Tài liệu Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu chủng vi khuẩn lactic có đặc tính probiotic từ mật và sáp ong (kl06153)

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN ĐINH THỊ PHƢƠNG PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU CHỦNG VI KHUẨN LACTIC CÓ ĐẶC TÍNH PROBIOTIC TỪ MẬT VÀ SÁP ONG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vật học HÀ NỘI, 2014 TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN ĐINH THỊ PHƢƠNG PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU CHỦNG VI KHUẨN LACTIC CÓ ĐẶC TÍNH PROBIOTIC TỪ MẬT VÀ SÁP ONG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vật học Ngƣời hƣớng dẫn khoa học TS. TRẦN THỊ THÚY HÀ NỘI, 2014 LỜI CẢM ƠN Em xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô giáo TS. Trần Thị Thúy, ngƣời đã tận tình dạy bảo, hƣớng dẫn và giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và hoàn thiện khóa luận tốt nghiệp này. Em gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS. TS. Đinh Thị Kim Nhung, cô giáo đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình học tập và thực hiện đề tài. Em xin trân trọng cảm ơn các thầy cô giáo công tác tại bộ môn Công nghệ Sinh học- Vi sinh, khoa Sinh học, trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội, đã hết lòng tạo điều kiện, giúp đỡ em thực hiện các nghiên cứu của mình. Xin cảm ơn tới các anh, chị, các bạn sinh viên đang làm việc và học tập Bộ môn Công nghệ Sinh học – Vi sinh, đã giúp đỡ em nhiệt tình trong suốt quá trình làm đề tài này. Cuối cùng em xin đƣợc cảm ơn những ngƣời thân, bạn bè, đã quan tâm giúp đỡ em trong suốt thời gian qua. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2014 Sinh viên Đinh Thị Phƣơng LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các kết quả nghiên cứu, số liệu đƣợc trình bày trong khóa luận là trung thực và không trùng với công trình của tác giả khác. Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2014 Sinh viên Đinh Thị Phƣơng NHỮNG TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT CFU (Colony Forming Unit) Đơn vị hình thành khuẩn lạc VSV Vi sinh vật VK Vi khuẩn GRAS Generally Regarded As Safe DNS DiNitroSalycilic acid Da Dalton kDa Kilodalton OD Optical Density Cs Cộng sự G+ Gram dƣơng G- Gram âm VTM Vitamin w/v Khối lƣợng/thể tích STT Số thứ tự ĐC Đối chứng PTN Phòng thí nghiệm DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Các chỉ tiêu để lựa chọn VSV làm probiotics ......................................... 10 Bảng 3.2. Các mẫu phân lập vi khuẩn lactic ............................................................. 25 Bảng 3.3. Một số đặc điểm sinh học của 61 chủng vi khuẩn lactic phân lập đƣợc từ mật và sáp ong………………………………………………..............26 Bảng 3.4. Khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn lactic phân lập đƣợc với các chủng vi khuẩn kiểm định.................................................................. 31 Bảng 3.5. Một số đặc điểm hình thái, sinh lý của chủng LT31................................33 Bảng 3.6. Động thái sinh trƣởng của chủng LT31 ................................................... 36 Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của môi trƣờng tự nhiên đến sự sinh trƣởng và phát triển của chủng LT31........................................................................................ 41 Bảng 3.8. Khả năng sinh trƣởng của chủng LT31 trong các môi trƣờng MRS có bổ sung dịch chiết bắp cải ........................................................................ 42 DANH MỤC HÌNH Hình 2.1. Đồ thị chuẩn mối tƣơng quan giữa số lƣợng tế bào vi khuẩn/ml dịch nuôi và giá trị OD620 của chủng LT31 ................................................ ….18 Hình 2.2. Đồ thị chuẩn về mối tƣơng quan giữa hàm lƣợng glucose trong dung dịch và giá trị OD540 ................................................................................ 20 Hình 3.3. Hình thái khuẩn lạc của một số chủng vi khuẩn lactic phân lập đƣợc từ sáp và mật ong ...................................................................................... 30 Hình 3.4. Đặc điểm hình thái tế bào của các chủng vi khuẩn lactic phân lập đƣợc từ sáp và mật ong ...................................................................................... 30 Hình 3.5. Khả năng đối kháng với các chủng vi khuẩn kiểm định của một số chủng vi khuẩn lactic phân lập từ mật và sáp ong .................................... 32 Hình 3.6. Hình thái tế bào và hình thái khuẩn lạc của chủng LT31 ........................ 33 Hình 3.7. Hoạt tính catalase ...................................................................................... 34 Hình 3.8. Khả năng sinh khí của chủng LT31 .......................................................... 34 Hình 3.9. Khả năng quần tụ của chủng LT31 .......................................................... 35 Hình 3.10. Động thái sinh trƣởng của chủng LT31 .................................................. 37 Hình 3.11. Khả năng sống sót trong axit của chủng LT31 ....................................... 38 Hình 3.12. Khả năng sống sót trong mật lợn của chủng LT31 ................................. 39 Hình 3.13. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sự sinh trƣởng của chủng LT31 ................ 40 Hình 3.14. Ảnh hƣởng của pH đến sự sinh trƣởng của chủng LT31 ........................ 41 MỤC LỤC MỞ ĐẦU ……………………………………………………………………………1 1. Lí do chọn đề tài…………………………………………………………………..1 2. Mục đích nghiên cứu……………………………………………………………...1 3. Nội dung nghiên cứu……………………………………………………………...1 4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu………………………………………………...2 5. Phƣơng pháp nghiên cứu…………………………………………………..……...2 6. Những đóng góp mới của đề tài………………………………………………......2 7. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn…….…………………………………….………...2 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 3 1.1. Vi khuẩn lactic .....................................................................................................3 1.1.1. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn lactic .............................................................3 1.1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của vi khuẩn lactic .................................................4 1.1.3. Ảnh hƣởng của các yếu tố môi trƣờng đến khả năng sinh trƣởng của vi khuẩn lactic .......................................................................................................4 1.1.4. Trao đổi chất của vi khuẩn lactic ......................................................................5 1.1.5. Sự phân bố của vi khuẩn lactic .........................................................................6 1.2. Probiotics..............................................................................................................7 1.2.1. Định nghĩa probiotics ........................................................................................7 1.2.2. Các loại VSV đƣợc dùng làm chế phẩm probiotics ..........................................7 1.2.3. Tác dụng của probiotics .................................................................................... 9 1.2.4. Các chỉ tiêu để lựa chọn VSV làm probiotics .................................................10 1.2.5. Nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm probiotics................................................10 1.3. Sáp ong và mật ong ............................................................................................12 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 14 2.1. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu ...........................................................................14 2.1.1. Vi sinh vật .......................................................................................................14 2.1.2. Máy móc thiết bị .............................................................................................14 2.1.3. Hoá chất ..........................................................................................................14 2.1.4. Môi trƣờng ......................................................................................................15 2.1.4.1. Môi trƣờng phân lập, nuôi cấy, giữ giống và nghiên cứu các đặc tính của vi khuẩn lactic – Môi trƣờng MRS .............................................................. 15 2.1.4.2. Môi trƣờng nuôi cấy và giữ giống VSV kiểm định – MPA.........................15 2.1.4.3. Môi trƣờng thay thế nuôi cấy vi khuẩn lactic……………………………15 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu....................................................................................15 2.2.1. Phân lập vi khuẩn lactic từ mật và sáp ong ....................................................15 2.2.2. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có khả năng kháng khuẩn ..................16 2.2.2.1. Xác định hoạt tính kháng sinh bằng phƣơng pháp đặt khối thạch .............16 2.2.2.2. Xác định hoạt tính kháng sinh bằng phƣơng pháp đục lỗ thạch .................17 2.2.3. Xác định số lƣợng tế bào vi khuẩn .................................................................17 2.2.4. Xây dựng đồ thị chuẩn về mối tƣơng quan giữa số lƣợng tế bào vi khuẩn trong dịch nuôi cấy với giá trị OD620....................................................18 2.2.5. Nghiên cứu đặc điểm của chủng vi khuẩn lactic tuyển chọn ..........................19 2.2.5.1. Phát hiện hoạt tính catalase ..........................................................................19 2.2.5.2. Phát hiện khả năng sinh khí từ glucose ........................................................19 2.2.5.3. Xác định lƣợng đƣờng còn lại trong dịch nuôi cấy......................................19 2.2.5.4. Xác định khả năng quần tụ của chủng vi khuẩn lactic theo phƣơng pháp của Reniero và cộng sự (1992).....................................................................21 2.2.5.5. Kiểm tra khả năng đồng quần tụ với các chủng vi sinh vật kiểm định theo phƣơng pháp của Kmet và cộng sự (1995) ..........................................21 2.2.5.6. Xác định khả năng chịu axit của chủng nghiên cứu ....................................22 2.2.5.7. Xác định khả năng sinh trƣởng với mật lợn .................................................22 2.2.6. Nghiên cứu ảnh hƣởng của một số yếu tố môi trƣờng đến khả năng sinh trƣởng và phát triển của chủng vi khuẩn lactic nghiên cứu ....................23 2.2.6.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ ...............................................................................23 2.2.6.2. Ảnh hƣởng của độ pH ..................................................................................23 2.2.6.3. Ảnh hƣởng của các môi trƣờng tự nhiên .....................................................23 2.2.7. Bảo quản chủng giống vi khuẩn trong dung dịch 30% glycerol .....................24 2.2.8. Phƣơng pháp thống kê và xử lí kết quả ...........................................................24 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 25 3.1. Phân lập vi khuẩn lactic từ mật ong, sáp ong .....................................................25 3.2. Tuyển chọn vi khuẩn lactic có hoạt tính kháng khuẩn .......................................30 3.3. Một số đặc điểm hình thái, sinh lý của chủng