Tài liệu Nghiên cứu quy trình tạo củ in vitro ở một số giống khoai môn sọ địa phương (colocasia esculenta (l.

Khóa luận tốt nghiệp Hà Phạm Thị Thu PHẦN I: MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Khoai môn sọ (Colocasia esculenta (L.) Schott) là loại cây trồng thích nghi cao với vùng nhiệt đới, là nguồn lương thực an toàn ở nhiều quốc gia trên thế giới. Đây là loại cây trồng lấy củ quan trọng, không chỉ là nguồn cây lương thực chính của các nước ở quần đảo Thái Bình Dương mà còn là nguồn lương thực, thực phẩm tại nhiều quốc gia trên thế giới tập trung ở Châu Phi, Tây Ấn Độ, Nam Mỹ và Châu Á [2][11]. Cả củ, thân và lá khoai môn sọ đều được sử dụng làm lương thực,thức ăn chăn nuôi và công nghiệp chế biến. Trong đó củ khoai môn sọ chứa hàm lượng hydratcacbon cao, hàm lượng chất béo thấp và nhiều chất khoáng. . Củ dùng để chế biến thành nhiều món ăn ngon như: khoai chiên, khoai hầm xương, bánh khoai…Củ khoai môn còn dùng trong công nghiệp chế biến bột dinh dưỡng trẻ em [11]. Có thể sử dụng tinh bột khoai môn sọ thay thế một số tinh bột phải nhập khẩu từ nước ngoài để chế biến các loại bánh tươi, xúc xích, giò, chả… Tinh bột khoai môn sọ có kích thước nhỏ nhất trong các loại tinh bột được biết cho đến nay nên chúng có thể thay thế tinh bột ngô trong sản xuất plastic sinh học, có khả năng chống thấm khí cao trong bao gói thực phẩm và bảo vệ môi trường. Lá và dọc lá chứa hàm lượng caroten và khoáng chất canxi, photpho, kali được sử dụng làm thực phẩm hoặc thức ăn chăn nuôi[7]. Khoai môn sọ được trồng ở khắp nơi trên đất nước ta, từ những vùng đất thấp có nước đến nơi có địa hình cao 5 m đến 1800 m so với mặt biển và ở những điều kiện môi trường khác nhau. Những năm gần đây, diện tích trồng khoai môn sọ hàng năm đã lên tới khoảng 15.000 ha, xếp thứ tư về diện tích trồng sau cà chua, sắn và khoai lang. Các tỉnh trồng nhiều khoai môn sọ như Sơn La, Thái Nguyên, Tuyên Quang, Thanh Hóa, Bắc Giang, Quảng Ninh và Hòa Bình [2]. Líp: K57A - Khoa Sinh học Nội 1 Trường ĐHSP Hà Khóa luận tốt nghiệp Hà Phạm Thị Thu Đặc biệt trồng khoai môn sọ có ưu điểm là có thể tận dụng đất ở ven suối, chân đồi, đất lầy thụt. Hơn nữa cây khoai môn sọ lại rất ít bị sâu bệnh nhờ đó mà tiết kiệm được chi phí và nâng cao được hiệu quả kinh tế. Nếu trồng đúng kĩ thuật cho hiệu quả kinh tế cao gấp 5 lần trồng lúa. Vì thế phương hướng và mục tiêu trong những năm tới là tập trung đầu tư cho cây khoai môn sọ phát triển ở những vùng khó khăn nhưng có điều kiện thích hợp thuộc vùng Trung du, miền núi và Tây Nguyên. Để thực hiện được mục tiêu trên phải tăng diện tích đi đôi với việc nâng cao sản xuất, xác định cơ cấu giống thích hợp với từng vùng sinh thái, tập trung nghiên cứu tốt đồng thời nhanh chóng ứng dụng các tiến bộ khoa học mới[2]. Tuy nhiên cây khoai môn sọ chủ yếu được trồng bằng củ con hoặc các chồi mắt được ủ nảy mầm từ củ do đó có hệ số nhân giống thấp, lượng củ làm giống cần nhiều mà chất lượng giống không đồng đều. Hơn nữa cây khoai môn sọ có thời gian ngủ nghỉ ngắn, dễ bị ảnh hưởng bởi các điều kiện ngoại cảnh rất khó để giữ giống. Việc nhân giống và bảo tồn nguồn gen các giống khoai môn sọ đặc sản gặp rất nhiều khó khăn vì các giống địa phương cho năng suất không cao,thời gian sinh trưởng dài và dễ bị sâu bệnh[11][2]. Nguồn giống thiếu là một trong những hạn chế lớn nhất để có thể trồng đại trà với quy mô lớn. Vì vậy yêu cầu đặt ra là phải xây dựng quy trình kĩ thuật sản xuất giống đảm bảo chất lượng cung cấp đủ nguồn cây giống sạch bệnh, có độ đồng đều cao đáp ứng yêu cầu sản xuất. Hiện nay công nghệ sinh học ngày càng phát triển,để bảo tồn và cung cấp đủ nguồn giống sạch bệnh nhiều nước đã áp dụng phương pháp nhân giống in vitro. Phương pháp vi nhân giống bằng tạo củ in vitro đã được tiến hành và đạt kết quả tốt trên nhiều đối tượng. Tạo củ in vitro có rất nhiều ưu điểm, có thể tạo được một số lượng giống sạch bệnh,có độ đồng đều cao trong thời gian ngắn, các củ in vitro cũng dễ dàng vận chuyển và bảo quản Líp: K57A - Khoa Sinh học Nội 2 Trường ĐHSP Hà Khóa luận tốt nghiệp Hà Phạm Thị Thu trong thời gian dài[8][10]. Tuy vậy trên thế giới và ở Việt Nam có rất ít báo cáo về tạo củ khoai môn sọ. Xuất