Tài liệu Nghiên cứu sugarcane yellow leaf virus gây bệnh vàng gân lá trên mía (yls) bằng kính hiển vi huỳnh quang và kỹ thuật rt-pcr

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** NGUYỄN MINH NAM NGHIÊN CỨU SUGARCANE YELLOW LEAF VIRUS GÂY BỆNH VÀNG GÂN LÁ TRÊN MÍA (YLS) BẰNG KÍNH HIỂN VI HUỲNH QUANG VÀ KỸ THUẬT RT-PCR Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************* NGHIÊN CỨU SUGARCANE YELLOW LEAF VIRUS GÂY BỆNH VÀNG GÂN LÁ TRÊN MÍA (YLS) BẰNG KÍNH HIỂN VI HUỲNH QUANG VÀ KỸ THUẬT RT-PCR LUẬN VĂN KỸ SƢ Chuyên ngành CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn: PGS. TS. BÙI CÁCH TUYẾN Sinh viên thực hiện NGUYỄN MINH NAM Niên khóa: 2002 – 2006 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY ***000*** RESEARCH ON SUGARCANE YELLOW LEAF VIRUS, THE CAUSAL AGENT OF YELLOW LEAF SYNDROME IN SACCHARUM BY FLUORESCENCE MICROCOPY AND RT-PCR METHOD Graduation thesis Major: Biotechnology Professor Student A.Professor. Dr. BUI CACH TUYEN NGUYEN MINH NAM Term: 2002 - 2006 Ho Chi Minh City 09/2006 LÔØI CAÛM TAÏ Con xin thành kính khắc ghi cù lao của cha mẹ, Ngƣời đã sinh thành, dƣỡng dục và hy sinh tất cả để cho anh em con đƣợc ăn học nên ngƣời. Con xin cảm ơn gia đình đã là chỗ dựa vững chắc cho con vững bƣớc vƣợt qua mọi khó khăn. Em xin chân thành cảm ơn: Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. HCM, ban Chủ Nhiệm bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã tạo điều kiện cho em thực hiện thành công khóa luận. PGS. TS. Bùi Cách Tuyến đã tận tình hƣớng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn tất khóa luận này. TS. Bùi Minh Trí đã tận tình dạy bảo và giúp đỡ em trong suốt thời gian qua. PGS. TS. Trần Thị Dân, TS. Nguyễn Ngọc Hải, ThS. Trần Nhật Phƣơng đã giúp đỡ em giải quyết những vƣớng mắc trong quá trình thực hiện khóa luận. Toàn thể Thầy, Cô đã trang bị cho em những kiến thức quí báu. TS. M. Irey (USDA) đã tận tình cung cấp trình tự primers và protocol RTPCR cho em. TS. Tania (South African Sugarcane Research Institute) và TS. S. Schenck (HARC) đã tận tình cung cấp antiserum của ScYLV cho em. TS. Becky (itdna company) đã cung cấp cho em những tài liệu quí giá. Anh Hà Đình Tuấn và anh Thống ở Trung tâm Nghiên cứu Mía đƣờng An Phú, các anh ở trại giống Đức Huệ, Long An và các hộ dân ở xã Phú Lý, Vĩnh Cửu, Đồng Nai đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ em trong quá trình thu thập mẫu. Các Thầy, Cô và anh chị tại Trung tâm Phân tích Hóa Sinh đã hết lòng giúp đỡ và cho em những kinh nghiệm quí báu để em thực hiện thành công khóa luận này. Các bạn lớp công nghệ sinh học 28 đã luôn ở bên mình, động viên và nhiệt tình giúp đỡ mình trong suốt thời gian mình học tập cũng nhƣ trong lúc mình thực hiện khóa luận này. Tp Hồ Chí Minh, ngày 30 tháng 08 năm 2006 Nguyễn Minh Nam TÓM TẮT Nguyễn Minh Nam, Đại học Nông Lâm Tp HCM. Tháng 9 năm 2006. “NGHIÊN CỨU SUGARCANE YELLOW LEAF VIRUS GÂY BỆNH VÀNG GÂN LÁ TRÊN MÍA (YLS) BẰNG KÍNH HIỂN VI HUỲNH QUANG VÀ KỸ THUẬT RT-PCR” đƣợc tiến hành tại Trung tâm Phân tích Hóa Sinh Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh; Trung tâm Công nghệ và Quản lý Môi trƣờng và Tài nguyên Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh; Trung tâm Nghiên cứu Mía đƣờng An Phú, Bình Dƣơng; xã Phú Lý, huyện Vĩnh Cửu, tỉnh Đồng Nai; xã Mỹ Thạnh Tây, Đức Huệ, Long An, xã Tân An, Thủ Dầu Một từ tháng 3/2006 đến tháng 8/2006. Triệu chứng vàng gân lá trên mía do sugarcane yellow leaf virus gây ra, đây là một tác nhân gây bệnh quan trọng. Bệnh này đã xảy ra ở nhiều vùng trồng mía trên thế giới. ScYLV tập trung trong bó mạch libe của cây. Triệu chứng của bệnh thƣờng xuất hiện ở cây trƣởng thành với biểu hiện vàng ở gân lá. Bệnh này có thể đƣợc chẩn đoán dựa vào biểu hiện triệu chứng, kỹ thuật RT-PCR, ELISA, TBIA, ISEM, kính hiển vi điện tử hoặc kính hiển vi huỳnh quang. Nội dung của đề tài bao gồm: - Phát hiện sự nhiễm ScYLV dựa vào triệu chứng. - Kiểm tra các bó mạch libe của cây có và không có biểu hiện triệu chứng vàng gân lá bằng kính hiển vi quang học và kính hiển vi huỳnh quang. - Chẩn