LT31 ..........................................33 3.4. Một số đặc tính probiotics của chủng vi khuẩn lactic LT31 ..............................35 3.4.1. Khả năng quần tụ của chủng LT31 .................................................................35 3.4.2. Khả năng đồng quần tụ của chủng vi khuẩn lactic LT31 với các chủng vi khuẩn gây bệnh đƣờng ruột.........................................................................35 3.4.3. Động thái sinh trƣởng của chủng vi khuẩn lactic LT31..................................36 3.4.4. Khả năng sống sót trong pH axit của chủng vi khuẩn lactic LT31 ................37 3.4.5. Khả năng sống sót trong mật lợn của chủng vi khuẩn lactic LT31 ................38 3.5. Ảnh hƣởng của một số yếu tố môi trƣờng đến sinh trƣởng của chủng vi khuẩn lactic LT31 ..............................................................................................39 3.5.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ ..................................................................................40 3.5.2. Ảnh hƣởng của pH ..........................................................................................40 3.5.3. Ảnh hƣởng của môi trƣờng tự nhiên ...............................................................41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................... 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 44 MỞ ĐẦU 1. Lí do chọn đề tài Probiotics là chế phẩm vi sinh vật (VSV) sống, đƣợc bổ sung cho ngƣời và động vật nuôi để hỗ trợ việc tiêu hóa thức ăn và giảm rối loạn trong hệ đƣờng ruột. Bên cạnh đó, probiotics còn đƣợc biết đến với các công dụng nhƣ: đẩy mạnh sự tổng hợp vitamin B, cải thiện sự dung nạp lactose, cải thiện chức năng miễn dịch, ngăn chặn các chứng viêm nhiễm, giảm cholesterol, ức chế các vi khuẩn gây hại trong ruột. Do các công dụng hữu ích trên mà probiotics đƣợc quan tâm nghiên cứu trên khắp thế giới. Cho đến nay, rất nhiều nghiên cứu về probiotics đã và đang thu đƣợc những kết quả đáng kể trong thử nghiệm cũng nhƣ trong ứng dụng thực tiễn. Vi khuẩn lactic là một trong số những vi sinh vật đƣợc sử dụng phổ biến trong các chế phẩm probiotics đƣợc sử dụng cho cả ngƣời và các loài vật nuôi (lợn, gà, tôm, cua, cá,…). Mật và sáp ong từ lâu đã đƣợc nhân dân ta sử dụng nhƣ một bài thuốc dân gian để phòng trị nhiều bệnh, từ các bệnh đƣờng hô hấp đến các bệnh đƣờng tiêu hóa, nhiễm trùng da. Một số nhóm nghiên cứu trên thế giới cũng đã báo cáo những phát hiện về khu hệ VSV có ích trong tổ ong, sáp và mật ong. Từ thực tiễn nghiên cứu và ứng dụng của vi khuẩn lactic làm chế phẩm probiotics đã nêu trên, chúng tôi lựa chọn thực hiện đề tài: “Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu chủng vi khuẩn lactic có đặc tính probiotic từ mật và sáp ong” 2. Mục đích nghiên cứu Tuyển chọn đƣợc chủng vi khuẩn lactic có đặc tính probiotics từ mật và sáp ong. 3. Nội dung nghiên cứu 3.1. Phân lập các chủng vi khuẩn lactic từ mật ong và sáp ong. 3.2. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có khả năng kháng khuẩn. 3.3. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của chủng tuyển chọn. 3.4. Nghiên cứu một số đặc tính probiotics của chủng tuyển chọn. 3.5. Nghiên cứu ảnh hƣởng của một số yếu tố môi trƣờng tới sinh trƣởng của chủng vi khuẩn lactic. 1 4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu Các chủng vi khuẩn lactic từ mật và sáp ong thu đƣợc ở một số khu vực phía bắc Việt Nam. 5. Phƣơng pháp nghiên cứu 5.1. Phƣơng pháp vi sinh học: phân lập, tuyển chọn vi khuẩn lactic từ mật và sáp ong; các phƣơng pháp quan sát, nghiên cứu đặc điểm sinh học và xác định số lƣợng tế bào vi khuẩn trong môi trƣờng nuôi cấy; các phƣơng pháp nghiên cứu ảnh hƣởng của các yếu tố môi trƣờng và dinh dƣỡng tới sinh trƣởng và phát triển của VSV; các phƣơng pháp bảo quản chủng giống VSV. 5.2. Phƣơng pháp hóa sinh: xác định hàm lƣợng đƣờng sót, định lƣợng axit tổng số. 5.3. Phƣơng pháp toán xác xuất thống kê: xử lý các số liệu thu đƣợc bằng phần mềm Excel 2010, Word 2010. 