Tài liệu Ứng dụng enzyme papain trong thủy phân bánh dầu đậu phộng nhằm tạo sản phẩm có giá trị dinh dưỡng ca

Công nghệ enzyme T.s Nguyễn Hoài Hương MỤC LỤC CHƯƠNG I : LỜI MỞ ĐẦU................................................................................................................. 3 CHƯƠNG II: GIỚI THIỆU VỀ ENZYME PAPAIN............................................................................4 2.1 Giới thiệu về cây đu đủ..............................................................................................4 2.1.1. Giới thiệu..........................................................................................................4 2.1.2. Phân bố sinh thái của cây đu đủ......................................................................5 2.1.3.Hoạt tính sinh học và công dụng của một số chất có trong cây đu đủ...........5 2.2 Giới thiệu về enzyme papain.....................................................................................5 2.2.1 Cysteine protease...............................................................................................5 2.2.2 Nguồn gốc........................................................................................................... 5 2.2.3 Tính chất của papain.........................................................................................5 2.2.3.1 Tính chất vật lý......................................................................................6 2.2.3.2 Tính chất hóa học..................................................................................7 a) Cấu tạo hóa học:..........................................................................................................7 b) Cấu trúc không gian...................................................................................................8 c) Cấu trúc tâm hoạt động của papain...........................................................................9 d) Phản ứng của papain................................................................................................11 e) Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của papain........................................13 CHƯƠNG III: PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN VÀ TINH SẠCH PAPAIN ............14 3.1 Phương pháp thu nhận papain...............................................................................14 3.1.1 Thu nhận nhựa đu đủ.....................................................................................14 3.1.2 Thu nhận papain.............................................................................................14 3.2 Phương pháp tinh sạch papain...............................................................................15 .. 3.2.1. Điện di..................................................................................................15 3.2.2 Lọc qua Sephadex G-75..................................................................................15 CHƯƠNG IV: ỨNG DỤNG ENZYM PAPAIN THỦY PHÂN BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG.......................................................................................................................... 17 4.1 Ứng dụng của enzyme papain trong thủy phân bánh dầu đậu phộng.................17 4.1.1 Sơ đồ thực hiện phản ứng thủy phân.............................................................17 a/ Nguyên lý chung:.......................................................................................................17 b/ Thuyết minh quy trình chung:.................................................................................18 