Tài liệu Tuyển chọn chủng bacillus từ rừng ngập mặn sinh mạnh protease kiềm và bước đầu định hướng ứng dụng

PHẦN MỞ ĐẦU Trong những năm gần đây, giá trị thương mại của các enzyme công nghiệp trên toàn thế giới đạt khoảng 1 tỷ USD, trong đó chủ yếu là các enzyme thủy phân (75%), và protease là mô ̣t trong ba nhóm enzyme thủy phân lớn nhất sử dụng trong công nghiệp (60%) [43]. Protease có thể được thu từ cỏc nhúm sinh vật khác nhau như thực vật, động vật, vi sinh vật trong đó nguồn enzyme từ vi sinh vật là phong phú nhất. Động vật và thực vật chỉ có khả năng sinh ra một trong hai loại enzyme protease là endoprotease hoặc exoprotease, trong khi vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai loại trên. Do đó, protease của vi khuẩn có phổ ứng dụng rộng, hiệu suất sử dụng cao, có khả năng phân hủy triệt để các liên kết peptide trong phân tử protein [66]. Các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease thuộc loài Bacillus subtilis, B. mesentericus, B. thermorpoteoliticus và một số loài thuộc chi Clostridium. Trong đó, B. subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất. Tuy nhiên, các vi khuẩn đất hoặc vi khuẩn nước ngọt thường tổng hợp các protease hoa ̣t động thích hợp ở vùng pH trung tính hoặc kiềm yếu và kém chịu mặn do đó việc ứng dụng còn hạn chế. Việc nghiên cứu các chủng Bacillus chịu mặn và sinh protease kiềm chưa được nghiên cứu nhiều. Lần đầu tiên các chủng này được nghiên cứu là vào năm 1968, các chủng ưa kiềm phát triển thuận lợi nhất ở điều kiện pH 9 và có thể ở pH 10 – 12, chúng không phát triển hoặc phát triển rất kém ở điều kiện pH 6.5 [44]. Những phát hiện ban đầu về những chủng ưa mặn và ưa kiềm trên là vô cùng quan trọng, đã mở ra các hướng ứng dụng lớn trong nhiều lĩnh vực như sản xuất như: chất tẩy rửa, thuộc da, y tế, nông nghiệp… 1 Việt Nam có đường bờ biển dài trên 3.000 km và khoảng 3.000 hòn đảo ven bờ, do vậy các loại hình đất ngập nước ven bờ rất phong phú (như rừng ngập mặn, bãi triều lầy, vịnh, ven đảo, cửa sông, rạn san hô...) và có tính đa dạng sinh học cao. Theo báo cáo của Cục Môi trường (Bộ TNMT, 2007), trong tổng số 621.162 ha đất ngập nước (ngập mặn) ven biển của Việt Nam có 209.741 ha RNM, 226.111 ha nuôi trồng thủy sản và 185.310 ha đất ngập mặn chưa có rừng (2008) [90], kèm theo đó, nghiên cứu khu hệ vi sinh vật rừng ngập mặn đã và đang được tiến hành tại bộ môn Công nghệ sinh học, vi sinh, với bộ sưu tập hơn 600 chủng Bacillus phân lập được. Một số nghiên cứu về Bacillus từ RNM đã được tiến hành nhưng chưa có nghiên cứu mang tính hệ thống về khả năng sinh protease kiềm của các chủng Bacillus phân lập được từ RNM Việt Nam. Xuất phát từ tình hình thực tế nghiên cứu và vai trò ứng dụng quan trọng của protease kiềm chúng tôi chọn đề tài: “Tuyển chọn chủng Bacillus từ rừng ngập mặn sinh mạnh protease kiềm và bước đầu định hướng ứng dụng ” Nội dung cụ thể của đề tài gồm: 1. Hoạt hóa lại các chủng Bacillus rừng ngập mặn. 2. Tuyển chọn các chủng Bacillus sinh enzime protease kiềm. o Xác định khả năng sinh protease kiềm (pH 9) của các chủng Bacillus. o Tuyển chọn các chủng có hoạt tính protease kiềm đầu dòng. 3. Nghiên cứu đặc tính lý hóa của dịch enzyme thô đã loại bỏ sinh khối: như ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, nồng độ NaCl đến độ bền và hoạt tính của enzyme. 4. Xác định môi trường thích hợp cho Bacillus sinh protease kiềm. 5. Lên men thu chế phẩm thô, xác định hoạt tính. 6. Bước đầu xác định khả năng tẩy lông của protease trên da bò. 2 PHẦN NỘI DUNG Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Các enzyme thủy phân protein Protease thuộc enzyme nhóm 3 (enzyme phân giải) và phân nhóm 3.4 (phân cắt các liên kết peptide). Dựa vào vị trí cắt đứt liên kết trong chuỗi liên kết peptide, người ta chia protease làm 2 nhóm: Endopeptidase và Exopeptidase [65]. Protease xúc tác cho sự thủy phân liên kết peptide (-CO-NH 2-) trong phân tử protein và cơ chất tương tự. Nhiều protease cũng có khả năng thủy phân liên kết este và vận chuyển axit amin [2]. Hình 1.1. Sơ đồ enzyme protease thủy phân phân tử protein 3 Peptidase (Protease) (E.C.3.4) Exopeptidase (E.C. 3.4.11.17) Endopeptidase (E.C. 3.4.21.99) Serine protease (trypsin, chymotrypsin, subtilisin) Aminopeptidase Cysteine protease (papain, cathepsin B) Aspartic protease (pepsin, chymosin) Carboxypeptidase Metallo protease (themolysin, carboxypeptidase A) Hình 1.2. Sơ đồ phân loại protease [65] 1.1.1. Exopeptidase Exopeptidase chỉ tác dụng ở gần điểm kết thúc của chuỗi polypeptide, tại đầu N hoặc đầu C. Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân chia thành hai loại: a/ Aminopeptidase xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide. Trong quá trình aminopeptidase xúc tác thủy phân liên kết peptide, 4 nếu giải phóng một amino acid gọi là aminopeptidase, giải phóng một dipeptide được gọi là dipeptidyl-peptidase và giải phóng một tripeptide được gọi là tripeptidyl-peptidase. b/ Carboxypeptidase xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide. Trong quá trình exopeptidase tác dụng tại đầu C, nếu giải phóng một amino acid gọi là cacboxyl-peptidase hoặc giải phóng một dipeptide gọi là peptidyl-dipeptidase. 1.1.2. Endopeptidase Endopeptidase tác động ở vùng bên trong của chuỗi liên kết peptide, cách xa 2 đầu C và N. Dựa vào cơ chế tác động của endopeptidase, người ta chia chúng thành 4 nhóm: serine protease, cysteine protease, aspartic protease và metallo protease. a/ Serine protease (EC.3.4.21) là nhóm peptidase lớn nhất và được phát hiện ở mọi giới sinh vật như eukaryote, prokaryote, archaea và virus. Những enzyme này đều có chung một cơ chế xúc tác phản ứng thủy phân thông qua hai bước chính [23]:  Bước 1, acyl hóa: hình thành liên kết cộng hóa trị giữa nhóm -OH của serine với nguyên tử các bon trong nhóm cacboxyl của phân tử cơ chất nhờ có hỗ trợ của nhóm imidazole từ histidine. Kết quả phản ứng này là tạo ra một hợp chất trung gian và một ion imidazolium (phản ứng cộng). Hợp chất trung gian không bền này nhanh chóng bị thủy phân thành một acyl-enzyme, vòng imidazole và một amin (phản ứng khử).  Bước 2, khử acyl hóa: phức hệ acyl - enzyme bị thủy phân bởi phân tử H2O theo chiều ngược lại của bước một. Trong đó, nhóm imidazole chuyển proton của gốc -OH từ serine cho nhúm amin để tái sinh lại enzyme. 5 Serine protease có 1 serine ở trung tâm hoạt động, nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin. Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như chymotrypsin, trypsin, elastase. Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như subtilisin Carlsberg, subtilisin BPN. Serine protease có mặt trong rất nhiều loài của Aspergillus và Bacillus. Các enzyme này bị ức chế bởi Phenylmethylsulgonyl fluorid (PMSF) hoặc diisopropyl fluorophosphat (DFP). Phần lớn enzyme này hoạt động tối thích trong khoảng pH từ 7 – 11 và có trọng lượng phân tử khoảng 20000 – 35000 dalton. b/ Cysteine protease (EC.3.4.22) có 1 cysteine ở trung tâm hoạt động. Cysteine protease bao gồm các protease thực vật như papayin, bromelin, một vài protease động vật và ký sinh trùng và ít thấy ở nấm. Phần lớn các enzyme này hoạt động tối thích ở pH từ 5 – 8, có tính đặc hiệu cơ chất rộng. Chúng mẫn cảm với các chất chứa sulphydryl như là P-chloromercuri benzoate. c/ Aspartic protease (EC.3.4.23) có 2 axit aspartic ở trung tâm hoạt động, là enzyme quan trọng thứ 2 trong số các protease công nghiệp, sau serine protease. Chúng chủ yếu là các protease axit với một axit aspartic được coi như chìa khóa phân giải trong vùng tác động. Enzyme này hoạt động tốt nhất ở khoảng pH từ 3 – 4, với trọng lượng phân tử từ 30000 – 45000 dalton. Aspartic protease rất phổ biến ở nấm và không ổn định ở pH 7.0. d/ Metallo protease (EC.3.4.24) sử dụng ion kim loại trong trung tâm hoạt động, enzyme này hoạt động tốt nhất ở pH 5 – 9, mẫn cảm với các EDTA nhưng không bị ảnh hưởng bởi các chất ức chế của serine protease hoặc thuốc thử sulphydryl. Kẽm, Coban hoặc Canxi, Mangan hoạt hóa trở lại khi bị EDTA làm bất hoạt [83]. Phần lớn các metallo protease là enzyme có chứa Kẽm và cấu trúc phân tử protein luôn ổn định bởi sự có mặt của Canxi. Đáng chú ý ở các enzyme này là phần lớn ưa nhiệt và rất phổ biến ở Bacillus thermoproteolyticus [56]. 