Tài liệu Nghiên cứu ứng dụng nano kim loại ag và cu trong ức chế nấm penicillium digitatum và colletotrichum gloeosporioides gây bệnh trên quả cam tại hàm yên tuyên quang (citrus nobilis lour)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ------------***------------ Nguyễn Vũ Mai Linh NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG NANO KIM LOẠI AG VÀ CU TRONG ỨC CHẾ NẤM PENICILLIUM DIGITATUM VÀ COLLETOTRICHUM GLOEOSPORIOIDES GÂY BỆNH TRÊN QUẢ CAM TẠI HÀM YÊN - TUYÊN QUANG (CITRUS NOBILIS LOUR) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ------------***------------ Nguyễn Vũ Mai Linh NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG NANO KIM LOẠI AG VÀ CU TRONG ỨC CHẾ NẤM PENICILLIUM DIGITATUM VÀ COLLETOTRICHUM GLOEOSPORIOIDES GÂY BỆNH TRÊN QUẢ CAM TẠI HÀM YÊN - TUYÊN QUANG (CITRUS NOBILIS LOUR) Chuyên ngành: Khoa học Môi trƣờng Mã số: 8440301.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. Phan Thị Hồng Thảo PGS. TS. Nguyễn Kiều Băng Tâm Hà Nội - 2018 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới TS. Phan Thị Hồng Thảo và PGS.TS. Nguyễn Kiều Băng Tâm đã tận tâm hướng dẫn và truyền đạt kiến thức chuyên môn cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu đề tài. Xin cảm ơn nguồn kinh phí từ dự án Khoa học công nghệ trọng điểm cấp Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, mã số VAST.TĐ.NANO-NN/15-18, “Nghiên cứu ứng dụng Công nghệ nano trong nồng nghiệp” do PGS.TS. Nguyễn Hoài Châu làm chủ nhiệm. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Khoa Môi trường, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã dành mọi tâm huyết giảng dạy, trang bị kiến thức cho tôi trong suốt khóa học này. Tôi cũng xin cảm ơn tập thể nghiên cứu viên Phòng Vi sinh vật đất, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã luôn nhiệt tình cộng tác và giúp đỡ tôi để hoàn thành đề tài này. Cuối cùng, tôi xin được gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã luôn ở bên động viên, chia sẻ khó khăn giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận văn này. Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Học viên cao học Nguyễn Vũ Mai Linh MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ................................................................................3 DANH MỤC BẢNG ..................................................................................................4 DANH MỤC HÌNH ...................................................................................................5 MỞ ĐẦU ....................................................................................................................7 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN .....................................................................................9 1.1. Giới thiệu về giá trị của quả cam và vai trò của cây cam Hàm Yên – Tuyên Quang ............................................................................................................ 9 1.2. Các bệnh phổ biến trên quả cam sau thu hoạch........................................ 11 1.2.1. Bệnh mốc xanh do nấm Penicillium digitatum trên cam ............................ 12 1.2.2. Bệnh thán thư do Colletotrichum gloeosporioides gây ra ........................... 16 1.3. Các phƣơng pháp bảo quản trái cây sau thu hoạch.................................. 20 1.3.1. Phương pháp bảo quản hóa học................................................................... 20 1.3.2. Phương pháp bảo quản bằng các loại màng ............................................... 22 1.4. Công nghệ nano và tiềm năng ứng dụng của nano ................................... 22 1.4.1. Giới thiệu về công nghệ nano và tình hình nghiên cứu trên thế giới ........ 22 1.4.2. Tiềm năng ứng dụng của nano..................................................................... 24 1.4.3. Tình hình nghiên cứu nano trong nước ...................................................... 29 2.1. Hóa chất ......................................................................................................... 31 2.2. Vật liệu nghiên cứu....................................................................................... 31 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................. 