Tài liệu Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm vi khuẩn lactic có hoạt tính sinh học và chế phẩm tỏi trong sản xuất

LỜI MỞ ĐẦU Sản phẩm thịt lờn men được biết đến từ lâu nhờ việc bổ sung muối và đường vào thịt để thu được một loại sản phẩm ăn ngon và giá trị dinh dưỡng cao. Thực tế việc bổ xung này tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển một vài loài vi sinh vật có sẵn trong sản phẩm để sinh ra một số chất làm cho sản phẩm có hương vị đặc biệt và có tác dụng bảo quản sản phẩm lõu bị hỏng. Ngày nay người ta đã biết rằng các đặc tớnh quý bỏu đó của sản phẩm là kết quả của quá trình lên men đường thành axit lactic, thực hiện bởi nhóm vi khuẩn lactic có trong hệ vi sinh vật tự nhiên của thịt. Các vi sinh vật này cũng có thể được đưa thêm vào thịt trong quá trình sản xuất.(chủng khởi động – starter cultures) Nem chua là sản phẩm thịt lên men lactic cổ truyền của người Việt Nam được rất nhiều người ưa thớch.Nem chua chế biến theo phương pháp truyền thống, cho chất lượng sản phẩm không ổn định do nhiều yếu tố như: phụ thuộc vào hệ vi sinh vật tự nhiên và trong thịt, chất lượng nguyên liệu thịt, điều kiện và qui mô sản xuất.Những yếu tố này rất khó kiểm soát trong điều kiện sản xuất thủ công, gây ra sự mất ổn định cho chất lượng sản phẩm. Đặc biệt thịt nguyên liệu do quá trình giết mổ vận chuyển thủ công nên sự nhiễm tạp các vi sinh vật không mong muốn là rất lớn vì vậy nguy cơ ô nhiễm các vi sinh vật gây bệnh là rất cao gây nguy hiểm cho sức khỏe con người. Xúc xích lên men là một trong những sản phẩm thịt lên men khá phổ biến trên thế giới.Tựy từng vùng, địa phương mà mỗi nơi có những sản phẩm đặc trưng rất nổi tiếng như: Chorozi (Tây Ba Nha), Salami (í) hay Summer (Mỹ). Trong số đó xúc xích lên men Summer là sản phẩm thịt lên men ở nhiệt độ cao, thời gian lên men ngắn rất giống với sản phẩm nem chua Việt Nam. Từ thực tế trên và với mong muốn phát triển sản phẩm mới cũng như làm ổn định, nâng cao chất lượng sản phẩm thịt lên men nên em đã chọn đề tài: “Nghiờn cứu ứng dụng chế phẩm vi khuẩn lactic có hoạt tính sinh học và chế phẩm tỏi trong sản xuất thịt lên men ( nem chua – xúc xích lên men)” Mục đích của đề tài: - Sử dụng chủng giống có đặc tính sinh học để định hướng quá trình lên men và nâng cao chất lượng của sản phẩm nem chua. - Sản xuất sản phẩm mới xúc xích lên men có sử dụng chủng giống có hoạt tính sinh học vào sản phẩm để định hướng quá trình lên men và đảm bảo chất lượng sản phẩm nhằm làm phong phú thêm nhóm sản phẩm này ở Việt Nam. Để thực hiện được những mục tiêu này, đề tài gồm nội dung nghiên cứu sau: 1. Nghiên cứu cơ chế kháng khuẩn của chủng vi khuẩn lactic sinh bacteroxin và chế phẩm tỏi trong môi trường thịt lên men. 2. Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm vi khuẩn lactic có hoạt tính sinh học và chế phẩm tỏi trong công nghệ sản xuất nem chua và đánh giá chất lượng sản phẩm. 3. Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm vi khuẩn lactic có hoạt tính sinh học vào công nghệ sản xuất xúc xích lên men Summer và đánh giá chất lượng sản phẩm. NỘI DUNG PHẦN I: TỔNG QUAN A.THỊT LÊN MEN (XÚC XÍCH LÊN MEN - NEM CHUA) I. Giới thiệu về thịt lên men 1 Thịt lên men [6][13] Lịch sử bảo quản thịt bằng lên men có từ hàng ngàn năm (lên men tự nhiên), theo Lucke (1985), sản phẩm xúc xích lên men truyền thống ở châu Âu xuất hiện từ thời La mã cổ đại. Theo Zeuthen (1995), thịt được bảo quản và lên men dựa trên vi khuẩn lactic tự nhiên trong thịt ( Lactic Acid Bacteria - LAB), một lượng nhỏ nitrat và một lượng lớn muối. Thịt lên men đã được chứng minh là tốt cho sức khoẻ vì chứa các thành phần dinh dưỡng có lợi như cung cấp hệ vi sinh vật có lợi probiotic và prebioic, tạo ra trạng thái cân bằng của hệ vi sinh vật đường ruột từ đó nâng cao khả năng chuyển hoá, tiêu hoá và ngăn ngừa bệnh tật của vật chủ. Là sản phẩm thịt có giá trị dinh dưỡng cao bởi tạo ra các sản phẩm chuyển hóa sau lên men dễ tiêu hóa, dễ hấp thụ. Là sản phẩm thịt có hương vị thơm ngon đặc trưng, truyền thống, làm phong phú sản phẩm từ thịt. a) Định nghĩa thịt lên men Đó là sản phẩm thu được từ quá trình lên men lactic một số đường có mặt trong hỗn hợp thịt do hệ vi sinh vật sẵn có trong thịt và môi trường hoặc được bổ sung từ bên ngoài vào, với sự có mặt của muối, các tác nhân bảo quản, và gia vị... b) Phân loại sản phẩm thịt lên men Các sản phẩm thịt lên men có ở rất nhiều nơi trên thế giới. Tuy nhiên, Châu Âu là nơi sản xuất và là thị trường tiêu thụ lớn nhất, theo ước tính có hơn một nghìn tấn xúc xích