6 NH2 – CH(R1) – CO – NH - … … - CO – NH – CH(RX) – COOH Cacboxypeptidase Endopeptidase Aminopeptidase Exopeptidase Hình 1.3. Sơ đồ vị trí tác động của enzyme thủy phân trên phân tử protein Endopeptidase là một trong những thành phần quan trọng nhất của nhóm enzyme công nghiệp, chiếm khoảng 60% tổng số enzyme đã được sử dụng rộng rãi [59], [26], [32]. Trong số các loại protease từ vi sinh vật, protease vi khuẩn là đáng kể nhất. Trong số các vi khuẩn thì Bacillus là sinh vật đặc trưng sinh protease ngoại bào. Protease có một số đặc điểm rất lý tưởng đối với công nghệ sinh học, vì vậy chúng trở thành một trong những enzyme quan trọng nhất trong sản xuất công nghiệp. Những protease này được ứng dụng rộng rãi trong các nghành công nghiệp như dược phẩm, thuộc da, tẩy rửa, thực phẩm và công nghiệp xử lý rác thải [80]. 1.2. Protease từ vi sinh vật Protease được tìm thấy ở nhiều nhóm vi sinh vật như động vật nguyên sinh, vi khuẩn, nấm mốc, nấm men và cả virus. Động vật 8%, thực vật 4%, nấm mốc và nấm men 50%, vi khuẩn 30%. Protein bị phân giải bởi nhiều vi sinh vật. Những vi sinh vật này sử dụng cơ chất protein làm nguồn cung cấp nitơ, các bon và năng lượng cho sinh trưởng và phát triển. Sự phân giải protein được bắt đầu bởi protease được tiết ra từ vi sinh vật tiếp sau đó là peptidase ở bên trong hay bên ngoài tế bào. Số lượng và thành phần protease được tiết ra từ vi sinh vật phụ thuộc vào từng loài, từng chủng vi sinh vật, thậm chí các protese khác 7 nhau cũng có thể được sinh ra từ cùng một chủng dưới các điều kiện nuôi cấy khác nhau [15]. 1.2.1. Protease từ nấm men và nấm mốc Nấm là nhóm có khả năng tạo ra nhiều loại protease hơn vi khuẩn. Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, ví dụ như: Aspergillus oryzae, Aspergillus tericola, Aspergillus fumigatus, Penicillium chryfogenum,…Đặc biệt Aspergillus oryzae là loại nấm mốc có khả năng tổng hợp cả 3 loại protease: protease axit, protease kiềm và protease trung tính. Tỷ lệ cấu tử enzyme có thể thay đổi tùy thành phần môi trường, ví dụ: Aspergillus oryzae khi nuôi trong điều kiện bình thường thì sinh tổng hợp chủ yếu protease kiềm, còn khi nuôi trong môi trường giảm bớt gluxit thì chủ yếu tạo protease axit [2], [41]. Các loại nấm mốc thuộc chi Rhizopus có khả năng tổng hợp chủ yếu các protease axit có khả năng thủy phân protein ở pH 2.5-3.0 [2]. Một số nấm khác như Aspergillus cadidates, Penicillium camberti, Penicillium roqueforti,... cũng có khả năng tổng hợp protease làm đông tụ sữa, được sử dụng trong làm pho mát. Bên cạnh đó, nguồn enzyme trong nấm men cũng rất phong phú và đa dạng, là đối tượng được con người biết đến từ rất sớm. Một số loại nấm men sinh enzyme như: Candida albicans và Candida tropicalis là những vi sinh vật khi nhiễm vào cơ thể vật chủ, gây nhiều bệnh cơ hội khi hệ thống miễn dịch của cơ thể vật chủ bị tổn thương. Enzyme ngoại bào của chúng (aspartic protease) được xem giống như yếu tố virus [89]. 1.2.2. Protease từ xạ khuẩn Sự tổng hợp protease của xạ khuẩn ít được nghiên cứu hơn vi khuẩn và nấm mốc. Tuy nhiên người ta đã tìm được 1 số chủng xạ khuẩn có khả năng tổng hợp protease cao như Streptomyces griceus, S. fradiae, S. rimosus,… [3], [12]. 8 Các chế phẩm protease từ xạ khuẩn được biết nhiều là Pronase (Nhật) được tách chiết từ Streptomyces grieus. Enzyme này có đặc tính đặc hiệu rộng, có khả năng thủy phân tới 90% liên kết peptide của nhiều protein thành amino acid. Ở Liờn Xụ (cũ), người ta cũng tách được chế phẩm tương tự từ Streptomyces grieus có tên là Protelin. Ở Mỹ, chế phẩm được sản xuất có tên là M-Zim dùng trong sản xuất da. Protease từ Streptomyces fradiae cũng có hoạt tính elastase cao, do đó chúng được dùng trong công nghiệp chế biến thịt. 1.2.3. Protease từ vi khuẩn Serine protease là nhóm enzyme được dùng nhiều nhất trong thương mại, chủ yếu là trung tính và kiềm, được sinh ra từ các vi khuẩn thuộc chi Bacillus, đại diện của nhóm này là Bacillus subtilis [41]. Ngoài ra các serine protease cũng được sinh ra từ cỏc nhúm vi khuẩn khác nhau như: Thermus caldophilus, Aeromonas, Escherichia và 1 số giống thuộc Chlostridium. Các protease trung tính hoạt động trong giải pH hẹp (từ 5 đến 8) ít bền nhiệt. Sản phẩm phân giải của các protease