Tài liệu Tổng quan về cảm biến sinh học Biosensor

Đồ án: Tổng quan tài liệu về Biosensor CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ BIOSENSOR 1. LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN CỦA BIOSENSOR Năm 1956, giáo sư Leland Clark Jnr – người khai sinh về khái niệm điện cực sinh học (Biosensor) đã có công bố về điện cực Oxy. Dựa trên kinh nghiệm và tâm huyết của mình, ông đã phát triển lĩnh vực phân tích giúp có thể đo lường được trong cơ thể. Năm 1962, tại Hội nghị Khoa học ở Viện hàn lâm New York, ông đã có bài diễn thuyết: “Làm thế nào để các điện cực điện hóa (phương pháp pH, cực phổ, phép đo điện thế, phép đo độ dẫn điện) thông minh hơn”. Trong đó, ông trình bày cách làm điện cực điện hóa thông minh hơn bằng cách thêm enzym vào máy chuyển đổi như những chiếc bánh sandwich được bao bọc bởi một lớp màng. Năm 1975, ý tưởng của Clark trở thành hiện thực với sự công bố của công ty Yellow Springs Instrument (Ohio) về máy phân tích glucose dựa trên việc đo dòng điện của hydro peroxide. Đây là lần đầu tiên các phòng thí nghiệm trên thế giới phân tích dựa trên một Biosensor. Cũng vào năm này, Biosensor tiến thêm một bước mới là khi Divis đề xuất rằng vi khuẩn có thể được dùng như một yếu tố sinh học trong điện cực vi khuẩn để đo hàm lượng rượu. Năm 1976, La Roche (Thụy Sĩ) giới thiệu máy phân tích Lactat (Lactate Analyser – LA640) trong đó sử dụng tác nhân trung gian hexacyanoferrat hòa tan để chuyển các electron từ lactatdehydrogenase tới một điện cực. Mặc dù không thành công trên thương trường nhưng là bước đột phá quan trọng cho một thế hệ của Biosensor được ứng dụng trong thể thao và chẩn đoán lâm sàng. Năm 1987, điện cực enzym screen-printed được công bố bởi Medisense (Cambridge, USA) với dụng cụ đo có kích thước như một chiếc bút cho phép giám sát lượng glucose trong máu tại nhà. Điện cực này được thiết kế lại làm cho thông dụng hơn và số lượng bán của Medisense đã đạt tới 175 triệu đôla năm 1996 khi họ được Abbort mua lại. Hiện nay Hãng Boehringer, Manheim và Bayer đang cạnh tranh nhau rất gay gắt về Biosensor và lượng bán ra của ba công ty chiếm ưu thế trên thị trường Biosensor của thế giới tới 85%. 1.2. KHÁI NIỆM VỀ BIOSENSOR Biosensor thực chất là một thiết bị phân tích chuyển một tín hiệu sinh học thành một tín hiệu điện. Đầu tiên, Biosensor sẽ nhận dạng hiện tượng và biên dịch thành một đặc tính có thể định lượng được, sau đó đặc tính định lượng này được chuyển đổi thành một tín hiệu điện bởi một bộ biến năng. Trong Biosensor, hiện tượng được nhận dạng bởi http://www.ebook.edu.vn 1 Đồ án: Tổng quan tài liệu về Biosensor một hệ thống sinh học gọi là cơ quan thụ cảm sinh học (bioreceptor). Hệ thống này sẽ tiếp xúc trực tiếp với mẫu phân tích gây ra phản ứng và tạo thành hợp chất nhạy cảm cho Biosensor. Cơ quan thụ cảm sinh học có đặc tính chọn lọc đặc biệt đối với chất phân tích. Hình 1.1. Sơ đồ cấu tạo của biosensor Chú thích: Chất xúc tác sinh học (a) chuyển cơ chất (S) thành sản phẩm (P). Bộ biến năng (b) chuyển sản phẩm phản ứng thành tín hiệu điện. Bộ khuếch đại (c) nhằm khuếch đại tín hiệu điện của bộ biến năng. Bộ vi xử lý tín hiệu (d). Màn hình hiển thị (e). 1.3. ĐẶC ĐIỂM – YÊU CẦU CỦA BIOSENSOR Để định lượng, Biosensor phải đáp ứng yêu cầu liên quan đến đo lường: khả năng lặp lại, khả năng tái sử dụng cao, tính chọn lọc, tính nhạy cảm, vùng trả lời tuyến tính và thời gian đáp ứng tín hiệu tốt. Các phép đo có độ lặp lại tốt nếu như hai loạt kết quả thu được tương tự nhau được thực hiện bởi cùng người phân tích, sử dụng cùng biosensor trong cùng một mẫu phân tích. Phương pháp đo có khả năng tái sử dụng cao nếu các kết quả trước có thể đạt được khi tiến hành phân tích lặp lại lần hai. Tính chọn lọc của biosensor thể hiện ở khả năng nhận ra một hợp chất đơn trong hỗn hợp các cấu tử của mẫu, khả năng này phụ thuộc vào cơ quan thụ cảm sinh học và bộ biến năng. Một biosensor có tính chọn lọc cao nếu như thành phần tạp chất của mẫu thấp. Tính nhạy cảm của biosensor thể hiện ở sự thay đổi về lượng thì sẽ gây ra sự thay đổi về tín hiệu trả lời: Da = s Dm http://www.ebook.edu.vn 2 Đồ án: Tổng quan tài liệu về Biosensor Trong đó Da : Độ dao động về biên độ của dòng ra Dm : Độ dao động về biên độ của dòng vào s : Độ nhạy cảm của biosensor, đặc trưng cho mức độ phù hợp của biosensor trong một ứng dụng cụ thể. Đối với Biosensor đo bằng điện thế thì biên độ của tín hiệu trả lời tỷ lệ thuận với logarite của nồng độ chất phân tích. Theo định luật Nernst: Da = s D(logc). Vùng tín hiệu tuyến tính thu được là một đường cong hiệu chỉnh của tín hiệu trả lời với nồng độ khác nhau của chất phân tích. Đường cong chỉ thật sự có ý nghĩa nếu tiến hành hiệu chỉnh cả hai loạt nồng độ tăng và giảm. Đường cong hiệu chỉnh gọi là tốt nếu như tín hiệu trả lời ổn định theo thời gian. Thời gian đáp ứng khá dài bởi bản chất của đường cong hiệu chỉnh, nó cho biết một phương pháp đo cho tín hiệu trả lời nhanh hay chậm khi thay đổi nồng độ. 1.4. NGUYÊN LÝ HOẠT ĐỘNG CỦA BIOSENSOR Các chất cần phân tích trong mẫu phân tích sẽ đi vào trong điện cực. Màng ngoài (external membrane) của biosensor sẽ cho các chất cần phân tích thấm qua. Các thành phần sinh học (enzym, tế bào vi sinh vật, mô, cơ quan) sẽ phản ứng với chất cần phân tích và tạo ra các đáp ứng mà các bộ biến năng (transducer) có thể phát hiện được. Các thành phần sinh học ở đây thực hiện các hoạt động sau: Biến đổi các chất cần phân tích thành các chất hóa học khác thông qua các phản ứng sinh hóa (biểu diễn bằng vòng tròn rỗng trong sơ đồ). Giải phóng ra các sản phẩm hóa học rồi từ đây tạo ra các tác nhân kích thích. Thay đổi các đặc tính như quang học, điện học, cơ học. Tạo ra một số các đáp ứng khác nhau với lượng có thể đo được. Còn có một số màng khác gần bộ phận transducer, những màng này có thể có các đặc tính thấm khác nhau so với màng bên ngoài. Tín hiệu ra của điện cực thường phụ thuộc vào loại biến năng mà nó sử dụng. http://www.ebook.edu.vn 3 Đồ án: Tổng quan tài liệu về Biosensor Hình 1.2: Nguyên lý hoạt động chung của một Biosensor: - Chất cần phân tích - Tác nhân kích thích (chất tạo ra tín hiệu) Bảng 1.1: Một số điện cực enzym thường sử dụng Điện cực để xác định Enzym Sản phẩm Glucose Glucooxydase và catalase H2O2, O2 Saccarose Lactose Rượu Ure Pennicillin Invertase, glucooxydase b-galactosidase, glucooxydase Alcoloxydase Urease Pennicillinase H2O2 H2O2 H2O2 NH4+, CO2 H+ CHƯƠNG 2 PHÂN LOẠI BIOSENSOR 1.1. ĐIỆN CỰC ĐIỆN HÓA (Electrochemical biosensor) 2.1.1. Điện cực đo điện thế (potentiometric biosensor) Điện cực đo điện thế hoạt động dựa trên nguyên tắc xác định sự khác nhau về điện thế giữa điện cực đo (probe electrode) và điện cực so sánh (reference electrode) (là điện cực có điện thế không đổi). Sự khác nhau về điện thế giữa hai điện cực là hàm của hoạt http://www.ebook.edu.vn 4 Đồ án: Tổng quan tài liệu về Biosensor độ các ion trong dung dịch điện phân nơ đặt điện cực (điều kiện hoạt động của điện cực đo điện thế là không có dòng điện trong mạch đo, vì thế người ta gọi nó là điện cực có dòng điện bằng không). Điện thế này được xác định theo phương trình Nerst: E = E0 + Trong đó: α RT × ln 1 nF α2 Eo: Điện thế oxy hóa-khử tiêu chuẩn; R: Hằng số khí; T: Nhiệt độ tuyệt đối; F: hằng số Faraday; N: số điện tử trao đổi của cơ chất; a1, a2: Hoạt độ trong dung dịch và trong lớp màng điện cực. Điện cực đo (probe electrode): Điện cực đo là điện cực có tham gia phản ứng điện hóa với một trong các cấu tử của cân bằng điện thế. Điện cực đo phải có thế điện cực được thiết lập đủ nhanh và có độ chính xác cao. Trong điện cực điện hóa, điện cực đo thường dùng là điện cực màng và điện cực khí. Điện cực khí: Điện cực được cấu tạo bởi kim loại trơ như