đoán ScYLV bằng kỹ thuật RT-PCR với cặp mồi YLS111 và YLS462. Kết quả của đề tài: - Triệu chứng vàng gân lá trên mía đã xuất hiện tại Trung tâm Nghiên cứu Mía đƣờng An Phú, Bình Dƣơng; xã Phú Lý, huyện Vĩnh Cửu, tỉnh Đồng Nai; xã Mỹ Thạnh Tây, Đức Huệ, Long An, xã Tân An, Thủ Dầu Một, Bình Dƣơng. - Đối với cây có biểu hiện triệu chứng thì bó mạch libe có sự phát huỳnh quang trong khi bó mạch của cây bình thƣờng thì không. - Xây dựng đƣợc qui trình RT-PCR có thể chẩn đoán ScYLV. SUMMARY The thesis entitled “RESEARCH ON SUGARCANE YELLOW LEAF VIRUS, THE CAUSAL AGENT OF YELLOW LEAF SYNDROME IN SACCHARUM BY FLUORESCENCE MICROCOPY AND RT-PCR METHOD”. This research was conducted from 3th, 2006 to 8th, 2006 in the laboratory of Biological and Chemical Analysis Center of Nong Lam University; Research Center for Environmental Technology and Nature Resource Management of Nong Lam University; and at Institute of Sugarcane Research of An Phu; Phu Ly village, Vinh Cuu district, Dong Nai province; My Thanh Tay village, Duc Hue district, Long An province, Tan An village, Thu Dau Mot town, Binh Duong province. Sugarcane yellow leaf syndrome is caused by sugarcane yellow leaf virus, being a pathogen of economic importance. The disease has been reported to occur in many sugarcane growing area worldwide. Sugarcane yellow leaf virus resides in the phloem of diseased canes. Symptoms of the disease generally appear in maturing plant as a yellowing of the leaf midrib. The disease can be diagnosed by symptoms, RTPCR, ELISA, TBIA, ISEM, EM or fluorescence microcopy. The objectives of this research are as follows: - To identify ScYLV infecting plants by symptoms. - To examine the phloem of plant with symptom and symptom less plant by light microcopy and fluorescence microcopy. - To diagnose the ScYLV by RT-PCR with YLS111 and YLS462 primers. The results of this research are as follows: - Sugarcane yellow leaf syndrome has been present in sugarcane grown at Institute of Sugarcane Research of An Phu; Phu Ly village, Vinh Cuu district, Dong Nai province; My Thanh Tay village, Duc Hue district, Long An province, Tan An village, Thu Dau Mot town, Binh Duong province. - In plants expressing disease symptom, the vascular bundles presented fluorescence in the phloem while symtomless plants do not have fluorescence. - Finding out the RT-PCR process that can be used for ScYLV diagnosis. MỤC LỤC CHƢƠNG Trang tựa TRANG LÔØI CAÛM TAÏ ........................................................................................................................ i TÓM TẮT .................................................................................................................................. ii MỤC LỤC ................................................................................................................................. iv DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT ......................................................................................... vi DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ ............................................................................. vii DANH SÁCH CÁC HÌNH ....................................................................................................... vii PHẦN 1. MỞ ĐẦU............................................................................................................ 1 1.1 Đặt vấn đề ................................................................................................................... 1 1.2 Mục Đích .................................................................................................................... 2 1.3 Yêu Cầu ...................................................................................................................... 2 PHẦN 2. 2.1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................. 3 Tổng quan về cây mía ................................................................................................. 3 2.1.1 Về cây mía .......................................................................................................... 