này ít bị đắng hơn so với các protease động vật do tốc độ cắt trung bình, vì thế rất có giá trị trong công nghệ thực phẩm [3]. Các protease trung tính từ vi khuẩn có tính đặc hiệu cao với mối liên kết giữa hai axit amin kỵ nước. Nhiệt độ tối ưu thấp rất có lợi cho việc phân giải thức ăn. Một số metallo protease cần có các ion kim loại cho quá trình hoạt động. Các protease kiềm của vi khuẩn hoạt động trong môi trường có pH cao, tính đặc hiệu cơ chất rộng, nhiệt độ hoạt động tối ưu ở 60oC, vì thế rất thích hợp cho công nghiệp chất tẩy rửa. 1.2.4. Protease từ virus Protease từ virus có vai trò quan trọng trong quá trình lắp ráp các thành phần của virus. Chúng có thể là serine protease, aspartic protease, cysteine protease nhưng không có metallo protease. Tất cả các protease của virus đều là 9 endoprotease. Aspartyl protease của Retrovirus tham gia vào quá trình lắp ráp hạt virus, tạo ra các đơn vị đồng nhất thể hiện như tiền thân của các protein vỏ. Ngày nay người ta nghiên cứu rất nhiều về protease của virus, cũng như các chất ức chế hoạt động của chúng nhằm chữa các bệnh nguy hiểm do virus gây ra như ung thư và AIDS… 1.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự tổng hợp protease của vi sinh vật 1.3.1. Chất cảm ứng sinh tổng hợp enzyme Những enzyme được tạo thành do tế bào vi sinh vật không chỉ phụ thuộc vào đặc tính riêng của từng loài vi sinh vật, mà còn phụ thuộc vào thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy. Những bằng chứng đầu tiên chỉ ra rằng, các protease ngoại bào có thể là enzyme cảm ứng được tìm thấy trong công trình nghiên cứu của Castaneda Agullo năm 1956 [28] và sau đó là công bố của một số tác giả khác. Theo Drucker, 1972 [31], khi nuôi chủng Neurospora crassa-74A trên môi trường Vogel chứa huyết thanh bò (BSA) như là nguồn các bon chính trong việc tạo thành các protease, Ông thấy rằng: nếu chỉ có mình BSA thì bào tử sẽ không nảy mầm, khi bổ sung 0.1% đường vào canh trường nuôi cấy là rất cần thiết cho sự phát triển của các bào tử và việc sản xuất protease sẽ bắt đầu vào giờ thứ 5 hoặc thứ 6 của quá trình nuôi cấy. Nếu nồng độ đường cao (0.5-2%) sẽ ức chế sự tổng hợp protease. Theo Wiersma và cs, sự tổng hợp enzyme sẽ bị ức chế khi môi trường chứa các chất dễ chuyển hóa. Cụ thể là khi nuôi cấy Vibrio SA1 trên môi trường pepton và môi trường tối thiểu chứa các axit amin thì sẽ tạo thành hai loại enzyme là endopeptidase và aminopeptidase, nhưng khi nuôi cấy trên môi trường hỗn hợp glucose, lactate và succinate thì enzyme sẽ bị ức chế. Tuy nhiên, có một khám phá thú vị, người ta đã xác định được một loại axit amin là 10 phenylalanine, axit amin này đóng vai trò quan trong như là chất cảm ứng trong quá trình tạo thành protease. Khi bổ sung 2mM phenylalanine vào môi trường lactate cơ bản thì sẽ cảm ứng tạo thành protease [82]. Vi khuẩn Bacillus subtilis tạo thành protease có hoạt lực cao ở môi trường có tinh bột. Nếu giảm nồng độ tinh bột từ 8% xuống 2% thì hoạt lực protease giảm vài lần. Đối với vi khuẩn sinh protease người ta thường dùng đường đơn hoặc đường đôi trong môi trường dinh dưỡng. Nuôi cấy Pseudomonas myxogenus trên môi trường glucose có nồng độ từ 1-10% ngường ta nhận thấy sự sinh tổng hợp protease tăng lên. Mặt khác glucose có tác dụng ức chế chủng Bacillus larvae sinh protease. Khi thêm vào môi trường nuôi cấy 0.5% glucose, một số chủng Arthrobacter không bị ức chế sinh trưởng nhưng hoạt lực protease thấp. Ngoài nguồn các bon, nguồn nitơ cũng đóng vai trò là chất cảm ứng quan trọng. Đối với xạ khuẩn ưa nhiệt Streptomyses vulgeris 42, pepton là chất cảm ứng tốt nhất. Thay pepton bằng casein hoạt lực protease giảm 20-30% [12]. Theo Vũ Thị Liên, nhiều xạ khuẩn ưa nhiệt, trong đó có Micromonospora vulgaris 42, mọc tốt và sinh tổng hợp protease cao ở môi trường có tinh bột. Tăng nồng độ tinh bột từ 0.25% lên 1.5% thì sinh khối cũng tăng đồng thời với hiệu suất tổng hợp protease. Nếu tăng nồng độ tinh bột cao hơn nữa sẽ không thu được kết quả dương tính, tỉ số giữa các bon và nitơ cần thiết là (4:1). Trên môi trường có maltose (0.5-2%) vi sinh vật phát triển bình thường nhưng sự tổng hợp protease ngoại bào bị ức