BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
NINH THỊ NHƢ QUỲNH
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ
CHỦNG XẠ KHUẨN SINH KHÁNG SINH
TỪ VÙNG RỄ CÂY NGẢI CỨU
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
HÀ NỘI, 2014
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
NINH THỊ NHƢ QUỲNH
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ
CHỦNG XẠ KHUẨN SINH KHÁNG SINH
TỪ VÙNG RỄ CÂY NGẢI CỨU
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
TS. DƢƠNG MINH LAM
HÀ NỘI, 2014
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Dƣơng Minh Lam đã tận tình
hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ phòng thí nghiệm Vi sinh, khoa Sinh KTNN, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2 đã nhiệt tình giúp đỡ.
Tôi chân thành cảm ơn ban Lãnh đạo Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2,
Ban chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN, đã tạo mọi điều kiện cho tôi học tập và hoàn
thành đề tài.
Tôi xin cảm ơn thầy cô và bạn bè đã động viên, tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi
trong suốt thời gian làm đề tài.
Lời cảm ơn sâu sắc nhất tôi xin dành cho gia đình và những ngƣời thân yêu
đã động viên và giúp đỡ tôi.
Hà Nội, tháng 05 năm 2014
Tác giả
Ninh Thị Như Quỳnh
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các kết quả
nghiên cứu, số liệu đƣợc trình bày trong khóa luận là trung thực và không trùng
với công trình của các tác giả khác.
Hà Nội, tháng 05 năm 2014
Tác giả
Ninh Thị Như Quỳnh
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1
1. Lí do chọn đề tài ................................................................................................ 1
2. Mục tiêu đề tài .................................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu .......................................................................................... 2
4. Ý nghĩa ............................................................................................................... 2
5. Điểm mới của đề tài ........................................................................................... 2
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 3
1.1. Vị trí và phân loại xạ khuẩn ............................................................................ 3
1.1.1. Vị tr
112
ạ khuẩn trong sinh giới ............................................................. 3
h n oại ạ khuẩn...................................................................................... 3
1.1.2.1. Lƣợc sử phân loại xạ khuẩn ...................................................................... 3
1.1.2.2. Một số phƣơng pháp trong phân loại xạ khuẩn ........................................ 5
1.2. Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn..................................................................... 9
1 2 1 Đặ điểm hình thái c a xạ khuẩn................................................................ 9
1.2.2. Cấu tạo xạ khuẩn ...................................................................................... 10
1.2.3 Đặ điểm sinh lý, sinh hóa c a xạ khuẩn.................................................. 10
1.2.4. Sinh sản c a xạ khuẩn ............................................................................... 12
1.3. Chất kháng sinh từ xạ khuẩn ......................................................................... 12
1.3.1. Khái niệm chất kháng sinh ........................................................................ 12
1 3 2 Lược sử nghiên cứu chất kháng sinh ........................................................ 12
1.3.3. Sự hình thành chất kháng sinh ở xạ khuẩn ............................................... 14
1.3.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh ....................... 15
1.3.4.1. Ảnh hƣởng của điều kiện nuôi cấy ......................................................... 15
1.3.4.2. Ảnh hƣởng của thành phần môi trƣờng lên men .................................... 16
1.4. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam về kháng sinh ................ 17
1.5. Cây ngải cứu.................................................................................................. 18
CHƢƠNG 2. V T LIỆU V
HƢƠNG H
NGHI N CỨU ....................... 20
2.1. Nguyên liệu và vi sinh vật............................................................................. 20
2.1.1. Vi sinh vật .................................................................................................. 20
2.1.2. Hóa chất và thiết bị ................................................................................... 20
2.2. Môi trƣờng .................................................................................................... 21
2 2 1 Môi trường phân lập, bảo quản và giữ giống xạ khuẩn ........................... 21
2 2 2 Môi trường thử hoạt tính kháng sinh ........................................................ 21
2.3. hƣơng pháp nghiên cứu............................................................................... 21
231
hương pháp ấy mẫu ............................................................................... 21
2.3.2. Phân lập tuyển chọn xạ khuẩn .................................................................. 22
233
hương pháp qu n sát hình thái ạ khuẩn ............................................... 23
234
hương pháp á định hoạt tính kháng sinh ............................................ 23
235
hương pháp thống kê và xử lý kết quả bằng toán học ............................ 25
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LU N ....................................................... 26
3.1. Phân lập xạ khuẩn trên vùng rễ cây Ngải cứu .............................................. 26
3.2. Xác định khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn ........................................ 30
3.3. Đặc điểm hình thái và sắc tố tan của các chủng xạ khuẩn đã phân lập ........ 32
3.3.1. Nghiên cứu đặ điểm khuẩn lạc các ch ng xạ khuẩn đã ph n ập........... 32
3.3.2. Nghiên cứu hình dạng cuống sinh bào tử c a các ch ng xạ khuẩn NR34
và ND2 đã ph n ập .................................................................................. 35
3.3.3. Nghiên cứu sắc tố tan c a ch ng xạ khuẩn đã ph n ập .......................... 36
KẾT LU N VÀ KIẾN NGHỊ.............................................................................. 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 42
CÁC TỪ VIẾT TẮT
m-ADP : meso-Diaminopimelic Acid
CFU
: Colony Forming Unit
CKS
: Chất kháng sinh
DNA
: Deoxyribonucleic Acid
HSCC
: Hệ sợi cơ chất
HSKS
: Hệ sợi khí sinh
HTKS
: Hoạt tính kháng sinh
ISP
: International Streptomyces Project
VSV
: Vi sinh vật
VSVKĐ : Vi sinh vật kiểm định
VK
: Vi khuẩn
RNA
: Ribonucleic Acid
rRAN
: Riboxom Ribonucleic Acid
PG
: Peptido Glycan
G+
: Gram dƣơng
G-
: Gram âm
DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH
Bảng 3.1.