32 2.3.1. Phân lập nấm từ cam bệnh ............................................................................32 2.3.2. Xác định đặc điểm nuôi cấy và phân loại nấm dựa trên phân tích trình tự gen ITS..................................................................................................................... 32 2.3.3. Khảo sát khả năng ức chế của nano kim loại đối với nấm ở giai đoạn bào tử .... .....................................................................................................................32 1 2.3.4. Khảo sát khả năng ức chế của nano kim loại đối với nấm ở giai đoạn sinh dưỡng .....................................................................................................................33 2.3.5. Xác định tác dụng của nano kim loại ở các nồng độ khác nhau lên nấm gây bệnh trên cam ....................................................................................................33 2.3.6. Đánh giá chất lượng của quả cam bảo quản sau xử lý nano ở quy mô phòng thí nghiệm .....................................................................................................34 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................35 3.1. Phân lập nấm Penicilium và Colletotrichum gây bệnh trên cam Hàm Yên Tuyên Quang .......................................................................................................... 35 3.1.1. Phân lập nấm Penicillium ............................................................................ 35 3.1.2. Phân lập nấm Colletotrichum ...................................................................... 36 3.2. Định danh nấm N8 và N11 dựa vào trình tự gen ITS.................................. 38 3.3. Khả năng ức chế của các nano kim loại Ag và Cu đến sự sinh trƣởng của nấm Penicillium digitatum N11 và Colletotrichum gloeosporioides N8 .............. 40 3.3.1. Giai đoạn bào tử ............................................................................................ 40 3.3.2. Giai đoạn sinh dưỡng.................................................................................... 46 3.4. Nghiên cứu ứng dụng nano trong hạn chế bệnh trên quả cam Hàm Yên Tuyên Quang trong lây nhiễm nhân tạo .............................................................. 54 3.5. Đánh giá chất lƣợng của quả cam sau xử lý nano bảo quản ở quy mô nhỏ .. ..................................................................................................................... 58 3.5.1. Ảnh hưởng của sử dụng nano đến tỷ lệ thối hỏng và mốc cuống quả cam58 3.5.2. Ảnh hưởng của sử dụng nano AgH đến chất lượng quả cam trong bảo quản ..................................................................................................................... 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................66 2 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ATP Adenosine triphosphate DNA Deoxyribonucleic acid FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations ITS Internal transcribed spacer MFC Minimum Fungicidal Concentration MIC Minimum Inhibitory Concentration PCR Polymerase Chain Reaction – phản ứng khuếch đại gen rDNA Ribosome Deoxyribonucleic Acid 3 DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Một số chất diệt nấm được sử dụng trong bảo quản quả sau thu hoạch --- 20 Bảng 2. Tính chất của các nano Ag và Cu sử dụng trong nghiên cứu --------------- 31 Bảng 3. Mức độ tương đồng của gen mã hóa vùng ITS của chủng nấm N11 với các chủng trên GenBank ------------------------------------------------------------------------- 39 Bảng 4. Mức độ tương đồng của gen mã hóa vùng ITS của chủng nấm N8 với các chủng trên GenBank ------------------------------------------------------------------------- 40 Bảng 5. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt (MFC) của nano kim loại Ag và Cu đối với bào tử nấm P. digitatum N11 ----------------------------------------- 41 Bảng 6. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và tiêu diệt (MFC) của các chất nghiên cứu đối với bào tử nấm C. gloeosporioides N8 ----------------------------------------------- 42 Bảng 7. Ảnh hưởng của nano kim loại đến khả năng phát triển của nấm N11 ----- 47 Bảng 8. Tỷ lệ cam bị bệnh trong điều kiện xâm nhiễm nấm N11 xử lý với nano AgH sau 5 ngày ------------------------------------------------------------------------------ 56 Bảng 9. Tỷ lệ cam bị bệnh trong điều kiện xâm nhiễm nấm N8 xử lý với nano AgH sau 5 ngày ------------------------------------------------------------------------------------- 57 Bảng 10. Ảnh hưởng của nano bạc đến tỷ lệ thối hỏng của quả cam ---------------- 59 Bảng 11. Chất lượng quả cam bảo quản với màng EC có bổ sung các nồng độ nano AgH khác nhau theo ngày ------------------------------------------------------------------ 61 4 DANH MỤC HÌNH Hình 1. Sản lượng cây có múi Việt Nam từ năm 1990 đến năm 2015 ....................10 Hình 2. Quả cam bị bệnh mốc xanh, hình thái nấm N11 trên môi trường Hansen, Czapek và cấu trúc sinh sản và bào tử nấm N11 ......................................................36 Hình 3. Cam bị bệnh thán thư ..................................................................................36 Hình 4. Hình thái khuẩn lạc nấm N8 nuôi cấy trên đĩa môi trường PDA sau 3 ngày và 2 tuần ....................................................................................................................37 Hình 5. Khuẩn lạc nấm N8 trên môi trường Czapek; cơ quan sinh bào tử và bào tử của nấm N8 ..............................................................................................................37 Hình 6. Điện di kiểm tra DNA tổng số và sản phẩm PCR khuếch đại vùng ITS của chủng nấm N11 và N8 trên gel agarose 1% .............................................................. 38 Hình 7. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của các nano kiểm tra với bào tử nấm N11với nano Cu , nano AgH, nano Ag và Carbendazim .........................................42 Hình 8. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) với bào tử nấm N8 với nano Cu, nano Ag, nano AgH và Carbendazim .......................................................................................43 Hình 9. Đánh giá mức độ tác động của nano với nấm N11 ở giai đoạn bào tử với nano Ag, nano Cu ......................................................................................................44 Hình 10. Ảnh hưởng của nano đến khả năng phát triển hình thành khuẩn lạc của nấm N8 ở giai đoạn bào tử với nano AgH, nano Ag, nano Cu ............................... 45 Hình 11. Hiệu quả ức chế nấm của nano Ag và nano Cu đối với nấm N11 sau 10 ngày ........................................................................................................................... 48 Hình 12. Hiệu quả ức chế nấm của các nano AgH đối với nấm N11 sau 3 ngày và 10 ngày ......................................................................................................................48 Hình 13. Hiệu quả ức chế nấm của Carbendazim đối với nấm N11 trong 10 ngày.49 Hình 14. Hiệu quả ức chế của nano Cu đối với C. gloeosporioides N8 sau 7 ngày 49 Hình 15. Hiệu quả ức chế của nano Ag đối với C. gloeosporioides N8 sau 7 ngày 50 Hình 16. Ảnh hưởng của nano đồng đến sinh trưởng của nấm N8 .......................... 50 Hình 17. Ảnh hưởng của bạc đồng đến sinh trưởng của nấm N8 ............................ 50 Hình 18. Hiệu quả ức chế của AgH đối với C. gloeosporioides N8 sau 7 ngày ......51 5 Hình 19. Ảnh hưởng của nano AgH đến sự phát triển của nấm N8......................... 51 Hình 20. Hiệu quả ức chế của Carbendazim với nấm N8 ........................................51 Hình 21. Cam Hàm Yên - Tuyên Quang được chuẩn bị cho thí nghiệm .................54 Hình 22. Hình ảnh cam lây nhiễm nấm bệnh trong in vitro đối với nấm N8...........55 Hình 23. Hình ảnh cam lây nhiễm nấm bệnh trong in vitro đối với nấm N11.........55 Hình 24. Hình ảnh cam lây nhiễm nấm bệnh trong in vitro xử lý với Anvil đối với nấm N11 và nấm N8 .................................................................................................55 Hình 25. Ảnh hưởng của nano bạc đến tỷ lệ mốc cuống của quả cam ....................60 Hình 26. Hình ảnh cam bảo quản theo ngày ở quy mô pilot ....................................64 6 MỞ ĐẦU Cam là một loại quả rất quan trọng, được Việt Nam định hướng là mặt hàng thương mại được chú trọng đầu tư đến năm 2030. Sau khi thu hoạch, quả cam thường được lưu trữ, bảo quản và phân phối. Tuy nhiên, hư hỏng do nấm gây