phát từ những lý do trên và hướng tới mục đích có thể tạo được một số lượng lớn cây giống khoai môn sọ sạch bệnh phục vụ cho sản xuất, cung cấp nguyên liệu cho công tác bảo tồn, chúng tôi tiến hành đề tài “ Nghiên cứu quy trình tạo củ in vitro ở một số giống khoai môn sọ địa phương (Colocasia esculenta (L.) Schott) ” 2. Mục đích và mục tiêu 2.1. Mục đích Xác lập quy trình tạo củ in vitro từ chồi đỉnh của một số giống khoai môn sọ nhằm tạo ra nguồn củ giống chất lượng cao, đồng đều và sạch bệnh phục vụ cho sản xuất đại trà. 2.2. Mục tiêu - Xác lập điều kiện khử trùng mẫu thích hợp, công thức tái sinh và nhân nhanh chồi, công thức ra rễ nhằm tạo cây in vitro hoàn chỉnh. - Xác định môi trường tạo củ in vitro của các giống khoai môn sọ nghiên cứu. 3. Đối tượng nghiên cứu Nghiên cứu trên 4 giống khoai môn sọ quý của nước ta:Khoai sọ Cụ Cang (Sơn La), khoai sọ núi (Bắc Giang), khoai Mán và khoai sọ thơm (Lạng Sơn). Các giống khoai môn sọ này được thu thập từ các tỉnh Sơn La, Bắc Giang và Lạng Sơn. 4. Địa điểm và thời gian nghiên cứu - Địa điểm: + Phòng nuôi cấy mô – Bộ môn Công nghệ vi sinh. Trường ĐHSP Hà Nội + Phòng thí nghiệm Bộ môn Di truyền học – ĐHSP Hà Nội - Thời gian: từ tháng 3/2010 – 5/2011 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Líp: K57A - Khoa Sinh học Nội 3 Trường ĐHSP Hà Khóa luận tốt nghiệp Hà Phạm Thị Thu - Cung cấp một số cơ sở lý thuyết cho điều khiển tạo củ. - Đặt cơ sở để hoàn thiện qui trình tạo củ giống in vitro cung cấp nguồn củ giống chất lượng cao và số lượng lớn cho sản xuất đại trà. PHẦN II: NỘI DUNG CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Đặc điểm chung của cây khoai môn sọ(Colocasia esculenta (L.) Schott) 1.1. Phân loại cây khoai môn sọ Trong hệ thống phân loại thực vât , loài khoai môn sọ có vị trí phân loại sau Giới (Kingdom) : Thực vât (Plantae) Ngành (division) : Thực vât hạt kín (Magnoliophyta) Lớp (class) : Một lá mầm ( Monocotyledoneae ) Phân lớp : Cau (Araceace) Bộ (oder) : Trạch tả (Alismatales) Họ (family) : Ráy (Araceace) Phân họ (subfamily) : Aroideae Chi (genus) : Khoai môn (Colocasia) Loài (species) : Colocasia esculenta Cây khoai môn sọ thuộc chi Colocasia là một trong những loài được trồng phổ biến vì có giá trị kinh tế hơn cả. Hai loài đầu tiên của chi Colocasia được Linnes mô tả năm 1753 là Arum Colocasia và Arum esculentum (Hill, 1952). Năm 1789, hệ thống phân loại học các cây họ Ráy mới được Heinrich Wilhelm Schott chính thức đưa ra, ông cũng đặt tên cho hai loài trên là Colocasia esculenta và Colocasia antiquorum. Cho đến thế kỉ XX đã có rất nhiều công trình nghiên cứu phân loại các loài trong chi khoai môn sọ dựa trên đặc điểm hình thái hoa và cơ quan sinh dưỡng nhưng Líp: K57A - Khoa Sinh học Nội 4 Trường ĐHSP Hà Khóa luận tốt nghiệp Hà Phạm Thị Thu vì có lịch sử lâu dài trong nhân giống vô tính nên vấn đề phân loại thực vật trong chi này còn nhiều điểm chưa thống nhất. Ở Việt Nam, trong những năm gần đây, thực hiện quyết định của Thủ tướng Chính phủ về “Kế hoạch hành động đa dạng sinh học Việt Nam”, dự án “Thành lập ngân hàng gen quốc gia những loài thực vật hữu ích” của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đã và đang được triển khai tại Viện Khoa học và Kỹ thuật nông nghiệp Việt Nam. Kết quả thu thập các loài cây trồng lấy củ bước đầu đã có được một tập đoàn giống khá lớn, đáng chú ý là tập đoàn giống khoai môn sọ (Colocasia esculenta) với hơn 290 mẫu giống (chiếm 2/3 trong tập đoàn giống đã thu thập đang được bảo tồn và nghiên cứu tại Trung tâm Tài nguyên di truyền thực vật Việt Nam) [5]. Hiện nay theo điều tra của viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật Việt Nam thì họ Ráy ở Việt Nam có 23 chi và 120 loài, trong chi Khoai môn (Colocasia) có 2 loài. Tuy nhiên, các nghiên cứu phân loại chủ yếu sử dụng các tài liệu đã có từ trước hay chỉ mới dừng lại ở mức độ nhận dạng của các chi. Cho đến nay, vẫn chưa có một khóa định loại các loài trong họ Ráy nói chung và trong chi Khoai môn (Colocasia) nói riêng [2]. Số lượng NST trong bộ NST lưỡng bội của giống khoai môn sọ nghiên cứu được là: 2n = 22, 26, 28, 38, 42, trong đó phổ biến nhất là hai dạng 2n = 28 và 2n = 42. Sự sai lệch số lượng NST của giống khoai môn sọ có thể do sự phát sinh đột biến đa bội và được duy trì thuân lợi nhờ sinh sản sinh dưỡng[9]. 