Các chủng xạ khuẩn phân lập đƣợc từ vùng rễ cây Ngải cứu ........ 27
Bảng 3.2.
Kết quả khảo sát khả năng sinh kháng sinh của các chủng xạ
khuẩn phân lập đƣợc từ vùng rễ cây Ngải cứu ............................... 30
Bảng 3.3.
Kết quả thống kê hoạt tính kháng sinh các chủng xạ khuẩn phân
lập từ vùng rễ cây Ngải cứu ........................................................... 31
Bảng 3.4.
Đặc điểm khuẩn lạc của các chủng xạ khuẩn nghiên cứu .............. 33
Bảng 3.5.
Sự phân bố của xạ khuẩn theo nhóm màu ...................................... 34
Bảng 3.6.
Đặc điểm sắc tố tan của chủng xạ khuẩn nghiên cứu ..................... 37
Hình 1.1.a. Ngải cứu .......................................................................................... 19
Hình 1.1.b. Vùng rễ Ngải cứu ............................................................................ 19
Hình 3.1.
Khuẩn lạc xạ khuẩn......................................................................... 28
Hình 3.2.
Một số chủng xạ khuẩn phân lập .................................................... 29
Hình 3.3.
Hình ảnh thử hoạt tính kháng sinh của một số chủng xạ khuẩn
nghiên cứu ...................................................................................... 31
Hình 3.4.
Nuôi cấy 2 chủng NR34 và ND2 ................................................... 35
Hình 3.5.
Cuống sinh bào tử và bào tử của chủng ND2, NR34 ..................... 36
Hình 3.6.
Sắc tố tan của một số chủng xạ khuẩn phân lập đƣợc .................... 39
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
Khóa luận tốt nghiệp
MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Tìm ra thuốc để chữa bệnh cho ngƣời, từ lâu đã là mơ ƣớc của nhân loại.
Năm 1928, A. Fleming phát hiện ra Penicillin - một CKS có nguồn gốc từ nấm
Penicillium. Nhƣng phải hơn 10 năm sau, vào năm 1940, một nhóm các nhà
khoa học mới tách chiết thành công đƣợc Penicillin. Kể từ đó, enicillin mới
chính thức đƣợc dùng để chữa bệnh cho ngƣời, động vật và sử dụng trong
nhiều ngành khác.
Tuy nhiên, việc sử dụng các CKS không hợp lý đã dẫn đến sự xuất hiện
ngày càng nhiều các VSV gây bệnh có khả năng kháng lại các thuốc kháng
sinh hiện có, đặc biệt là nhiều loài VSV có khả năng kháng chéo nhiều CKS có
cấu trúc tƣơng tự nhau. Do đó việc tìm ra những CKS mới, nhất là các CKS có
cấu trúc hóa học tự nhiên do chính VSV tiết ra cần đƣợc quan tâm nhiều hơn.