bệnh thực vật là yếu tố chính hạn chế thời hạn sử dụng của trái cam, gây ra những thất thoát về cả số lượng và chất lượng của quả. Tăng thời gian bảo quản bằng cách hạn chế sự phát triển của vi sinh vật gây thối hỏng trên trái cây có thể giảm tổn thất kinh tế. Hiện nay, tại Việt Nam, thuốc bảo quản hóa học đang được sử dụng tràn lan và sự lạm dụng hóa chất đang gây ra những tác động tiêu cực đến môi trường cũng như sức khỏe con người. Sự kháng thuốc của các vi sinh vật ngày càng gia tăng, thiếu hụt các biện pháp thay thế thuốc diệt nấm hiệu quả đồng thời những lo ngại về sức khỏe do đặc tính gây ung thư của hóa chất là thách thức lớn trong lĩnh vực bảo quản thực phẩm. Thực tế này đặt ra yêu cầu cấp thiết cho sự tìm kiếm cách tiếp cận và các phương pháp khác an toàn hơn, thân thiện với môi trường để giảm tổn thất sau thu hoạch. Trong vài thập kỷ gần gây, vật liệu nano đã nhanh chóng chiếm vị trí quan trọng trong nhiều lĩnh vực khoa học và công nghệ do những đặc tính khác biệt của chúng so với vật liệu khối và khả năng ứng dụng chuyên sâu trong nhiều lĩnh vực khoa học. Trong những năm đầu tiên, việc áp dụng công nghệ nano trong sản xuất nông nghiệp chủ yếu được thực hiện qua các nghiên cứu trong phòng thí nghiệm, nhưng ngay sau đó nó đã bắt đầu và đang tiếp tục có ảnh hưởng đáng kể trong các ngành quan trọng. Các vật liệu nano cũng được chú trọng sử dụng trong lĩnh vực quản lý chất lượng nước và nông sản, đặc biệt là để bảo quản, đóng gói nông sản. Các ứng dụng trong tương lai hướng tới kéo dài thời hạn sử dụng, cải thiện chất lượng thực phẩm. Việc áp dụng công nghệ nano vào các ngành nông nghiệp và thực phẩm được đặt ra lần đầu tiên trong chương trình hành động của Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ vào tháng 9 năm 2003 và được dự đoán sẽ là công nghệ then chốt tạo ra thay đổi quan trọng trong các ngành này. 7 Vật liệu chứa nano kim loại kháng khuẩn, kháng nấm dùng trong đóng gói thực phẩm là một hình thức đầy hứa hẹn của “bao bì thực phẩm hoạt hóa”, đóng một vai trò quan trọng trong việc kéo dài thời gian sử dụng của thực phẩm và giảm nguy cơ gây bệnh. Xuất phát từ ý tưởng đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu ứng dụng nano kim loại Ag và Cu trong ức chế nấm Penicillium digitatum và Colletotrichum gloeosporioides gây bệnh trên quả cam tại Hàm Yên - Tuyên Quang (Citrus nobilis Lour)” nhằm ứng dụng và phát triển công nghệ nano trong hạn chế nấm bệnh thực vật điển hình trên quả cam, thay thế cho các loại hóa chất độc hại đang hiện hành, góp phần bảo vệ môi trường và sức khỏe con người.  Mục tiêu của luận văn: Nghiên cứu ứng dụng của chế phẩm nano để ức chế nấm gây bệnh mốc xanh và bệnh thán thư trên quả cam Hàm Yên- Tuyên Quang.  Ý nghĩa khoa học của luận văn: + Góp phần nghiên cứu phát triển thêm giải pháp hiệu quả theo hướng thân thiện với môi trường, thay thế cho biện pháp sử dụng hóa chất trong xử lý nấm gây thối hỏng quả cam sau thu hoạch  Nội dung nghiên cứu: + Phân lập và định danh được chủng nấm Penicillium sp. gây bệnh mốc xanh và Colletotrichum sp. bệnh thán thư trên quả cam Hàm Yên- Tuyên Quang. + Xác định được nano kim loại thích hợp để ức chế nấm Penicillium sp. và Colletotrichum sp. trên quả cam. + Xác định được nồng độ nano kim loại có khả năng ứng dụng trong bảo quản quả cam. + Đánh giá chất lượng quả cam khi được xử lý với nano sau thời gian bảo quản. 8 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về giá trị của quả cam và vai trò của cây cam Hàm Yên – Tuyên Quang  Giá trị của quả cam Cam là một loại quả rất quan trọng được con người sử dụng từ thời cổ đại, và hiện nay được trồng ở trên 100 nước trên thế giới. Quả cam là nguồn cung cấp dồi dào vitamin C - là hoạt chất có khả năng chống oxy hóa cao [18]. Trong 100 g cam có chứa hàm lượng dinh dưỡng cao: Calo (47 kcal), Kali (181 mg), Cacbohydrat (11,75 g), chất xơ (2,4 g), đường (9,35 g), protein (0,94 g ), vitamin A (225 IU ), vitamin C (53,2 mg), Canxi (40 mg ) [50]. 40 - 45% sản lượng cam của thế giới được tiêu thụ trong công nghiệp sản xuất nước ép. Brazil là nước sản xuất nước cam nhiều nhất thế giới, sau đó là Florida, Hoa Kỳ. Tinh dầu cam được chế biến bằng cách ép vỏ, nó được dùng làm gia vị trong thực phẩm và làm hương vị trong nước hoa. Tinh dầu từ quả cam chứa khoảng 90% D-Limonene, một dung môi có trong nhiều hóa chất dùng trong gia đình, cùng với dầu chanh dùng để làm chất tẩy dầu mỡ và tẩy rửa nói chung. Chất tẩy rửa từ tinh chất cam hiệu quả, thân thiện với môi trường, và ít độc hại hơn sản phẩm cất từ dầu mỏ, đồng thời có mùi dễ chịu hơn [54].  