Nhóm _08DSH2 -1- Công nghệ enzyme T.s Nguyễn Hoài Hương 4.1.2 Các thay đổi hóa sinh trong quá trình thủy phân.........................................18 4.1.3 Tính chất của sản phẩm sau thủy phân.........................................................19 4.1.4 Chỉ tiêu theo dõi papain thủy phân bánh dầu đậu nành..............................19 4.1.5 Phương pháp xác định hoạt tính....................................................................20 a. Cơ chất:..................................................................................................................... 20 b. Điều kiện:................................................................................................................... 20 c. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme:..................................................................20 .. c.1. Khái quát...................................................................................................20 c.2. Phương pháp xác định hoạt tính của papain...........................................21 4.2 Một số ứng dụng của enzyme papain.....................................................................25 4.2.1 Trong y học......................................................................................................25 4.2.2 Trong công nghiệp thực phẩm:......................................................................25 4.2.3 Trong các ngành công nghiệp khác:...............................................................26 CHƯƠNG V: KẾT LUẬN............................................................................................28 Tài lệu tham khảo.....................................................................................................29 Nhóm _08DSH2 -2- Công nghệ enzyme T.s Nguyễn Hoài Hương CHƯƠNG I : LỜI MỞ ĐẦU Trong mủ đu đủ có ba enzyme chính bao gồm: papain, chymopapain và peptidase. Papain là một enzym được lấy ra từ mủ của các quả đu đủ xanh. Ngoài ra, papain còn là một loại men phân giải protein tồn tại trong đu đủ. Enzym papain rất tốt cho hệ tiêu hóa, giúp tiêu hóa các thức ăn giàu protein một cách dễ dàng hơn. Nó có thể giúp phân giải và loại bỏ những lớp da chết trên bề mặt cơ thể. Papain có tác dụng tiêu hóa protid, biến đổi các chất có albumin thành pepton, có tác dụng trên mỡ, trên các hydrat carbon trong môi trường hơi kiềm hay trung tính. Ở nhiệt độ thường khi cho tiếp xúc papain với lòng trắng trứng thì lòng trắng trứng bị mất tính sánh sền sệt. Trung bình một trái đu đủ cho được 12g mủ, từ 4kg mủ đu đủ tươi cho 1kg papain khô và trồng đu đủ để khai thác lấy mủ chỉ hiệu quả trong vòng 3 - 4 năm tuy vòng đời của một cây đu đủ khoảng 20 năm. Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học , các chế phẩm enzyme được sản xuất ngày càng nhiều và được sử dụng hầu hết trong các lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Khoảng 75% chế phẩm là enzyme thủy phân được sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên. Với những lợi ích và giá trị mà enzyme papain đem lại , nó được ứng dụng rộng rãi và thường được dùng trong lĩnh vực chế biến mỹ phẩm. Ngoài ra, Papain rất cần cho nhiều lĩnh vực công nghiệp: dược phẩm, hóa chất, kỹ nghệ tơ sợi dệt may, thuộc da, thực phẩm.... Vì tầm quan trọng của enzyme papain trong nhiều lĩnh vực nên nhóm chúng tôi thực hiện đề tài: Ứng dụng enzyme papain trong thủy phân bánh dầu đậu phộng nhằm tạo sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao ứng dụng trong chăn nuôi. Nhóm _08DSH2 -3- Công nghệ enzyme T.s Nguyễn