Cho tới nay khoảng hơn 8000 chất kháng sinh hiện biết trên thế giới thì có
tới 80% là do xạ khuẩn sinh ra. Trong số đó có trên 15% có nguồn gốc từ các
loại xạ khuẩn hiếm nhƣ Micromonospora, Actinomadura, Actinoplanes,
Streptoverticillium, Streptospor ngium… Điều đáng chú ý là các xạ khuẩn
hiếm đã cung cấp nhiều chất kháng sinh có giá trị đang dùng trong y học nhƣ
gentamixin, tobramixin, vancomixin, rosamixin. Ngoài ra, xạ khuẩn tham gia
tích cực vào các quá trình chuyển hoá vật chất trong tự nhiên. Dùng để sản xuất
nhiều enzyme nhƣ proteaza, amylaza, xenluloza…một số axit amin và axit hữu
cơ. Một số xạ khuẩn có thể gây bệnh cho ngƣời, động vật. Xuất phát từ những
yêu cầu thực tế trên, từ xu hƣớng nghiên cứu trên thế giới hiện nay và cũng
nhƣ để góp phần khai thác nguồn VSV vô cùng phong phú của vùng rễ cây
Ngải cứu tại Xuân Hòa, Vĩnh húc, tôi thực hiện đề tài: “ h n ập và tuyển
chọn một số ch ng xạ khuẩn sinh kháng sinh từ vùng rễ cây Ngải cứu”
Ninh Thị Như Quỳnh
1
K36B - Sinh
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
Khóa luận tốt nghiệp
2. Mục tiêu đề tài
Phân lập và tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh có
nhiều triển vọng ứng dụng trong thực tế.
3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Phân lập và thuần chủng xạ khuẩn từ các mẫu đất, mẫu rễ cây Ngải cứu
khu vực Xuân Hòa, Vĩnh húc.
3.2. Kiểm tra HTKS của các chủng xạ khuẩn đã phân lập, lựa chọn ra các
chủng có HTKS cao.
3.3. Nghiên cứu đặc điểm hình thái và sắc tố tan các chủng xạ khuẩn phân lập
đƣợc.
4. Ý nghĩa
4.1. Ý nghĩa lí luận
Góp phần đem lại cho con ngƣời những hiểu biết về đời sống tự nhiên của
vi sinh vật nói chung và xạ khuẩn nói riêng. Đề tài cho phép hiểu rõ hơn về vai
trò của xạ khuẩn trong môi trƣờng đất, khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh cao, ứng dụng
các chủng xạ khuẩn này vào trong đời sống (trong y tế, chăn nuôi). Từ các
chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh cao này có thể tạo ra các chế phẩm
thuốc kháng sinh phục vụ cho chữa bệnh, y tế…
5. Điểm mới của đề tài
Tuyển chọn đƣợc 2 chủng ND2 và NR34 cho hoạt tính kháng sinh cao
hơn các chủng còn lại để tiếp tục nghiên cứu.
Ninh Thị Như Quỳnh
2
K36B - Sinh
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
Khóa luận tốt nghiệp
CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Vị trí và phân loại xạ khuẩn
1.1.1. Vị tr
ạ khuẩn trong sinh giới
Xạ khuẩn (Actinomycetes) là một nhóm vi sinh vật Gram+ lớn trong giới
Bacteria. Theo Krassilnikov (1970) xạ khuẩn đƣợc tách thành một lớp riêng
gồm có xạ khuẩn bậc cao có hệ sợi phát triển, có cơ quan sinh sản riêng và
nhóm xạ khuẩn bậc thấp có hệ sợi kém phát triển, tế bào có dạng hình que hoặc
hình cầu. Xạ khuẩn có hệ sợi ngắn nhƣ họ Mycobacteriaceae và
Actinomycetaceae, hoặc hệ sợi dài nhƣ họ Streptomycetaceae [7].
Xạ khuẩn thuộc về lớp Actinobacteria, bộ Actinomycetales, bao gồm 10
phân bộ, 35 họ, 110 chi và 1000 loài. Hiện nay, 478 loài đã đƣợc công bố thuộc
chi Streptomyces và hơn 500 loài thuộc tất cả các chi còn lại và đƣợc xếp vào
nhóm xạ khuẩn hiếm.
Bộ
xạ
khuẩn
gồm
Permatophilaceae,
10
họ:
Actinomycetaceae,
Frankiaceae,
Actinoplanaceae,
Micromonosporaceae,
Thermonosporaceae, Micobacteriaceae, Mycobacteriaceae, Norcarddiceae,
Streptomycetaceae. Trong đó Streptomycetaceae là họ xạ khuẩn có hệ sợi phát
triển mạnh và đƣợc nghiên cứu khá kỹ.
ạ
ạ khuẩn
1 1 2 1 Lược sử phân loại xạ khuẩn
Trƣớc thế kỉ XIX, xạ khuẩn đƣợc xếp vào giới nấm (Fungi). Về sau các
nghiên cứu cho thấy chủng có nhân nguyên thủy, kích thƣớc bề ngang nhỏ nhƣ
vi khuẩn nên ngƣời ta xếp vào giới vi khuẩn (Eubacteria).