Vai trò của cây cam trên thế giới và tại Việt Nam Cây có múi là cây ăn quả quan trọng nhất trên thế giới, với tổng sản lượng vượt xa các cây rụng lá như táo, lê, đào và mận. Sản lượng trồng các loại cây có múi ở thế giới trong niên vụ 2014 - 2015 vào khoảng 130,947 triệu tấn, trong đó cam giữ vị trí dẫn đầu với 52,39%, thứ hai là quýt 29,25%, 11,83% chanh, và 6,53% bưởi. Tổng số sản lượng các loại trái cây có múi đã tăng lên trong những thập kỷ qua và đạt mức cao nhất là 131 triệu tấn trong năm 2014 [15]. Cam được trồng rộng rãi ở những nơi có khí hậu ấm áp, và vị cam có thể biến đổi từ ngọt đến chua. Khu vực Địa Trung Hải gồm các nước xuất khẩu trái cây tươi lớn nhất. Các nhà nhập khẩu lớn nhất là Đức, Pháp, Hà Lan và Anh. Hiện nay cam quýt được trồng ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, giới hạn bởi vĩ độ 40 Bắc, Nam tại hơn 9 137 quốc gia trên 6 lục địa và tạo ra khoảng 105 tỷ $ mỗi năm trên thị trường trái cây thế giới [19]. Theo số liệu về cây có múi năm 2014 và 2015 của FAO [15], tại Việt Nam, tổng sản lượng cây có múi năm 1990 đạt 109,2 nghìn tấn đã tăng lên 985,6 nghìn tấn năm 2015 và 998,7 nghìn tấn năm 2016. Trong đó, sản lượng cam đạt 520 nghìn tấn năm 2015 và luôn đóng vai trò quan trọng nhất trong sản lượng cây có múi. Trong quy hoạch phát triển cây nông nghiệp đến năm 2020 và tầm nhìn đến năm 2030 của Chính Phủ, cây cam, quýt được định hướng phát triển từ 61,5 nghìn ha năm 2010 mở rộng đến diện tích 115 nghìn ha và là quả thương mại được chú trọng đầu tư. Sản lƣợng cây có múi tại Việt Nam Sản lƣơng (Nghìn tấn) 998,7 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 109,2 100 0 Năm 1990 Năm 2015 Hình 1. Sản lượng cây có múi Việt Nam từ năm 1990 đến năm 2015 [15] Một số giống cam đặc sản ở Việt Nam bao gồm cam Sành Bố Hạ, cam Sành Hà Giang - Tuyên Quang - Yên Bái, Cam Xã Đoài, Cam Ham-Lin, Cam Sông Con, Cam Vân Du, Cam Bù Hà Tĩnh, Cam Canh [51]. 10  Cam Sành Hàm Yên-Tuyên Quang Tuyên Quang có tọa độ 21°46′38″B 105°13′42″Đ, là một tỉnh thuộc vùng Đông Bắc Việt Nam. Khu vực này có điều kiện tự nhiên - kinh tế xã hội thuận lợi để sản xuất một số sản phẩm nông nghiệp. Trong đó, cam Sành là giống cây địa phương đã được người dân ưu tiên khai thác từ lâu đời và đem lại nguồn thu nhập đáng kể cho người nông dân. Trên địa bàn huyện Hàm Yên, cam Sành được trồng ở 15 xã, thị trấn, trong đó có 9 xã, thị trấn nằm trong vùng được quy hoạch gồm: Yên Thuận, Yên Phú, Bạch Xa, Minh Khương, Minh Dân, Yên Lâm, Tân Thành, Phù Lưu và thị trấn Tân Yên. Trong mùa vụ 2015-2016, huyện Hàm Yên có 4037,9 ha cam Sành, năng suất trung bình trên 13 tấn / ha, sản lượng đạt 31,075 tấn quả; tổng thu nhập trên 310 tỷ đồng. Đặc biệt, năm 2013 cam Sành Hàm Yên đã được vinh danh và lọt vào Top 10 loại trái cây nổi tiếng bậc nhất Việt Nam. Xác định đây là loại cây trồng mũi nhọn trong phát triển kinh tế, huyện Hàm Yên sẽ ưu tiên phát triển, mở rộng diện tích vùng trồng cam trong những năm tiếp theo và đẩy mạnh thương hiệu cam Sành Hàm Yên [56]. 1.2. Các bệnh phổ biến trên quả cam sau thu hoạch Trái cây sau thu hái luôn có những biến đổi về vật lý, sinh lý và sinh hóa, gây ra những thất thoát về cả số lượng và chất lượng của quả. Các biến đổi này xảy ra có mối liên hệ chặt chẽ với nhau và phụ thuộc nhiều vào yếu tố như giống, điều kiện chăm sóc, độ chín, vận chuyển, kỹ thuật bảo quản... Trong đó, yếu tố vi sinh vật gây ra sự tổn thất đáng kể của trái cam sau thu hoạch. Tại Việt Nam, khí hậu nhiệt đới nóng ẩm quanh năm, nhiệt độ trên 20oC đến 35oC (hoặc cao hơn), và độ ẩm không khí thường xuyên trên 80 ÷ 90% nên rất thích hợp cho vi sinh vật phát triển. Do đó, trái cây dù ở dạng tươi hay dạng đã chế biến, thường bị các vi sinh vật, đặc biệt là nấm mốc gây hư hỏng, ảnh hưởng xấu đến chất lượng và giá trị thương phẩm của trái cây [2]. Hư hỏng sau thu hoạch do nhiễm nấm tiềm ẩn thông qua vết thương gây ra tổn thất lớn (25 ÷ 50%) và vẫn là một thách thức quan trọng trong sản xuất lương thực bền