Hoài Hương CHƯƠNG II: GIỚI THIỆU VỀ ENZYME PAPAIN 2.1 Giới thiệu về cây đu đủ 2.1.1 Giới thiệu Tên khoa học: Carica papaya L., thuộc họ đu đủ - Caricac Cây đu đủ còn được gọi thù đủ ở Huế, phiên mộc, cà lào, phiên qua, phan qua thụ, lô hong phlê (Campuchia), mắc hung (Lào), má hống (Thái). Đu đủ thường là cây đồng chu, nhưng đu đủ có thể xếp thành 3 loại trên phương diện giới tính: cây đực, cây lưỡng tính và cây cái. Vài cây đu đủ cũng có thể trổ cả ba loại hoa nói trên. Ngoài ra cũng có cây ra hoa không hẳn hoàn toàn đực, cái hay lưỡng tính mà lại pha lẫn nhiều ít đặc tính của ba loại hoa. Khuynh hướng thay đổi giới tính phần lớn do thời tiết gây ra tỉ như khô hạn và thay đổi nhiệt độ. 2.1.2 Phân bố sinh thái của cây đu đủ. Chi Carica L. có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới châu Mỹ. Ở vùng núi cao (1500-3000m), từ Panama đến Bolivia, cây đu đủ trồng hiện nay rất có thể là giống lai tự nhiên của loài Nhóm _08DSH2 -4- Công nghệ enzyme T.s Nguyễn Hoài Hương C. peltata Hook & Ann. Vào khoảng thế kỷ 16, người Tây Ban Nha đã đưa đu đủ vào trồng ở vùng Caribê và một số nước Đông Nam Á. Từ các địa điểm này, cây tiếp tục được trồng rộng rãi ở Ấn Độ, Srilanca, châu Đại Dương và châu Phi. 2.1.3 Hoạt tính sinh học và công dụng của một số chất có trong cây đu đủ 1. Nhựa đu đủ có thể gây viêm da. 2. Ở Trung Mỹ, trong dân gian, người ta sử dụng đu đủ để điều trị bệnh lỵamip (Entamoeba histolytica), một loại ký sinh trùng gây tiêu chảy dạng lỵ và biến chứng ápxe gan. 3. Ở Samoa, người dân dùng phần dưới vỏ thân cây đu đủ để chữa chứng nhức răng. 4. Nhựa đu đủ có chứa papain, là một trong hai loại men tiêu hủy protein (proteolytic enzymes) có tác dụng làm mềm thịt bắp. Chính do tác dụng này, khi dùng đu đủ hầm chung với thịt, thịt sẽ mềm hơn. Người dân vùng Ca-ri-bê, Trung Mỹ cho biết họ có thể dùng khẩu phần với số lượng lớn thịt cá nhưng vẫn không hề gì nếu ăn đu đủ xanh sau đó. 5. Phần cơm đu đủ là thành phần chính của các loại mỹ phẩm như kem nền (mặt), kem đánh răng, xà bông gội đầu. 6. Các ứng dụng quan trọng trong y học của nhựa đu đủ là chiết xuất papain để dùng trong phẫu thuật cột sống (là một loại "dao phẫu thuật tự nhiên" để mở đĩa đệm). Nghiên cứu cho thấy chiết xuất papain có hoạt tính kháng sinh (antibioticactivity) với tác dụng chống vi khuẩn gram dương (gram-positive bacteria). Nó còn được dùng để điều trị lở loét, làm tiêu giả mạc trong bệnh bạch hầu, chống kết dính sau phẫu thuật, làm thuốc giúp tiêu hóa. Trong công nghiệp, papain được dùng để tinh chế bia; xử lý len và lụa trước khi nhuộm; là phụ gia trong công nghệ chế biến cao su; khi tinh chế dầu gan cá tuna, người ta tiêm papain vào gan trước khi chiết xuất, làm cho thành phẩm giàu Vitamin A và D hơn. Khoảng 1,500 quả đu đủ xanh cỡ vừa cho được khoảng 650g papain. 2.2 Giới thiệu về enzyme papain 2.2.1 Cysteine protease Nhóm _08DSH2 -5- Công nghệ enzyme T.s Nguyễn Hoài Hương - Cysteine proteases (EC.3.4.22) là nhóm các protein có trọng lượng phân tử trong khoảng 21-30kDa, các protein này có khả năng xúc tác để thủy phân các loại liên kết: peptide, amide, esterthiol. Đây cũng là những enzyme có nhóm –SH trong tâm hoạt động. - Người ta đã tìm thấy hơn 20 họ cysteine proteases (Barrett, 1994) và nhiều enzyme trong số này (papain, bromelain, ficain, animal cathepsins) được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp. - Có 2 loại cysteine proteases là exopeptidase ( cathepsin X, carboxypeptidase B) và endopeptidases ( bromelain, ficain, cathepsin…). Exopeptidase thủy phân liên kết peptide ở đầu N hoặc đầu C tự do trong khi đó endopepetidase cắt đứt các liên kết peptide ở giữa chuỗi polypeptide. 