Fosters là ngƣời đầu tiên phân lập một số xạ khuẩn có tuyến mắt của ngƣời
và đƣợc Jonh miêu tả năm 1874. Đến năm 1977, Harze mô tả đầu tiên một loại
Ninh Thị Như Quỳnh
3
K36B - Sinh
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
Khóa luận tốt nghiệp
xạ khuẩn có hệ sợi rất điển hình, đƣợc phân lập từ bệnh nấm sao của trâu bò và
đặt tên là Actinomyces bovis.
Năm 1914, Krainski lần đầu tiên đề ra các chỉ tiêu mới trong việc phân loại
các loài khác nhau và sơ bộ phân loại 17 chủng thuộc chi Actinomycetes.
ng
coi các đặc điểm sinh lý, sinh hóa là mấu chốt cơ bản trong nguyên tắc phân
loại. Waksman và Curtis (1919) đã đề cập đến những dạng trung gian trong mô
tả phân loại của mình và coi đặc điểm hình thái bào tử là đặc tính quan trọng
nhất của các cá thể và đƣa ra một số loài mới có ý nghĩa.
Năm 1926, Millard và Burr tìm ra 17 loài trong đó có 7 loài còn tồn tại đến
bây giờ. Jensen (1930 - 1931) tìm ra 2 loài mới, đến năm 1934 Dutche tìm ra 3
loài mới [12]. Baldacci và cộng sự đã nghiên cứu xạ khuẩn từ năm 1930 - 1953
đã công bố một khóa phân loại chi Streptomyces dựa trên cơ sở HSKS, HSCC
và một số đặc điểm trung gian khác. Waksman và Henrici (1953) đã đƣa ra một
hệ thống phân loại và đến năm 1961 đã đƣợc sửa đổi lại. Trong hệ thống phân
loại này, xạ khuẩn đƣợc xếp vào nhóm gồm 3 họ, chia nhỏ thành 10 chi và mô
tả chi tiết hơn 250 loài thuộc chi Streptomyces. Hệ thống phân loại này dựa vào
màu sắc HSKS, HSCC, hình dạng bào tử, chuỗi bào tử...
Krassinilcov từ năm 1941 - 1949 đã phát hiện trên 38 loài mới. Năm 1970,
ông công bố hệ thống phân loại nấm tia mới dựa vào hệ thống công bố năm
1949, trong đó xạ khuẩn đƣợc phân thành 6 họ gồm 26 chi.
Năm 1957, Gause và cộng sự đã phân bố hệ thống phân loại mới. Hệ thống
phân loại này dựa vào màu sắc HSKS, HSCC, hình dạng màng bào tử và cuống
sinh bào tử. Hệ thống này đƣợc chỉnh lý và tái bản năm 1983. Trong những
năm gần đây, hệ thống phân loại xạ khuẩn ngày càng nhiều nhƣ hệ thống phân
loại của rihan (1972), Nonomura (1972) và đáng chú ý hơn là hệ thống phân
loại của Goodfellow Stackebradt (1988). Để thống nhất cách mô tả, IS đã nêu
lên các phƣơng pháp và môi trƣờng mô tả (Shirling và Gottlieb, 1966).
Ninh Thị Như Quỳnh
4
K36B - Sinh
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
Khóa luận tốt nghiệp
1.1.2.2. Một số phương pháp trong ph n oại xạ khuẩn
Dựa vào sự phát triển của khoa học kĩ thuật, số lƣợng xạ khuẩn đƣợc mô tả
ngày càng nhiều và chính xác trên cơ sở sự phát triển của sinh học phân tử, hóa
sinh học, lý sinh học... Để phân loại nhanh chóng và chính xác các xạ khuẩn
đến loài, ngƣời ta đã sử dụng phƣơng pháp phân loại số (Numberical
taxonomy), nghiên cứu chủng loại phát sinh ( hylogeny taxonomy). Tuy
nhiên, vì nhiều lý do và trong thực nghiệm, ngƣời ta vẫn chủ yếu dựa vào các
đặc điểm hình thái, tính chất nuôi cấy, đặc điểm sinh lý, sinh hóa, miễn dịch
học và sinh học phân tử.
Hiện nay có rất nhiều khóa phân loại xạ khuẩn nhƣng có thể gộp thành hai
hệ thống phân loại chính sau:
Hệ thống phân loại dựa chủ yếu vào đặc điểm hình thái để phân loại nhóm
lớn nhƣ họ, giống. Các phân loại thấp hơn loài thì dùng đặc điểm nuôi cấy,
sinh lý, sinh hóa để phân loại [13].
Hệ thống phân loại chủ yếu dựa vào các đặc điểm sinh lý nhƣ màu sắc hệ
sợi... để phân nhóm, sau đó dùng các đặc điểm nuôi cấy để phân loại đến loài.