3 2.1.2 Một số bệnh do virus trên cây mía ..................................................................... 5 2.2 Bệnh vàng gân lá trên mía và sugarcane yellow leaf virus ........................................ 7 2.2.1 Bệnh vàng gân lá trên mía .................................................................................. 7 2.2.2 Sugarcane yellow leaf virus................................................................................ 9 2.2.3 Ảnh hƣởng về kinh tế của bệnh vàng gân lá .................................................... 15 2.2.4 Những nghiên cứu về tính kháng ScYLV trên mía .......................................... 16 2.2.5 Tạo cây mía chuyển gene kháng ScYLV ......................................................... 16 2.2.6 Tạo cây mía sạch bệnh bằng kỹ thuật nuôi cấy mô .......................................... 17 2.2.7 Một số kỹ thuật trong chẩn đoán ScYLV ......................................................... 17 2.3 Những nghiên cứu về ScYLV trên thế giới và ở việt nam ....................................... 25 2.3.1 Những nghiên cứu về ScYLV trên thế giới ...................................................... 25 2.3.2 Những nghiên cứu về ScYLV ở Việt Nam ...................................................... 26 2.4 Kỹ thuật PCR và RT-PCR ........................................................................................ 27 2.4.1 PCR................................................................................................................... 27 2.4.2 RT-PCR ............................................................................................................ 28 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................... 30 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ............................................................................ 30 iv 3.2 Phƣơng pháp lấy mẫu ............................................................................................... 30 3.3 Trang thiết bị và dụng cụ thí nghiệm ........................................................................ 31 3.3.1 Máy móc, thiết bị .............................................................................................. 31 3.3.2 Dụng cụ ............................................................................................................ 31 3.4 Hóa chất .................................................................................................................... 32 3.4.1 Hóa chất sử dụng trong RT- PCR ..................................................................... 32 3.4.2 Hóa chất sử dụng trong điện di ......................................................................... 32 3.5 Phƣơng pháp quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang ............................................ 33 3.6 Phƣơng pháp phát hiện bằng kỹ thuật RT-PCR ....................................................... 33 3.6.1 Qui Trình Ly Trích RNA .................................................................................. 33 3.6.2 Qui trình thực hiện phản ứng RT-PCR ............................................................. 35 3.6.3 Qui trình RT-PCR chỉnh sửa ............................................................................ 35 3.7 Phƣơng pháp xử lý số liệu ........................................................................................ 36 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................................... 37 4.1 Các biểu hiện của triệu chứng vàng gân lá do ScYLV ............................................. 37 4.2 Kết quả chuẩn đoán dựa vào triệu chứng ................................................................. 39 4.2.1 Tỷ lệ nhiễm bệnh theo giai đoạn sinh trƣởng ................................................... 39 4.2.2 Tỷ lệ nhiễm bệnh theo địa phƣơng ................................................................... 40 4.2.3 Tỷ lệ nhiễm bệnh theo nguồn gốc giống .......................................................... 