chế [8]. Có thể coi việc có chất cảm ứng là điều kiện rất cần thiết để thu được những enzyme mong muốn. Trong công nghiệp sản xuất enzyme, cần phải lựa chọn chất cảm ứng thích hợp và xác định nồng độ tối ưu của nó trong môi trường để có hiệu suất sinh tổng hợp enzyme cao nhất. 11 1.3.2. Nguồn dinh dưỡng 1.3.2.1. Ảnh hưởng của nguồn các bon Có rất nhiều chất hydratcacbon và các hợp chất khác là nguồn các bon thích hợp sinh protease có hoạt lực cao. Tinh bột cũng là nguồn các bon tốt để sinh protease, nhưng hiệu quả này lại phụ thuộc vào các chủng vi sinh vật có hoạt lực amylase để thủy phân triệt để tinh bột. Vì vậy, nhiều chủng nuôi cấy trên môi trường có tinh bột cũng cho kết quả như đối với glucose. Trong sản xuất enzyme protease người ta có thể dùng một số cơ chất tự nhiên làm nguồn các bon như bột mỳ đen, bột đậu tương, cám mỳ, cỏm ngụ,… Trong môi trường dinh dưỡng nếu bổ sung mỡ cá voi thì hoạt lực protease có thể tăng 30%. Một số chủng Penicillium aeruginosa có thể đồng hóa carbohydrate và sinh protease. Những chủng này có hoạt lực cao trên môi trường có n-parafin với 12, 14 và 16 nguyên tử C, dầu nặng hoặc propilencol. Chúng không những chỉ đồng hóa được hydrocacbua béo mà còn đồng hóa được cả hydrocacbua thơm [12]. 1.3.2.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ Đối với môi trường nuôi cấy vi sinh vật sinh protease, trong môi trường cần phải có các chất cảm ứng-nguồn nitơ hữu cơ (bột đậu tương, bột mì, pepton, protein…). Ngoài các nguồn nitơ hữu cơ, người ta còn bổ sung vào môi trường nuôi cấy các nguồn nitơ vô cơ như các muối nitrat và amon thậm chí cả HNO3, HNO2. Nhiều loại nấm mốc khác nhau như Aspergillus oryzae, A. awmori, A. niger, A. flavus sinh tổng hợp mạnh protease axit trên môi trường cú cỏc nguồn nitơ hữu cơ. Trên môi trường Czapeck mà NaNO 3 được thay bằng casein thì hoạt lực của nấm mốc tăng lên 3.5 lần, còn khi thay tinh bột bằng glucose và bổ sung pepton, hoạt lực protease tăng lên 6 lần [7]. Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy, sinh tổng hợp enzyme được nâng cao khi môi trường có cả nguồn nitơ vô 12 cơ và nitơ hữu cơ. Nếu cho thêm vào môi trường cỏm mỡ, bột đậu tương đã tách chất béo và các nguồn nitơ vô cơ thì hoạt lực protease tăng 22 – 74%. Còn trường hợp chỉ dựng cỏc nguồn nitơ vô cơ duy nhất thì sẽ dẫn tới ngừng sinh tổng hợp protease nói chung [12]. Trong quá trình nuôi cấy Bacillus subtilis và B. mesentericus, các chất vô cơ và hữu cơ được phối hợp trong môi trường sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sinh tổng hợp protease. Nếu trong môi trường chỉ có nguồn nitơ hữu cơ thì hoạt lực protease sẽ thấp hơn môi trường đối chứng có (NH 4)2SO4 và nước chiết đậu tương. Những nguồn protein khác nhau (pepton, albumin, gluten, sừng móng nghiền nhỏ, bột đậu tương) có ảnh hưởng nhất định đến việc sinh protease của xạ khuẩn [12]. Các axit amin có ảnh hưởng rõ rệt tới sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật. Glyxerin, alanin, metionin và lơxin có tác dụng làm tăng hoạt lực protease của chủng đột biến A. oryzae 251-90 từ 6-9% và chủng nguyên thủy 132-63 tới 7-24%. Một số axit amin như valin, axit glutamic, izolơxin… làm giảm hoạt lực protease ở A. oryzae 251-290 từ 22-42%. Treonin, izolơxin ức chế tổng hợp ở Bacillus megaterium 60%. Còn đối với Bacillus subtilis, các axit amin ức chế trong quá trình tổng hợp protease là glysin, metionin, alanin, lơxin, axit glutamic…[11]. 1.3.2.3. Ảnh hưởng của các nguyên tố khoáng Ngoài nguồn các bon và nitơ, các nguyên tố khoáng cũng ảnh hưởng rõ rệt tới quá trình tổng hợp enzyme. Các nguyên tố này bao gồm cả nguyên tố vi lượng và đa lượng. Các nguyên tố vi lượng thường là Sắt, Kẽm, Đồng, Coban. Các nguyên tố này có sẵn trong nước hoặc trong các thành phần hữu cơ khác của môi trường. Các nguyên tố đa lượng đặc biệt là photpho và lưu huỳnh, có thể được đưa vào môi trường dưới dạng muối vô cơ, cả hai nguyên tố này là 13 thành phần cấu tạo của nhiều chất trong tế bào, nhất là nucleotit, vitamin, enzyme và protein [4]. 1.3.3. Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy 1.3.3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ Nhiệt độ môi trường có ảnh hưởng sâu sắc không những đối với sự sinh trưởng của vi sinh vật mà còn đối với sự trao đổi chất của chúng. Đa số các loài vi khuẩn, sinh trưởng tối thích ở nhiệt độ từ 30-37 oC. Đối với các loại thuộc giống Bacillus và Clostridium, chúng là các vi khuẩn ưa nhiệt, sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 45-50 oC. Theo Raja et al, khi nuôi cấy chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa K đã chỉ ra rằng: khả năng sinh trưởng và sản xuất protease trong khoảng từ 37 oC - 45oC với nhiệt độ tối ưu cho việc tạo thành protease là 37 oC [63]. 1.3.3.2. Ảnh hưởng của độ pH Vi sinh vật sống trong các môi trường sẽ chịu ảnh hưởng trực tiếp và gián tiếp của các ion H+ và OH-. Nồng độ ion H+ trong môi trường dinh dưỡng có ảnh hưởng đến sự trao đổi chất và phát triển của vi sinh vật. Đối với chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa K, khi khảo sát trên môi trường có giá trị pH từ 6.0-10.0 thì thấy rằng, chúng có khả năng thích ứng và tạo protease trong khoảng pH rộng từ 6.0-9.0 và giá trị pH tối ưu cho việc sản sinh protease là 7.0 [63]. Giá trị pH của môi trường có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và sinh tổng hợp enzyme một cách không giống nhau. Có những giá trị pH mà ở đó vi sinh vật phát triển bình thường nhưng tạo ra rất ít hoặc không tạo ra enzyme [24]. Một số vi sinh vật có khả năng tự điều chỉnh pH của môi trường. Ví dụ Bacillus brevis B1 trong môi trường có pH ban đầu là 7.0 sau 16h lên men thì pH môi trường là 8.5 [61]. 14 1.3.3.3. Ảnh hưởng của độ thông khí Độ thông khí có ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp protease. Tuy nhiên, ảnh hưởng này rất khác nhau tùy chủng vi sinh vật. Tăng độ thông khí đến một giới hạn xác định thì sự phát triển của vi sinh vật cũng tăng theo. Đối với nhiều vi sinh vật, sự thông khí sẽ làm tăng tốc độ sinh trưởng, rút ngắn pha tiềm phát, nâng cao sinh khối. Trong một số trường hợp, thiếu oxi tuy có kìm hãm sinh trưởng và phát triển nhưng lại làm tăng quá trình tổng hợp protease. Lượng oxi thích hợp cho các vi sinh vật khác nhau là không giống nhau. Ngay cả đối với một vi sinh vật nhất định, sự hiếu khí cũng ảnh hưởng khác nhau đến sự tổng hợp protease khác nhau. Đối với các vi khuẩn hiếu khí, trong quá trình nuôi cấy, lượng oxi hòa tan là một trong những yếu tố quan trọng có ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp enzyme [5]. 1.3.3.4. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy Thời gian nuôi cấy ảnh hưởng lớn đến sự tạo thành enzyme ở vi sinh vật. một số vi sinh vật, ví dụ như Bacillus subtilis có thể tổng hợp enzyme tốt nhất ở pha sinh trưởng, một số khác lại tổng hợp enzyme với năng suất cao ở pha cân bằng hay ở giai đoạn tạo bào tử. Rất nhiều chủng vi sinh vật được phát hiện là chủng sản sinh enzyme ngoại bào có khả năng tích lũy cực đại sau giai đoạn phát triển [86]. 1.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động enzyme protease Có nhiều yếu tố ngoại cảnh ảnh hưởng đến sự hoạt động của enzyme, đó là: sự thay đổi nồng độ cơ chất, nhiệt độ, độ pH, chất ức chế, chất cảm ứng,… 1.4.1. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất Enzyme có phản ứng một cách rõ ràng với sự thay đổi của nồng độ cơ chất. Ở nồng độ cơ chất cực nhỏ, sự tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất xảy ra không thường xuyên, do đó quá trình phản ứng rất chậm. Nếu tăng dần nồng độ 15 cơ chất, lúc đầu tốc độ phản ứng tăng tương ứng với sự tăng của nồng độ cơ chất do sự tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất diễn ra thường xuyên. Khi enzyme bắt đầu tăng dần, tốc độ phản ứng đạt đến mức cực đại, tại đó, chúng có thể tổ hợp với chất phản ứng và giải phóng sản phẩm, kết quả là nồng độ cơ chất giảm. Tại thời điểm tốc độ phản ứng đạt cực đại, tăng thêm nồng độ cơ chất cũng không làm thay đổi tốc độ phản ứng, khi đó enzyme bão hòa. 1.4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ Đa số trường hợp nhiệt độ cao thì hoạt tính của enzyme tăng vì khi tăng nhiệt độ, sự chuyển động của phân tử enzyme và phân tử cơ chất tăng, do đó sự va chạm giữa enzyme và cơ chất xảy ra thường xuyên. Tuy nhiên, nếu nhiệt độ tăng đến ngưỡng nào đó thì hoạt tính của enzyme ở mức thăng bằng, sau đó suy giảm mạnh. Vì khi nhiệt độ tăng, các nguyên tử của phân tử enzyme thu được một năng lượng lớn hơn nên có xu hướng chuyển động nhanh hơn. Năng lượng mà chúng thu được có thể đủ để thắng các tương tác yếu vốn quyết định cấu trúc của các protein cấu hình, dẫn đến một sự biến đổi hình thể protein và do đó làm giảm hoạt tính của enzyme [6], [12]. 