Pt, Au…tiếp xúc đồng thời với khí và dung dịch chứa ion tương ứng với khí này. Trên thị trường đã có điện cực khí hydro, điện cực Oxy, điện cực khí clo được sử dụng rộng rãi. Điện cực màng chọn lọc ion: Điện cực màng chọn lọc thông thường là các bán pin có lớp màng phân cách dung dịch cần phân tích với một dung dịch chuẩn ở bên trong. Nguyên tắc hoạt động của điện cực màng là dựa vào sự xuất hiện của một đại lượng điện thế trên bề mặt của màng phân cách chứ không phải do phản ứng điện hóa kèm theo sự vận chuyển ion. Màng có tác dụng thuận nghịch với một ion hay một nhóm ion trong dung dịch một cách chọn lọc. Điện cực thủy tinh là điện cực điển hình của loại điện cực màng này. Tất cả các loại điện cực màng đều phải đáp ứng các yêu cầu bắt buộc sau đây: 1. Màng phải không được tan trong dung dịch cần phân tích. Để đáp ứng được điều này, màng phải được cấu tạo từ những chất có phân tử lượng lớn như thủy tinh silicate hoặc nhựa polymer. http://www.ebook.edu.vn 5 Đồ án: Tổng quan tài liệu về Biosensor 2. Màng chọn lọc phải có độ dẫn điện. Độ dẫn điện này thường được tạo ra nhờ vào sự dịch chuyển của các ion hóa trị một bên trong màng. 3. Màng hoặc một vài phần tử chứa trong bộ khung của màng phải có khả năng tác dụng chọn lọc với ion cần khảo sát theo nguyên tắc: trao đổi ion, kết tinh hay tạo phức. Hai nguyên tắc đầu phổ biến hơn nguyên tắc thứ ba. Điện cực màng thủy tinh: Đây là loại điện cực màng thông dụng nhất. Điện cực gồm một ống thủy tinh, ở đầu của ống là một bầu tròn cấu tạo bằng thủy tinh mỏng (0.06-0.10mm). Đây chính là lớp màng thủy tinh có thành phần xác định và có khả năng trao đổi chọn lọc với proton và các cation khác. Điện cực màng thủy tinh đo pH: Phổ biến nhất là thủy tinh chứa 22%Na2O, 6%CaO và 72%SiO2 có khả năng trao đổi chọn lọc ion H+ đến pH xấp xỉ 9. Ở pH cao hơn, lớp màng thủy tinh trở nên kém chọn lọc với H+ vì có thể trao đổi với Na+ cũng như các cation hóa trị I khác. Ngày nay người ta đã sử dụng loại thủy tinh trong đo Na+ và Ca2+ được thay thế bởi Li+ và Ba2+ có khả năng xác định chọn lọc H+ ở pH cao hơn. Phần cuối của điện cực là một bầu thủy tinh có thành mỏng và có thành phần đặc biệt. Bên trong bầu thủy tinh chứa dung dịch H+ có nồng độ xác định. Nhúng vào dung dịch H+ là dây dẫn Pt hay kim loại Ag phủ AgCl. Toàn bộ bộ phận trên được đặt trong ống bảo vệ. Khi nhúng điện cực thủy tinh vào dung dịch chứa ion H+, ở hai bề mặt của màng thủy tinh tiếp xúc với H+ có phản ứng trao đổi: H+tt H+dd + Na+dd + Na+dd nghĩa là ở hai mặt của lớp thủy tinh sẽ tạo ra hai lớp “gel” H2SiO3 (dày 10-4-10-5 mm) do sự hiện điện của H+ trong thủy tinh. Vì có hiện tượng trao đổi ion xảy ra ở hai mặt của màng thủy tinh nên mỗi lớp gel sẽ xuất hiện một điện thế có giá trị phụ thuộc vào hoạt độ của H+ trong dung dịch và hoạt độ của H+ trong lớp gel. Hay nói cách khác, hiệu thế màng E qua lớp thủy tinh sẽ phụ thuộc vào hoạt độ của H+ bên trong bầu, của H + ở ngoài bầu và hoạt độ H+ ở trong hai lớp gel. Với giả sử rằng hiện tượng trao đổi ion xảy ra ở hai mặt thủy tinh gần giống nhau và do cố định hoạt độ H + ở trong bầu thủy tinh nên hiệu thế màng E chỉ phụ thuộc vào hoạt độ của H+ trong dung dịch cần khảo sát. Bằng việc thay thế thành phần của thủy tinh sao cho điện thế màng không phụ thuộc vào giá trị pH, thường sử dụng Al2O3 và B2O3 ta có thể tạo ra các điện cực màng thủy tinh dùng xác định các cation hóa trị I như Na+, K+, NH4+… Đầu dò khí: http://www.ebook.edu.vn 6 Đồ án: Tổng quan tài liệu về Biosensor Đầu dò khí là các thiết bị đo có tính chọn lọc và độ nhạy cao dùng để xác định các khí hòa tan hoặc các ion có thể chuyển thành khí hòa tan khi điều chỉnh pH của môi trường. Bộ phận chính của đầu dò khí là một lớp màng xốp mỏng được lắp vào phần cuối của đầu dò và có thể được thay thế một cách dễ dàng. Tấm màng này được gọi là màng thấm khí, được chế tạo