lên men được sản xuất ở châu Âu mỗi năm. Những nước sản xuất nhiều sản phẩm thịt lên men nhất là Đức, Italy, Tây Ban Nha và Pháp, ở đây 20 đến 40% những sản phẩm thịt chế biến có thể được xếp vào loại nhóm sản phẩm thịt lên men. Người Đức tiêu thụ nhiều xúc xích lên men nhất, trung bình cả nước là 5 kg/ người/ năm (Lucke). Riêng về xúc xích lên men bán khô thì lịch sử ra đời của nó ở Châu Âu và ở Đông Nam Á, Trung Quốc đều lâu đời như nhau, khoảng 2000 năm trước đây. Các sản phẩm thịt lên men được phân loại theo nhiều hình thức, có thể theo thành phần, cấu trúc như là xúc xích lên men, jăm bụng,… hay theo mức độ lên men như chín nhanh, chín vừa, chín chậm. Dựa vào hàm lượng nước, có thể chia xúc xích lên men thành các nhóm: - Nhóm có độ ẩm cao (moist) có độ ẩm lớn hơn 50%. - Nhóm bán khô (semi-dried) có độ ẩm 35-50%. - Nhóm sấy khô (dried) có độ ẩm 20-35%. Đại diện của nhóm thứ nhất là xúc xích Mettwurst và Teewurst ở Đức, Merguez Bắc Phi, Lebanon bologna ở Mỹ, Mortadella ở Nam Mỹ, Italy, Pháp. Đại diện của nhóm thứ hai là Summer sausage, Longaniza ở Pháp và Bồ Đào Nha, Laap ch’eung, Xun chan của Trung Quốc, Nham, Sai-krok-pries của Thái Lan. Đại diện của nhóm thứ ba là Chourisam của Ấn Độ, Bồ Đào Nha, Chorizo của Tây Ban Nha, Veneto salami của Úc, Pepperoni ở châu Âu, Bắc Mĩ, Úc,… 2.Nem chua Việt Nam Theo phân loại thì nem chua Việt Nam được xếp vào loại xúc xích lên men có độ ẩm cao, giống như nhóm sản phẩm ở vùng Đông Nam Á được bao gói trong lá chuối, thường lên men tự nhiên ( không cấy chủng ) và có nhiệt độ lên men cao 25-350C, thời gian lên men ngắn và không qua xử lý nhiệt nên thời hạn sử dụng ngắn. Hiện nay vẫn chưa có thống kê cụ thể về sản lượng tiêu thụ nem chua ở Việt Nam, nhưng với sự phát triển rộng khắp của các cơ sở sản xuất nem chua trong cả nước con số sẽ không phải là nhỏ. Ở miền Bắc có làng nghề Ước Lễ sản xuất nem chua nổi tiếng, miền Trung có nem Vinh, nem Thanh Hoá. Miền Nam đã xuất hiện nem chua sản xuất trên quy mô lớn hơn như Nem chua Năm Sao, Thiên Hương... Gia vị đưa vào nem chua cũng rất đa dạng và phong phú tuỳ theo khẩu vị người dân từng vùng. Nem chua ở miền Bắc không thể thiếu lá ổi, vị ngọt nhẹ và chua nhẹ, trong khi người dân miền Trung lại ưa thích nem chua có lá đinh lăng, miền Nam nem thường hơi ngọt và có vị rất cay. Các gia vị hay được đưa thêm vào nem chua ở cả ba vùng thường là tiêu, tỏi, ớt…trong đó ngoài tạo hương vị cho sản phẩm còn có vai trò khá quan trọng trong việc ức chế các tác nhân vi sinh vật gây hại trong sản phẩm do đặc thù là sản phẩm lên men tự nhiên. 3.Xúc xích lên men Summer (Mỹ) Là sản phẩm thịt lên men làm từ hỗn hợp thịt lợn, bò, mỡ và các loại gia vị. Loại xúc xích này có đặc điểm là lên men ở nhiệt độ cao và lên men nhanh gần giống với nem chua, phù hợp với khí hậu Việt Nam. Lên men có thể tự nhiên ở 35 – 370C trong thời gian vài ngày hoặc có cấy chủng giống. Các chủng cấy sử dụng cho loại này thường là Pedicoccus do có khả năng sinh axit cao và lên men phù hợp ở nhiệt độ cao. Khi lên men đạt độ pH nhất định (4.5 – 4.7) thì dừng quá trình lên men bằng cách đưa sản phẩm đi sấy hay hun khói ở nhiệt độ 70 – 75 0C trong khoảng 1h (tùy kích thước sản phẩm) để đạt 63 0C (trong vòng 20 – 30 phút). Sản phẩm sau đó được bảo quản lạnh 0 – 40C và được tiêu thụ. Sản phẩm có màu đỏ hồng, chắc thơm ngon đặc trưng. II Tính an toàn và nguy cơ không an toàn của sản phẩm thịt lên men và nem chua 1.Tính an toàn của sản phẩm thịt lên men Nem chua hay xúc xích lên men đều được xếp vào các loại sản phẩm ăn liền ( Ready-to-eat foods ) không qua xử lí nhiệt chính vì vậy yêu cầu về vệ sinh an toàn thực phẩm cần phải chú trọng. Do sản phẩm thịt lên men là một hệ thống gồm nhiều cấu tử rắn phức tạp với một hệ vi sinh vật vô cùng phong phú nên sự an toàn của sản phẩm thịt lên men chủ yếu phụ thuộc vào khả năng kháng khuẩn của chính sản phẩm đối với các loại vi sinh vật gây thối hỏng và cả nhưng loài gây bệnh cho con người. Những tác nhân chủ yếu có tính ngăn ngừa những mối nguy từ vi sinh vật của xúc xích là hàm lượng muối ăn, pH, và hàm lượng muối Nitrit trong sản phẩm. Trong khi muối ăn có tác động giảm hoạt độ của nước a w thì pH thấp ( pH = 4,0 – 5,1 ) của sản phẩm lại có tác động ngăn ngừa hoạt động của các vi sinh vật gây thối và cả những vi sinh vật gây bệnh. Muối nitrit dưới dạng NO2- có khả năng đi qua lớp màng ion trong thành tế bào vi khuẩn, vô hoạt các enzyme của chúng và do đó làm giảm sự phát triển của chúng ( Cook and Pierson, 1983; Pierson and Smooth, 1987). Trong ngày đầu