6. Những đóng góp mới của đề tài Đây là những kết quả nghiên cứu đầu tiên khảo sát sự có mặt của một số chủng vi khuẩn lactic có đặc tính probiotics phân lập từ mật và sáp ong. 7. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 7.1. Ý nghĩa khoa học Đề tài đóng góp những hiểu biết về khu hệ vi khuẩn lactic trong mật và sáp ong, tiềm năng ứng dụng chúng trong các chế phẩm probiotics. 7.2. Ý nghĩa thực tiễn Tuyển chọn đƣợc chủng vi khuẩn lactic có đặc tính probiotics từ mật và sáp ong, bƣớc đầu góp phần làm đa dạng các sản phẩm probiotics cho ngành chăn nuôi gia súc, gia cầm và cả cho con ngƣời. 2 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Vi khuẩn lactic Nhóm vi khuẩn lactic đƣợc xác định bởi Orla Jensen (1919), bao gồm nhiều giống có đặc tính chung là lên men gluxit sinh năng lƣợng và tạo ra một lƣợng lớn axit lactic [5]. Từ lâu vi khuẩn lactic đã đƣợc sử dụng để chế biến các loại thức ăn nhƣ sữa chua, nem chua, dƣa và cà muối… Tuy nhiên, mãi đến năm 1780, một nhà hóa học ngƣời Thụy Điển mới tách đƣợc axit lactic từ sữa bò bị chua. Năm 1857, L.Paster đã chứng minh đƣợc sữa chua là kết quả hoạt động của một nhóm VSV đặc biệt (gọi là vi khuẩn lactic) trên sữa bò. Năm 1878, Lister là ngƣời đầu tiên phân lập thành công vi khuẩn lactic từ sữa chua và đặt tên là Bacterium lactis, nay gọi là Streptococus lactis. Từ đó đến nay, các nhà khoa học đã phát hiện rất nhiều loài vi khuẩn lactic khác nhau trong nhiều loại cơ chất, từ thực phẩm lên men chua đến các loại hoa quả tự nhiên và cả trên niêm mạc của ngƣời và động vật [3]. 1.1.1. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn lactic Căn cứ vào đặt điểm hình thái tế bào, ngƣời ta chia vi khuẩn lactic thành hai nhóm: Hình que và hình cầu.  Nhóm hình que có hình dạng tế bào thay đổi từ que ngắn (0.5 – 0.7 m) đến que dài (3 – 8 m). Các tế bào này có thể ở dạng đơn, đôi hay tạo thành chuỗi (ngắn, dài tùy loài). Thuộc về nhóm này là các loài thuộc chi Lactobacillus, Bifidobacterium.  Nhóm hình cầu có hình dạng tế bào biến đổi từ hình cầu đến hình ovan, đƣờng kính khoảng 0.5 – 1 m. Các tế bào cũng có thể ở dạng đơn, đôi, tạo tứ cầu hoặc tạo chuỗi ngắn hay chuỗi dài (tùy loài). Nhóm này gồm các loài thuộc chi Streptococcus, Pediococcus, Leuconostoc, Enterococcus [5]. 3 1.1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic là những vi khuẩn Gram dƣơng, nói chung là bất động, không sinh nội bào tử, catalaza và nitrate reductaza âm. Vi khuẩn lactic lactic là các vi khuẩn hoá dị dƣỡng hữu cơ. Khả năng sinh tổng hợp nhiều hợp chất cần cho sự sống của chúng rất yếu, cho nên, chúng là những VSV khuyết dƣỡng đối với nhiều axit amin, bazơ nucleic và vitamin… Vi khuẩn lactic không có khả năng tổng hợp các porphyrin (nhƣ Hem), bình thƣờng chúng không có cytocrom. Song, một số vi khuẩn lactic khi sinh trƣởng trên các môi trƣờng chứa máu có thể tạo thành các cytocrom và có thể tiến hành cả quá trình phosphoryl hoá trong chuỗi hô hấp. Khi bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy các porphyrin thì một số vi khuẩn lactic cũng có thể tổng hợp các sắc tố hemin tƣơng ứng [3]. Vi khuẩn lactic là những vi khuẩn kị khí tuỳ nghi hoặc vi hiếu khí, là loại vi sinh vật duy nhất có khả năng lên men lactic ngay cả ở trong điều kiện hiếu khí [5]. 1.1.3. Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến khả năng sinh trưởng của vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic cũng nhƣ các VSV nhân sơ khác, cấu tạo cơ thể của chúng chỉ gồm một tế bào nên hoạt động sống của chúng liên quan chặt chẽ với các điều kiện của môi trƣờng xung quanh. Một yếu tố môi trƣờng có thể tham gia vào quá trình sống của vi khuẩn lactic dƣới hình thức cản trở, ức chế hay tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình đó. * Ảnh hưởng của nhiệt độ Các chủng vi khuẩn lactic khác nhau có giới hạn về nhiệt độ khác nhau. Giới hạn nhiệt độ cho vi khuẩn lactic phát triển khá rộng, từ 5ºC – 55ºC, thƣờng hoạt động tốt nhất ở vùng nhiệt độ 15ºC – 40ºC. Nhóm ƣa ấm hoạt động thích hợp trong khoảng 20ºC – 40ºC, nhóm ƣa nhiệt thích hợp trong khoảng 40ºC – 45ºC. Tuy nhiên cũng có những chủng vi khuẩn lactic có khả năng chịu đƣợc nhiệt độ rất cao. Buchta K. (1983) tìm ra chủng L. bulgaricus có khả năng hoạt động tối ƣu ở nhiệt độ 45ºC – 62ºC [16]. 4 Giới hạn nhiệt độ cho vi khuẩn lactic sinh trƣởng, phát triển và lên men cũng là giới hạn nhiệt độ hoạt động của các enzyme nội bào. Chính vì thế mà trong phạm vi nhiệt độ thích hợp, nếu nhiệt độ càng tăng thì sự lên men lactic càng mạnh, thời gian lên men càng ngắn. * Ảnh hưởng của pH Độ pH ban đầu của môi trƣờng thích hợp cho lên men lactic là 5,8 – 7,3 (tùy loài). Trong quá trình lên men lactic, sự tích tụ các axit lactic trong giai đoạn đầu có tác dụng kích thích sinh trƣởng của vi khuẩn lactic và ức chế các VSV khác, nhƣng khi lƣợng axit lactic tiếp tục tăng sẽ làm cho pH của môi trƣờng giảm xuống đến pH 3 – 4, dẫn đến ức chế cả vi khuẩn lactic, làm giảm tốc độ sinh trƣởng, phát triển của chúng [3]. * Ảnh hưởng của nồng độ oxy Vi khuẩn lactic là những vi khuẩn kỵ khí tuỳ nghi và vi hiếu khí. Chúng thực hiện quá trình lên men lactic cả trong điều kiện vi hiếu khí cũng nhƣ kỵ khí. Trong quá trình lên men lactic, sự có mặt của oxy phân tử không gây độc với vi khuẩn nhƣng sự lên men diễn ra thuận lợi hơn trong điều kiện yếm khí. 1.1.4. Trao đổi chất của vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic có khả năng chuyển hóa kị khí đƣờng và tạo ra một lƣợng axit lactic lớn thông qua quá trình lên men lactic. Lên men lactic là quá trình chuyển hóa sinh hóa kị khí các hợp chất cacbonhydrat tạo năng lƣợng, axit lactic và một số sản phẩm khác với sự tham gia của nhóm vi khuẩn lactic [3], [5]. Tùy theo cách chuyển hóa các hợp chất cacbonhydrat mà quá trình lên men lactic có thể xảy ra theo phƣơng thức lên men đồng hình, lên men dị hình hoặc kết hợp cả hai phƣơng thức trên.  Lên men lactic đồng hình Khi lên men đồng hình, vi khuẩn lactic phân giải cacbonhydrat theo con đƣờng EMP (Embden – Meyerhof – Parnas) và cho sản phẩm chủ yếu là axit lactic (90 – 98%) [6], do đó lên men lactic đồng hình rất có ý nghĩa trong công nghiệp sản xuất axit lactic. Phƣơng trình phản ứng tổng quát của quá trình lên men lactic đồng hình: 5 C6H12O6 + 2 ADP + 2 Pv (glucose) Vi khuẩn lactic 2CH -CHOH-COOH + 2ATP 3 lactic (axit lactic) lên men đồng hình Đại diện của nhóm vi khuẩn lên men lactic đồng hình thƣờng gặp là: Lactococcus, lactis, Enterococcus faecalis, Lactobacillus acidophilus, L.plantarum, L.bulgaricus, Streptococcus thermophilus, S.cremoris, Sporolactobacillus inulinus, …  Lên men lactic dị hình Vi khuẩn lên men lactic dị hình do thiếu hai enzyme chủ yếu của con đƣờng EMP là aldolase và triozophosphate – izomerase nên giai đoạn đầu của quá trình phân giải glucose xảy ra theo con đƣờng PP (Pentose phosphate). Sau đó, quá trình chuyển hóa triozophosphate thành axit lactic xảy ra tƣơng tự nhƣ lên men đồng hình. Sản phẩm của quá trình lên men lactic dị hình ngoài axit lactic (khoảng 40%) còn có các sản phẩm khác nhƣ: axit axetic (10%), axit xuccinic và rƣợu ethylic (20%), còn lại là carbon dioxit (CO2). Sự hình thành CO2 trong quá trình lên men lactic là đặc điểm khác biệt dễ nhận biết nhất giữa lên men lactic dị hình và lên men lactic đồng hình. Phƣơng trình phản ứng tổng quát của quá trình lên men lactic dị hình đƣợc biểu diễn nhƣ sau: 2C6H12O6  Glucose 2C3H6O3 + C2H4O2 + C2H5OH + 2CO2 + H2O + Q Axit lactic Axit axetic Rƣợu ethylic Các vi khuẩn lactic lên men dị hình là: Leuconostoc mensenteroides, L.cremoris, Lactobacillus brevis, L. fermentum, L. viridescens, Bifidobacterium bifidum, Leuconostoc, Weissella …. 