2.2.2 Nguồn gốc Papain (EC 3.4.22.3) là cysteine protease được biết đến nhiều nhất và được phân lập lần đầu tiên vào năm 1879 từ nhựa trái đu đủ (Carica papaya). Đây cũng là enzyme đầu tiên được xác định cấu trúc tinh thể (Drenth et al., 1968; Kamphuis et al., 1894). Trong nhựa đu đủ ngoài enzyme papain còn có các loại protease khác như chymopapain, caricain, glycyl endopeptidase và một số enzyme khác (Baines and Brock-lehurst, 1979). Nhựa đu đủ có hàm lượng và hoạt tính papain cao nhất tập trung ở vùng có nắng nóng và độ ẩm ổn định quanh năm. 2.2.3 Tính chất của papain 2.2.3.1 Tính chất vật lý Bảng 2.1: Tính chất vật lý của papain Tính chất vật lý Điểm đẳng điện Hằng số sa lắng S20 Hằng số phân tán D20 (10-7giây.cm2) Phân tử lượng Độ triền quang [α]D Nhóm _08DSH2 Giá trị pI = 8.75 2.42 ± 0.04 10.27 ± 0.13 20,700 -66.70 -6- Công nghệ enzyme T.s Nguyễn Hoài Hương Độ xoắn 17% Vòng hiệu ứng cotton 290nm Thể tích riêng phần V(mL/g) 0.724 Trị số ma sát f/fo 1.16 Bột màu vàng hay màu nâu nhạt, tùy thuộc phương pháp sấy, không tan trong hầu hết các chất hữu cơ nhưng tan một phần trong H2O hay glycerine. Bền nhiệt. 2.2.3.2. Tính chất hóa học a) Cấu tạo hóa học: Papain là 1 endoprotease có chứa 16% N và 1.2% S. Papain là 1 protease thiol, theo nghiên cứu của R. L. Hill và E. L Smith, papain là 1 chuỗi polypeptide gồm 185 amino acid, trọng lượng phân tử là 20.900 Dalton. Bảng 2.2: Thành phần hóa học: Amino acid Số lượng Amino acid Số lượng Alanine 13 Lyeine 9 Arginine 10 Proline 4 Aspartic acid 17 Serine 9 Half – Cysteine 6 Threonie 11 Glutamid acid 17 Tryptophan 7 Glycine 23 Tyrosine 5 Histidine 2 Valine 17 Isoleucine 10 Methionine 15 Leucine 10 0 Tổng cộng: 185 Theo kết quả phân tích bằng tia X, phân tử papain được cấu tạo bởi 212 acid amin trong đó không có chứa methionine. Phân tử lượng khoảng 23,350 Da, phân tử là một Nhóm _08DSH2 -7- Công nghệ enzyme T.s Nguyễn Hoài Hương mạch polypeptide với đầu N là isoleucine, đầu C là asparagine, có 6 gốc cysteine tạo thành 3 cầu disulfur ở các vị trí 22-63, 56-95, 153-200 không có chức năng sinh học, chỉ làm tăng tính bền vững của cấu trúc và một nhóm –SH tự do ở vị trí 25. b) Cấu trúc không gian Phân tử papain có dạng hình cầu với kích thước 36x48x36Ao và mạch chính bị gấp thành hai phần riêng biệt bởi một khe. Trung tâm hoạt động nằm tại bề mặt của khe này, nhóm -SH hoạt động của cysteine 25 nằm bên trái khe và nhóm histidine 159 nằm bên phải khe. Phần xoắn chiếm 20% toàn bộ các amino acid có trong phân tử. Hoạt tính của papain dựa trên hai tâm hoạt động là Cys25 và His159. Khoảng pH hoạt động của papain khá rộng (3.5 – 8.0) tùy thuộc vào cơ chất. Khi cơ chất là casein thì hoạt tính tối ưu của papain trong vùng pH từ 5.7 – 7.0 và nhiệt độ thích hợp là 50 – 570C. c) Cấu trúc tâm hoạt động của papain - Tâm hoạt động của papain gồm có nhóm –SH của cysteine 25 và nitrogen bậc 3 của histidine 159. Bên cạnh đó nhóm imidazole của His 159 cũng liên kết với Asp 175 bởi liên kết hydrogen. - Vùng tâm hoạt động của papain chứa mạch polypeptide với các amino acid là: Nhóm _08DSH2 -8- Công nghệ enzyme T.s Nguyễn Hoài Hương Lys-Asp-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Ser-Cys. - Theo các nghiên cứu của Lowe, chuỗi polypeptide trong trung tâm hoạt động của papain gần giống như của ficin hay trypsin, mặc dù chúng có nguồn gốc khác nhau. Ficin: Arg-Glu-Glu-Gly-Glu-Cys-Gly-Ser-Cys. Trypsin: Lys-Asp-Ser-Cys-Glu-Gly-Gly-Asp-Ser.  