1.4.3. Ảnh hưởng của pH Sự thay đổi về pH cũng ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme. Mỗi enzyme có một giải pH thích hợp giúp cho nó giữ vững hình dạng bình thường trong môi trường mà nó hoạt động. Chế phẩm protease của A. oryzae hoạt động trong khoảng 5.0 đến 7.5, tốt nhất ở pH 5.5 và bị giảm mạnh ở các giá trị pH từ 8 đến 10 [19]. Protease của B.subtilis hoạt động tốt nhất ở các giá trị pH từ 6.4 đến 7.0 [2]. Tất cả các enzyme đều nhạy cảm với sự thay đổi pH của môi trường. Có một vùng pH mà hoạt độ của enzyme là cực đại. Vùng pH này là kết quả của nhiều tham số: nhiệt độ, lực ion, nồng độ cơ chất…nghĩa là những yếu 16 tố bên ngoài, cũng như bản chất của enzyme. Mỗi enzyme có một số gốc axớt amin tham gia vào liên kết định vị cơ chất, một số khác tham gia vào phản ứng còn đa số axớt amin dùng để duy trì hình thể của enzyme. Các gốc axớt amin này cũng như cơ chất trong nhiều trường hợp, rất nhạy cảm với pH và thường cú cỏc trạng thái ion hóa khác nhau phụ thuộc vào giá trị pH. Ở pH tối ưu, protein enzyme thường có điện tích tổng cực tiểu. Nói chung pH tối ưu của enzyme thường gần với điểm đẳng ion của protein [15]. 1.4.4. Ảnh hưởng của các chất hoạt hóa và chất ức chế Các chất hoạt hóa và chất ức chế có thể làm tăng hoặc giảm hoạt động của enzyme bằng cách gián tiếp hay trực tiếp [2]. Đối với protease từ Bacillus cereus, Ca2+ là yếu tố cần cho hoạt động của enzyme, tại 60oC khi bổ sung 2 mM Ca2+ thì sẽ làm tăng hoạt tính của enzyme lên 500%. Một số ion kim loại khác như Mg2+, Mn2+ cũng có tác dụng làm tăng hoạt tính của protease và mức tăng tương ứng là 285% và 175% tại 60oC. Mặt khác, các ion Zn2+ và Cu2+ lại có tác dụng kìm hãm sự hoạt động của enzyme [24]. 1.5. Vi sinh vật ưa kiềm và chịu kiềm (alkalophilic or alkalotolerant organisms) 1.5.1. Lịch sử nghiên cứu vi sinh vật ưa kiềm (alkaliphilic) Vi sinh vật ưa kiềm chỉ mới được phát hiện gần đây. Đến năm 1968 mới chỉ có 16 bài báo khoa học viết về chủ đề này. Nhật Bản là nước đi đầu và có một quá trình lịch sử lâu dài trong việc nghiên cứu và ừng dụng các vi sinh vật ưa kiềm. Kể từ thời cổ xưa, màu chàm đã được làm giảm dưới điều kiện hiện diện của natri carbonat và chỉ được thực hiện bởi các kỹ năng của các nghệ nhân. Tuy nhiên, điều đó không được tiến hành mãi cho tới những phát hiện về alkaliphiles của Horikoshi và cs vào năm 1971 [47]. Thời đó alkalphiles cũn ớt được chú ý và chưa có một ứng dụng công nghiệp nào [48]. Horikoshi và cs đã đóng góp công sức rất lớn trong việc phân lập, và tuyển chọn một 17 lượng lớn các vi sinh vật ưa kiềm [46]. Hơn hai thập kỷ sau đó Horikoshi và cs đã tập trung nghiên cứu về các vấn đề như enzyme học, sinh lý học, sinh thái học, phân loại học, sinh học phân tử và di truyền học của các chủng vi sinh vật ưa kiềm mới được phân lập này. Không những thế, việc ứng dụng công nghiệp của các chủng vi sinh vật ưa kiềm cũng đã được áp dụng rộng rãi, một số emzyme, chẳng hạn như protease kiềm, amylases kiềm và cellulases kiềm, đã được đưa vào sử dụng trên quy mô công nghiệp. Rõ ràng vi sinh vật ưa kiềm, trong quá trình tiến hóa của mỡnh đó tích lũy được một lượng lớn thông tin di truyền nhằm thích nghi vời những điều kiện môi trường có độ kiềm cao. Nguồn thông tin di truyền chứa trong các gen của các vi sinh vật ưa kiềm là nguồn thông tin có giá trị, hứa hẹn cho những khám phá thú vị và khai thác có hiệu quả bởi công nghệ sinh học [48]. Năm 1998, Gronstad và cs đã phát hiện, phân tích các gen chịu trách nhiệm về tính chịu kiềm của Bacillus halodurans C-125 và B. firmus OF4 [37], [74]. Gần đây, bộ gen hoàn chỉnh của B. halodurans C-125 đã được giải trình tự, đó là cơ sở phân tử của vi sinh vật ưa kiềm trong việc ứng dụng vào công nghệp. 