1.1.5. Sự phân bố của vi khuẩn lactic Các vi khuẩn lactic rất phổ biến trong tự nhiên. Chúng có trên bề mặt rau, củ, quả, thịt, cá, tôm, sữa …. ; trong đất, phân, rác, xác động vật, thực vật. Trên niêm mạc miệng, ruột của ngƣời, gia súc, gia cầm, ngƣời ta cũng phát hiện thấy sự có mặt của vi khuẩn lactic. Vi khuẩn lactic có mặt nhiều nhất trong các loại thức ăn ủ chua 6 nhƣ: sữa chua, rau quả muối chua, thịt, cá muối chua … Ngoài ra, cũng có một số loài vi khuẩn lactic sống ký sinh trên thực vật, hút các chất trong biểu mô cây [22]. 1.2. Probiotics 1.2.1. Định nghĩa probiotics Probiotic có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp bao gồm hai từ “pro” có nghĩa là dành cho và “biosis” có nghĩa là sự sống. Định nghĩa về probiotic đầu tiên đƣợc R.Fuller đƣa ra vào năm 1989. Theo ông, probiotics là thành phần của thức ăn có cấu tạo từ những VSV sống và có tác động hữu ích lên vật chủ qua việc làm cải thiện sự cân bằng hệ vi khuẩn đƣờng ruột của nó [17]. Ngày nay, probiotics đƣợc định nghĩa những VSV sống đƣợc bổ sung vào đƣờng tiêu hóa của ngƣời và động vật làm tăng sức khỏe con ngƣời và động vật nuôi thông qua việc cải thiện vân bằng của khu hệ VSV đƣờng ruột [17]. 1.2.2. Các loại VSV được dùng làm chế phẩm probiotics Các chế phẩm probiotics chứa một hoặc nhiều chủng VSV hữu ích. Thông thƣờng, chế phẩm này bao gồm một tổ hợp các chủng VSV có tính chất probiotics. Điều này giúp chế phẩm khi đƣợc áp dụng sẽ tác động một cách đồng đều đến hệ VSV của vật chủ tránh việc gia tăng đột biến một chủng VSV trong hệ tiêu hóa. Vi khuẩn lactic là nhóm VSV đƣợc dùng phổ biến trong các chế phẩm probiotics cho ngƣời và động vật nuôi bởi chúng đƣợc xem là nhóm vi sinh vật an toàn (GRAS), có khả năng tồn tại trong đƣờng ruột, có tác dụng phục hồi và cân bằng khu hệ vi sinh vật tự nhiên trong đƣờng ruột, khống chế các bệnh đƣờng ruột, làm tăng sức đề kháng cho vật nuôi. Một số vi khuẩn lactic đƣợc sử dụng để làm chế phẩm probiotics thƣơng mại gồm: Lactobacillus, Streptococcus, Bifidobacterium [17]. Vi khuẩn lactic đƣợc quan tâm nghiên cứu trong tạo chế phẩm probiotics là do chúng có đƣợc những ƣu điểm sau: (*) Có khả năng ngăn cản đƣợc bệnh tiêu chảy. Cơ chế chống tiêu chảy có thể đƣợc giải thích là do vi khuẩn laclic (1) tạo ra sự cân bằng cho khu hệ vi sinh vật đƣờng ruột. (2) cạnh tranh về dinh dƣỡng và nơi khu trú với các vi sinh vật gây bệnh. (3) tạo ra các sản phẩm trao đổi chất có tác dụng chống lại mầm bệnh. VD các 7 chủng L. casei, L. acidophilus, và L. bulgaricus có khả năng sản sinh ra các chất kháng khuẩn nhƣ acidophilin, bulgarican có tác dụng kìm hãm sự sinh trƣởng của vi sinh vật gây bệnh. (4) tăng cƣờng miễn dịch cho cơ thể vật nuôi, phòng chống đƣợc tiêu chảy. (**) Ngoài khả năng sinh axit lactic, làm giảm pH môi trƣờng, vi khuẩn lactic còn sinh nhiều loại chất kháng khuẩn khác: - Axit hữu cơ và ethanol: Các axit hữu cơ nhƣ axit lactic, axit formic, axit propionic…và ethanol là các sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn lactic. Các sản phẩm này có tác dụng làm giảm pH môi trƣờng đến mức có thể ức chế và tiêu diệt một số VSV gây bệnh. - Hydroperoxit (H2O2): Whater và cs (1951) đã chứng minh đƣợc Lactobacilus lactic có khả năng tạo ra H2O2 nên chúng kháng đƣợc Staphylococcus aureus.. - Diacetyl: có khả năng ức chế mạnh các vi khuẩn Gram âm, nấm mốc, đặc biêt là vi khuẩn gây bệnh lao (Micrococcus tubeculosis). - Bacteriocin: là các phân tử protein mang điện tích dƣơng, kích thƣớc nhỏ (gồm 30 – 60 axit amin), trung tính, có điểm đẳng điện cao, có khả năng ức chế và tiêu diệt hầu hết các vi khuẩn có quan hệ chủng loại gần với vi khuẩn sinh bacteriocin. Nhiều loài vi khuẩn lactic đƣợc phát hiện có khả năng sinh bacteriocin [14]. (***) Khả năng quần tụ là khả năng quần hợp giữa các tế bào do phản ứng giữa kháng thể và kháng nguyên làm kết tủa kháng nguyên. Khả năng quần tụ của vi khuẩn lactic là do yếu tố APF quyết định. APF (Aggregation Promoting Factor) là phân tử protein phức tạp, trọng lƣợng phân tử 32 kda, đƣợc sinh ra trong quá trình sinh trƣởng của các chủng vi khuẩn lactic. Chúng có thể liên kết các thành phần: axit lipoteichoic, axit teichoic của thành tế bào; làm thay đổi cấu trúc mạch bên α – D – Glucopyranosyl – (1,2) – D – Glucose, do đó thiết lập đƣợc cầu nối cho giữa các tế bào vi khuẩn, làm các tế bào gắn kết và quần tụ [23]. 8 Một số loài thuộc chi Bacillus cũng đƣợc phát hiện có tính chất probiotics và đƣợc ứng dụng làm chế phẩm probiotics. Đó là các loài B. subtilis và B.Coagulans[17], [21], [26]. Nguồn VSV làm probiotics rất đa dạng, đƣợc phân lập từ đất, nƣớc… nhƣng nguồn quan trọng nhất chính là từ hệ tiêu hóa của động vật nuôi, vì các VSV này thích nghi đƣợc với hệ tiêu hóa cũng nhƣ khu hệ VSV của vật chủ. 1.2.3. Tác dụng của probiotics Những ảnh hƣởng có lợi của probitics đã đƣợc Fuller cũng nhƣ Patterson và Burkholder (2003) tổng kết lại nhƣ sau [17], [21]:  Làm thay đổi cấu trúc quần thể VSV đƣờng ruột theo chiều hƣớng có lợi cho vật chủ.  Kích thích hệ thống miễn dịch và tăng cƣờng khả năng miễn dịch cho vật chủ.  Giảm phản ứng viêm.  Ngăn cản sự xâm nhập và ức chế sự phát triển của các vi sinh vật gây bệnh.  Tăng khả năng sản xuất axit béo bay hơi.  Tăng cƣờng quá trình tổng hợp các vitamin nhóm B.  Tăng hấp thụ chất khoáng.  Làm giảm cholesterol trong huyết thanh.  Giảm tỉ lệ còi cọc và làm tăng năng suất vật nuôi.  Giảm hàm lƣợng amoniac và ure trong chất thải.  Phòng bệnh tiêu chảy cho vật nuôi, làm giảm tỉ lệ nhiễm bệnh, rút ngắn thời gian bị bệnh, giảm tỉ lệ tái phát, giảm tỉ lệ chết… 9 1.2.4. Các chỉ tiêu để lựa chọn VSV làm probiotics Bảng 1.1. Các chỉ tiêu để lựa chọn VSV làm probiotics STT 1 Mục đích Chỉ tiêu lựa chọn Chịu đƣợc pH thấp Sống đƣợc khi đi qua dạ dày và tá tràng 2 Chịu đƣợc trong môi trƣờng có Sống đƣợc khi đi qua phần ruột non nồng độ axit mật cao phía trên 3 Sản sinh axit từ glucose và lactose Tiêu diệt vi khuẩn gậy bệnh ở phần ruột trên 4 Sản sinh ra các chất kháng khuẩn Cạnh tranh vị trí cƣ trú, dinh dƣỡng và tiệu diệt các vi khuẩn gậy bệnh 5 Bám đƣợc lên tế bào biểu mô của Chiếm hữu các vị trí khác, cƣ trú và ruột loại trừ các VSV khác ra khỏi vị trí bám 6 Chịu đƣợc nhiệt độ cao Sống đƣợc qua quá trình ép viên của máy sấy phun 7 Chịu đƣợc các chất kháng khuẩn Có thể dùng với thức ăn trị bệnh có có trong thức ăn 8 chất kháng sinh Dễ nuôi cấy, có khả năng tồn tại Tạo điều kiện cho chế phẩm bảo quản độc lập trong thời gian dài trong thời gian dài 9 Sinh ra các enzyme hoặc các sản Tăng hiệu suất tiêu hóa của vật nuôi phẩm cuối mà vật chủ có thể sử dụng đƣợc 10 An toàn không gây bệnh cho vật chủ Trên thực tế khó có chủng VSV nào đáp ứng đầy đủ các chỉ tiêu trên vì thế khi tuyển chọn phải dựa vào mục đích cụ thể. Cân nhắc các tính chất của chủng để thu đƣợc các chủng theo mục đích phù hợp [9], [21]. 1.2.5. Nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm probiotics  Trên thế giới Công trình nghiên cứu đầu tiên ứng dụng probiotics đƣợc tiến hành trên lợn do Pollman và cs công bố năm 1959 mang tên “Giá trị dinh dƣỡng và phòng trị bệnh của việc cấy những chủng vi khuẩn lactic vào lợn con”. Tiếp theo năm 1987, 10