lên men sự phát triển của quần thể vi sinh vật đã sử dụng hết lượng oxy trong nguyên liệu và làm giảm quá trình oxy hoá khử xảy ra trong sản phẩm, điều này làm tác động của muối nitrit càng thêm hiệu quả và ngăn ngừa sự phát triển của loài vi khuẩn hiếu khí gây thối hỏng ( Pseudomonas ) trong nguyên liệu ban đầu. Sau vài ngày lên men tiếp theo một lượng lớn vi khuẩn lactic sản xuất ra nhiều axit lactic làm pH sản phẩm giảm nhanh và pH giảm ngăn ngừa sự phát triển của các loài gây bệnh như Salmonella, Clostridium…Sự phát triển của bào tử Bacillus và Clostridium có thể được kiểm soát bởi pH thấp và hoạt độ nước thấp. Tuy nhiên, những yếu tố trên vẫn không ngăn ngừa được sự phát triển của Listeria monocytogenes ( Farber and Peterkin, 1991) và Escherichia coli O157: H7 ( Reed, 1995 ). [10] [14] [23] Sự hư hỏng của thịt lên men (xúc xích – nem chua) Thịt lên men, được coi là một nhúm cú sự ổn định cao. Điều này là do sự kết hợp của các yếu tố như: mức aw và hàm lượng ẩm thấp, gớa trị PH giảm, sự xuất hiện của các axit hữu cơ và nồng độ NaCl và NaNO 2 cao. Trong loại xúc xích có đường kính lớn khả năng ụxi hóa- khử thấp gây nhiều ức chế hơn đối với sự phát triển của các sinh vật gây thối hỏng hiếu khí trong khi đó quá trình đóng gói chân không hay trong điều kiện không khí thay đổi có tác động tương tự trong các sản phẩm được thái nhỏ trước khi đóng gói. Sự ổn định của các loại xúc xích lên men khác nhau thì khác nhau, chỳng cú vai trò quan trọng tương ứng với của các tác nhân ức chế khác nhau. Xúc xích lên men khô là ổn định nhất và mức aw là một trong những yếu tố quan trọng trước tiên. Trái lại loại xúc xích bỏn khụ, có thể nhân rộng có độ ổn định thấp nhất với hạn sử dụng ngắn và thường yêu cầu bảo quản lạnh trong thời gian bảo quản. Mức a w cao hơn có nghĩa là các yếu tố ức chế khác như giá trị pH thấp và nồng độ NO 2 thấp đó là nhân tố quan trọng hơn tương ứng trong loại xúc xích này. Trong các trường hợp, có tác động qua lại đáng kể giữa các tác nhân ức chế, nó làm tăng một cách rõ rệt hiệu lực tổng thể của toàn hệ thống. Ví dụ như sự giảm giá trị pH làm tăng mức aw tới hạn trong khi nitrite cũng ức chế mạnh hơn ở pH thấp. Axit lactic và acetic được thừa nhận là đóng vai trò quan trọng trong sự ổn định của xúc xích lên men nhưng ít nhất trong một số trường hợp hoạt tính ức chế vi sinh vật có hiệu quả của các loại axit này là có giới hạn. 2 Nguy cơ không an toàn của sản phẩm thịt lên men 2.1 Sự phát triển của S. aureus trong quá trình lên men Sự tạo thành enterotoxin bởi Staphylococcus aureus (S. aureus) là vấn đề chủ yếu trong quá trình sản xuất thịt lên men mặc dù sự kiểm soát quá trình lên men đã được cải tiến nhiều đã làm giảm rõ rệt phạm vi của các vấn đề đó trong những năm gần đây. S.aureus thường bị nhiễm từ thịt tươi mặc dù sự phát triển thường bị hạn chế thậm chí ở nhiệt độ bảo quản cao do sức ép cạnh tranh trong quần thể vi sinh vật có hại. Tuy nhiên S. aureus bị ức chế bởi hàm lượng NaCl và nitrite cao và nó được thúc đẩy tuyển chọn trong sự xuất hiện của các thành phần này nếu sự bắt đầu quá trình lên men bị trì hoãn. Sự phát triển và sự tạo thành enterotoxin xảy ra nhanh dưới các điều kiện này và trong khi bản thân các sinh vật bị chết, enterotoxin vẫn giữ lại trong các thời kỳ tiếp theo. Việc xác định chỉ tiêu vi sinh trong xúc xích lên men là phương pháp nhằm đảm bảo sự an toàn của xúc xích lên men, có gợi ý rằng sản phẩm nờn cú ít hơn 10 4 cfu/g S.aureus ngay sau quá trình lên men. 2.2 Sự sống sót của các mầm bệnh vi khuẩn Các loại thịt lên men là sản phẩm của thịt sống và sự vắng mặt của các mầm bệnh vi khuẩn là không thể đảm bảo được. Các điều kiện trong thịt thông thường không cho phép sự sinh sôi nảy nở nhưng sự sống sót có thể kéo dài. Salmonella góp phần gây độc cho thực phẩm đối với sự tiêu dùng salami ở Úc, Ý và hầu hết hiện nay là ở Anh, tại đó sản phẩm salami-snack có dính dáng tới. Sản phẩm đú cú thời gian chế biến rất ngắn và có thể thúc đẩy sự sống của Salmonella. Listeria monocytogens được phân lập từ thịt lên men và theo các lý lẽ của dịch tễ học thì sự tiêu dùng của salami được thừa nhận là nhân tố nguy hiểm đối với listeriosis ở Mỹ. Nói chung S. aureus được coi là gây nguy hiểm chỉ trong giai đoạn phát triển ở thời kỳ đầu của quá trình lên men, nhưng một sự bùng nổ về sự độc hại của thực phẩm được ghi lại mà trong đó sự phát triển và sự tạo thành enterotoxin xảy ra trong sản phẩm cuối. Thịt lên men có liên quan tới mức aw cao và có chứa nồng độ NaCl thấp tương đối và thành phần các tác nhân bảo