từ các polymer chịu nước như polytetrafluoroethylene hoặc polypropylene với độ xốp khoảng 70% (kích thước lỗ xốp nhỏ hơn 1mm). Lớp màng này sẽ phân tách dung dịch cần phân tích với dung dịch NaHCO3 và NaCl (nếu thiết bị dùng để đo CO2 hòa tan). Điện cực chuẩn: Trong hầu hết các ứng dụng điện hóa, ngoài điện cực đo ta phải sử dụng thêm một điện cực có điện thế xác định và không đổi. Điện cực này được gọi là điện cực chuẩn hay điện cực so sánh. Điện cực chuẩn phải không tham gia phản ứng với bất kỳ thành phần nào trong dung dịch cần khảo sát, phải thuận nghịch và tuân theo phương trình Nerst, phải có điện thế không đổi theo thời gian và có thể lấy lại giá trị thế ban đầu sau khi có dòng điện nhỏ chạy qua… Điện cực chuẩn thường là điện cực kim loại loại hai (kim loại M phủ một lớp hợp chất ít tan MA của kim loại đó và được nhúng vào trong dung dịch muối có chứa anion A- có nồng độ xác định). Điện cực calomel: Điện cực calomel được tạo thành bởi kim loại Hg tiếp xúc với dung dịch chứa muối Hg2Cl2 bão hòa và KCl có nồng độ xác định (bão hòa hay 1M). Điện cực Ag/AgCl: Ngày nay điện cực Ag/AgCl được sử dụng rộng rãi để làm điện cực chuẩn thay cho điện cực calomel. Nồng độ dung dịch KCl sử dụng là bão hòa hay 3.5M Các điện cực chuẩn thường có một lỗ nhỏ ở gần đầu phía trên. Lỗ này thường có một nút đậy kín khi không sử dụng để chống lại sự bay hơi của dung dịch phía trong. http://www.ebook.edu.vn 7 Đồ án: Tổng quan tài liệu về Biosensor Hình 2.1: Cấu tạo của một biosensor đo điện thế đơn giản e) Điện thế giữa điện cực đo và điện cực so sánh Chú thích: a) Màng bán thấm g) Dung dịch HCl b) Thành phần sinh học f) Điện cực đo Ag/AgCl c) Màng thủy tinh h) Điện cực so sánh d) Điện cực thủy tinh đo pH Ứng dụng: Điện cực đo điện thế được dùng để xác định glucose với sự cố định enzym glucooxydase lên điện cực: D-glucose Glucooxydase D-gluconat + H+ Đo lượng H+ tạo thành (đo pH sau khi giải phóng H+) sẽ xác định hàm lượng D -glucose. Xác định Ure với sự có mặt của enzym Urease: NH2CONH2 + H2 O NH2CONH2 + H2 O http://www.ebook.edu.vn pH=9 2NH3 + 2H+ 8 urease + HCO3- + H+ 2NH4+ + CO2 Đồ án: Tổng quan tài liệu về Biosensor Chú thích: c – Cáp bảo vệ e – Dung dịch điện phân à k ướ Hình 2.2: Cấu tạo điện cực pCO2 Xác định lysin: lysindecarbocylase lysin cadalverin + CO2 2.1.2. Điện cực đo dòng điện (Amperometric biosensor) Điện cực đo dòng điện hoạt động dựa vào dòng điện chạy qua mạch đo khi đặt một hiệu điện thế giữa hai điện cực (điện cực đo và điện cực so sánh). Mật độ của các hạt tích điện tỷ lệ thuận với cường độ dòng điện chạy giữa hai điện cực. Cường độ dòng điện chạy giữa hai điện cực là hàm của mật độ các hạt tích điện trong dung dịch và điện thế đặt giữa hai điện cực. Trong đa số trường hợp, người ta thường tiến hành oxy hóa hoặc khử một loại hạt tích điện trên cực đo. Nếu đặt vào điện cực đo một điện thế E biến thiên so với điện cực so sánh và vẽ đường cong I = f(E), chiều cao I của bậc giới hạn khuếch tán sẽ tỷ lệ với nồng độ của hạt bị oxy hóa hoặc bị khử trên điện cực đo. Hình 2.3: Đồ thị I = f(E) Chú thích: 1- E quá nhỏ để sự oxy hóa có thể xảy ra http://www.ebook.edu.vn 9 Đồ án: Tổng quan tài liệu về Biosensor 2- vận tốc oxy hóa điện hóa và cường độ dòng điện sẽ tăng cường với sự tăng hiệu điện thế 3- cường độ không phụ thuộc vào hiệu điện thế và I = K.Cred Hiện nay các điện cực đo dòng điện đang được sử dụng rộng rãi là điện cực oxy và điện cực hydroperoxyde. Oxy và hydroperoxyde (H2O2) đều là những chất được sinh ra trong một số phản ứng có enzym xúc tác, cũng như trong phản ứng có các chất trung gian oxy hóa-khử nhân tạo: ferrocyanua, ion N-metyl-phenazini (NMP) và benzoqiunon và chúng có thể xác định nhờ đo dòng điện. Các điện cực đo dòng điện thường sử dụng các enzym oxydoreductase để gắn vào màng. Oxy, NAD+, NADP+ được dùng như chất nhận điện tử để phục hồi