1.5.2. Phân lập và phân loại vi sinh vật ưa kiềm (Alkalophiles) Vi sinh vật ưa kiềm bao gồm hai nhóm sinh lý chính; vi sinh vật ưa kiềm và vi sinh vật ưa muối và ưa kiềm. Vi sinh vật ưa kiềm (alkalophiles) đòi hỏi pH 9.0 hoặc cao hơn cho sự phát triển của chúng và phát triển cực thuận vào khoảng pH 10. Trong khi đó, vi sinh vật ưa kiềm và ưa muối (haloalkalophiles) vừa đòi hỏi độ pH cao (> pH 9.0) vừa đòi hỏi độ muối cao (lên tới 33% NaCl). Vi sinh vật ưa kiềm và ưa muối (haloalkaliphiles) được phân lập chủ yếu từ môi trường kiềm và nồng độ muối rất cao ví dụ như hồ thung lũng Rift ở Đông Phi và hồ sô đa ở miền tây Hoa Kỳ [48]. 18 1.5.3. Những đặc tính sinh lý đặc biệt của vi sinh vật ưa kiềm (alkaliphiles) 1.5.3.1. pH nội bào Hầu hết các vi sinh vật ưa kiềm đều sinh trưởng tối ưu tại khoảng pH 10. Để phát triển trong môi trường khắc nghiệt như vậy, có một số giả thuyết rằng pH tế bào chất được ước tính từ pH tối ưu của enzyme nội bào. Ví dụ như: enzyme α-galactosidase từ Micrococcus sp chủng 31-2 có pH tối ưu là 7.5, điều này gợi ý rằng pH nội bào của chủng này là trung tính. Hơn nữa, các hệ thống tổng hợp protein của những vi sinh vật tự do ưa kiềm, có pH tối ưu để lắp ghép các axit amin trong phân tử protein là từ 8.2 đến 8.5, chỉ cao hơn 0.5 đơn vị so với các vi khuẩn tăng bạch cầu trung tính Bacillus subtilis [47]. 1.5.3.2. Thành tế bào [48] a/ Axit polyme Thành tế bào đóng một vai trò quan trọng trong việc bảo vệ các tế bào trong môi trường kiềm. Thành phần của thành tế bào các chủng Bacillus ưa kiềm đã được nghiên cứu, ngoài thành phần peptidoglycan, các chủng Bacillus còn bao gồm các polyme axit nhất định như là: axit galacturonic, axit gluconic, axit glutamic, axit aspartic, and axit phosphoric [20]. Sự biến đổi của những thành phần không phải peptidoglycan đã làm tăng sự hấp phụ các ion Na + và hydronium, và đẩy ra ngoài các ion hidroxit. Như vậy, có thể giúp cho tế bào có thể sống được trong môi trường kiềm. b/ Peptidoglycan Peptidoglycan của các Bacillus ưa kiềm tương tự với Bacillus subtilis. Tuy nhiên, thành tế bào của chúng được đặc trưng bởi sự vượt trội của các hexosamin và các axit amin trong thành. Một số thành phần như: glucosamin, axit muramic, D- và L-alanine, axit D-glutamic, axit meso-diaminopimelic và axit acetic đã được tìm thấy trong thành phần thủy phân của thành tế bào các 19 Bacillus ưa kiềm. Mặc dù có một số biến đổi trong số các peptidoglycan từ các chủng Bacillus ưa kiềm là tương tự với sự biến đổi trong các mẫu vi khuẩn tăng bạch cầu trung tính được tìm thấy. 1.5.3.3. Vận chuyển ion Na+ qua màng Các vi sinh vật ưa kiềm phát triển mạnh mẽ từ pH 9 đến 11 và đòi hỏi Na+ trong quá trình phát triển [53]. Sự có mặt của ion Na trong môi trường xung quanh đã được chứng minh là cần thiết cho sự vận chuyển có hiệu quả chất tan qua màng của các chủng Bacillus ưa kiềm. Theo thuyết hóa thẩm, lực proton trong các tế bào được sinh ra từ chuỗi vận chuyển electron hoặc sự bài tiết của H+ bắt nguồn từ sự chuyển hóa ATP của ATPase. Sau đó H+ bám trên những cơ chất khác nhau đi vào trong tế bào. Trong hệ thống vận chuyển thụ động Na +, H+ được trao đổi với Na+ bởi hệ thống protein vận chuyển thứ cấp Na +/H+, như vậy sẽ sinh ra một lực vận chuyển ion Na+ vào trong tế bào [48]. 1.5.3.4. Các cơ chế điều chỉnh pH tế bào chất Các tế bào có hai hàng rào để giảm pH từ 10.5 về 8. Thành tế bào có chứa các polyme axít có chức năng giảm bớt giá trị pH trên bề mặt tế bào. Bề mặt màng sinh chất của tế bào được cho là bắt buộc phải có giá trị pH dưới 9.0, thấp hơn nhiều so với pH tối ưu cho sự sinh trưởng. Bởi vì, màng sinh chất rất không ổn định ở giá trị pH kiềm (8.5 tới 9.0). Màng sinh chất có thể duy trì được cơ chế nội cân bằng như vậy vì có hệ thống protein vận chuyển thứ cấp Na+/H+, K+/H+ và bơm H+ được điều khiển bởi ATPase. Những nghiên cứu gần đây trên những protein vận chuyển thứ cấp đã làm sáng tỏ một số tính chất đặc trưng của chúng. Đặc tính của protein vận chuyển thứ cấp là tích cực duy trì cơ chế nội cân bằng của pH [50], [51], [52], [57]. Hamamoto và cs đã chuyển một gen được tách từ chủng ưa kiềm có chiều dài 3.7 kb (đoạn pALK) vào B. 20