quản. Kết quả là khả năng ổn định phụ thuộc nhiều vào giá trị pH thấp. Việc lạm dụng nhiệt độ trong quá trình bảo quản dẫn đến sự phát triển của nấm mốc và sự chuyển hóa lactate, mà điều này làm tăng giá trị pH tới một mức mà tại giá trị đó sự phát triển và sự sinh độc tố có thể xảy ra. 2.3 Sự tạo thành Mycotoxin ( độc tố nấm mốc) Nấm mốc sinh mycotoxin được phân lập cả trong loại xúc xích lên men được làm chín bởi mốc và cả trong loại bị nhiễm mốc. Một số nghiên cứu cho thấy rằng sự tạo thành mycotoxin bị ức chế bởi nhiệt độ bảo quản thấp, mức aw giảm và ở các sản phẩm có hun khói. Trái lại một số loài thuộc chủng Aspergillus cho thấy rằng nó sinh aflatoxin ở mức cao trong quá trình phát triển trên xúc xích lên men. Vai trò của các chủng khởi động cho thấy ở nhiệt độ thấp cả Lactobacillus và Pediococcus đều cho thấy khả năng ức chế sự tạo thành aflatoxin [9]. Việc lạm dụng nhiệt độ trong quá trình bảo quản dẫn đến sự phát triển của nấm mốc và sự chuyển hóa lactat, mà điều này làm tăng giá trị pH tới một mức mà tại giá trị đó sự phát triển và sự sinh độc tố có thể xảy ra. Các sản phẩm thịt nói chung và thịt lên men nói riêng là các cơ chất không thuận lợi đối với sự tạo thành mycotoxin thậm chí cả khi các sợi nấm phát triển ồ ạt. Đối với một số sự đánh giá, các tranh luận về khả năng nấm mốc sinh mycototoxin trong thịt lên men làm sao lãng sự quan tâm đến vấn đề quan trọng hơn có liên quan tới việc lựa chọn loại nấm mốc làm chín. Sự an toàn có thể được đảm bảo bằng việc cấy các chủng vào thịt lên men mà các chủng đó phải được biết đến là không sinh độc tố và sau đó là sự quan tâm tới liệu các chủng có bắt nguồn ngẫu nhiên có sinh mycotoxin hay không. Tương tự như thế, với các loại xúc xích được làm chớn khụng do mốc nên chú ý đảm bảo rằng các điều kiện trong quá trình bảo quản và vận chuyển như là để ngăn chặn sự phát triển của nấm mốc. 2.4 Sự tạo thành các amin sinh học (biogenic amines) Các loài thuộc chủng Lactobacillus góp phần sinh các amin sinh học như histamine và tyramine. Trong quá trình đề cacboxyl hóa cỏc aa, thành histidine và tyrosine. Sự xuất hiện của các amin sinh học với số lượng đáng kể có thể dẫn tới sự tăng lên tới hạn huyết áp, kèm theo đau đầu, đỏ mặt và có thể là phát ban. Trong một số trường hợp, các triệu chứng thoạt tiên là thuộc dạ dày- ruột, bao gồm đột nhiên nôn mửa và tiêu chảy kèm theo đau bụng. Sự bùng nổ được thừa nhận về bệnh do sự xuất hiện của các amin sinh học diễn ra sau khi sử dụng các loại rau muối (lên men) và pho mát đặc biệt là ở các sản phẩm khác nhau như pho mát Anh(stilton) và Thụy sĩ. Không có trường hợp xác thực nào kết hợp với việc tiêu thụ xúc xích lên men, nhưng sự phát triển về các triệu chứng như đau đầu và tiêu chảy thì có liên quan mật thiết với các amin sinh học. Tuy nhiên sự sáng tỏ này nên được xử lý cẩn thận vì hàm lượng nitrite cao có thể gây nên các tác động tương tự đối với cảm nhận của người tiêu dùng để tránh nhầm lẫn. Các nhân tố ảnh hưởng tới sự tạo thành histamine trong sản phẩm Mettwurst đã được nghiên cứu tỷ mỷ. Sự tạo thành histidine xảy ra mạnh trong 2 tuần đầu của giai đoạn chín,cần phải có mặt với số lượng lớn các vi khuẩn đề cacboxyl hóa tạo histidine và mức độ histidine cũng phải cao hơn đáng kể so với chỉ tiêu. Với mức độ như vậy được kết hợp với sự bảo quản thịt chưa được chế biến ở nhiệt độ cao và/hoặc đối với thời kỳ vượt quá mức, việc bảo vệ chống lại đáng kể sự tạo thành amin sinh học đạt được bởi việc sử dụng loại thịt có chất lượng tốt làm nguyên liệu sống và bằng việc sử dụng các chủng khởi động mà chúng không có hoạt tính decarboxyl hóa aa. III. Một số chỉ tiêu về vi sinh vật đối với sản phẩm thịt lên men ( nhóm sản phẩm ăn ngay ).[1] Theo tiêu chuẩn của Food Safety Standard of Australia & New Zealand: Bảng 1.1: Giới hạn cho phép chỉ tiêu vi sinh vật đối với sản phẩm thịt lên men theo tiêu chuẩn Food Safety Standard of Australia & New Zealand. Các chủng gây Chất lượng Chấp bệnh Staphylococci Clostridium nhận Không tốt Tiềm tốt <102 <102 được 102 – 103 102 – 103 4 10 - 10 103 - 104 nguy > 104 > 104 perfringens Bacillus cereus và <102 102 – 103 103 - 104 > 104 < 3 – 102 102 – 104 >104 3 ẩn mối một số gây bệnh thuộc họ Bacillus Vibrio <3 parahaemolyticus Salmonella spp Không có Phát hiện ra Campylobacter trong 25 g Không có Phát hiện ra spp Listeria trong 25 g Không có > 102 monocytogenes trong 25 g Bảng 1.2 Giới hạn cho phép chỉ tiêu vi sinh vật đối với sản phẩm ăn liền (Salami và xúc xích lên men) của Ireland Tiêu chuẩn Tổng số khuẩn lạc hiếu