vững [39]. Tình trạng tổn thất sau thu hoạch của các loại trái cây có múi 11 nói chung và quả cam nói riêng bắt nguồn từ một trong hai giai đoạn phát triển của cây. Giai đoạn đầu là khoảng thời gian từ khi ra hoa đến khi quả chín. Giai đoạn thứ hai kéo dài trong suốt quá trình thu hoạch đến các hoạt động bảo quản. Nhiễm nấm thường tiềm ẩn trong quả trước khi thu hoạch, ngay tại các vườn trồng, trong quá trình thu hái và trong quá trình hoàn thiện sản phẩm: tại các nhà buôn, nhà phân phối, bán lẻ… nhưng tồn tại trong trạng thái nghỉ và hoạt động khi gặp các điều kiện thích hợp cho sự phát triển. Trong nhiều năm qua, Viện Bảo vệ thực vật đã điều tra phát hiện trên cây có múi tại Việt Nam có tới 19 loại bệnh do nấm, 2 loại bệnh do vi rút, 2 loại do bệnh vi khuẩn. Hiện nay, các vùng trồng cam quýt ở nước ta bị nhiễm các bệnh do nấm Phytophthora (bệnh chảy gôm), Capnodium citri (bệnh nấm muội đen), vi khuẩn Xanthomonas (bệnh loét) vv…, nấm Colletotrichum gloeosporioides (bệnh thán thư), nấm Lasiodiplodia theobromae (bệnh thối cuống), Penicillium digitatum (bệnh mốc xanh lá), P. intalicum (bệnh mốc xanh da trời)… [52]. Bệnh thán thư và bệnh mốc xanh là nguyên nhân chính gây thất thoát nặng nề sau thu hoạch cho trái cam tại Hàm Yên, Tuyên Quang. 1.2.1. Bệnh mốc xanh do nấm Penicillium digitatum trên cam Trong số các tác nhân gây bệnh từ vết thương, nấm mốc xanh lá (P.digitatum) và mốc xanh da trời (P. italicum) chính là nguyên nhân gây hư hỏng quả có múi trên toàn thế giới [31]. Các bào tử trong Penicillium chứa sắc tố màu xanh lá hoặc xanh da trời, đây là màu sắc đặc trưng của nấm khi phát triển và phát bệnh trên quả. Penicillium digitatum, nấm mốc màu xanh lá, được mô tả và phân loại bởi Saccardo năm 1886. Hiện nay, tên khoa học được chấp nhận là Penicillium digitatum (Pers: Fr.) Sacc. (MycoBank # 169.502). Theo cơ sở dữ liệu MycoBank, có ba tên đơn vị phân loại: P. digitatum var. californicum Thom (1930), P. digitatum var. digitatum, và P. digitatum var. latum S. Abe (1956). Các loài được xếp vào giới Nấm, ngành Ascomycota (nấm túi hay nấm nang), ngành phụ 12 Pezizomycotina, lớp Eurotiomycetes, lớp phụ Eurotiomycetidae, bộ Eurotiales, họ Trichocomaceae, và chi Penicillium [28]. Bề mặt khuẩn lạc có màu xanh lá và mặt dưới thường có màu vàng hoặc xanh. Kết cấu khuẩn lạc có lông tơ, không có giọt tiết. Các loại nấm có khả năng nảy mầm trong môi trường nhân tạo tại 5°C, không tăng trưởng ở 37°C. Bộ máy sinh bào tử rất dễ vỡ và có xu hướng phá vỡ thành nhiều tế bào. Bào tử sinh ra từ sợi nấm khí sinh, bề mặt bào tử đính trơn, có thành bao quanh, hình dạng thay đổi từ elip đến hình trụ, kích thước không đồng đều, trung bình là 3,5 ÷ 8,0 × 3,0 ÷ 4,0 mm. Nảy mầm bào tử là bước đầu tiên để nấm bệnh xâm nhiễm vào cây chủ [28]. Thiệt hại thực tế do tác động của Penicillium thay đổi phụ thuộc vào khí hậu và các yếu tố vườn cây ăn quả, giống quả, mức độ chấn thương vật lý quả trong thu hoạch, hiệu quả của phương pháp xử lý nấm, và môi trường sau thu hoạch [41]. Tại Tây Ban Nha, nghiên cứu của Tuset (1988) ước tính rằng quả thối hỏng do Penicillium spp. chiếm 55 ÷ 80% tổng số quả bị hư hỏng sau thu hoạch khi theo dõi trong suốt mùa vụ thương mại, và chiếm 30 ÷ 55% trong các phòng lưu trữ đóng gói quả trong nhà. Kiểm tra ở New York, quả có múi ở California và Florida bị nhiễm nấm mốc màu xanh lá và màu xanh da trời chiếm 30% các lô hàng kiểm tra [7]. Mốc xanh lá thường gây thiệt hại lớn hơn trong thương mại hóa bởi vì nó chiếm ưu thế ở nhiệt độ môi trường, nhưng mốc xanh da trời trở nên nghiêm trọng hơn khi trái cây có múi bảo quản ở nhiệt độ rất lạnh trong thời gian dài vì P. italicum phát triển nhanh hơn so với P. digitatum dưới 10°C [31]. Nhìn chung, tỷ lệ hư hỏng sau thu hoạch cao hơn trong trồng trọt tại những vùng có lượng mưa dồi dào, như Brazil, Florida hay Đông Nam Á. Mầm bệnh do nấm Penicillium spp. có ảnh hưởng rất lớn đến tất cả các khu vực này vì chúng sinh sản rất nhanh, bào tử của chúng có mặt khắp nơi trong bầu không khí, trên bề mặt trái cây và dễ dàng được phát tán bởi dòng không khí. Vì vậy, nguồn gốc nấm bệnh trong vườn cam quýt và khu bảo quản tồn tại trong suốt mùa vụ, và chính trái cây có thể bị lây nhiễm trong khu vườn, trong khu bảo quản, đóng gói, phân phối và tiếp