Nhóm hệ thống này của Waksman, Gause... các tác giả đều thống nhất lấy đặc
điểm sử dụng nguồn nitơ, cacbon làm yếu tố bổ sung cho phân loại đến loài.
Đặ điểm hình thái và tính chất nuôi cấy
Dựa vào các đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy ngƣời ta chia xạ
khuẩn làm 4 nhóm chính:
Nhóm 1: Gồm các xạ khuẩn mang bào tử rõ rệt, sinh sản bằng bào tử và
phân hóa thành HSKS, HSCC.
Nhóm 2: Gồm xạ khuẩn có bào tử nang, hệ sợi phân chia theo hƣớng vuông
góc với nhau tạo thành cấu trúc tƣơng tự nang bào tử.
Nhóm 3: Gồm xạ khuẩn có dạng Norcadia, sinh sản bằng phân đốt hệ sợi.
Nhóm 4: Gồm các xạ khuẩn có dạng Corynebacter và dạng cầu, tế bào có
hình chữ T, V và thƣờng không có hệ sợi.
Ninh Thị Như Quỳnh
5
K36B - Sinh
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
Khóa luận tốt nghiệp
Theo tài liệu của IS đƣợc nêu bởi Shirling và Gottlieb (1968, 1969 và
1972) và trong cuốn “Bergey’s M nu
đƣợc xuất bản lần thứ 8, ngƣời ta chia
hình dạng chuỗi bào tử xạ khuẩn thành 6 kiểu:
Kiểu S: Type “Spira - chuỗi bào tử xoắn.
Kiểu SRA: Type “Spira- Rectinaculum- Apertum - chuỗi bào tử xoắn có
dạng móc câu hay xoắn không hoàn toàn.
Kiểu SRF: Type “Spirina - Rectus - Flexibilis - chuỗi bào tử xoắn, cong
đến thẳng.
Kiểu RA: Type “Rectinaculum - Apertum - chuỗi bào tử có móc có khóa.
Kiểu RA - RF: Type “Rectinaculum Apertum - Rectus Flexibilis - chuỗi
bào tử có dạng móc hay xoắn không hoàn toàn.
Kiểu RF: Type “Rectus - Flexibilis - chuỗi bào tử thẳng đến lƣợn sóng.
Trƣớc đây, các đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy đƣợc coi là dữ liệu
cơ bản dùng trong phân loại xạ khuẩn. Tuy nhiên, xạ khuẩn là vi sinh vật rất dễ
biến dị tự nhiên dẫn đến sự khác nhau về kiểu hình của cùng một loài hay
giống nhau về kiểu hình giữa các loài khác nhau. Vì vậy, ngày nay trong phân
loại xạ khuẩn phải dùng thêm các chỉ tiêu bổ sung khác nhƣ đặc điểm sinh lý,
sinh hóa, miễn dịch học và sinh học phân tử.
Đặ điểm hóa phân loại
hƣơng pháp hóa phân loại dựa vào các dữ liệu về định tính, định lƣợng
các thành phần hóa học trong tế bào vi sinh vật để phân loại, chủ yếu dựa vào
các đặc điểm sau:
Type thành tế bào: dựa trên cơ sở phân tích acid amin trong thành phần dây
nối peptide, đƣờng trong thành tế bào hay các polysaccaride gắn vào thành tế
bào.
Type Peptidoglucan (PG)
Acid mycolic
Acid béo
Ninh Thị Như Quỳnh
6
K36B - Sinh
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
Khóa luận tốt nghiệp
Menaquinon
Type photpholipid
Trong các đặc điểm trên, type thành tế bào là đặc điểm quan trọng nhất
trong phân loại xạ khuẩn. Theo hƣớng phân loại hóa sinh, ngƣời ta chia thành
tế bào thành 4 dạng sau:
Type I: thành tế bào có L - ADP và glixin
Type II: thành tế bào có m - ADP và gilixin
Type III: thành tế bào có m - ADP
Type IV: thành tế bào có m - AD , đƣờng arabinose, galactose
Trong type peptidoglucan ngƣời ta chia xạ khuẩn thành:
Type
Type phụ
A (3-4)
A1
Liên kết peptide trực tiếp.
A2
Chuỗi peptit bên.