Hoạt tính enzyme và cơ chất tác dụng: - Papain thủy phân peotein thành các polypeptide và các polypeptide và các amino acid, đóng vai trò vừa như endopeptidase vừa như exopeptidase. - Các endopeptidase thủy phân protein chủ yếu thành các peptid: (-NH-CH(R)-CO-NH-CH(R)-CO-)n + HOH  (-NH-CH(R)-COOH)I + (H2N- CH(R)CO-)k i+k=n - Các exopeptidase thủy phân các peptide thành các amino acid (H2N-CH(R )-CO-NH-CH(R )-CO-)n + HOH  (H2N-CH(R)-COOH)n` + (H2NCH(R)-CO-)k n`+k = n Nhóm _08DSH2 -9- Công nghệ enzyme T.s Nguyễn Hoài Hương - So với các protease có nguồn gốc động vật và vi sinh vật khác thì papain có khả năng thủy phân sâu hơn. Tính đặc hiệu cơ chất của papain rất rộng vì nó có khả năng phân hủy hầu hết các liên kết peptide trừ các liên kết với proline và các glutamic acid có nhóm carboxy tự do. Papain có thể nhận biết 1 chuỗi gồm 7 amino aicd trên cơ chất peptide của mình và sẽ ưu tiên cắt liên kết peptide trên 1 chuỗi có phenylamine như sau: nếu peptide có dạng X-Phe-Y-Z (X, Y, Z là các gốc amino acid) thì papainsex cắt tại vị trí giữa Y và Z, nhưng nếu peptide có dạng X-Phe-Y ( có Phe nằm ở vị trí thứ 2 trước đầu tận cùng) thì không được thủy phân bởi papain. - Ngoài ra papain còn có hoạt tính esterase, thiolesterase và trafnerase.  Hoạt hóa papain: Papain chỉ thể hiện hoạt tính xác tác của mình khi nhóm –SH ở dạng tự do. Vì vậy ta sử dụng chất hoạt hóa để đưa papain từ trạng thái không hoạt động sang trạng thái hoạt động. do trung tâm hoạt động của papain có tính khử nên các chất hoạt hóa là các chất có tính khử như cysteine, glytation aicd, hdrocyanic… trong đó cysteine là chất hay dùng nhất. hki có mặt các chất này thì nhóm –SH của papain được phục hồi và làm tăng hoạt tính papain. Để thu được hoạt tính cao nhất thì thích hợp là dùng hỗn hợp cysteine và EDTA, trong đó cysteine đóng vai trò là chất hoạt hóa papain, còn EDTA đóng vai trò chất liên kết tạo phức với ion kim loại nặng có trong nhựa đu đủ.  Bất hoạt: - Papain bị kìm hãm ( ức chế bất thuận nghịch) bởi các chất oxy hóa như: O2, O3, H2O2, iodur acetate, cysteine và các hợp chất disufur khác. Các chất này phản ứng với nhóm –SH ở tring tâm hoạt động của papain làm phá vỡ cấu trúc tâm hoạt động của nó. - Papain bị bất hoạt thuận nghịch bởi không khí, cysteine ở nồng độ thấp. papain tác dụng với chloromethul cetone của Phe và Lys thì mất hoàn toàn hoạt tính. Tuy nhiên papain lại rất bền với các tác nhân biến tính là dung môi hữu cơ ( độ quay cực của papain hầu như không biến đổi trong ethanol 70% hay urea 6-8m). d) Phản ứng của papain Nhóm _08DSH2 - 10 - Công nghệ enzyme T.s Nguyễn Hoài Hương Papain thủy phân protein thành các polypeptide và các acid amin, nó đóng vai trò vừa như endopeptidase vừa như exopeptidase. Nhóm _08DSH2 - 11 - Công nghệ enzyme Nhóm _08DSH2 T.s Nguyễn Hoài Hương - 12 - Công nghệ enzyme T.s Nguyễn Hoài Hương e. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của papain Nhiệt độ: Papain là enzyme chịu được nhiệt độ tương đối cao. Ở dạng nhựa khô papain không bị biến tính trong 3 giờ ở 100 0C. Còn ở dạng dung dịch papain bị mất hoạt tính sau 30 phút ở 82.50C và nếu nhiệt độ tăng cao hơn (>1000C) thì nó sẽ bị mất hoàn toàn hoạt tính kể cả khi thêm lượng lớn chất hoạt hóa vào dung dịch. Điều này là do ở dạng dung dịch khi tăng lên đến nhiệt độ lớn hơn 100 0C thì cấu trúc tâm hoạt động của papain bị phá hủy hoàn toàn. Điều đáng lưu ý là sau khi đã được tinh sạch và ở trạng thái tinh thể thì papain có độ bền nhiệt thấp hơn papain ở trong nhựa, do trong nhựa còn chứa các protein khác có tác dụng bảo vệ papain. Papain trong dung dịch NaCl giữ ở 40C bền trong nhiều