thị. 13  Quá trình nhiễm bệnh của nấm Bệnh sau thu hoạch được chia thành hai nhóm dựa trên thời gian chiếm ưu thế nhiễm bệnh: nhiễm bệnh trước thu hoạch gây ra những mầm bệnh tiềm ẩn, và nhiễm bệnh sau thu hoạch do những mầm bệnh trên vết thương. Nấm mốc Penicillum gây bệnh theo cách thứ hai. Penicillium digitatum và P. italicum là nguyên nhân gây bệnh cho trái cây có múi chỉ thông qua nhiễm trùng vết thương vỏ. Thông thường, những vết thương được gây ra trong quá trình thu hoạch và xử lý trái cây trong nhà đóng gói hoặc trong quá trình thương mại hóa, nhưng một nấm bệnh có thể lây nhiễm trước khi thu hoạch thông qua chấn thương, vết nứt hay vết thương do côn trùng. Trong trường hợp này, nếu trái cây nhiễm bệnh một thời gian dài trước khi thu hoạch thường rụng xuống khỏi cây, nhưng trái cây bị nhiễm ít hơn 3 ngày trước khi thu hoạch không thể phát hiện được và có thể được thu hoạch như quả lành. Bào tử nấm từ hoa quả thối rữa trên mặt đất trong vườn cây ăn quả, trong bao bì ở các cơ sở lưu trữ, hoặc ở bất kỳ nơi nào trong quá trình vận chuyển và tiếp thị đang liên tục chuyển động bằng dòng không khí và có thể dễ dàng lây nhiễm trái cây xung quanh. Bệnh không phát tác nếu các trái cây có vỏ còn nguyên vẹn vì bào tử tự do nằm trên bề mặt vỏ không thể nảy mầm. Ngược lại, các bào tử nằm ở vết thương bị vỡ tuyến dầu của vỏ thường gây ra sự nhiễm bệnh chỉ trong vòng 48 giờ ở 20 ÷ 25°C. Bào tử của nấm Penicillium spp. nảy mầm bên trong vết thương vỏ và sự phát triển sợi nấm tiếp theo đòi hỏi nước, chất dinh dưỡng, điều kiện nhiệt độ và pH riêng [28]. Khi nhiễm P. digitatum thường chỉ nhìn thấy bằng mắt thường sau 3 ngày ở điều kiện nhiệt độ phòng. Một vòng tròn xung quanh các chỗ bị nhiễm trùng (vỏ vết thương) xuất hiện ướt nước, mềm và mất màu. Nấm sản xuất ra enzyme thủy phân, chủ yếu là polygalacturonase và cellulase làm mềm các mô vỏ, tạo điều kiện phát triển bệnh. Khi phát triển, sợi nấm khí sinh màu trắng phát triển tại trung tâm tổn thương và mở rộng tỏa tròn. Tùy thuộc vào mức độ của nguồn bệnh, bào tử bắt đầu hình thành sau 3 đến 5 ngày ở nhiệt độ phòng (15 ÷ 28°C), sau 7 đến 8 ngày, khu vực trung tâm của tổn thương có màu xanh lá được bao quanh bởi một dải rộng dày 14 đặc, trắng của những sợi nấm không hình thành bào tử, giới hạn ngoài là viền vỏ mục nát [28]. Chủng P. digitatum có thể thay đổi khả năng tấn công, nhưng không có báo cáo nào về những chủng phân lập bị biến đổi di truyền làm mất khả năng gây độc. Sự nhiễm bệnh rõ ràng và sự phát triển bệnh phụ thuộc vào số lượng bào tử của các chủng Penicillium để sự xâm nhiễm thành công qua vết thương ở vỏ. Các mối quan hệ giữa số lượng bào tử và tỷ lệ nhiễm thực tế là tuyến tính, với điều kiện là các trái cây nhạy cảm cao (không non) và nhiệt độ thích hợp cho nhiễm trùng (20 ÷ 25°C). Trong những điều kiện này, 50 và 500 bào tử của P. digitatum được cấy vào vết thương vỏ cam trên dẫn đến tỷ lệ nhiễm nấm màu xanh lá tương ứng là 10% và 65%. Mật độ cấy 106 bào tử / ml P. digitatum đã được đề nghị là mật độ thí nghiệm để thu được các các mức độ gây bệnh có thể chấp nhận được sau khi cấy nhân tạo vào quả có múi để đánh giá khả năng kiểm soát của phương pháp điều trị chống nấm sau thu hoạch. Nhiều báo cáo cho rằng Penicillium spp. thường kết hợp với một mầm bệnh quan trọng từ vết thương sau thu hoạch trên cam quýt, ví dụ như Geotrichum citri-aurantii (Ferraris) E.E. Butler - nguyên nhân gây ra bệnh thối chua [28]. Mốc xanh lá xuất hiện thường xuyên hơn trên trái cây giữ ở nhiệt độ phòng, vì nó phát triển nhanh hơn trong những điều kiện này. Các nghiên cứu in vitro khác nhau cho thấy P. italicum nảy mầm và lớn nhanh hơn so với P. digitatum ở nhiệt độ thấp và trong điều kiện khô hạn. Các nhiệt độ tối ưu cho sự nảy mầm và phát triển của cả hai loài là 25°C và chúng hoạt động trong khoảng 4 ÷ 30°C. Tuy nhiên, chúng đều không thể phát triển ở 37°C. Khi cam bảo quản ở nhiệt độ 4°C, triệu chứng mốc xanh lá có thể nhìn thấy sau 16 ngày. Ngược lại, P. digitatum lớn nhanh hơn ở nhiệt độ khác nhau trên 10°C. Về ảnh hưởng của pH, kết quả bởi Prusky et al. (2004) cho rằng P. digitatum và P. italicum tăng cường tính độc của chúng bằng cách axit hóa môi trường xung quanh vết thương trên vỏ cam quýt [28]. 