A3
Glycerol hoặc các acid monocacboxylic
A4
Acid dicacboxylic
B1
Acid đƣợc diamine hóa
B2
Các acid amin đƣợc diamine hóa
B (2-4)
Cầu liên kết
Phân loại số
hƣơng pháp này dựa trên sự đánh giá về mức độ giống nhau giữa các vi
sinh vật trong một số lớn các đặc điểm về hình thái, sinh lý, sinh hóa. Để so
sánh các chủng với nhau theo từng đôi một, hiện nay có một số công thức tính
hệ số giống nhau. Trong đó công thức của Sokal và Mitchener (SSM) và công
thức của Jaccard (SJ) đƣợc sử dụng nhiều nhất.
Ninh Thị Như Quỳnh
7
K36B - Sinh
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
Khóa luận tốt nghiệp
Công thức của Sokal và Michener (SSM)
SSM (AB)= (Ns + + Ns-)* 100/ (Ns + + Ns- + Nd)
Trong đó:
SSM (AB) : Mức độ giống nhau giữa hai cá thể A, B (%).
Ns +
:Số các tính trạng giống nhau.
Nd
: Số các tính trạng khác nhau.
Ns-
:Số các tính trạng đối lập nhau.
Công thức của Jacard (SJ)
SJ(AB)= Ns * 100/ (Ns + Nd)
Trong đó:
SJ(AB) : mức độ giống nhau giữa hai ch ng A, B (%).
Ns: Tổng số các đặc điểm dương tính (giống nhau) c a hai ch ng so sánh.
Nd : Tổng số các đặc điểm khác nhau (tổng số các đặc điểm dương t nh
a ch ng này
và âm tính c a ch ng kia).
Kết quả của sự so sánh số học đƣợc biểu hiện trên sơ đồ nhánh và tùy thuộc
mức độ giống nhau mà các vi sinh vật đƣợc xếp vào các nhóm. Bằng phƣơng
pháp phân loại số học Streptomyces đƣợc chia ra làm các nhóm lớn (major
clusters), nhóm nhỏ (minor clusters) và các nhóm đơn thành viên (single
member clusters).
Nghiên cứu về h ng oại phát sinh
Nhờ sự sắp xếp chủng loại phát sinh mà các vi sinh vật đƣợc sắp xếp vào
hệ thống phân loại gần tự nhiên hơn.
Các nghiên cứu về di truyền phân tử nhằm xây dựng cây phát sinh chủng
loại bằng cách tiến hành so sánh các cao phân tử DNA, RNA, protein mà quan
trọng hơn cả là sự sắp xếp các nucleotide của rRNA 16S. Mức độ giống nhau
giữa hai cá thể so sánh càng lớn thể hiện mối quan hệ giữa chúng càng chặt
ch .
Ninh Thị Như Quỳnh
8
K36B - Sinh
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
Khóa luận tốt nghiệp
1.2. Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn
Đặ đ ểm hình thái c a xạ khuẩn
Tùy loại môi trƣờng mà xạ khuẩn có hình thái khác nhau. Trên môi trƣờng
đặc, xạ khuẩn phát triển thành những khuẩn lạc. Tùy theo loài, môi trƣờng nuôi
cấy mà kích thƣớc màu sắc khuẩn lạc có thể khác nhau nhƣ đỏ, da cam, hồng,
trắng, vàng, nâu, xám... Khuẩn lạc xạ khuẩn có thƣờng chắc, xù xì, dạng nhung
tơ, hay dạng màng dẻo và có cấu trúc 3 lớp: lớp ngoài có cấu trúc sợi bện chặt,
lớp giữa có dạng cấu trúc tổ ong và lớp trong cùng có cấu trúc tƣơng đối xốp.
Cấu trúc khuẩn lạc xạ khuẩn có hƣớng sinh trƣởng trong môi trƣờng tạo ra
HSCC và mặt ngoài môi trƣờng tạo ra HSKS. Đƣờng kính hệ sợi xạ khuẩn thay
đổi theo trong khoảng 0,02 - 0,1 μm đến 2 - 3 μm. Đa số các xạ khuẩn có hệ
sợi phân nhánh mạnh, không có vách ngăn. Màu sắc hệ sợi đa dạng, có thể gặp
các màu trắng, vàng, da cam, nâu, tím, đen... HSCC có thể sinh sắc tố tan trong
nƣớc hoặc tan trong dung môi hữu cơ. HSKS ở tận cùng thƣờng là các chuỗi
bào tử xoắn, lƣợn sóng, thẳng, vòng... Đây là đặc điểm khá quan trọng để phân
loại xạ khuẩn [1].
Các bào tử xạ khuẩn có thể có hình tròn, bầu dục, hình que, hay hình trụ...
Cấu trúc bề mặt bào tử có thể nhẵn (Smooth), có gai (Spinny), khối u (Warty),
nếp nhăn (Rugose) hay dạng tóc (Hairy). Hình dạng, kích thƣớc, cấu trúc bề
mặt bào tử cũng là một trong những tiêu chí quan trọng để định loại xạ khuẩn
[1].