khí ( 300C/48h) Chất lượng vi sinh vật ( CFU/g) (a) Đạt tiêu Chấp Không tốt Tiềm ẩn mối chuẩn nhận (b) nguy(c) N/A 103-<104 ≥104 N/A Nhóm vi sinh vật chỉ thị Enterobacteriaceae <100 100-<104 ≥104 N/A <20 20-<100 ≥ 100 N/A Listeria spp Nhóm gây bệnh Salmonella spp <20 Không có/25g 20-<100 ≥ 100 N/A Có trong 25g Campylobacter spp Không có/25g Escherichia coli E.coli O157 và nhóm có độc tố khác Vibro cholerae Có trong 25g Không có/25g Có trong 25g Không có/25g Không có/25g Vibro parahaemolyticus) <20 20-<100 L.monocytogenes Staphylococcus aureus Clostridium perfringens Bacillus cereus và các nhóm gây bệnh Bacillus spp <20 <20 <20 < 103 100-<103 ≥103 20-<100 20-<100 20-<100 N/A 100-<104 100-<104 ≥ 100 ≥104 ≥104 103 -<104 104-<105 ≥105 Ghi chú N/A : (không được phép) Họ Enterobacteriaceae bao gồm nhiều loại vi khuẩn tìm thấy trong hệ đường ruột của con người và động vật kể cả những loài gây bệnh như Salmonella và Shigella. Các loài thuộc Enterobacteriaceae là những chỉ thị hữu dụng nhằm chỉ ra tình trạng nhiễm khuẩn trong quá trình chế biến. Một lượng > 104 / g sản phẩm có mặt trong sản phẩm là không chấp nhận được đối với loại sản phẩm ăn liền như xúc xích lên men. Escherichia coli. Sự có mặt của E. coli trong các sản phẩm ăn liền là không thể chấp nhận được bởi nó chỉ ra tình trạng vệ sinh nghèo nàn và dễ dàng có những sự nhiễm khuẩn khác. Sản phẩm ăn liền nờn cú lượng số E. coli là < 3 và số tế bào E. coli > 100 /g là không thể chấp nhận được. Salmonella được báo cáo là gây độc đối với sự tiêu dùng salami ở Úc, Ý và hầu hết hiện nay là ở Anh, nhiều nhất là sản phẩm salami-snack, một loại sản phẩm có thời gian chế biến rất ngắn. Tuy nhiên trong các trường hợp, Samonella không có khả năng phát triển trong xúc xích lên men nếu sự nhiễm tạp của nó thấp. Trong các dạng salami được sản xuất ở Úc, sự axit hóa bởi các chủng khởi động có ảnh hưởng một cách rõ rệt hơn đối với Salmonella so với sự axit hóa bởi glucono-δ-lactone. Ở Việt Nam hiện chưa có tiêu chuẩn cụ thể cho loại sản phẩm này, do đó chúng tôi tham khảo một số tiêu chuẩn trên để đánh giỏ chất lượng sản phẩm nem chua và xúc xích lên men. B.ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM VI KHUẨN LACTIC Cể HOẠT TÍNH SINH HỌCVÀCHẾ PHẨM TỎI TRONG SẢN PHẨM THỊT LÊN MEN. I. Sự lên men tự nhiên Trong một số trường hợp, các quá trình lên men tự nhiên phụ thuộc hoàn toàn vào sự có mặt của LAB trong thịt tươi. LAB xuất hiện trong thịt là điều bất biến nhưng ban đầu với số lượng thấp, trừ khi thịt được bảo quản một thời gian trong cỏc tỳi chân không. Sự lựa chọn các điều kiện ban đầu ngăn cản quần thể vi sinh vật gram âm nổi trội trong thịt và các vi khuẩn sinh hương gram dương bao gồm Micrococcus và các loài Staphylococcus coagulase dương và âm, cũng như các loại LAB. Người ta chứng minh rằng quá trình lên men theo thứ tự bất đầu là các loài Enterobacteriaceae, tiếp theo là Enterococcus và cuối cùng là Lactobacillus và Pediococcus.Ở những loại xúc xích có bổ sung nitrate mà không có mặt của nitrite thỡ cỏc loại vi khuẩn có thể phát triển rộng hơn và điều này làm cải thiện chất lượng của xúc xích lên men khô một cách rõ rệt. Với những loại xúc xích được lên men theo đúng công nghệ thì LAB phát triển nhanh và đạt mức 10 6 −10 8 cfu/g sau 2-5 ngày lên men. Sự giảm giá trị pH tương ứng làm cho chủng Pseudomonas và các loại cầu khuẩn gram âm nhạy cảm với axit khác bị tiêu diệt trong vòng 2-3 ngày, mặc dù có nhiều loài có thể chống chịu axit hơn như Salmonella, có thể tồn tại trong thời kỳ kéo dài. Số lượng LAB có xu hướng giảm sau khi đạt được cực đại, mặc dù trong các loại xúc xích được chín bởi nấm mốc thì thời kỳ thứ hai của quá trình sinh trưởng thường diễn ra khoảng sau 15 ngày trùng với sự tăng giá trị pH do sự chuyển hóa lactate. Sự trì hoãn quá trình lên men lactic ban đầu và sự giảm chậm giá trị pH tạo thuận lợi cho sự phát triển của S. aureus và có thể sinh enterotoxin. Lượng mùi hương thấp cũng có thể do sự phát triển của các vi sinh vật không mong muốn. Các loài thuộc chủng Lactobacillus là các LAB nổi trội trong quá trình lên men xúc xích tự nhiên. Các loài xuất hiện phổ biến nhất là Lb. bavaricus, Lb. curvatus, Lb. farciminis, Lb. plantarum và Lb. sake. Lb. sake có thể là loài đóng vai trò quan trọng nhất, tiếp đó là Lb. curvatus. Các loài không mong muốn như loài Lb. viridescens sinh H2O2, cũng có thể xuất hiện với số lượng rõ rệt. Pediococcus xếp thứ 2 sau chủng Lactobacillus, nó nổi trội hơn về số lượng trong quá trình lên men. Các loài Pd. damnosus, Pd. acidilactici