tháng. Trong dung dịch dẫn xuất thủy ngân, papain cũng không mất hoạt tính trong nhiều tháng. Trong khi đó hầu hết các enzyme mất hoạt tính mỗi ngày 1-2% do sự phân hủy hoặc oxy Khi thủy phân các protein khác nhau, thì tùy thuộc vào cơ chất mà nhiệt độ thích hợp cho papain cũng khác nhau chẳng hạn đối với cơ chất là casein thì nhiệt độ tối ưu cho phản ứng là 37 0C. Papain dạng ổn định ở trạng thái khô có thể chịu nhiệt độ sấy ở 115 0C trong thời gian 2 giờ mà hoạt tính vẫn duy trì được 90%. pH: Papain hoạt động trong khoảng pH tương đối rộng từ 4.5-8.5 nhưng lại dễ biến tính trong môi trường acid có pH < 4.5 hoặc trong môi trường kiềm mạnh có pH > 12. Khi phản ứng với cơ chất thì tùy thuộc vào bản chất của cơ chất mà pH tối ưu sẽ khác nhau. Chẳng hạn, papain phản ứng với casein ở pH tối ưu là 7-7.5. Papain dạng ổn định tức là dạng mà cấu trúc không gian của enzyme được ổn định, có thể chịu được các pH = 1.5 và pH = 8.5 trong 90 phút. Dung môi: Papain không thay đổi độ quay quang học trong dung môi là methanol 70% và không thay đổi độ nhớt trong dung môi methanol 50%. Trong dung dịch dimethylsulfoxide chứa 20% dung môi hữu cơ và urea 8M không làm giảm hoạt tính Nhóm _08DSH2 - 13 - Công nghệ enzyme T.s Nguyễn Hoài Hương cũng như thay đổi cấu hình của papain. Các chất gây biến tính mạnh như TCA 10%, guanidine hydrochloride 6M làm biến đổi bất thuận nghịch về độ quay quang học và hoạt tính của papain. CHƯƠNG III: PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN VÀ TINH SẠCH PAPAIN 3.1 Phương pháp thu nhận papain Sơ đồ quy trình công nghệ: Nguyên liệu 180g nhựa đu đủ Celite(100g) 200-300m dd cysteine 0.04M Nghiền pH: 5.7 Cát sạch(150g) 110mlNaOH 1M Trích ly Bã Lọc Bã Chỉnh pH Lọc (NH4)2SO4 Kết tủa phân đoạn 1 Ly tâm 1 60g NaCl rắn Kết tủa phân đoạn 2 Tủa xám Thời gian: 1-2 giờ 400-500ml (NH4)2SO4 Dịch lỏng pH : 7-7.5 thời gian: 1 giờ Ly tâm 2 Kết tinh Dịch lỏng pH: 6.5 Thời gian: 30phút dd NaCl bão hòa Tái kết tinh t: 370C Sấy chân không Nhóm _08DSH2 - 14 - Công nghệ enzyme T.s Nguyễn Hoài Hương t: 400C Papain. 3.1.1 Thu nhận nhựa đu đủ: Nhựa cây đu đủ nằm trong các ống dẫn nhựa trải rộng khắp toàn bộ cây, ngoại trừ rễ. nhựa là hỗn hợp enzyme chứa các protease sau: papain, chymopapain A( gốc amino acid cuối là glutamic acid), chymopapain B(gốc amino aicd là tyrosine), proteinase III, proteinase IV, thilprotesase, trong đó papain chiếm tới 95%. 3.1.2 Thu nhận papain:  Chuẩn bị: Do trong nhựa đu đủ ngoài papain, chymopapain còn có 1 số enzyme, protein, chất nhựa, chất cao su, chất béo và các tạp chất khác để có được quy trình tách và làm sạch papain từ nhựa đu đủ có hiệu quả thì có quy trình hòa tan nhựa đu đủ nhằm loại bỏ tạp chất. cách làm như sau: Trộn 180g nhựa đu đủ với 100g cetile và 150g cát sạch, nghiền kĩ trong cối ở nhiệt độ phòng với 200-300mL dung dịch cysteine 0.04M (hòa tan 6.3g cysteine hydrochloride trong 1000mL dung dịch NaOH 0.054M, kiềm được sử dụng để đư pH dịch chiết tới 5.7) Khi nhựa tạo thành thể huyền phù thì gạn bỏ lớp nổi ở trên. Quá trình nghiền và trích được lặp lại với 300mL dung dịch cysteine. Rửa cối với dung dịch cysteine để điều chỉnh thể tích chiết lên 11. Dịch huyền phù sau cùng được lọc lạnh (có thể hút nhẹ) trên giấy lọc Whatman số 1, thời gian lọc có thể rất dài. Nước lọc có màu trắng sữa hoặc vàng xanh, pH gần 5.7. Các bước còn lại của quá trình tinh sạch enzyme được tiến hành trong điều kiện lạnh.  Loại bỏ các chất không tan pH9: Thêm từ từ và khuấy đều 1 lượng khoảng 110ml dung dịch NaOH 1M để điều chỉnh pH của dịch chiết thu được ở trên lên pH 9. Lọc hoặc ly tâm ở 2600 vòng/phút trong 1 giờ để loại bỏ tủa xám tạo thành (tủa gây biến tính protein), thu dịch trích trong.  