42 4.3 Quan sát mạch dẫn bằng kính hiển vi huỳnh quang ................................................. 43 4.4 Kết quả RT-PCR dựa theo qui trình của M. Irey...................................................... 46 4.5 Kết Quả RT-PCR ...................................................................................................... 46 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................ 48 5.1 Kết luận .................................................................................................................... 48 5.2 Đề nghị ..................................................................................................................... 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................................... 50 v DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT Bp: Base pair BYDV: Barley Yellow Dwarf Luteovirus cDNA: complementary DNA CP: Coat Protein DAS-ELISA: Double Antibody Sandswich - ELISA DBIA: Dot-Blot Immunoassay DEPC: Diethyl Pyrocarbonate DNA: Deoxyribonucleic Acid dNTP: Deoxyribonucleoside Triphosphate dsRNA: double stranded RNA ELISA: Enzyme - Linked Immunosorbent Assay EM: Electron Microscopy g: Gram ha: Hecta ISEM: Immunosorbent Electron Microscopy k Da: Kilo Dalton kg: Kilogram ml: Mililitre µl: Microlitre µm: Micrometre mm: Milimetre MP: Movement Protein mRNA: Messenger RNA NASBA: Nucleic Acid Sequence-Based Amplification nm: Nanometre ORF: Open Reading Frame PCR: Polymerase Chain Reaction PEMV: Pea enation mosaic virus PLRV: Potato leaf roll virus PTGS: Posttranscriptional Gene Silencing PVP: Polyvinylpyrrolidone RdRp: RNA dependent RNA polymerase RNA: Ribonucleic Acid RT-PCR: Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction SCBV: Sugarcane bacilliform virus ScYLV: Sugarcane Yellow Leaf Virus SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sunfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis SSR: Single Sequence Repeat ssRNA: Single stranded Ribonucleic Acid TIBA: Tissue Blot Immunoassay UTR: Untranslated Region YLS: Yellow Leaf Syndrome vi DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ Bảng 4.1. Tỷ lệ nhiễm bệnh theo giai đoạn sinh trƣởng........................................................... 39 Bảng 4.2. Tỷ lệ nhiễm bệnh vàng gân lá theo địa phƣơng ....................................................... 40 Bảng 4.3. Tỷ lệ nhiễm bệnh theo giống .................................................................................................... 42 Biểu đồ 4.1. Tỷ lệ nhiễm bệnh theo giai đoạn sinh trƣởng ...................................................... 39 Biểu đồ 4.2. Tỷ lệ nhiễm bệnh giữa các địa phƣơng ................................................................ 41 Biểu đồ 4.3 Tỷ lệ nhiễm bệnh theo nguồn gốc giống ............................................................... 43 DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1. Sự phân bố của ScYLV trên thế giới .......................................................................... 8 Hình 2.2. Sugarcane yellow leaf virus dƣới kính ....................................................................... 9 Hình 2.3. Rệp lá bắp. Rệp có cánh (A,B), rệp không cánh (C) trƣởng thành. ......................... 11 Hình 2.4. Biểu đồ mô tả bộ gene của Luteovirus thuộc nhóm phụ I và II ............................... 12 Hình 2.5. Cấu trúc kẹp tóc giả định trong bộ gene của ScYLV ............................................... 14 Hình 2.6. Các bó mạch gân lá đƣợc kiểm tra bởi kính hiển vi huỳnh quang.. ......................... 19 Hình 2.7. Vi ảnh điện tử của lát cắt siêu mỏng của tế bào kèm libe cây mía ........................... 20 Hình 2.8. Kết quả TIBA của vết in gân lá khỏe (trên) và lá bị nhiễm (dƣới) ........................... 21 Hình 2.9. Màng nitrocellulose đƣợc xử lý bằng kỹ thuật TBIA với huyết thanh ..................... 22 Hình 2.10. Kết quả immunoblotting (westren blotting) của protein ScYLV ........................... 22 Hình 2.11. Phân tử Beacon ....................................................................................................... 