enzym sau khi tham gia phản ứng xúc tác cơ chất. Các enzym sử dụng Oxy như oxydase và enzym sử dụng NAD+, NADP+ được gọi là dehydrogenase hay reductase. Trong hai nhóm enzym này thì oxydase được dùng nhiều nhất. Các điện cực đo dòng điện được sử dụng để xác định các cơ chất của enzym như glucose, monosacharide, hypoxanthyl, lactate, acid amin, sulfite, salicylate, oxalate và pyruvate. Điện cực enzym để đo nồng độ glucose có cấu tạo gồm: một anod Pt và một catod Ag phủ AgCl tiếp xúc với màng đã cố định glucoseoxydase (GOD). Cả hai đều được đặt trong dung dịch điện phân KCL. Điện áp phân cực 0.68 Volt được đặt vào giữa hai điện cực. Dưới tác động của điện áp phân cực này H2O2 được giải phóng ra sẽ bị oxy hóa ở mặt phân cách giữa anod và màng theo phản ứng: GOD Glucose + O2 H2O2 O2 Acid gluconic + H 2O2 + 2H+ + 2e- Dòng điện đo được tỷ lệ với lượng H2O2 bị oxy hóa và do đó tỷ lệ với lượng glucose trong môi trường cần đo. Hình 2.4: Sơ đồ nguyên tắc của điện cực đo dòng điện http://www.ebook.edu.vn 10 Đồ án: Tổng quan tài liệu về Biosensor Cũng như đo glucose, để đo lượng lactate, dùng điện cực có gắn lactatoxydase (LOD) từ Pediscoccuspecies xúc tác phản ứng: Lactate + O2 lactatoxydase pyruvat + H2O2 Để đo lượng cholesterol thì gắn enzym cholesteroloxydase (ChOD) từ Rhodococcus eryththropolis, xúc tác phản ứng: Cholesterol + O2 ChOD Chlest-4-ene-3-one + H O 2 2 Để đo lượng lactose thì gắn enzym b-galactosidase (b-GAL) từ E.coli và glucoozydase (GOD) từ A.niger, xúc tác các phản ứng: lactose β-D-glucose + + O2 H 2O + β-GAL H2O β-D-glucose + GOD acid gluconic + D-galactose H2O2 Do quá trình chuyển khối H2O2 đến điện cực anod mà vận tốc phản ứng ở anod thường bị giới hạn. Khi đó, cường độ dòng điện ở anod tỷ lệ thuận với nồng độ H2O2 trong môi trường tiếp xúc với anod. Cũng có thể xác định lượng glucose qua đo nồng độ Oxy hòa tan trong dung dịch nhờ điện cực Oxy hay điện cực Clark, có cấu tạo gồm: hai điện cực có khả năng phân cực, một catod bằng Pt và một anod bằng Ag phủ AgCl. Cả hai điện cực được đặt vào chất điện phân là KCl. Hệ thống điện cực này được ngăn cách với môi trường nghiên cứu bằng một màng thấm khí kỵ nước bằng teflon hay polypropylen) cho Oxy thấm qua. Dưới tác dụng của điện áp phân cực 0.65V đặt vào giữa hai điện cực, Oxy khuếch tán qua màng sẽ bị khử tại catod theo phản ứng: O2 + 4e- + 4H+ 2H2O Hình 2.5: Cấu tạo của điện cực Oxy xác định nồng độ Glucose http://www.ebook.edu.vn 11 Đồ án: Tổng quan tài liệu về Biosensor Dòng điện chạy giữa hai điện cực do phản ứng điện hóa tỷ lệ với lượng O2 bị khử và do đó tỷ lệ với lượng O2 và lượng glucose. Dòng điện được đo sau khi khuếch đại và được chỉ thị trực tiếp bằng số hoặc biểu diễn dưới dạng nồng độ Oxy hay áp suất riêng phần của Oxy. Phương pháp đo dòng điện này có những đặc điểm sau: Phản ứng Enzym sẽ phụ thuộc vào vận tốc khuếch tán của cơ chất qua màng Khi phản ứng oxy hóa – khử xảy ra, gradient nồng độ của cơ chất giảm dần, do đó vận tốc chuyển khối chậm và có thể dòng điện bị khử, để duy trì dòng điện không đổi cần phải giữ vững vùng tiếp xúc càng nhỏ càng tốt (tức là cần điều chế các vi điện cực có đường kính rất nhỏ, đến vài mm). Vận tốc phản ứng oxy hóa – khử phụ thuộc vào nồng độ Oxy hòa tan. Để hạn chế ảnh hưởng của nồng độ Oxy hòa tan trong dung dịch đến kết quả phân tích thì người ta không sử dụng oxy làm chất nhận điện tử mà sử dụng các chất trung gian để vận chuyển điện tử đến bề mặt điện cực. Các chất vận chuyển điện tử trung gian có thể là ion Fe3+, N-methylphenazinium (NMP) hoặc tetracyanoquinodimethane (TCNQ), hexacyanoferate. 