1.2. Nguồn gốc và phân bố Các bằng chứng phân loại thực vật cho thấy rằng khoai môn sọ có nguồn gốc ở Nam Trung Á, có lẽ ở Ấn Độ hoặc bán đảo Mã Lai. Dạng hoang dại phát sinh ở các vùng khác nhau của Đông Nam Á (Purseglove, 1972). Từ cái nôi này khoai môn sọ lan về phía đông, tới phần còn lại của Đông Nam Á và Trung Quốc, Nhật Bản, quần đảo Thái Bình Dương. Líp: K57A - Khoa Sinh học Nội 5 Trường ĐHSP Hà Khóa luận tốt nghiệp Hà Phạm Thị Thu Một số tác giả đã cho rằng các hòn đảo của New Guinea có thể là một trung tâm phát sinh của khoai môn sọ, khác biệt với trung tâm châu Á. Từ châu Á, khoai môn sọ lan rộng về phía tây tới Ả Rập Saudi và vùng Địa Trung Hải. Hơn 100 năm trước công nguyên, cây khoai môn sọ bắt đầu được trồng ở Trung quốc và Ai cập. Cây khoai môn sọ được du nhập đến châu Phi khoảng 2000 năm trước, bắt đầu ở Tây Phi và sau đó theo tàu nô lệ đến Caribe. Ngày nay khoai môn sọ được phân bố và trồng chủ yếu ở các vùng nhiệt đới. Tỉ lệ canh tác cao và đóng góp của khoai môn sọ vào chế độ ăn của người dân cao nhất tại quần đảo Thái Bình Dương. Tuy nhiên, diện tích canh tác lớn nhất lại là tại vùng Tây Phi, do đó chiếm sản lượng lớn nhất. Cây khoai môn sọ được trồng chủ yếu ở những vùng ẩm ướt của châu Á. 1.3. Đặc điểm hình thái Cây khoai môn sọ (Colocasia esculenta (L.) Schott) là cây thân thảo, cao từ 0,5- 2,0m. Cây có một củ cái ở giữa, lá phát triển lên trên, rễ phát triển xuống dưới, các củ con (cormels), củ nách (daughter corms) và các dải bò (stolons) phát triển sang ngang. Rễ chùm, ngắn mọc từ đốt mầm xung quanh thân củ, có nhiều tầng phụ thuộc vào số lá của cây. Phần gốc phình to thành củ hoặc thân củ chứa tinh bột. Củ cái là cấu trúc thân chính của cây, có nhiều đốt, mỗi đốt có mầm phát triển thành nhánh. Mỗi dọc lá lụi đi thì thân củ có thêm một đốt. Đỉnh củ cái là điểm sinh trưởng của cây, kích thước và hình dạng củ rất khác nhau và phụ thuộc vào kiểu gen giống và các yếu tố sinh thái. Lá là phần duy nhất nhìn thấy trên mặt đất, toàn bộ phần dọc lá tạo nên thân giả của cây. Mỗi lá cấu tạo bởi một cuống lá thẳng và một phiến lá. Phiến lá hình khiên, gốc hình tim, có rốn gần giữa (điểm nối giữa cuống và phiến lá). Trên phiến lá có 3 tia gân chính, một gân chạy từ rốn lá 6 Líp: K57A - Khoa Sinh học Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Hà Phạm Thị Thu đến đỉnh phiến lá, hai gân còn lại chạy ngang về 2 đỉnh của thùy lá. Từ 3 gân chính có nhiều gân nhỏ tỏa ra tạo thành hình mắt lưới. Cuống lá (dọc lá) xốp, trong nhu mô có nhiều khoảng trống. Dọc lá mập có bẹ ôm chặt phía gốc tạo nên thân giả. Bẹ của dọc lá có chiều dài khoảng 1/3 chiều dài của dọc. Hoa thuộc loại đơn tính, hoa đực và hoa cái thuộc trên cùng một trục. Cụm hoa cấu tạo bởi một cuống ngắn, một trục hoa và một bao mo dài khoảng 20 cm. Hoa không có bao, hoa đực màu vàng có nhị tụ nhiều cánh, hạt phấn tròn, bao phấn nứt rãnh. Hoa cái có bầu một ô, vòi rất ngắn. Hình thức thụ phần của khoai môn sọ chủ yếu là nhờ gió. Quả mọng có đường kính khoảng 3-5cm và chứa nhiều hạt. Hạt thuộc loại có nội nhũ. Tuy nhiên trong tự nhiện sinh sản bằng hạt ở khoai môn sọ rất hiếm xảy ra[4]. 1.4. Sinh trưởng và phát triển Từ khi trồng đến khi thu hoạch cây khoai môn sọ trải qua 3 thời kỳ sinh trưởng: ra rễ mọc mầm, sinh trưởng thân lá, phình to của thân củ. * Giai đoạn ra rễ mọc mầm: Ngay sau khi mọc mầm, rễ hình thành và phát triển nhanh chóng, tiếp đó là sự phát triển nhanh của chồi (mầm) củ. Chồi mầm ra khỏi mặt đất thì rễ dài khoảng 3-5 cm. Sự phát triển của rễ tỷ lệ thuận với sự phát triển của lá: cứ ra một lá thì lại sinh thêm một lớp rễ. * Giai đoạn sinh trưởng thân lá: Sự hình thành của củ cái bắt đầu sau trồng khoảng 3 tháng, ngay sau đó là sự hình thành của củ con. Trong giai đoạn này cây cũng đẻ nhánh phụ. Sự phát triển của lá và chồi giảm mạnh sau trồng khoảng 5-6 tháng. * Giai đoạn phình to của thân củ: Khi phát triển của chồi giảm thì củ cái và củ con phát triển rất nhanh. Cuối vụ (đầu vụ khô) bộ rễ và các chồi chính chết là thời điểm thu hoạch củ. Nếu củ không được thu hoạch thì củ cái