Quá trình phân đoạn bằng (NH4)2SO4: Nhóm _08DSH2 - 15 - Công nghệ enzyme T.s Nguyễn Hoài Hương Cho (NH4)2SO4 vào dịch enzyme đến 40% độ bão hòa, sau 1-2 giờ, ly tâm ở 2500 vòng/ phút. Thu nhận tủa, bỏ dịch lỏng hoặc có thể giữ lại lấy chymopapain. Tủa được rửa lại 1 lần nữa với 400-500ml dung dịch (NH4)2SO4 40% độ bão hòa.  Quá trình phân đoạn bằng NaCl: Hòa tan trong 600mL dung dịch cysteine 0.02M, dung dịch thu được có pH 7- 7.5 sau đó thêm từ từ 60g NaCl rắn. Sau 1 giờ, ly tâm ở 2500 vòng/phút trong 1 giờ để thu tủa, bỏ dich lỏng.  Kết tinh Hòa tan tủa với 400mL dung dịch cysteine 0.002M ở nhiệt độ phòng được 1 dung dịch huyền phù có pH = 6.5. Giữ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút để tinh thể tạo thành, duy trì ở 40C qua đêm, sau đó ly tâm lạnh ở 2500 vòng/ phút trong 4-5 giờ để thu nhận tinh thể.  Tái kết tinh: Hòa tan tinh thể thu được ở bước trên trong nước cất nhiệt độ phòng tạo dung dịch có nồng độ protein khoảng 1%. Sau đó cho vào từ từ ( đồng thời khuấy đều) dung dich NaCl bão hào ( 10mL/ 300mL dung dịch protein). Khi 75% thể tích dung dịch NaCl đã cho vào, papain bắt đầu kết tinh ở nhiệt độ phòng. Dịch huyền phù được giữ ở 4 0C qua đêm, sau đó ly tâm lạnh 2500 vòng/ phút trong 4-5 giờ thu nhận tinh thể. Hoạt động riêng của enzyme có thể tăng nhẹ nếu tiến hành tái kết tinh thêm 1 lần nữa như trên. Để tăng hoạt tính enzyme, trước khi tái kết tinh có thể hòa tan tinh thể papain trong dung dịch đệm phosphate chứa cysteine, sau đó tiến hành siêu lọc với màng lọc 4000A 0 và đem kết tinh dịch lỏng thu được sau siêu lọc.  Sấy chân không Sấy chân không ở nhiệt độ 400C thu nhận papain tinh chế. 3.2 Phương pháp tinh sạch papain 3.2.1. Điện di: Sử dụng gel polyacrylamide 12%, dung dịch đệm là beta-alanine 34mM, pH = 4.3 và cường độ dòng điện không đổi là 4mM. mẫu sẽ được chuẩn bị trong Tris-glycerol-beta- Nhóm _08DSH2 - 16 - Công nghệ enzyme T.s Nguyễn Hoài Hương mercatoethanol cho vào nước sôi trong 40 giây. Gel sẽ được hiện màu bằng thuốc thử Coomassie-Blue R-250 và Brilliant Blue G-colloidal. 3.2.2 Lọc qua Sephadex G-75: Để xác định phân tử lượng của papain, ta dùng cột Sephadex G-75 có kích thước cột là 1.1x100 cm. cột được cân bằng trước dung dịch đệm gồm sodium phosphate 0.1M và dung dịch EDTA ( ethylenediamine-tetraacetic aicd) pH=7. Nhóm _08DSH2 - 17 - Công nghệ enzyme T.s Nguyễn Hoài Hương CHƯƠNG IV: ỨNG DỤNG ENZYM PAPAIN THỦY PHÂN BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG 4.1 Ứng dụng của enzyme papain trong thủy phân bánh dầu đậu phộng 4.1.1 Sơ đồ thực hiện phản ứng thủy phân Enzyme papain (khô) Bánh dầu đậu phộng xay nhuyễn Thủy giải dd đệm phosphate 0.1M t: 1500C pH : 8-8.5 thời gian: 2 giờ Lọc hoặc ly tâm Sản phẩm thu được dạng dung dịch loãng Dịch lọc Bã sau lọc Bất hoạt enzym O2, O3, H2O2, iodur acetate Cô đặc Sản phẩm đậm đặc hoặc khô Sơ đồ thủy phân. a/ Nguyên lý chung: Nhóm _08DSH2 - 18 - Công nghệ enzyme T.s Nguyễn Hoài Hương Quá trình chuyển từ protein bánh đậu phộng thành acid amin là một quá trình khá phức tạp. Dưới điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân, enzyme sẽ tham gia phản ứng theo sơ đồ sau: E + S  ESS + P - Người ta cho rằng ban đầu enzyme sẽ liên kết với cơ chất (bánh dầu đậu phộng), sau đó mới diễn ra sự thủy giải và tạo ra các sản phẩm là các acid amin và các đoạn peptid ngắn. - Ở đây E là enzyme papain và S là protein đậu phộng, ES là phức hợp trung gian giữa enzyme và cơ chất, P là