và Pd. pentasacceous đều đóng vai trò quan trọng. Lactococcus và Leuconostoc thường chỉ xuất hiện với số lượng nhỏ, mặc dù chủng Leuconostoc với số lượng lớn thường đi kèm với các loại xúc xích kém chất lượng. II. Sự lên men thịt có cấy chủng khởi đầu (starter culture)[22] 1. Nhóm vi sinh vật hay sử dụng làm chủng giống trong sản xuất thịt lên men Để định hướng quá trình lên men và nâng cao chất lượng của nhóm sản phẩm thịt lên men trên thế giới việc lựa chọn và sử dụng các chủng cấy vi sinh vật có lợi vào công nghệ sản xuất thịt lên men đã được thực hiện từ rất lâu. Các chế phẩm vi sinh vật thương mại được bán rộng rãi trên cơ sở cỏc nhúm vi sinh vật như sau: Vi khuẩn: - Các chủng LAB được sử dụng phổ biến: Lactobacillus ( Lb. plantarum, Lb. curvatus, Lb. rhamnosus, Lb. sakei…); Pediococcus (P. pentosaceus); Lactococcus lactis. - Micrococcaceae ( Micrococcus varians). - Staphylococci ( Staphylococcus carnosus, S. .xylosus ) Nấm men: Debaryomyces hansenii, Candida famata Nấm mốc: Penicillium nalgiovense, P. chrysogenum, P. camemberi Các chủng LAB được lựa chọn làm chủng khởi động trong xúc xích lên men phải đáp ứng một số các tiêu chuẩn như sau : - Phải có khả năng cạnh tranh hiệu quả đối với các LAB bản thể. - Phải sinh axit lactic với số lượng đầy đủ. - Phải có khả năng chống chịu NaCl và có thể phát triển ở nồng độ muối cao ( có thể là 6% ). - Phải có khả năng chống chịu được NaNO 2 và có thể phát triển ở nồng độ ít nhất là 100mg/kg. - Phải có khả năng phát triển trong khoảng nhiệt độ 15-40°C, tối ưu ở 30-37°C. - Phải là chủng lên men đồng hình. - Phải không phân giải protein ( must not be proteolytic ). - Phải không sinh H2 O2 với số lượng lớn. - Nờn có catalase dương - Nên có khả năng phân giải nitrate - Nên có khả năng tăng cường hương cho xúc xích thành phẩm - Nên không có khả năng sinh các amin biogenic - Nờn không sinh nhày nhớt - Nên có khả năng đối kháng với các vi sinh vật gây hư hỏng và các vi sinh vật không mong muốn. - Nên có khả năng chống chịu hoặc kết hợp với các chủng khởi động khác. Sử dụng các chủng vi khuẩn lactic thuần khiết nhằm mục đích:  Rút ngắn thời gian lên men  Tăng tốc độ cho quá trình làm chín  Loại bỏ những nguy hiểm do các vi sinh vật khác.  Loại các vi sinh vật không mong muốn và các vi sinh vật gõybệnh. bệnh.  Tăng chất lượng sản phẩm.  Làm sản phẩm ổn định và bảo quản tốt hơn.  Góp phần đưa lại hương vị đặc trưng 2. Vi khuẩn lactic sinh bacterioxin ứng dụng trong sản xuất thịt lên men Cơ chế kháng khuẩn hay cạnh tranh môi trường của LAB là do gây ra sự nhiễu vi sinh vật đối với các vi khuẩn gây hỏng và gây bệnh thông qua một số cơ chế như cạnh tranh oxi và dưỡng chất, cạnh tranh vị trí tấn cụng/bám dính và sản sinh ra một loạt các chất ức chế: axit lactic, axetic, acetaldehit, diacetyl, hydroperoxit, reuterin… và bacterioxin. Trong đó bacterioxin một thành phần kháng khuẩn có bản chất protein chỉ được sinh ra bởi một số loài. Nhiều loại bacterioxin có phổ kháng khuẩn khá rộng đặc biệt là có khả năng kháng được các vi sinh vật gây bệnh, sinh độc tố. Do có bản chất là protein nên rất dễ bị phân huỷ bởi proteaza trong hệ thống tiêu hóa, do vậy hiện nay trên thế giới nó được quan tâm đặc biệt nhằm ứng dụng trong chế biến và bảo quản thực phẩm. Bacterioxin là các polipeptit có tính kháng khuẩn được sản sinh trên ribosome hoặc các protein có tác dụng kháng khuẩn khi ở dạng thành thục, chống lại một phổ hẹp các loài vi khuẩn họ hàng gần gũi (Jack và cộng sự, 1995). Tuỳ thuộc vào bản chất protein của mình mà bacteriocin có thể bị vô hoạt bởi các proteaza trong đường ruột. Phần lớn các bacterioxin đã biết cho đến nay là các phân tử cation có tới 60 phần tử axit amin và bền nhiệt. Bacterioxin do vi khuẩn lactic sinh ra là các phân tử protein hay peptit mang điện tích dương, kích thước nhỏ (gồm 30-60 axit amin), có điểm đẳng điện cao và có khả năng ức chế các vi khuẩn có quan hệ gần với vi khuẩn sinh ra bacterioxin đó. Nhiều chủng vi khuẩn lactic sản sinh bacterioxin là: Latococcus sub. lactic (nisin), L. acidophilus (lactacinB,F), L. brevis, L. casei, L. carnis, L. delbrueckii, L. fermenti, L. gasseri, L. helveticus, L. plantarum… 2.1. Bacterioxin của vi khuẩn lactic [11] Theo hệ thống do Klaenhammer công bố, các bacterioxin được chia thành 4 nhóm như sau: a- Nhóm I: Nhóm lantibiotic gồm các bacterioxin có phân tử lượng nhỏ hơn 5 kDa, có chứa các axit amin dị thường lanthionin, tiêu biểu là nisin, lactixin 481, carnoxin U149 và lactoxin S. Chúng là các peptit nhỏ, phân biệt với các bacteriocin