và củ con cho phép cây tồn tại qua mùa khô và mọc thành cây mới vào vụ tiếp theo. Nhữnxg vùng không có mùa khô, sau khi thân tàn củ lại mọc mầm mới và tiếp tục phát triển. Líp: K57A - Khoa Sinh học Nội 7 Trường ĐHSP Hà Khóa luận tốt nghiệp Hà Phạm Thị Thu * Quá trình ra hoa và kết hạt ở khoai môn sọ là rất hiếm thấy trong tự nhiên, chỉ xảy ra đối với một số kiểu gen. Hoa quan sát thấy khá sớm cùng với sự hình thành của củ, hoa được thụ phấn nhờ côn trùng. Tuy nhiên, các giống đều kết thúc vòng đời trên đồng ruộng mà không có thời kì ra hoa. Ở Việt Nam trong điều kiện tự nhiên chỉ có các giống khoai nước thường ra hoa, còn khoai sọ rất hiếm. Từ khi bắt đầu ra hoa đến khi hoa bắt đầu lụi mất khoảng 20- 25 ngày. 1.5. Điều kiện sinh thái Cây khoai môn sọ yêu cầu nhiệt độ trung bình ngày trên 21 0C. Điều kiện nhiệt độ thấp và sương mù làm cây giảm sinh trưởng và cho năng suất thấp. Cây có bề mặt thoát hơi nước lớn nên có yêu cầu về độ ẩm cao, cần lượng mưa hoặc nước tưới khoảng 1500 – 2000mm để cho năng suất tối ưu. Cây khoai môn sọ đạt năng suất cao nhất trong điều kiện cường độ ánh sáng cao và năng suất giảm rõ rệt ở điều kiện khô hạn. Nhưng nó lại là loại cây chịu được bóng râm hơn hầu hết các loại cây khác. Sự hình thành củ được kích thích bởi điều kiện ngày ngắn, trong khi đó sự ra hoa được kích thích bởi điều kiện ngày dài. Cây có thể cho năng suất hợp lý ngay trong điều kiện che bóng, nơi những cây trồng khác không thể phát triển được. Đây là đặc tính ưu việt,vì thế cây khoai môn sọ được coi là cây trồng xen lý tưởng. Cây khoai môn sọ thích ứng được với nhiều loại đất khác nhau, được trồng nhiều ở loại đất chua (pH 5,5 – 6,5), thành phần đất nhẹ và nhiều mùn. Tuy nhiên, cây môn sọ phát triển tốt nhất trên đất tương đối chua, ngoài ra một số giống có tính chịu mặn cao. Có lẽ vì thế ở Nhật Bản và Ai Cập, khoai môn đã được sử dụng tốt như một cây trồng tiên phong trong cải tạo đất mặn (Kay, 1973). Đây chắc chắn sẽ mở ra khả năng cho việc sử dụng khoai môn để khai thác một số nơi có điều kiện sinh thái khó khăn mà các Líp: K57A - Khoa Sinh học Nội 8 Trường ĐHSP Hà Khóa luận tốt nghiệp Hà Phạm Thị Thu cây trồng khác không thể phát triển. Cũng như các loại cây trồng lấy củ khác, cây môn sọ yêu cầu đất tốt đầy đủ NPK và các nguyên tố vi lượng để cho năng suất cao. Như vậy, cây khoai môn sọ là loại cây chịu được hạn, chịu đất chua, đất mặn, đất nghèo dinh dưỡng, phù hợp để khai thác tại những vùng sinh thái khó khăn, nơi những cây trồng khác không thể trồng được hoặc kém phát triển. Khoai môn sọ là loại cây dài ngày, yêu cầu độ ẩm khá cao cho sinh trưởng và phát triển[11]. 1.6. Thành phần dinh dưỡng, giá trị kinh tế và sử dụng * Thành phần dinh dưỡng: Phần có giá trị kinh tế chính của khoai môn sọ là củ cái, củ con và một số giống là dọc lá. Trong củ tươi, nước chiếm 63 - 65% , hydratcacbon chiếm 13 - 29%, protein chiếm 1,4 - 3,0% với rất nhiều axit amin cần thiết cho cơ thể. Tinh bột chiếm tới 77,9% lượng hydratcacbon với 4/5 là amylopectin và 1/5 là amylose. Hạt tinh bột của khoai môn sọ rất nhỏ, dễ tiêu hoá. Chính yếu tố này đã khiến khoai môn sọ có thể thay thế các loại cây lương thực khác, là món ăn đặc biệt dành cho trẻ nhỏ bị dị ứng, những người rối loạn dinh dưỡng và người ăn chay. Lá khoai môn sọ rất giàu protein, chứa khoảng 23% khối lượng khô, ngoài ra lá chứa nhiều Ca, P, Fe, Vitamin C, thiamin, riboflavin. * Giá trị kinh tế: Cây khoai môn sọ được sử dụng làm lương thực và thực phẩm khá phổ biến trên thế giới. Các bộ phận của cây là củ cái, củ con, dọc lá và dải bò đều có thể chế biến thành các món ăn. Trồng khoai sọ lãi hơn trồng lúa nếu được chăm sóc đúng kĩ thuật, năng suất trung bình đạt 5 - 6 tấn/ ha, có nơi đạt đến 12 - 13 tấn/ ha với giá trung bình 5000 – 7000VNĐ/kg. Mặt khác, người dân có thể trồng cây khoai môn sọ tại những vùng đất xấu hoặc trồng xen với các loại cây khác để tăng thu nhập. Ngoài ra, một số giống khoai môn sọ được dùng làm thuốc để chữa bệnh đau đầu, kiết lỵ, tê phù,…và một số giống lại được trồng để làm cảnh[7]. 