23 Hình.2.12. Nguyên tắc của phản ứng PCR ............................................................................... 27 Hình 2.13. Sơ đồ phản ứng RT-PCR ........................................................................................ 29 Hình.4.1. Lá biểu hiện triệu chứng vàng gân lá ....................................................................... 37 Hình 4.2 Triệu chứng vàng gân lá bắt đầu từ lá thứ 3 .............................................................. 37 Hình 4.3. Cây biểu hiện triệu chứng vàng gân lá. .................................................................... 38 Hình 4.4. Cánh đồng có triệu chứng vàng gân lá (A). Cánh đồng khỏe mạnh (B) ................. 38 Hình 4.5 Các bó mạch của gân lá đƣợc kiểm tra bởi kính hiển vi huỳnh quang. ..................... 44 Hình 4.6. Các bó mạch gân lá đƣợc quan sát bằng kính hiển vi quang học (100X) ................ 45 Hình 4.7. Sự phát huỳnh quang của tế bào do có phản ứng chết (200X) ................................. 45 Hình 4.8. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR. ......................................................................... 46 Hình 4.9. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR ......................................................................................... 47 vii iv PHẦN 1. MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Ở nƣớc ta hiện nay mía là nguyên liệu duy nhất để chế biến ra đƣờng, nên mía là một cây trồng quan trọng trong cơ cấu cây thực phẩm. Ngoài ra, mía còn là cây có sản lƣợng cao (có thể đạt tới 200-250 tấn sinh khối/1ha/năm) và hiệu quả kinh tế cao nên mía là cây xóa đói giảm nghèo cho nông dân (Trần Văn Sỏi, 2003). Tuy nhiên trở ngại lớn trong quá trình canh tác cây mía là bệnh dịch, đặc biệt nhất là bệnh do virus. Trong đó, bệnh do Sugarcane yellow leaf virus (ScYLV) đang là tác nhân gây bệnh quan trọng về kinh tế ở nhiều nƣớc trên thế giới. Virus này đƣợc phát hiện và công bố ở hơn 30 nƣớc trên khắp thế giới nhƣ South Afica, Swaziland, Malawi và Zimbabwe (Bailey et al., 1996), Mauritius (Anon 1996, Saumtally and Moutia, 1997), USA và Australia (Borg et al., 1997), Brazil (Anon., 1995), Cuba (Arocha, Y., Gonzalez, L., Peralta, E. L., and Jones, 1999) (trích bởi Schenck, 2001), Ecuador (Freddy, 2006), … Sugarcane yellow leaf virus gây thiệt hại kinh tế lớn trên các vùng trồng mía, thiệt hại ƣớc tính khoảng 40-60% ở Brazil và hơn 20% ở các vùng khác. Việc chẩn đoán sự nhiễm virus và đƣa ra các biện pháp phòng trừ có ý nghĩa kinh tế rất lớn. Diện tích trồng mía ở nƣớc ta lớn, triệu chứng vàng lá do virus Sugarcane yellow leaf virus cũng đã xuất hiện ở nhiều nơi. Tuy vậy, hiện nay vẫn chƣa có một công trình nghiên cứu nào cụ thể đánh giá sự hiện diện và phân bố cũng nhƣ nguồn gốc của virus này ở nƣớc ta. Việc chẩn đoán và đánh giá tình hình, sự hiện diện nguồn gốc và phân bố của Sugarcane yellow leaf virus là rất cần thiết trong việc hạn chế và phòng ngừa thiệt hại do virus này gây ra tại Việt Nam. Với thực tế trên chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sugarcane yellow leaf virus gây bệnh vàng lá trên mía (YLS) bằng kính hiển vi huỳnh quang và kỹ thuật RT-PCR”. 2 Mục đích ­ Đánh giá tình trạng nhiễm virus ScYLV trên tập đoàn giống gốc và tập đoàn giống mới nhập nội từ Thái Lan tại Trung tâm Nghiên cứu Mía đƣờng An Phú, huyện Bến Cát, tỉnh Bình Dƣơng và các tỉnh Bình Dƣơng, Đồng Nai, Long An dựa vào triệu chứng đặc trƣng của bệnh vàng gân lá. ­ Kiểm tra thiết vật từ gân và bản lá mía bằng kính hiển vi huỳnh quang ở bƣớc sóng 510nm, từ đó thiết lập mối tƣơng quan giữa kết quả quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang và triệu chứng vàng gân lá trên mía. ­ Thực hiện quy trình RT-PCR để phát hiện virus ScYLV. Yêu cầu ­ Nắm vững các triệu chứng của bệnh vàng gân lá do ScYLV gây ra. ­ Phân biệt đƣợc sự khác nhau giữa các thiết vật có triệu chứng vàng gân lá và thiết vật không có biểu hiện triệu chứng vàng gân lá. ­ Nắm vững nguyên tắc và cách tiến hành phản ứng