sản phẩm (chủ yếu là các acid amin và các peptid cấp thấp). Sự tạo thành và chuyển biến của hợp chất trung gian ES xảy ra qua 3 bước: Bước 1: Enzyme kết hợp với protein tạo thành phức enzyme – protein (ES). Bước 2: Có sự thay đổi mật độ điện tử và sự biến dạng hình học của các mối liên kết đồng hóa trị trong phân tử cơ chất S cũng như trung tâm hoạt động của E. Bước 3: Giai đoạn tạo thành acid amin hay peptid cấp thấp và giải phóng enzyme. b/ Thuyết minh quy trình chung: Bánh dầu đậu phộng sau khi được xay nhuyễn ta bổ sung enzyme khô papain và dd đệm phosphate 0.1M để quá trình phân giải bánh dầu nhanh hơn, quá trình thủy phân được thực hiện ở nhiệt độ 1500C với pH = 8-8.5, thời gian thủy phân là 1- 2 giờ. Sau quá trình thủy giải ta đem đi ly tâm nhằm thu dịch lỏng ( loại bỏ bã ) đồng thời ta bổ sung các chất như O2,O3,H2O2, iodur acetate …. Làm cho enzyme không hoạt động nữa để thu được sản phẩm loãng. Nhưng nhà sản xuất muốn sản phẩm đạt được chất lượng cao và bảo quản dễ dàng hơn người ta thường cô đặc sản phẩm tao ra sản phẩm khô ở đây ta kết thúc quá trình thủy phân của enzyme papain. Mục đích người ta dùng enzyme papain dể thủy phân bánh dầu đậu phộng là nhằm cung cấp them các acid amin có trong enzyme vào trong bánh dầu, để bổ sung vào thức ăn cho gia súc và cho người. 4.1.2 Các thay đổi hóa sinh trong quá trình thủy phân: - Những nghiên cứu về sự liên kết enzyme và cơ chất đề ra giả thuyết: phần lớn các enzyme trở nên hấp thụ với bề mặt ngoài của protein đậu phộng theo một tiến trình tương đối nhanh, sau đó sự khuếch tán những phân tử enzyme vào trong những thành phần này Nhóm _08DSH2 - 19 - Công nghệ enzyme T.s Nguyễn Hoài Hương xảy ra chậm hơn. Sự thủy phân những nối peptid của protein đậu phộng có thể chia làm hai pha: + Pha nhanh (pha động): xảy ra ở giai đoạn đầu. Trong suốt pha này, một số lớp peptid bị phá hủy trong một đơn vị thời gian và một phần chất hòa tan được phóng thích vào trong dung dịch. + Pha chậm (pha tĩnh): tốc độ thủy phân càng về sau càng giảm, tiến trình hầu như ít có sự thay đổi cho đến khi phản ứng thủy phân kết thúc. 4.1.3 Tính chất của sản phẩm sau thủy phân - Tính chất quan trọng nhất của sản phẩm là tính dinh dưỡng. Chiều dài chuỗi peptid của sản phẩm thủy phân có tầm quan trọng đặc biệt. Khả năng hòa tan, khả năng nhũ tương, vị đắng …đều phụ thuộc ít nhiều vào kích thước và trọng lượng phân tử của các loại proteint có trong sản phẩm. Tất cả các sản phẩm thủy phân đều có vị đắng ở những mức độ khác nhau làm hạn chế rất nhiều tính cảm quan của sản phẩm. Vị đắng là nhược điểm chung của các sản phẩm thủy phân với xúc tác enzyme và được cho là có liên quan đến những peptid có trọng lượng phân tử thấp (khoảng 6,000 Da). Ta không thể khử được vị đắng nhưng có thể giảm bớt được bằng cách kiểm soát mức độ thủy phân để cho những peptid có phân tử lượng lớn chiếm ưu thế. - Việc sử dụng enzyme làm xúc tác có nhược điểm là thủy phân không triệt để, sau thủy phân còn khoảng 20% nitơ tổng số vẫn không tan, do đó người ta thường phối hợp thủy phân bằng hóa chất để nâng cao hiệu suất thủy phân. 4.1.4 Chỉ tiêu theo dõi papain thủy phân bánh dầu đậu nành. Chúng tôi điều chế enzyme papain để thủy phân protein trong bánh dầu đậu phộng với các nội dung sau: 1. Thu nhận enzyme papain từ nhựa trái đu đủ - Khảo sát các điều kiện thu nhận enzyme papain - Định lượng và hoạt tính của enzyme papain sau mỗi giai đoạn tinh chế. - Khảo sát sự biến đổi lượng và hoạt tính enzyme papain theo thời gian. - Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme papain. Nhóm _08DSH2 - 20 -