Khi nuôi cấy xạ khuẩn trong môi trƣờng dịch thể, xạ khuẩn có thể mọc
thành dạng màng hay dạng vòng trên thành bình nuôi cấy. Trên bề mặt môi
trƣờng hay dạng bọt hoặc kết tủa kiểu vi khuẩn. Khi nuôi cấy chìm trên máy
lắc hoặc nồi lên men đƣợc khuấy đảo thì xạ khuẩn phát triển thành dạng sợi
bông hoặc cặn xốp. Nhƣng thƣờng gặp hơn cả là xạ khuẩn phát triển thành
những quả cầu nhỏ chứa đầy môi trƣờng, kích thƣớc từ 0,1 mm đến 3 mm.
Ninh Thị Như Quỳnh
9
K36B - Sinh
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
Khóa luận tốt nghiệp
1.2.2. Cấu tạo xạ khuẩn
Xạ khuẩn có cấu tạo tƣơng đối giống vi khuẩn gồm có thành tế bào, màng
tế bào, vật chất nhân sơ, các hạt dự trữ. Xạ khuẩn thuộc nhóm vi sinh vật
Gram+. Thành tế bào dày khoảng 20 nm có vai trò duy trì hình dạng hệ sợi và
bảo vệ tế bào, đƣợc cấu tạo chủ yếu gồm các lớp glycopeptide gồm các gốc NAcetylGlucosamine liên kết với N- AcetylMuramic.
Căn cứ vào kết cấu hóa học của thành tế bào xạ khuẩn có thể chia thành
thành 4 nhóm sau:
Nhóm 1 (Type I): có chứa L- ADP (L- diaminopimelic và glixin). Gồm các
chi Streptomyces, Norcarsioider...
Nhóm 2 (Type II): có chứa m- ADP (meso- diaminopimelic) và glixin.
Gồm các chi Micromospora, Actinoplans, Ampullariella...
Nhóm 3 (Type III): có chứa m- ADP (meso- diaminopimelic). Gồm có
Actinomadura, Actinobigfida, Micromobispora...
Nhóm 4 (Type IV): có chứa m- ADP (meso- diaminopimelic), đƣờng
araninose, galactose. Gồm có Norcardia, Pseudonocardia, Microbacterium...
Khuẩn lạc xạ khuẩn có dạng sợi phân nhánh phức tạp đan xen nhau, có ít
vách ngăn ngang. Giống nhƣ vi khuẩn, nhân thuộc loại đơn giản, không có
màng nhân. Thành tế bào xạ khuẩn giống thành tế bào vi khuẩn Gram+. Màng
tế bào chất dày khoảng 50 nm và có cấu trúc tƣơng tự màng tế bào chất của vi
khuẩn. Khi mới hình thành, toàn bộ tế bào chỉ có một nhiễm sắc thể sau đó
hình thành nhiều hạt rải rác trong toàn bộ khuẩn ty (gọi là hạt cromatin) [8].
3 Đặ đ ểm sinh lý, sinh hóa c a xạ khuẩn
Xạ khuẩn là một nhóm cơ thể dị dƣỡng, chúng sử dụng đƣờng, rƣợu, acid
hữu cơ, lipid, protein và nhiều hợp chất hữu cơ khác làm nguồn cacbon, còn
nitrat, nitrit, muối amon, ure, pepton, cao thịt...để là nguồn nitơ. Ở các loài
khác nhau thì khả năng hấp thụ các hợp chất này là khác nhau. Phần lớn xạ
Ninh Thị Như Quỳnh
10
K36B - Sinh
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
Khóa luận tốt nghiệp
khuẩn là vi sinh vật hiếu khí, ƣa ẩm, nhiệt độ thích hợp cho sinh trƣởng và phát
triển là 25 – 30oC. Đa số xạ khuẩn phát triển tốt nhất trong môi trƣờng pH là
6.8 – 7.0, một số ít có khả năng phát triển tốt trong môi trƣờng kiềm [17].
Xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn Gram+, đặc biệt khác với các vi sinh vật khác
của nhóm nhân sơ có tỉ lệ (G+X) cao (trên 70%), trong khi đó ở vi khuẩn tỷ lệ
này khá thấp (25 - 45%). Một trong những đặc điểm đáng lƣu ý của xạ khuẩn là
chúng không bền vững về mặt di truyền và thƣờng xảy ra sự sắp xếp lại trong
phân tử DNA. Điều này gây ra tính đa dạng về hình thái, tính chất sinh lý, sinh
hóa của xạ khuẩn (khả năng đồng hóa nguồn cacbon, nitơ, hoạt tính kháng sinh,
tính kháng thuốc, khả năng phân giải cellulose...) [16].