RT-PCR. 3 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan về cây mía 2.1.1 Về cây mía 2.1.1.1 Phân loại học Theo phân loại thực vật cây mía thuộc: Ngành: Spermatophyta Lớp: Monocotyledneae Họ: Gramineae Loại: Saccharum Trong loại Saccharum có năm loài: - Loài nhiệt đới (Saccharum officinarum L.) - Loài Trung Quốc (Saccharum sinence Roxb Emend. Jesw) - Loài Ấn Độ (Saccharum barberi Jesw) - Loài hoang dại thân nhỏ (Saccharum spontaneum L.) - Loài hoang dại thân to (Saccharum robustum Bround và Jesw) 2.1.1.2 Nguồn gốc a. Loài nhiệt đới (Saccharum officinarum L.) Số nhiễm sắc thể 2n = 80. Loài này có nguồn gốc từ các đảo phía nam Thái Bình Dƣơng (Niu Ghinê), chỉ có nguồn gốc trong mía trồng không thấy ở dạng hoang dại. b. Loài Trung Quốc (Saccharum sinence Roxb Emend. Jesw) Số nhiễm sắc thể 2n = 134. Loài này có nguồn gốc ở Trung Quốc, Miến Điện, Ấn Độ, miền bắc Việt Nam. c. Loài Ấn Độ (Saccharum barberi Jesw) Số nhiễm sắc thể 2n = 92. Loài này có nguồn gốc ở bắc Ấn Độ. d. Loài hoang dại thân nhỏ (Saccharum spontaneum L.) Số nhiễm sắc thể 2n = 112. Loài này mọc dã sinh từ sƣờn núi Himalaya đến vùng Nam Ấn Độ. Từ một nhóm thực vật nhỏ Saccharum spontaneum đã phát triển thành một quần thể rộng lớn bao gồm nhiều loại hình khác nhau. Grassl đã lập một bảng gồm 16 loại hình Saccharum spontaneum khác nhau. e. Loài hoang dại thân to (Saccharum robustum Bround và Jesw) 4 Số nhiễm sắc thể 2n = 84. Loài này mọc dã sinh ở vùng nhiệt đới, ở Niu Ghinê (Trần Văn Sỏi). 2.1.1.3 Vị trí kinh tế của cây mía Hiện nay ở nƣớc ta mía là nguyên liệu duy nhất để chế biến ra đƣờng, nên mía là một cây trồng quan trọng trong cơ cấu cây thực phẩm. Đƣờng là thức ăn lành tính dễ tiêu, giàu năng lƣợng. Một cân đƣờng cung cấp năng lƣợng tƣơng đƣơng với 0,5 kg mỡ; 50-60 kg rau quả. Đƣờng cung cấp 10% nhu cầu năng lƣợng của cộng đồng. Trên thế giới năng lƣợng do đƣờng cung cấp bằng 7% năng lƣợng do các loại ngũ cốc cung cấp (Trần Văn Sỏi, 2003) Đƣờng có thị trƣờng tiêu thụ ổn định do nhu cầu về đƣờng trong nƣớc ngày càng tăng cao. Đƣờng lại là mặt hàng chế biến bằng công nghệ hiện đại nên chất lƣợng ổn định, dễ dàng đạt tiêu chuẩn quốc tế, cho nên nếu sản xuất nhiều sẽ xuất khẩu ra bất cứ nƣớc nào trong khu vực. Vì vậy nên ngƣời trồng mía không có gì lo ngại về thị trƣờng tiêu thụ. Mía là cây xóa đói giảm nghèo cho nông dân trung du, miền núi, là cây có hiệu quả kinh tế cao. Do mía là cây hàng năm, thích hợp với nhiều loại đất, bộ rễ bám sâu nên có khả năng chịu hạn khá, có thể trồng trên đất đồi và trung du miền núi. Vì mía có khả năng lƣu gốc tới vụ sau nên đỡ công và giống trồng. Mía là cây có sản lƣợng cao (200-250 tấn sinh khối/1ha/năm). Nhờ những ƣu thế trên mà cây mía trở thành cây làm giàu cho nhiều gia đình, nhiều khu vực nhƣ Thanh Hóa, Nghệ An, Phú Yên, Bình Định, Quảng Ngãi, … Mía là cây năng lƣợng cuối thế kỷ XX và về sau. Do nguồn nhiên liệu địa khai ngày càng cạn kiệt trong khi nhu cầu năng lƣợng trên thế giới càng tăng nên việc tìm ra một nguồn nguyên liệu thay thế có ý nghĩa rất quan trọng. Nguồn năng lƣợng từ thực vật là hƣớng đƣợc nhiều quan tâm vì đây là nguồn năng lƣợng tái tạo đƣợc hàng năm không bao giờ cạn kiệt. Trong đó, cây mía đƣợc coi là cây năng lƣợng hàng đầu trong các loại thực vật có thể sản xuất năng lƣợng lỏng. Từ một tấn mía có thể sản xuất ra 35-50 lít cồn 960, có thể dùng làm nhiên liệu cho động cơ. Ở Brazil từ lâu ngƣời ta đã sản xuất cồn từ mía để thay thế xăng chạy ô tô vận tải. Mía là cây kiêm dụng, ngoài đƣờng, cellulose trong bã mía có thể làm giấy, làm gỗ ép thay cho một phần gỗ rừng. Mía là cây ngắn ngày lại là cây đặc biệt cao sản nên rất có nhiều triển vọng trong lĩnh vực này. 5 Mía với thành phần hóa học rất phong phú nên ngày càng đƣợc nhiều ngành công nghiệp quan tâm khai thác. Saccarose đƣợc ngành đƣờng khai thác để sản xuất đƣờng trắng. Cellulose đƣợc ngành giấy và ngành gỗ ép khai thác. Mật rỉ trong quá trình lên men, chƣng cất và các phƣơng pháp hóa học khác có thể sản xuất ra rƣợu các loại, cồn tinh khiết, acid lactic, acid nitric, acid glutamic, men thực phẩm, … 