2.2. ĐIỆN CỰC ĐO NHIỆT (Calorimetric biosensor) Các phản ứng giữa cơ chất và chất xúc tác sinh học thường giải phóng ra nhiệt năng và người ta có thể đo lượng nhiệt giải phóng ra đó bằng một thiết bị đ nhiệt (điện cực đo nhiệt), từ đó sẽ tính được lượng cơ chất ban đầu. Khi nhiệt lượng tỏa ra càng lớn thì độ nhạy phát hiện càng lớn. Do đó để tăng nhiệt lượng tỏa ra, có thể cố định đồng thời 2 hoặc 3 enzym (cũng có thể lên tới 4-5 enzym). Bảng 2.1: Enthanpi của một số phản ứng có enzym xúc tác: Cơ chất Enzym xúc tác H2O2 Catalase 100.4 Cholesterol Cholesterol oxydase 52.9 Glucose Glucooxydase 80.0 Glucose Hexokinase 27.6 Ure Urease 6.6 Uric acide Uricase 49.1 Ester Chymotrypsin 4-16 http://www.ebook.edu.vn 12 -DH, kJ/mol Đồ án: Tổng quan tài liệu về Biosensor Pennicilin G Pennicillinase 67 Tinh bột Amylase 8 Saccharose Invertase 20 Sử dụng đồng thời enzym glucooxydase oxy hóa đường glucose và enzym catalase để oxy hóa peroxide. Hai phản ứng này xảy ra cùng một lúc do đó lượng nhiệt tỏa ra nhiều hơn. GOD Glucose + O2 H2O2 catalase O2 Acid gluconic + H2O2 + 2H+ + 2e- Qua nghiên cứu ta thấy cứ 0.1mM cơ chất chuyển hóa hoàn toàn thành sản phẩm sẽ tạo ra 100 kJ/mol. Các thiết bị này phải luôn được đặt trong hệ thống cách nhiệt để giữ môi trường ổn định nhiệt độ. 2.2.1. Điện cực enzym – cặp nhiệt Trong loại điện cực này, bộ biến năng là cặp nhiệt điện. Trên căp nhiệt, người ta phủ một lớp màng chứa enzym. Cặp nhiệt có cấu tạo gồm hai dây dẫn nối với nhau nhờ mối hàn. Sức điện động E của mạch phụ thuộc vào bản chất của dây dẫn và vào nhiệt độ T1, T2. Thông thường nhiệt độ của một mối hàn được giữ ở giá trị không đổi và biết trước, gọi là nhiệt độ chuẩn T1 = Tref. Nhiệt độ của mối hàn thứ hai khi đặt trong môi trường nghiên cứu sẽ nhạy cảm với sự thay đổi nhiệt độ của môi trường gây ra do phản ứng xúc tác bởi enzym. Ưu điểm: Kích thước cặp nhiệt nhỏ nên có thể đo nhiệt độ ở từng thời điểm của đối tượng cần nghiên cứu và tăng vận tốc hồi đáp tín hiệu (do nhiệt dung nhỏ). Trên cơ sở này, Bataillard đã đưa ra cải tiến là sử dụng một cặp nhiệt bán dẫn (intergrated silicon) để định lượng glucose, ure và penicillin. Do tính chất của cặp nhiệt và lớp tiếp xúc enzymcặp nhiệt có tính truyền nhiệt cao cho phép không phải kiểm soát chặt chẽ nhiệt độ của môi trường xung quanh, do đó có thể thu nhỏ kích thước của thiết bị để có thể cấy vào dưới da đo trực tiếp nồng độ các chất trong máu. http://www.ebook.edu.vn 13 Đồ án: Tổng quan tài liệu về Biosensor Hình 2.6: Sơ đồ điện cực enzym-cặp nhiệt 2.2.2. Điện cực enzym- nhiệt điện trở: Loại điện cực này còn có thể gọi là điện cực áo nhiệt vì buồng đo nhiệt hoàn toàn bị cô lập với môi trường xung quanh nhờ lớp áo nhiệt, quá trình này gần giống với quá trình đoạn nhiệt. Loại thiết bị này có cấu tạo đơn giản và được sử dụng rộng rãi nhất. Hình 2.7: Sơ đồ điện cực enzym – nhiệt điện trở. Chú thích: a- Ống mao dẫn f- cột enzym (1mL) b- lớp vỏ áo nhiệt g- nhiệt điện trở đo c- Thiết bị trao đổi nhiệt h- ống mao dẫn d- lớp cách nhiệt i- Nguồn điện e- nhiệt điện trở so sánh Cơ chất được đi vào thiết bị trao đổi nhiệt rồi qua cột enzym để phản ứng với enzym và giải phóng ra nhiệt, nhiệt độ giải phóng ra sẽ được đo bởi nhiệt điện trở so sánh. Kết quả đo được sau đó đi ra qua bộ xử lý để thu nhận tín hiệu. Mối quan hệ giữa điện trở và nhiệt độ được xác định theo phương trình: Hay: http://www.ebook.edu.vn 14 Đồ án: Tổng quan tài liệu về Biosensor Trong đó R1: điện trở của nhiệt điện trở so sánh, R2: điện trở của nhiệt điện trở đo, T1: nhiệt độ của mẫu sau khi qua bộ phận gia nhiệt, T2: nhiệt độ của mẫu sau khi qua cột enzym, B: Hằng số nhiệt độ của nhiệt điện trở. Khi sự thay đổi nhiệt độ rất nhỏ, B(1/T1-1/T2) nhỏ hơn 1 thì khi đó eB(1/T1-1/T2) ~ 1 + B(1/T1-1/T2) và do đó ta có: Khi T1~T2 thì biểu thức trên trở thành: Độ giảm tương đối điện trở (DR/R) của nhiệt điện trở thì tỷ lệ thuận với độ tăng nhiệt độ DT. Hằng số tỷ lệ (-B/T12) là -4%oC-1. Do đó dựa vào sự thay đổi nhiệt độ mà có thể xác định được chất cần phân tích. Ngoài cách chế tạo cột vật liệu sinh học như trên, người ta còn có thể bao bên