nhưỡng, kỹ thuật canh tác,.. 1.1.4.4. Alkaloid Trong chè có nhiều loại alkaloid nhưng nhiều nhất là caffeine. Hàm lượng caffeine trong chè vào khoảng 2 - 4% CK, thay đổi theo giống, độ non già của lá, thời vụ thu hoạch và điều kiện canh tác. Caffeine có tác dụng kích thích hệ thần kinh trung ương, hoạt động của thận, của tim và có tác dụng lợi tiểu.[9] 1.1.4.5. Amino acid và protein Trong chè, protein chiếm khoảng 18% CK và có khoảng 17 loại amino acid. Protein trong lá chè chủ yếu là dạng glutelin hoà tan trong kiềm. Trong quá trình chế biến, protein và amino acid đóng vai trò quan trọng trong việc tạo hương và vị của nước chè pha.[4] 1.1.4.6. Carbohydrate Glucid trong chè rất đa dạng, bao gồm các monosacharide (chiếm khoảng 1 2%) và các polysaccharide (chiếm 10 – 12%). Ở chè, các dạng đường tan trong nước có hàm lượng không nhiều nhưng rất cần thiết cho việc hình thành chất lượng đặc trưng của chè thành phẩm.[4] 1.1.4.7. Tinh dầu Tinh dầu trong chè rất ít, hàm lượng của chúng trong lá chè tươi vào khoảng 0,007 – 0,009% và trong chè bán thành phẩm khoảng 0,024 – 0,025%. Hàm lượng này phụ thuộc nhiều vào giống và độ cao trồng trọt.[9] 1.1.4.8. Vitamin Có nhiều loại vitamin trong chè. Chính vì vậy, giá trị dược liệu cũng như giá trị dinh dưỡng của chè rất cao. Hàm lượng một số vitamin trong chè tính theo mg/1000 g chất khô như sau: Vitamin A: 54,6; B1: 0,7; B2: 12,2; PP: 47,0; C: 27,0 v.v... Đáng chú ý nhất là hàm lượng vitamin C ở trong chè nhiều hơn trong cam chanh từ 3 đến 4 lần.[4] 1.1.4.9. Enzyme Trong búp chè có hầu hết các loại enzyme nhưng chủ yếu gồm hai nhóm chính: nhóm thủy phân (amylase, glucosidase, protease...) và nhóm oxi hóa khử (peroxidase và polyphenoloxidase). Các enzym này đóng vai trò quan trọng trong công nghiệp chế biến chè.[4] 1.1.4.10. Chất tro Hàm lượng tro trong chè tươi vào khoảng 4 - 5% CK và lên tới 5 - 6% CK trong chè thành phẩm. Các chất khoáng có nhiều trong chè là K, Se, Mn, Zn...[4] 1.1.5. Dược tính của chè Chè là loại nước uống tốt nhất trên thế giới, mọi người điều biết chè đã được sử dụng như là một phương thuốc trong y học phương đông từ rất lâu. Căn cứ vào các sách đông y dược, ghi chép qua các thời đại và thực tiễn chứng minh chẳng những bảo vệ sức khỏe mà còn có tác dụng điều trị nhiều loại bệnh, nên người ta coi chè là loại thuốc chữa bệnh. Tuy nhiên các hiểu biết về cơ chế tác đông của lá chè mới được bắt đầu nghiên cứu mạnh mẽ trong thế kỉ 20. Trước đây tác dụng của trà được cho rằng do tác động của các thành phần caffeine và vitamin C. Bắt đầu từ khoảng thập niên 70 của thế kỉ 20, việc nghiên cứu chi tiết về chè đã chỉ ra rằng những tác dụng về mặt dược lý của chè là do sự có mặt của nhiều nhóm hợp chất như; alcoloid: caffeine, theophyllin, theobromin, purin. Các flavonoid, chất catechin, lipid, dẫn chất phenol, tinh dầu, các acid amin và nhiều sinh tố cùng các nguyên tố hằng lượng và vi lượng như P, sắt, iod,