1.7. Kĩ thuật trồng và chăm sóc Líp: K57A - Khoa Sinh học Nội 9 Trường ĐHSP Hà Khóa luận tốt nghiệp Hà Phạm Thị Thu Giống: Có nhiều giống khoai môn nổi tiếng như khoai ruột đỏ, ruột tím ở Bắc Kạn; khoai sáp ruột vàng ở Ninh Bình, Lục Yên (Yên Bái), Văn Lâm, Khoái Châu (Hưng Yên), khoai sọ núi Lai Châu, Hòa Bình, khoai Chũ (Bắc Giang),… Ở miền Bắc khoai môn chủ yếu được trồng ở các tỉnh miền núi và trung du, ít trồng ở vùng đồng bằng đất thấp bị ngập nước vì dễ sượng và ngứa. Giống khoai sọ núi củ to, nhiều tinh bột, ăn ngon được trồng chủ yếu ở các tỉnh miền núi như Yên Bái, Lai Châu, Thái Nguyên, Bắc Kạn, Hòa Bình… Ngược lại các tỉnh phía Nam như An Giang, Bến Tre, Cần Thơ… khoai môn được trồng nhiều ở vùng đất bãi, đồng bằng để bán cho các cơ sở xuất khẩu. Tuy nhiên, các giống khoai môn miền núi vẫn có thể trồng được ở đồng bằng nhưng nên chọn các vùng đất cao, tơi xốp, dễ thoát nước và đặc biệt là lên luống cao như trồng khoai lang mới không bị sượng và ngứa. Cách nhân giống: Trước khi trồng 1 tháng nên chọn những củ nhánh nhỏ, đều nhau đem giâm trong cát ẩm nơi góc nhà ít ánh sáng cho mọc mầm rồi đem trồng ra ruộng thì tỷ lệ sống mới cao. Thời vụ: Khoai môn là loại cây nhiệt đới nên có thể trồng được quanh năm. Tuy nhiên thích hợp và cho năng suất cao nhất ở vụ đông xuân. Với các tỉnh phía Nam nên xuống giống từ tháng 10-12, thu hoạch từ tháng 4 đến tháng 6 năm sau. Các tỉnh miền Bắc do nhiều giống có thời gian sinh trưởng dài hơn (thường từ 8-12 tháng), đặc biệt vùng ĐBSH có 2 vụ trồng khoai môn: vụ xuân trồng tháng 3-4, vụ thu trồng tháng 8-9. Khoai sọ có thể trồng tháng 11-12 và tháng 7 hàng năm. Chuẩn bị đất trồng: Chọn đất tốt, tơi xốp, giàu mùn, cao ráo, dễ thoát nước để trồng khoai môn, khoai sọ. Các loại đất thịt nhẹ, cát pha, đất vườn miền núi, trung du mới khai hoang thường cho năng suất cao, củ to và chất lượng tốt, ăn không sượng, không ngứa. Ngược lại nếu đất thấp, dễ bị ngập nước, nhất là thời gian sắp cho thu hoạch mà bị mưa nhiều hoặc đất ướt thì Líp: K57A - Khoa Sinh học Nội 10 Trường ĐHSP Hà Khóa luận tốt nghiệp Hà Phạm Thị Thu củ không hình thành bột được, ăn sượng và rất ngứa. Đất được cày sâu, để ải ít nhất 15-20 ngày rồi bừa kỹ, bón nhiều phân hữu cơ và lên luống cao. Nếu trồng khoai sọ nên lên luống rộng 2-3m để trồng thành băng; với khoai môn tốt nhất là trồng luống hẹp hơn: luống đôi 1,2-1,4m hoặc luống đơn 60cm, cao 50-60cm. Trồng và chăm sóc: Trên mặt luống trồng các cây cách nhau 3040cm, nếu là luống đôi thì hàng cách hàng 60cm. Trộn đều phân với đất và trồng thấp hơn mặt đất 3-4cm. Tủ rơm rạ dày 7-10cm rồi tưới nhẹ đủ ẩm. Nếu có điều kiện trước khi trồng 1 ngày nên phun thuốc trừ cỏ tiền nảy mầm Ronstar (100cc/1000m2) để hạn chế cỏ mọc. Những ngày đầu tưới nước 1 lần, sau khi khoai đã lên cao có thể tưới rãnh nhưng không để ngập mặt luống. Lượng phân bón được tính cho 1 sào (360m2) bao gồm: 1 tấn phân chuồng hoai mục + 8 kg đạm urê + 30 kg supe lân + 8 kg kali. Bón lót toàn bộ phân chuồng và 2/3 lân. Bón lót lần 1 khi cây được 3 lá với 1/2 lượng đạm, 1/3 kali kết hợp làm cỏ và vun xới. Bón thúc lần 2 sau trồng 60-70 ngày với lượng đạm và lân còn lại và 1/3 lượng kali. Bón thúc lần 3 sau khi trồng 150 ngày với số phân kali còn lại kết hợp vun gốc cao cho khoai làm củ. Trước khi thu hoạch 1-2 tháng hạn chế tưới nước và ngừng hẳn để củ chuyển hóa tinh bột hoàn toàn. Chú ý phát hiện và phòng trừ một số dịch hại như rệp, nhện đỏ và bệnh thối củ do nấm gây nên. Thu hoạch: Khi thấy cây khoai đã héo rũ, các tàu lá đã lụi dần, đất ở gốc đã nứt nẻ nhiều thì tiến hành dỡ khoai nhẹ nhàng, tránh xây xước, dập nát. Tách củ phân loại theo kích cỡ để tiêu thụ hoặc để làm giống. Bảo quản khoai thương phẩm và khoai giống nơi thoáng mát, cao ráo[1][13]. 2. Công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật trong công tác giống cây trồng 2.1. Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.1.1. Định nghĩa Líp: K57A - Khoa Sinh học Nội 11 Trường ĐHSP Hà Khóa luận tốt nghiệp Hà Phạm Thị Thu Nuôi cấy mô, tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng. Nuôi cấy mô, tế bào thực vật còn gọi là nuôi cấy thực vật in vitro (trong ống nghiệm) để phân biệt với các quá trình nuôi cấy trong điều kiện tự nhiên ngoài ống nghiệm gọi là nuôi cấy in vivo. 2.1.2. Khả năng sử dụng nuôi cấy mô và tế bào thực vật vào công tác giống cây trồng * Các loại nuôi cấy mô, tế bào thực vật: - Nuôi cấy cây non và cây trưởng thành. - Nuôi cấy cơ quan: rễ, thân, lá, hoa, quả, bao phấn, noãn chưa thụ tinh. - Nuôi cấy phôi: phôi non và phôi trưởng thành. - Nuôi cấy mô sẹo (callus). - Nuôi cấy tế bào đơn (huyền phù tế bào). - Nuôi cấy protoplast: nuôi cấy phần bên trong tế bào thực vật sau khi đã tách vỏ, còn gọi là nuôi cấy tế bào trần. 2.1.3. Cơ sở sinh học của kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật 2.1.3.1.Tính toàn năng của tế bào Haberlandt (1902) lần đầu tiên đã quan niệm rằng mỗi tế bào bất kỳ của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Theo quan niệm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả cơ thể sinh vật đó. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Đó là tính toàn năng của tế bào. Líp: K57A - Khoa Sinh học Nội 12 Trường ĐHSP Hà Khóa luận tốt nghiệp Hà Phạm Thị Thu Tính toàn năng của tế bào do Haberlandt nêu ra chính là chính là cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô, tế bào thực vật. Cho đến nay con người đã hoàn toàn chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ[4]. 2.1.3.2. Sự phản phân hóa và phân hóa của tế bào * Sự phân hóa tế bào Cơ thể thực vật trưởng thành là một chỉnh thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, được hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau. Tuy nhiên tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên (tế bào hợp tử). Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử tiếp tục phân chia hình thành niều tế bào phôi sinh chưa mang chức năng riêng biệt (chuyên hóa). Sau đó từ các tế bào phôi sinh này chúng tiếp tục được biến đổi thành các tế bào chuyên hóa đặc hiệu cho các mô, cơ quan có chức năng khác nhau. Khái niệm: Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô chuyên hóa, đảm nhận các chức năng khác nhau. * Sự phản phân hóa Khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng chuyên biệt chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình. Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ. Quá trình đó gọi là phản phân hóa tế bào, ngược lại với sự phân hóa tế bào. Phân hóa tế bào Tế bào phôi sinh Tế bào dãn Tế bào chuyên hóa Phản phân hóa tế bào Ví dụ: Khi nuôi cấy mô thuốc lá, các tế bào đã phân hóa của lá gặp điều kiện thích hợp của môi trường sẽ phản phân hóa và liên tục phân chia Líp: K57A - Khoa Sinh học Nội 13 Trường ĐHSP Hà Khóa luận tốt nghiệp Hà Phạm Thị Thu tạo thành các mô sẹo (callus). Các tế bào của mô sẹo không còn có chức năng như tế bào lá nữa. Nếu chuyển mô sẹo này sang môi trường khác, tùy theo thành phần môi trường mà tế bào mô sẹo lại có thể phân hóa theo hướng hình thành chồi, rễ và có thể hình thành nên cây hoàn chỉnh. Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt hóa, ức chế các gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen được hoạt hóa (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho ra tính trạng mới, còn một số gen khác lại bị “đình chỉ” hoạt động. Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc của phân tử ADN của mỗi tế bào khiến quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn được hài hòa. Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thường bị ức chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách riêng các tế bào hoặc giảm kích thước của khối mô sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự hoạt hóa các gen của tế bào. Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật thực chất là kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào. Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật xét cho đến cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo và vô trùng) một cách định hướng dựa vào sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào trên cơ sở tính toàn năng của tế bào thực vật. Để điều khiển sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy, người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy hai nhóm chất điều tiết sinh trưởng thực vật là auxin và cytokinin. Tỷ lệ hàm lượng hai nhóm chất này trong môi trường khác nhau sẽ tạo sự phát sinh hình thái khác nhau. Tỷ lệ nồng độ auxin (đại diện là IAA)/cytokinin (đại diện là kinetin) trong môi trường nuôi cấy thấp thì sự sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy Líp: K57A - Khoa Sinh học Nội 14 Trường ĐHSP Hà Khóa luận tốt nghiệp Hà Phạm Thị Thu theo hướng tạo chồi, cao thì mô nuôi cấy sẽ phát sinh hình thái theo hướng tạo rễ, cân đối sẽ phát sinh theo hướng tạo mô sẹo (callus). Một số đường hướng phát sinh hình thái của mô nuôi cấy: Bảng 1 (Phụ lục) [4]. Líp: K57A - Khoa Sinh học Nội 15 Trường ĐHSP Hà Khóa luận tốt nghiệp Hà Phạm Thị Thu 2.2. Nhân giống vô tính in vitro 2.2.1. Ý nghĩa Đây là lĩnh vực mà nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã mang lại hiệu quả kinh tế to lớn thực sự. Một trong những ưu việt của phương pháp nhân in vitro là việc sử dụng các mô nuôi cấy ở kích thước nhỏ: - Sự tương tác giữa các tế bào trong mô sẽ đơn giản hơn. - Tác động của các phương pháp sẽ hiệu quả hơn. - Mô nuôi cấy dễ phân hóa và sau đó dễ tái sinh hơn. Kỹ thuật nhân nhanh in vitro có những ưu việt mà các phương pháp khác không có được đó là: - Có thể nhân giống cây trồng ở quy mô công nghiệp (kể cả trên các đối tượng khó nhân bằng phương pháp thông thường). - Có hệ số nhân cao. - Tính đồng nhất về mặt di truyền của các cá thể tạo ra cao. Kỹ thuật nhân nhanh được ứng dụng vào các mục đích sau: - Duy trì và nhân nhanh các các kiểu gen quí làm vật liệu cho công tác giống. - Nhân nhanh các loài hoa, cây cảnh khó trồng bằng hạt. - Duy trì nhân nhanh các dòng bố mẹ và các dòng lai để tạo hạt giống cây rau, cây hoa và cây trồng khác. - Nhân nhanh kết hợp với làm sạch virus. - Bảo quản tập đoàn gen. Với phương pháp này nhiều giống cây hoa (hoa lan, cẩm chướng, đồng tiền, lily, cúc,…), cây lương thực, thực phẩm (khoai tây, súp lơ, măng tây, cọ dầu, mía, cà phê, cải dầu,…), cây ăn quả(chuối, dứa, dâu tây,…), cây Líp: K57A - Khoa Sinh học Nội 16 Trường ĐHSP Hà Khóa luận tốt nghiệp Hà Phạm Thị Thu lâm nghiệp (bạch đàn, keo lai, thông, tùng, dứa sợi,…) đã được phổ biến rất nhanh vào trong sản xuất. 2.2.2. Quy trình nhân giống vô tính in vitro Theo Georger (1993) quá trình nhân giống vô tính in vitro gồm các bước sau: - Bước 0: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ + Chọn cây mẹ để lấy mẫu: thường là cây ưu việt, sạch bệnh, ở giai đoạn sinh trưởng mạnh +Chọn cơ quan để lấy mẫu: thường là chồi non, đoạn thân có chồi ngủ, hoa non hoặc lá non +Mô chọn để nuôi cấy thường là mô có khả năng tái sinh cao, sạch bệnh giữ được các đặc tính sinh học quý của cây mẹ. Thường sử dụng mô phân sinh của chồi đỉnh. Việc chọn lọc và chuẩn bị vật liệu khởi đầu tốt sẽ làm giảm tỉ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh trưởng của mẫu cấy in vitro - Bước 1: Nuôi cấy khởi động là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro. Giai đoạn này cần đảm bảo tỉ lệ nhiễm thấp, tỉ lệ mẫu sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt. - Chuẩn bị môi trường có các chất dinh dưỡng cần thiết và các chất điều hòa sinh trưởng thích hợp sau đó được hấp khử trùng. - Khử trùng bề mặt mẫu vật. - Cấy mẫu vô trùng vào môi trường nhân tạo (ống nghiệm, bình tam giác), giai đoạn này gọi là cấy mẫu in vitro Các mẫu nuôi cấy nếu không bị nhiễm khuẩn, nấm hoặc virus sẽ được lưu giữ trong phòng với điều kiện nhiệt độ, ánh sáng thích hợp. Sau một thời gian nhất định, từ mẫu nuôi cấy bắt đầu xuất hiện các cụm tế bào hoặc cơ Líp: K57A - Khoa Sinh học Nội 17 Trường ĐHSP Hà Khóa luận tốt nghiệp Hà Phạm Thị Thu quan (chồi, cụm chồi, rễ) hoặc phôi vô tính có đặc điểm gần như phôi hữu tính. Giai đoạn này cần ít nhất 4 lần cấy chuyển - Bước 2: Nhân nhanh Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng số lượng thông qua các con đường: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô tính. Vấn đề là phải xác định được môi trường nuôi cấy và điều kiện ngoại cảnh thích hợp để có hiệu quả cao nhất. + Theo nguyên tắc chung môi trường có nhiều cytokinin sẽ kích thích tạo chồi. + Chế độ nuôi cấy thường là: 25-270C;16h chiếu sáng/ngày, cường độ ánh sáng 2000-4000 lux Tuy nhiên đối với mỗi đối tượng nuôi cấy đòi hỏi chế độ nuôi cấy khác nhau. Chẳng hạn + Nhân nhanh súp lơ cần quang chu kỳ 9h chiếu sáng/ ngày. + Nhân nhanh phong lan Phalenopsis