15  Các yếu tố sau thu hoạch ảnh hưởng đến sự xâm nhiễm của nấm Cả P. digitatum và P. italicum là mầm bệnh gây hại trên vết thương sau khi thu hoạch. Sự xâm nhiễm vào trái non của các loại nấm rất hiếm khi phát triển thành bệnh do khả năng kháng bệnh tự nhiên của cây chủ được kích hoạt bằng hàng loạt cơ chế phức tạp. Tuy nhiên, còn có các yếu tố khác bên cạnh những điều kiện nội tại để mầm bệnh và cây chủ có thể ảnh hưởng đến sự xâm nhiễm hoặc phát triển bệnh. Các thông số quan trọng (nhiệt độ, mật độ cấy, vỏ trưởng thành và điều kiện…) có thể giải thích ảnh hưởng của các hoạt động xử lý trái cây thương mại như làm sạch, phân loại hoặc lưu trữ kho lạnh. Thu hoạch: mối quan hệ trực tiếp giữa mức độ của chấn thương vỏ và tỷ lệ nấm Penicillium đã được chứng minh. Do đó, việc xử lý trái cây khi thu hoạch cần rất cẩn thận để giảm thiểu việc trầy xước vỏ, tạo thương tổn, vết bầm tím, và chấn thương cơ học nói chung. Mặt khác, thu hoạch không nên thực hiện sau mưa hoặc khi nước tự do tồn tại trên bề mặt trái cây. Đây là những điều kiện thuận lợi cho sự hình thành bào tử mầm bệnh, và sự căng quá mức của vỏ làm cho nó dễ bị tổn thương cơ học và nhiễm trùng sau đó [28]. 1.2.2. Bệnh thán thư do Colletotrichum gloeosporioides gây ra Tên Colletotrichum gloeosporioides lần đầu tiên được đề xuất ở Penzig (1882) dưới tên Vermicularia gloeosporioides, loại mẫu được thu thập từ cây có múi ở Ý. C. gloeosporioides gây bệnh thán thư với nhiều loại cây trên toàn thế giới. Ảnh hưởng nghiêm trọng của C. gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc và bệnh thán thư gây ra cho sản phẩm rau quả hiện là mối đe dọa đối với nông nghiệp toàn cầu. Trong những khoản thua lỗ khi kinh doanh trái cây tươi và rau quả, hơn 50% gây ra bởi loài nấm Colletotrichum [6, 29]. Bệnh thán thư dễ bùng phát ở điều kiện ẩm ướt và ấm [53]. Các triệu chứng không xuất hiện trong suốt mùa vụ là nguyên nhân gây ra bệnh và dẫn đến thua lỗ đáng kể sau thu hoạch. Các tác nhân gây bệnh thán thư xâm nhiễm trước thu hoạch trong chùm hoa, trái cây, lá và thân của một loạt các loại cây ăn quả. Các loại nấm sản xuất các enzym (polygalacturonase và 16 pectatelyase) làm suy giảm thành tế bào thực vật và nguyên nhân thiệt hại kinh tế đáng kể [34]. Triệu chứng bệnh thán thư có đặc điểm điển hình là vết bệnh dạng đốm tròn hoặc bất kỳ, có viền xung quanh màu nâu đỏ đến nâu đen. Vết đốm có thể nứt, lõm sâu trên thân, quả. Phân loại nấm Colletotrichum lần đầu tiên được nghiên cứu bởi Corda (1837), lúc đó được gọi là Colletothrichum, sau đó cũng chính tác giả đã đổi lại tên gọi thành Colletotrichum và được mô tả có 11 loài. Theo ý kiến gần nhất của Baxter và cộng sự (1985), Colletotrichum được giới thiệu có 21 loài: C. coccodes, C. dematium, C. gloeosporioides, C. graminicola, C. falcatum và C. capsici… là những loài thường gây bệnh thán thư (anthracnose). Các loài Colletotrichum gây bệnh trên cây trồng tại một số vùng ở Việt Nam được xác định là C. acutatum (cao su); C. gloeosporioides (địa lan); C. acutatum (dâu tây); C. gloeosporioides (cà phê, cam, xoài); C. capsici (ớt) [1]. Nấm có thể sinh trưởng ở nhiệt độ 4oC nhưng nhiệt độ thích hợp nhất cho nấm phát triển là ở nhiệt độ 28 † 30°C và độ ẩm cao. Đặc biệt bào tử nấm thán thư có sức sống cao, có khả năng chịu đựng khô hạn, dễ dàng phát tán nhờ gió và côn trùng. Bào tử nảy mầm sau 6 † 12 giờ ở độ ẩm 98 † 100%. Bào tử phân sinh hình thành nhiều trên lá già trong giai đoạn khô có thể tồn tại vài tuần tới 60 ngày. Nấm gây bệnh tồn tại chủ yếu ở dạng sợi nấm và bào tử phân sinh trên tàn dư lá, thân cành, quả và hạt bị nhiễm bệnh. Vì vậy, tàn dư cây bị nhiễm bệnh và hạt giống cũng là những con đường truyền lan bệnh chủ yếu trong tự nhiên. Sợi nấm già đôi khi hình thành vách dày, màu nâu sậm, hình cầu hoặc không đều gọi là hậu bào tử, nó có thể ở tận cùng hoặc xen giữa sợi nấm và tồn tại trong thời gian dài, khi tách ra chúng cũng mọc mầm để hình thành sợi nấm mới [39]. Trên môi trường Hansen, tản nấm có màu trắng xám nhạt đến màu xám đậm. Ở một số mẫu phân lập sợi nấm kí sinh chỉ hình thành quả thể và quả thể hình thành trên khuẩn lạc non phổ biến hơn so với khuẩn lạc già. Phân loại các chủng Colletotrichum chủ yếu dựa vào đặc điểm khuẩn lạc, hình dạng, kích thước bào tử, lông gai và giác bám. Đĩa cành hình thành trên các bộ 17