ngoài nhiệt điện trở một lớp vỏ silicon và đặt màng cố định enzym ở trên, nhờ đó thu nhỏ được kích thước thiết bị. Hình 2.8: Điện cực Enzym-nhiệt điện trở có vỏ bọc silicon Cũng có thể tích hợp nhiều nhiệt điện trở tạo ra điện cực nhiệt định lượng đồng thời nhiều chất. Các nghiên cứu về loại điện cực nhiệt độ cho thấy ngoài những ứng dụng http://www.ebook.edu.vn 15 Đồ án: Tổng quan tài liệu về Biosensor trong các lĩnh vực y tế, môi trường, thực phẩm, chúng còn có thể có những ứng dụng đặc hiệu như: - Xác định các hằng số Ki, Km, Vm của enzym cố định (Stefuca, 1990) - Định lượng ADP, ATP bằng cách sử dụng puruvatkinase và hexokinase đồng thời cố định trên aminopropyl CPG (Kirstein, 1989). 2.3. ĐIỆN CỰC ĐO QUANG (Optical Biosensor) Điện cực đo quang được chế tạo dựa vào các tính chất vật lý của ánh sáng để phát hiện ra sự biến đổi nhỏ trong mẫu phân tích. Nguyên tắc hoạt động: Dung dịch phân tích được tiếp xúc với màng và khi phản ứng enzym xảy ra thì sẽ có hiện tượng ánh sáng bị hấp thụ hoặc phát ra ánh sáng màu. Người ta có thể xác định được hàm lượng các chất của mẫu phân tích thông qua việc đo độ hấp thụ ánh sáng hoặc sự phát quang ánh sáng của các chất tạo thành do phản ứng xúc tác bởi enzym. Cơ sở của kiểu điện cực quang là sự kết hợp các sợi dẫn ánh sáng với phép trắc phổ quang, phép trắc huỳnh quang, hoặc phép đo phản xạ quang. Nó có khả năng chỉ báo những thay đổi của các thông số quang học, chẳng hạn như sự hấp thụ ánh sáng, chiều dài bước sóng hoặc chỉ số phản xạ trong môi trường đo bao quanh sợo dẫn. Những thiết bị này gắn vào hoặc là sợi đơn hoặc là chùm sợi kép để ánh sáng tới và chùm tia sáng được đo. 2.3.1. Điện cực đo phản xạ quang: Điện cực này hoạt động theo nguyên tắc: năng suất phản xạ từ mặt phản xạ tuân theo phương trình: R = R0 × I ,% I0 Trong đó R- năng suất phản xạ, R0-hằng số phản xạ của môi trường chuẩn, I-cường độ của tia tới, Io- cường độ của tia phản xạ. Mối quan hệ giữa R với nồng độ chất hấp thụ màu theo phương trình: C× K ε 2 ( 1 − R) = 2R Trong đó C-nồng độ chất hấp thụ, K-hằng số hấp thụ, e- hằng số tán sắc Kỹ thuật này được dùng để định lượng glucose trong máu nhờ thuốc hiện màu MBTH (3methyl-2-benzotiazolinon) và DMAB (3-dimethyl-aminobenzoic acid). Hai enzym http://www.ebook.edu.vn 16 Đồ án: Tổng quan tài liệu về Biosensor Glucooxydase (GOD) và peroxydase được cố định bằng cách hấp thụ lên bề mặt tấm nền đã phủ thuốc nhuộm. Khi mẫu phân tích tiếp xúc với tấm nền thì phản ứng xảy ra như sau: Glucosemaãu H2 O 2 + O2 + MTBH GOD + Acid Gluconic + DMAB peroxydase H 2O2 MTBH-DMAB (maøu xanh) nếu H2O2 có nồng độ cao thì phải dùng enzym catalase. Mẫu phân tích sau đó được đem đo năng suất phản xạ ở bước sóng thích hợp và từ đó sẽ tính được hàm lượng glucose. Với Biosensor dựa trên nền tảng của sự phản xạ toàn phần (total internal reflection – TIR) thì bề mặt dây dẫn được phủ kháng thể, sẽ tiếp xúc với mẫu phân tích. Khi sóng ánh sáng đi đến lớp màng nhạy thì chỉ có một phần nhỏ sóng ánh sáng bị hấp thụ vào trong môi trường, còn tất cả chúng bị phản xạ lại nhiều lần và dần dần nguồn sáng bị suy giảm. Dựa vào lượng ánh sáng phản xạ, ta có thể tính được hàm lượng mẫu phân tích. Hình 2.9: Biosensor dựa trên hiện tượng phản xạ toàn phần 2.3.2. Điện cực đo phát quang: Nguyên tắc hoạt động: Cơ chất tác dụng với enzym cố định để tạo thành sản phẩm có khả năng phát ra ánh sáng màu. Đo ánh sáng màu đó ở một bước sóng nhất định sẽ suy ra được nồng độ cơ chất. Dựa vào đặc tính này, người ta thường sử dụng nó để xác định các vi khuẩn trong thực phẩm. Khi các vi khuẩn tác dụng đặc hiệu với ATP và D-luciferin dưới tác dụng của enzym luciferase sẽ tạo thành oxyluciferin, AMP. Pyrophosphate, CO2 và ánh sáng vàng đo được ở bước sóng 562nm. Từ đó xác định lượng vi khuẩn có mặt trong thực phẩm. 2.4. ĐIỆN CỰC ĐIỆN ÁP (Piezoelectric biosensor): http://www.ebook.edu.vn 