Đặ điểm c a chi xạ khuẩn Streptomyces
Chi Streptomyces có số lƣợng loài mô tả lớn nhất, chi này có HSKS, HSCC
phát triển và phân nhánh, khuẩn lạc thƣờng không lớn, đƣờng kính khuẩn lạc từ
1- 5 mm. Khuẩn lạc chắc dạng da, mọc đâm sâu vào cơ chất, bề mặt khuẩn lạc
thƣờng đƣợc phủ bởi HSKS dạng nhung, dày hơn HSCC và đôi khi không thấm
nƣớc. Chuỗi bào tử đƣợc tạo thành trên cuống sinh bào tử, chúng có thể thẳng,
lƣợn sóng hoặc xoắn. Bề mặt bào tử có thể nhẵn, xù xì, có thể lông hoặc có gai.
Xạ khuẩn có khả năng tạo thành các loại sắc tố khác nhau, sắc tố này có thể
nhuộm màu HSKS, HSCC, đôi khi nhuộm màu môi trƣờng.
Các loài thuộc chi Streptomyces có cấu tạo tế bào của vi khuẩn Gram+, là vi
sinh vật hiếu khí, dị dƣỡng. Nhiệt độ sinh trƣởng tối ƣu từ 25 – 30oC, pH tối ƣu
là 6.5 - 8.0. Một số loài có thể sinh trƣởng ở nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn (xạ
khuẩn ƣa nhiệt và xạ khuẩn ƣa ẩm). Bên cạnh các đặc điểm hình thái, nuôi cấy
trên xạ khuẩn thuộc chi này còn có đặc điểm hóa phân loại sau:
Type thành tế bào: Type I dạng L- ADP và glixin
Type Peptidoglycan
Axit béo: mạch thẳng bão hòa, đồng phân nhánh 15 - 17 C với số lƣợng ít
và số lƣợng lớn các axit phân nhánh 16 Ciso và 15 - 17 Canteiso
Ninh Thị Như Quỳnh
11
K36B - Sinh
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
Khóa luận tốt nghiệp
Dạng menaquinon: MK-9 (H6) hoặc MK-9 (H9)
Dạng photpholipit : PII
Không có axit mycolic [23].
1.2.4. Sinh sản c a xạ khuẩn
Xạ khuẩn sinh sản sinh dƣỡng bằng bào tử. Bào tử đƣợc hình thành trên
các nhánh phân hóa từ khuẩn ty khí sinh gọi là cuống sinh bào tử. Cuống sinh
bào tử ở các loài xạ khuẩn có kích thƣớc và hình dạng khác nhau. Có loài dài
tới 100 - 200 nm, có loài chỉ dài 20 - 30 nm. Có cấu trúc theo hình lƣợn sóng.
Có loài hình lò xo hay xoắn ốc. Sắp xếp các cuống sinh bào tử cũng khác nhau
mọc đơn, mọc đối, mọc vòng hoặc từng chùm. Bào tử đƣợc hình thành từ
cuống sinh bào tử theo kiểu kết đoạn (fragmentation) hoặc cắt khúc
(Segmentation). Ngoài hình thức sinh sản bằng bào tử, xạ khuẩn còn có hình
thức sinh sản bằng khuẩn ty. Các đoạn khuẩn ty gãy ra môi trƣờng phát triển
thành hệ khuẩn ty [11].
1.3. Chất kháng sinh từ xạ khuẩn
1.3.1. Khái niệm chất kháng sinh
Theo định nghĩa truyền thống thì chất kháng sinh (còn gọi là trụ sinh) là
những chất có khả năng tiêu diệt vi khuẩn hay kìm hãm sự phát triển của vi
khuẩn một cách đặc hiệu. Nó tác dụng lên vi khuẩn ở cấp độ phân tử, thƣờng là
một vị trí quan trọng của vi khuẩn hay một phản ứng trong quá trình phát triển
của vi khuẩn. Theo định nghĩa hiện nay, kháng sinh đƣợc hiểu là các hợp chất
hóa học do vi sinh vật sinh ra và nồng độ thấp chúng có thể kìm hãm sự sinh
trƣởng hoặc tiêu diệt các vi sinh vật khác (Nduka, 2007).
1.3.2. Lược sử nghiên cứu chất kháng sinh
Theo định nghĩa của Outchinnikov: chất kháng sinh là chất có nguồn gốc
thiên nhiên và các sản phẩm cải biến của chúng bằng con đƣờng hóa học có
Ninh Thị Như Quỳnh
12
K36B - Sinh
- Xem thêm -