2.1.1.4 Sản xuất protein tái tổ hợp từ mía Việc sử dụng cây trồng nhƣ một nhà máy sinh học có năng suất cao đòi hỏi cả một hệ thống chuyển biến nạp và khả năng sản xuất, tích lũy ở mức độ cao các protein tái tổ hợp có giá trị kinh tế cao. Wang và cộng sự (2001) đã tạo ra cây mía chuyển gene tạo ra protein dƣợc liệu có giá trị cao là granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM_CSF). Trên một vài dòng mía đã tạo ra tới 0,03% protein tổng số giống GM-CSF. GM-CSF đƣợc sản xuất từ mía có hoạt tính tự nhiên đƣợc chỉ ra trong thử nghiệm sự tăng sinh tế bào xƣơng ngƣời. Dịch trích từ mía kích thích sự phân chia của tế bào tủy xƣơng (TF-1). 2.1.2 Một số bệnh do virus trên cây mía 2.1.2.1 Peanut Clump Furovirus Peanut Clump Furovirus (PCV) gây bệnh đốm đỏ trên lá mía đã đƣợc công bố đầu tiên bởi Baudin và Chatenet (1988). Biểu hiện triệu chứng do Peanut Clump Furovirus gây ra thƣờng biến đổi và phụ thuộc vào giống (Baudin và Chatenet, 1988; Baudin và cộng sự, 1994; Rott, 1996). Các triệu chứng thƣờng là xuất hiện những sọc vàng úa với những đốm vàng hay đỏ. Toàn bộ lá sẽ trở thành màu nâu hơi vàng (Braithwaite, 2001). 2.1.2.2 Sugarcane Bacilliform Badnavirus Công bố đầu tiên của dạng virus hình que trên mía là ở Cuba (Rodriguez-Lema và cộng sự, 1985). Sau đó, Lockhart và Autrey (1988) đã công bố rằng dòng Mex.57473 trồng ở Morocco và Hawaii và CP44-101 từ Morocco đã chứa virus hình que tƣơng tự banana streak virus (BSV) đƣợc tìm ra gần đó (Lockhart, 1986). Virus có tên là sugarcane bacilliform virus (SCBV) có quan hệ gần với BSV và chúng đƣợc chứng minh là cùng thuộc một loại virus (Lockhart và Olszewski, 1993). Triệu chứng của SCBV thì thƣờng biến đổi và không chắc chắn. Sự đồng nhiễm của SCBV và các virus khác đã đƣợc nhận thấy. Tất cả các dòng nhiễm với sugarcane mild mosaic virus đều nhiễm SCBV (Lockhart và cộng sự, 1992). 6 Ảnh hƣởng của SCBV với năng suất trên mía không đƣợc xác định rõ ràng. Sinh khối sinh ra ở giống mía CP63-588 bị nhiễm SCBV giảm đáng kể từ 23-31% trong khi sinh khối sinh ra tăng ở giống CP65-357 bị nhiễm SCBV. 2.1.2.3 Sugarcane Mild Mosaic Closterovirus Trong quá trình kiểm tra SCVB trên mía bằng kính hiển vi điện tử ngƣời ta đã thấy những dạng hạt dài khúc khuỷu ở Mauritius và Mỹ. Những hạt này trƣớc đây không đƣợc biết đến trên mía và xuất hiện tƣơng tự với Closterovirus. Virus này ban đầu có tên là sugarcane clostero-like virus, nhƣng bây giờ nó đƣợc gọi là sugarcane mild mosaic closterovirus (SCMV; Lockhart và cộng sự, 1992). 2.1.2.4 Ramu Streak Ramu streak đƣợc phát hiện đầu tiên ở vùng đất Ramu, Papua New Guinia vào giữa những năm 1980 nhƣng nó không đƣợc coi là vấn đề cho đến năm 1993 khi nó xuất hiện trên giống Casius (Magarey và cộng sự, 1996). Triệu chứng của Ramu streak tƣơng tự với bệnh sọc vàng trên mía. Ảnh hƣởng của bệnh lên năng suất thì không đƣợc biết đến. 2.1.2.5 Reovirus ở Nam Phi Một bệnh mới đã đƣợc tìm thấy ở Nam Phi năm 1994 (Bailey, 1996). Những nốt nhỏ xuất hiện trên bề mặt lá và bẹ lá nhƣng thƣờng thƣa thớt và không dễ nhận thấy. Bệnh này không biểu hiện ảnh hƣởng trên cây trƣởng thành. Những hạt virus hình cầu có thể đƣợc quan sát bởi kính hiển vi điện tử từ những nốt bệnh. Hạt virus này có chứa dsRNA và primer của RT-PCR đƣợc thiết kế cho Fiji disease virus (FDV) có thể đƣợc sử dụng để tạo ra sản phẩm PCR. Triệu chứng, kích thƣớc, hình dạng virus và bộ gene RNA sợi đôi (dsRNA) chứng tỏ rằng virus mới này tƣơng tự với FDV và thuộc nhóm Reovirus. 2.1.2.6 Fijivirus Nguyên nhân của bệnh Fiji trên mía là do họ Reoviridae. Bệnh này thƣờng xảy ra ở Australia. Nó đƣợc truyền bởi vector là Perkisiella sp. planthoppers. Bệnh này đƣợc phát hiện dựa vào triệu chứng, RT-PCR hoặc ELISA. 