ở giai đoạn đầu cần che tối,… Quy trình cấy chuyển để nhân nhanh chồi khoảng 1 - 2 tháng tùy loại cây. Hệ số nhân nhanh là 2 - 8 lần/ lần cấy chuyển. - Bước 3: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh Để tạo rễ cho chồi, người ta chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh sang môi trường tạo rễ. Môi trường tạo rễ thường được bổ sung một lượng nhỏ auxin. Một số chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trường nhân nhanh giàu cytokinin sang môi trường không chứa chất điều tiết sinh trưởng. Giai đoạn này thường kéo dài từ 2-4 tuần - Bước 4: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên Líp: K57A - Khoa Sinh học Nội 18 Trường ĐHSP Hà Khóa luận tốt nghiệp Hà Phạm Thị Thu Để đưa cây từ ống nghiệm ra vườn ươm với tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởng tốt cần đảm bảo một số yếu cầu: + Cây trong ống nghiệm đã đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định (số lá, số rễ, chiều cao cây). + Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thoát nước. + Phải chủ động điều chỉnh được ẩm độ, sự chiếu sáng của vườn ươm cũng như có chế độ dinh dưỡng phù hợp. 2.2.3. Các phương thức nhân giống in vitro Dựa trên sự phát sinh hình thái của mẫu mà có các phương thức nhân giống vô tính in vitro sau đây: * Hoạt hóa chồi nách. Sự phát triển của chồi nách được kích thích bằng cách loại bỏ ưu thế ngọn khi nuôi cấy các đỉnh sinh trưởng và các đoạn thân mang mắt ngủ. Theo phương pháp này sự phát triển của chồi nách diễn ra theo 2 cách: - Cây phát triển trực tiếp từ chồi đỉnh hoặc chồi nách (thường gặp khi nuôi cấy cây hai lá mầm) - Tạo cụm chồi từ chồi đỉnh hoặc chồi nách (thường gặp khi nuôi cấy cây một lá mầm) * Tạo chồi bất định: Khi mẫu cấy không phải chồi đỉnh mà là các bộ phận khác như: thân, lá, mảnh lá, cuống hoa,….Trong trường hợp này các tế bào soma hình thành chồi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua giai đoạn phát triển mô sẹo. Trong trường hợp mô nuôi cấy không tái sinh trực tiếp thành cây mà phát triển thành mô sẹo thì mô sẹo phải qua cấy chuyển mới tạo thành cây. Trường hợp này dễ có sự không ổn định di truyền. Để khắc phục người ta chỉ sử dụng mô sẹo vừa hình thành để tái sinh cây vì mô sẹo qua nhiều lần cấy chuyển sẽ phát sinh biến dị. Líp: K57A - Khoa Sinh học Nội 19 Trường ĐHSP Hà Khóa luận tốt nghiệp Hà Phạm Thị Thu Ở cây một lá mầm thường gặp sự phát triển qua giai đoạn dẻ hành (protocorm) cùng một lúc mẫu cấy tạo hàng loạt protocorm, các cá thể này hoặc tiếp tục sinh protocorm mới hoặc phát triển thành cây, phương pháp này cho hệ số nhân giống rất cao. * Tạo phôi vô tính: Phôi là sản phẩm tự nhiên của quá trình thụ tinh trong sinh sản hữu tính. Tuy nhiên trong nuôi cấy in vitro, phôi có thể hình thành từ các tế bào soma và gọi là phôi vô tính. Phôi vô tính có thể tái sinh cây hoàn chỉnh hoặc sử dụng làm nguyên liệu sản xuất hạt giống nhân tạo. 2.3. Môi trường nuôi cấy 2.3.1.Thành phần cơ bản của môi trường nuôi cấy Thành phần hóa học của môi trường đóng vai trò quyết định thành công cho nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Mỗi loài cây, kiểu gen giống, kiểu nuôi cấy khác nhau (mô sẹo, huyền phù tế bào, tế bào trần, hạt phấn) có những đòi hỏi khác nhau về thành phần môi trường. Khi bắt đầu nuôi cấy mô một loài mới hoặc một giống mới, cần phải lựa chọn cho đối tượng nghiên cứu một loại môi trường cơ bản phù hợp. Hiện nay, các nhà khoa học đã tạo ra một số lượng rất lớn các môi trường thích hợp với từng đối tượng và mục tiêu nghiên cứu trong đó có một số môi trường cơ bản được sử dụng rất phổ biến. Các môi trường khoáng cơ bản được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật là: môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962) ; môi trường B5 (Gamborg cs., 1968) ; môi trường White (1963). Môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật gồm một số thành phần cơ bản như: muối khoáng (đa lượng và vi lượng), các vitamin, các amino axit, nguồn cacbon (một số loại đường), các phytohoocmon, các chất hữu cơ bổ sung (nước dừa, dịch chiết nấm men…), chất làm thay đổi trạng thái môi trường (các loại thạch). Líp: K57A - Khoa Sinh học Nội 20 Trường ĐHSP Hà