khác nhờ các thành phần axit dehydroamino và axit amin thioeter của chúng. b- Nhóm II: Nhóm bacterioxin có phân tử lượng nhỏ hơn 10 kDa, bền nhiệt nhưng không chứa lanthionin (<10KDa), được chia thành 3 phân nhóm trên cơ sở hoặc là trật tự khác biệt của đầu amin của chuỗi mạch, sự tạo thành các lỗ bicomponent của chúng, hoặc là sự có mặt của nhóm chức sulfhydryl. Nhóm bacteriocin II được chia nhỏ thành 3 phân nhóm khác nhau. Nhóm IIa gồm các bacteriocin là các peptit đơn bao gồm nhóm giống Pediocin ức chế Listeria; Nhóm IIb là các bacteriocin có các peptit đôi tiêu biểu là Lactococxin G, lactococxin M và lactixin F và nhóm IIc là các bacteriocin được tiết ra phụ thuộc thứ cấp (Von Heijne, 1986, 1988) Lactococin B. c- Nhóm III: Nhóm bacterioxin có phân tử lượng lớn hơn 30 kDa, không bền nhiệt. Nó bao gồm nhiều enzim ngoại bào có tính kháng khuẩn (hemolisins và muramidases) mà có thể bắt chước hoạt động sinh lý của bacteriocin bền nhiệt, tiêu biểu là helvetixin J, helvetixin V-1829, acidophilucin A, lactticin A và B. Nhóm này bao gồm cả các enzim ngoại bào làm tan vi khuẩn. Bảng 2.1: Đặc điểm của bacterioxin của vi khuẩn lactic (theo Vuyst và Vandamme, 1993) Bacteriocin Vật sản xuất Nhóm I: Lantibiotics Nisin (A và Z) Lactococcus lastic Trường Số lượng Ức Vị trí axit amin chế* Rộng 34 Transposon Lacticin 481 Lactocin S Carnocin U149 Lactococcus lastic Rộng 27 Plasmit Lactobacillus sake Rộng 37 Plasmit Carnobacterium Rộng 35-37 Chưa biết piscicola Nhóm II: Non-lantibiotic, nhỏ, bền nhiệt Diplococcin Lactococcus lastic Hẹp 51 Plasmit Lactococcin A Lactococcus lastic Hẹp 54 Plasmit Lactococcin B Lactococcus lastic Hẹp 47 Plasmit Lactococcin M Lactococcus lastic Hẹp 48 Plasmit Lactacon F Lactobacillua Hẹp 57&48 Plasmit johsonii Sakacin A Lactobacillus sake Rộng 41 Plasmit Curvacin A Lactobacillus Rộng 38-41 Chưa biết curvatus Sakacin P Lactobacillus sake Rộng 41 Chưa biết Carnobacteriocin Carnobacterium Rộng 53&48 Plasmit A&B piscicola Pediocin AcH Pediococcus Rộng 44 Plasmit acidilactici Pediocin PA-1 Pediococcus Rộng 44 Plasmit acidilactici Leucocin A-UAL- Leuconostoc Rộng 37 Plasmit 187 gelidum Enterocin 1146 Enterococcus Rộng Nhiễm sắc faecium thể Nhóm III: lớn, không bền nhiệt Helveticin J Lactobacillus Hẹp 333 Nhiễm sắc helveticus thể * ( Trường ức chế hẹp là chỉ các bacteriocin chỉ có ảnh hưởng lên các loài sản xuất) d- Nhóm IV: Nhóm bacterioxin phức hợp là nhóm trong cấu trúc của chúng ngoài protein ra còn chứa một hay nhiều loại chất khác là các lipit hoặc một nửa hydrocacbon cùng với protein, tiêu biểu cho nhóm này là plantarixin S, leuconoxin S, lactoxin 27. Cho đến nay, nhóm bacteriocin I và II là nhóm được nghiên cứu kỹ nhất vì chúng đa dạng nhất và có nhiều ứng dụng trong công nghiệp. Các LAB có khả năng sản sinh bacterioxin trong thịt được công bố đa số thuộc về nhóm I và II. Đặc tính bacterioxin Tính chất công nghệ quý báu của bacterioxin là vẫn giữ được hoạt tính ở một số điều kiện xử lý khác nhau như nhiệt độ, pH, dung môi hữu cơ…Plantacin rất bền sau khi bảo quản ở nhiệt độ 4 - 2 0C, hoặc xử lý với dung môi hữu cơ như metanol, cloroform, axetonitrit và nhiệt độ 1000C trong 60 phút hoặc 1210C trong 10 phút. Lactacin B, Lactacin F chịu được 100 0C trong vòng 1giờ được dùng nhiều trong việc sản xuất thực phẩm đóng hộp Bản chất các bacterioxin là peptit nên bị phân hủy bởi hệ enzim proteaza của hệ thống tiêu hóa vì vậy không có hại đối với cơ thể. Với các đặc tính trên của bacterioxin đã mở ra triển vọng ứng dụng rộng lớn của bacterioxin trong công nghiệp thực phẩm. 2.2 Ứng dụng của bacterioxin trong công nghệ thịt và thịt lên men [12] a- Phương pháp ứng dụng bacterioxin trong các sản phẩm thịt theo bốn biện pháp cơ bản sau : Bổ sung chủng LAB thuần khiết, có sản sinh bacterioxin và có thể phát triển được vào trong thực phẩm. Biện pháp này là cách trực tiếp để phối hợp đồng đều bacterioxin vào trong các sản phẩm thực phẩm. Sự thành công của nó phụ thuộc vào khả năng phát triển và sản xuất bacterioxin của chủng bổ sung trong các điều kiện kỹ thuật và môi trường (nhiệt độ, pH, chất phụ gia, …) của thực phẩm. Vì thịt không thể thanh trùng paster trước khi bổ sung chủng LAB nên các chủng LAB để ngăn ngừa sinh học hoặc để lên men thịt phải có khả năng cạnh tranh với hệ vi sinh vật tự nhiên. Bổ sung các chế phẩm bacteriocin thô, dịch lên men hoặc dịch cô đặc thu nhận được từ quá trình nuôi LAB sản sinh bacteriocin trong các chất nền phức tạp. Cách này tránh được việc sử dụng các hợp chất tinh chế. Bổ sung các chất đối kháng