2.1.2.7 Sugarcane mosaic virus (SCMV) Đây là virus đƣợc phân bố rộng rãi, nhƣng sự đột phát thƣờng bị giới hạn ở những vùng lạnh. Sự mất mùa có thể lên tới trên 20%. Bệnh này có thể đƣợc phát hiện dựa vào triệu chứng hoặc kỹ thuật ELISA, PCR, RFLP. 7 2.2 Bệnh vàng gân lá trên mía và sugarcane yellow leaf virus 2.2.1 Bệnh vàng gân lá trên mía 2.2.1.1 Nguyên nhân Triệu chứng vàng gân lá đã đƣợc biết đến từ lâu với những tên gọi khác nhau nhƣ “Yellow wilt” ở châu Phi (Ricaud, 1968; Siddiqi, 1969; Rogers, 1970) và “autum decline” ở Brazil (Hughes, 1964) (trích bởi Lockhart và cộng sự, 2000). Triệu chứng này cũng đã đƣợc nhận thấy ở Hawaii trong những năm 1980 và sau đó là nhiều nƣớc khác trên khắp thế giới (Comstock và cộng sự, 2002; Izaguirre-Mayoral và cộng sự, 2002; Lockhart và cộng sự, 1996; Lockhart và Cronje, 2000; Vega và cộng sự, 1997; Viswanathan, 2002). Nhƣng đến những năm 1980 ngƣời ta mới biết rõ về nguyên nhân gây bệnh (Schenk và Hu, 1991; Comstock và cộng sự, 1994). Có hai tác nhân liên quan đến triệu chứng vàng lá trên mía. Một là Sugarcane Yellow Leaf Virus (ScYLV) (Lockhart và cộng sự, 1996; Vega và cộng sự, 1997; Scagliusi và Lockhart, 2000) và tác nhân còn lại là Sugarcane yellows phytoplasma (ScYP) (Cronjé và cộng sự, 1998). Tuy nhiên một vài báo cáo khác chỉ ra rằng triệu chứng tƣơng tự cũng có thể bị gây ra bởi côn trùng, stress sinh lý, thời tiết, một vài phản ứng chống stress và một vài yếu tố vô sinh khác (Bailey và cộng sự, 1996; Matsuoka và Meneghin,1999). 2.2.1.2 Sự phân bố địa lý Bệnh vàng gân lá do ScYLV hiện nay đƣợc báo cáo là hiện diện ở nhiều nƣớc trên thế giới nhƣ Argentina, Australia, Barbados, Brazil, Colombia, Cuba, Dominican Republic, El Salvador, Guadeloupe, Guatemala, Hawaii, India, Iran, Jamaica, Kenya, Martinique, Mexico, Morocco, Mozambique, Nicaragua, Peru, Réunion, Senegal, Nam Phi, Swaziland, Thailand, Uganda, Mỹ, Venezuela, Zambia, Zimbabwe, … (Lockhart và cộng sự, 2000) (hình 2.1). 8 Hình 2.1. Sự phân bố của ScYLV trên thế giới (Nguồn: Salem Saumtally và cộng sự) 2.2.1.3 Triệu chứng Triệu chứng đặc trƣng của bệnh vàng gân lá giống nhau ở tất cả mọi nơi. Gân lá màu vàng tƣơi, đặc biệt ở trên bề mặt và đỉnh của lá trở nên vàng, sau đó hoại tử. Hoại tử lan rộng xuống bản lá cho tới khi toàn bộ lá bị nhiễm. Thƣờng thì lá non nhất không có biểu hiện triệu chứng, nhƣng màu vàng xuất hiện ở những lá thứ tƣ hoặc thứ năm và những lá già hơn. Những cây non thƣờng không biểu hiện trên đồng ruộng mặc dù những cây non trong nhà kính đôi khi có những triệu chứng đặc trƣng dƣới những điều kiện stress (Schenck, 2001). Trong một vài trƣờng hợp thì mặt dƣới của gân lá trở nên vàng hơn lá già. Mặt trên của gân lá có thể vẫn giữ màu bình thƣờng (trắng hoặc trắng hơi xanh) hoặc có thể trở vàng, hồng hay hơi đỏ. Sự đổi màu của gân lá thƣờng xảy ra trong khi bản lá vẫn giữ màu xanh. Ở một số giống màu vàng của lá có thể ảnh hƣởng tới toàn bộ lá. Sự thay đổi sang màu vàng cũng có thể lan rộng ra bản lá và hoại tử bắt đầu từ chóp lá phát triển tới bản lá. Triệu chứng này thƣờng tạm thời và nhạt dần khi cây bắt đầu đƣợc chăm sóc tốt. Sự biểu hiện triệu chứng vàng gân lá trên mía rõ ràng hơn ở những cây trƣởng thành và những cây bị stress. Sự biểu hiện triệu chứng liên quan đến giống, nhiệt độ 9 lạnh hoặc yếu tố stress khác và cây bị nhiễm trên đồng thƣờng không có biểu hiện triệu chứng (Schenck và cộng sự, 2001). Đối với những cây có triệu chứng YLS thì brix cao hơn từ 2 đến 3 lần so với những cây khỏe mạnh. Vega và cộng sự (1997) đã nhận thấy sự tích lũy fenola trong mạch libe, điều đó chứng tỏ có sự rối loạn chức năng của mạch dẫn. Ở những vùng lá khác nhau thì sự giảm tổng lƣợng đƣờng, hàm lƣợng chlorophyl và sự vận chuyển đƣờng đã đƣợc nhận thấy giữa cây có triệu chứng và cây không có triệu chứng nhiễm với virus ScYLV. 2.2.2 Sugarcane yellow leaf virus 2.2.2.1 Virus ScYLV Sugarcane yellow leaf virus là một virus mới đƣợc mô tả gần đây, nó nhiễm vào mía và gây ra triệu chứng vàng gân lá (YLS) (Vega và cộng sự, 1997; Scagliusi và Lockhart, 2000). Hạt virus ScYLV có đƣờng kính từ 24-29 nm trong sodium phosphatungstate ở pH5 (hình 2.2). Nó có tỉ trọng là 1,30g/cm3 trong Cs2SO4 và chứa 5,8 kb ssRNA. Protein vỏ có trọng lƣợng 27 kDa và không chứa glycosylate. (Scagliusi và Lockhart, 2000). Hình 2.2. Sugarcane yellow leaf virus dƣới kính hiển vi điện tử (24-28nm), tỉ lệ thƣớc 100nm. (Nguồn: Scagliusi và Lockhart, 2000)