17 Đồ án: Tổng quan tài liệu về Biosensor Nguyên lý của loại điện cực này dựa vào sự dao động của các tinh thể. Các chất điện môi tự nhiên như thạch anh, tuamalin, hoặc nhân tạo như liti sulfat, thạch anh tổng hợp…dao động khi chịu tác động của từ trường. Tần số dao động của tinh thể phụ thuộc vào độ dày và sự biến dạng của tinh thể, mỗi tinh thể có một tần số dao động đặc trưng. Tần số dao động này thay đổi theo sự hấp thụ hay nhả hấp thụ từ bề mặt tinh thể, thông thường nó sẽ tăng khi có tạp chất hấp thu lên trên bề mặt của tinh thể. Đo tần số dao động sẽ biết được nồng độ của cơ chất cần đo. Tần số dao động được tính theo công thức: trong đó: Df: Chênh lệch tần số dao động (Hz), Dm: chênh lệch khối lượng của chất hấp thu (g), K: hằng số đặc trưng cho sự dao động của tinh thể, phụ thuộc vào bề dày và độ nứt của tinh thể, A: diện tích bề mặt hấp thu (cm2). Điện cực điện áp được dùng để đo amoniac, methane, lưu huỳnh dioxit và cơ chất phosphate hữu cơ. Ta có thể dùng nó để xác định nồng độ formaldehyde nhờ formaldehyde dehydrogenase hay xác định dư lượng thuốc trừ sâu vô cơ phospho vốn kìm hãm enzym xholinesterase. Ưu điểm: Cho thời gian đáp ứng nhanh, nhỏ gọn và rẻ tiền Nhược điểm: Không dùng phân tích mẫu dạng lỏng, dễ bị hư hỏng do độ ẩm không khí. Hình 2.10: Sơ đồ cấu tạo của điện cực điện áp http://www.ebook.edu.vn 18 Đồ án: Tổng quan tài liệu về Biosensor 2.5. ĐIỆN CỰC MIỄN DỊCH (Immunobiosensor): Điện cực miễn dịch hoạt động dựa trên tính chất kháng nguyên – kháng thể. Tức là các kháng thể phản ứng đặc hiệu với các kháng nguyên sinh ra nó. Mỗi kháng thể là một protein hình chữ Y, gồm 4 chuỗi polypeptide, trong đó có hai chuỗi nặng và hai chuỗi nhẹ liên kết với nhau bởi các cầu disulfite. Một phần cấu trúc của các chuỗi là cố định, nhưng các phần đầu mút của hai nhánh chữ Y lại biến đổi và tạo nên các vị trí kết hợp có khả năng phản ứng với các chất hóa học khác gọi là kháng nguyên. Kháng nguyên là các “chất lạ” có bản chất protein hay hydrat cacbon. Phản ứng kháng nguyên – kháng thể được xác định bằng nhiều cách, trong đó có kỹ thuật ELISA (enzym linked immunosorben assay: kỹ thuật hấp thụ miễn dịch có gắn enzym). Nguyên tắc của kỹ thuật ELISA như sau: Kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên được cố định trên bề mặt của một ống. Một hỗn hợp gồm một lượng đã biết phức kết enzym-kháng nguyên và một lượng chưa biết kháng nguyên của mẫu được đặt vào ống. Sau một thời gian thích hợp kháng thể, phức enzymkháng nguyên và kháng nguyên tự do có thể gắn kết hoặc vẫn ở trạng thái tự do, phụ thuộc vào nồng độ của chúng. Các kháng nguyên tự do được rửa trôi và loại bỏ. Lượng phức kết enzym-kháng nguyên gắn với kháng thể được xác định bằng vận tốc phản ứng enzym. http://www.ebook.edu.vn 19 Đồ án: Tổng quan tài liệu về Biosensor Hình 2.11: Nguyên lý hoạt động của kỹ thuật ELISA ELISA được sử dụng để phát hiện và khuếch đại một phản ứng kháng nguyênkháng thể. Lượng kháng nguyên liên kết với enzym gắn với kháng thể cố định được xác định bằng nồ độ tương đối giữa kháng nguyên liên kết và kháng nguyên tự do và được định lượng bằng tỷ lệ của phản ứng enzym. Để có thể đáp ứng nhanh chóng, người ta sử dụng các enzym có khả năng sử dụng lại nhiều lần. Độ nhạy của phương pháp này cũng có thể tăng lên bằng cách sử dụng các phản ứng có xúc tác enzym. Các phản ứng này cho đáp ứng nhanh hơn: chẳng hạn tạo ra các sản phẩm phát quang, hoặc huỳnh quang, hoặc có màu đậm hơn. Kỹ thuật này hiện nay được sử dụng rộng rãi trong các phòng phân tích thí nghiệm. Gần đây để tăng phạm vi ứng dụng, vận tốc và độ nhạy, kỹ thuật ELISA được kết hợp với các bộ Biosensor hình thành phương pháp sử dụng điện cực miễn dịch (immunosensor). Các điện cực miễn dịch này rất thích hợp khi sử dụng với điện cực điện áp hoặc các điện cực đo điện thế. http://www.ebook.edu.vn 20