đã tinh chế hoặc bán tinh chế. Theo cách này, liều lượng bacteriocin phải chính xác hơn và do đó phải được ước lượng trước. Tuy nhiên, ứng dụng của nó còn hạn chế, tuỳ theo tập quán sử dụng phụ gia của từng nước. Bổ sung LAB ưa nhiệt ụn hoà như là yếu tố bảo quản ‘an toàn dự phòng’ để chống lại sự lạm dụng nhiệt độ. Trong trường hợp này, các chủng bảo vệ sinh học sẽ giữ ở mật độ như ban đầu trong các điều kiện kiện giá lạnh còn trong điều kiện lạm dụng nhiệt độ, chúng sẽ phát triển cạnh tranh vượt trước các vi khuẩn gây bệnh. Vì vậy tránh được những nguy hại cho sức khoẻ. b- Ứng dụng của các bacterioxin trong thịt và các sản phẩm thịt [12] Nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy LAB sinh ra từ thịt như là một nguồn cung cấp các chủng sản xuất bacterioxin. Tuy nhiên chỉ một số bacterioxin được nghiên cứu như là chất bảo quản sinh học trong thực phẩm và đặc biệt là trong các sản phẩm thịt bao gồm nisin A, P và K và leucoccin A, đặc biệt là pediocin PA1/AcH… Nissin dạng phun xịt (AmbicinR, 5000AU/malolactat) có hiệu quả loại trừ sự ô nhiễm trên bề mặt thịt. Sự phối hợp của nitrit với nisin 1000-10000 IU/g có hiệu quả chống lại Clostridium và một vài vi khuẩn gây bệnh Gram dương khác như Lissteria và Staphylococcus trong xúc xích Đức, thịt lợn nghiền nhão và thịt thô. Trong xúc xích lên men kiểu Mỹ sự sản sinh Pediocin trong xúc xích ngăn ngừa sự phát triển của L. monocytogenes ngay khi không có độ chua. Hoạt động của Pediocin PA-1 không bị ảnh hưởng bởi sự có mặt của chất béo hay protein trong thực phẩm, còn tác động của Pediocin và axit lactic lại hỗ trợ lẫn nhau. Quá trình chế biến Wisonsin sử dụng chủng sản sinh Pediocin P. acidilactici cùng với cacbohydrat đã được USDA phê chuẩn để sử dụng trong thịt muối có hàm lượng nitrit giảm để trợ giúp ngăn ngừa sự sản sinh độc tố botulinum do sự bùng phát của Cl. botulinum. Quá trình này cũng được cải tiến để sử dụng trong các thực phẩm bảo quản lạnh có độ axit thấp như salat gà ở pH 5,1. c- Những hạn chế của bacterixin và biện pháp tăng phạm vi ứng dụng Một cản trở trong việc ứng dụng các bacteriocin làm chất bảo quản sinh học cho thịt là do chúng có khu vực vật chủ hẹp, chỉ ảnh hưởng tới các vi khuẩn họ hàng gần gũi. Tuy nhiên các chủng sản sinh bacteriocin có thể có tác động dương tính đối với các vi khuẩn Gram (-) theo cách gián tiếp như là tạo ra một hệ vi sinh vật chiếm ưu thế và loại trừ các vi sinh vật Gram (-) ưa lạnh. Trái lại với vi khuẩn G (+), vi khuẩn G(-) , như Escherichia coli O157 :H7, có thêm vào màng trong một màng ngoài mà những kháng khuẩn kỵ nước không thể xuyên qua. Lớp trong của màng ngoài thì được tạo thành bởi glyserophospholipid, trong khi lớp ngoài thì được tạo ra bởi lipopolysaccharide. Lipopolysaccharide bao gồm một phần chất béo kỵ nước bên trong và một phần heteropolysaccharide ưa nước bên ngoài, mà được ổn định bởi cation hoá trị II (như Mg 2+). Màng nguyên vẹn bên ngoài có thể bị phá hỏng bởi sự thấm qua, như là EDTA, a xit citric hoặc a xit lactic, mà kháng khuẩn kỵ nước có thể xuyên vào tế bào G (-). Tác động của LAB trong tế bào có thể một phần dựa trên việc tạo ra nồng độ tương ứng của a xit lactic trong môi trường vi sinh, mà kết hợp với chất tẩy trong ruột như muối mật để kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn gây độc G (-). Các biện pháp xử lý khác nhau đã được thử nghiệm làm cho vi khuẩn Gram (-) nhạy cảm với bacterioxin, đặc biệt là nisin. Việc sử dụng nisin cùng với tác nhân có càng kẹp (EDTA, Tween, Triton-X 100) đã mở rộng phổ kháng kháng khuẩn của nisin tới cả các vi khuẩn Gram (-) (bằng sáng chế US 4 980 163). Sự gõy sốc về tính thẩm thấu (hàm lượng muối cao) cũng đã được thử nghiệm như là phương tiện để vi khuẩn Gram (-) nhạy cảm hoá với nisin. 3. Các hợp chất kháng khuẩn từ tỏi và ứng dụng trong công nghệ thực phẩm 3.1 Tỏi và các hợp chất có hoạt tính kháng vi sinh vật [8][15] Lịch sử phát hiện và sử dụng tỏi làm gia vị và làm thuốc. Các nhà nghiên cứu thực vật coi Trung Á là nơi phát sinh của cây tỏi, và Allium sativum (tên khoa học của tỏi) dường như đã được con người sử dụng từ thời đại đồ đá mới. Lần đầu tiên nhà khoa học người Đức Wertheim (1844 - 1845) đã chứng minh được bản chất của các chất gõy mựi ở tỏi mà cũng là các chất có tác dụng sinh lý và dược lý của tỏi chính là các hợp chất sulfur. Hàm lượng các hợp chất sulfur có trong tỏi cao khác thường so với trong cỏc cõy thực vật khác (1,1-3,5%), và nếu làm mất đi từ cỏc tộp tỏi một lớp hợp chất sulfur dễ bay hơi gọi là các thiosulfinates trong đó