Tài liệu Nghiên cứu quy trình nhân giống cây thanh long bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH – KTNN ******************** ĐỖ THỊ THU PHƯỢNG NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CÂY THANH LONG BẰNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật HÀ NỘI, 2016 TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH – KTNN ******************** ĐỖ THỊ THU PHƯỢNG NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CÂY THANH LONG BẰNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật Người hướng dẫn khoa học PGS.TS. NGUYỄN VĂN MÃ HÀ NỘI, 2016 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Văn Mã và TS. La Việt Hồng – Khoa Sinh KTNN Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin cảm ơn tới Ban Giám hiệu trường ĐHSP Hà Nội 2, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN trường ĐHSP Hà Nội đã tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành khoá luận này. Trong thời gian thực hiện đề tài tôi cũng nhận được sự giúp đỡ tận tình của cô Mai Thị Hồng – Phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật đã giúp đỡ, đóng góp ý kiến để tôi hoàn thành đề tài khoá luận, nhân đây tôi cũng xin giử lời cảm ơn. Tôi cũng xin trân thành cảm ơn tập thể cán bộ Phòng thí nghiệm Sinh lý Thực vật – trường ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo điều kiện thuận lợi về thiết bị, phương tiện để tôi có thể hoàn thành khoá luận này. Cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, góp ý cho tôi trong quá trình học tập và hoàn thành đề tài. Hà Nội, 10 tháng 04 năm 2016 Sinh Viên Đỗ Thị Thu Phượng LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong khoá luận là trung thực và chưa được ai công bố. Hà Nội, 10 tháng 04 năm 2016 Sinh viên Đỗ Thị Thu Phượng MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU...........................................................................................................1 1. Lý do chọn đề tài........................................................................................1 2. Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu..............................................................2 3. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn.......................................................................3 NỘI DUNG....................................................................................................... 4 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU...........................................................4 1.1. Giới thiệu về cây Thanh long..................................................................4 1.2. Đặc điểm sinh học...................................................................................5 1.2.1. Sinh thái............................................................................................5 1.2.2. Thực vật học.....................................................................................5 1.3. Giá trị sử dụng........................................................................................ 6 1.4. Tình hình sản xuất và tiêu thụ Thanh long ở nước ta............................. 7 1.5. Một số nghiên cứu về cây Thanh long....................................................8 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................10 2.1. Vật liệu nghiên cứu...............................................................................10 2.2. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm..............................................................10 2.2.1. Dụng cụ.......................................................................................... 10 2.2.2. Thiết bị............................................................................................10 2.3. Môi trường nuôi cấy............................................................................. 10 2.4. Điều kiện nuôi cấy in vitro....................................................................11 2.5. Phương pháp nghiên cứu...................................................................... 11 2.5.1. Sơ đồ nghiên cứu............................................................................11 2.5.2. Phương pháp phân tích thống kê dữ liệu thực nghiệm...................14 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................. 15 3.1. Tạo vật liệu khởi đầu............................................................................ 15 3.2. Nhân nhanh chồi in vitro cây Thanh long.............................................17 3.3. Tạo cây hoàn chỉnh: Ra rễ cho cây Thanh long in vitro....................... 20 3.4. Rèn luyện cây Thanh long in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên.............................................................................................................22 SƠ ĐỒ QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG THANH LONG IN VITRO................24 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................25 4.1. Kết luận.................................................................................................25 4.2. Kiến nghị...............................................................................................25 TÀI LIỆU THAM KHẢO...............................................................................26 PHỤ LỤC........................................................................................................29 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Tạo vật liệu in vitro cây Thanh long từ đốt thân............................12 Bảng 2.2. Công thức thí nghiệm ảnh hưởng của BAP và NAA đến sự tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro từ đốt thân cây Thanh long 13 Bảng 2.3. Công thức thí nghiệm ảnh hưởng của NAA đến sự hình thành rễ của chồi Thanh long in vitro 13 Bảng 2.4. Công thức thí nghiệm ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng và phát triển của cây Thanh long in vitro 14 Bảng 3.1: Kết quả tạo vật liệu khởi đầu từ đốt thân cây Thanh long.............16 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của BAP và NAA đến sự tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro từ đốt thân cây Thanh long 18 Bảng 3.3: Ảnh hưởng của NAA đến sự hình thành rễ của chồi Thanh long in vitro 21 Bảng 3.4: Ảnh hưởng của giá thể đến sự thuần hoá cây Thanh long in vitro 22 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cây Thanh long trồng ngoài tự nhiên................................................................12 Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu............................................................................................................18 Hình 3.2. Ảnh hưởng của BAP và NAA đến sự tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro từ đốt thân cây Thanh long..........................................................27 Hình 3.3. Ảnh hưởng của NAA đến sự hình thành rễ của chồi Thanh long in vitro.......................................................................................................................30 Hình 3.4. Thanh long trồng ngoài vườn ươm trên các giá thể khác nhau(100% đất, đất: cát (1:1), đất: xơ dừa (1:1)Error! Bookmark not defined DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT NAA Napthlacetic acid BAP 6- Benzyl amino purin MS Murashige và Skoog ĐC Đối chứng CT Công thức Nxb Nhà xuất bản Tp. HCM Thành phố Hồ Chí Minh MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Thanh long (tên tiếng Anh là Pitahaya, hay còn gọi là Dragon fruit) thuộc họ Xương rồng (Cactaceae), có nguồn gốc ở các vùng sa mạc thuộc Mehico và Colombia [1], [13]. Thanh long đang dần trở thành trái cây ưa thích của nhiều người bởi tính mát, mềm và chứa nhiều khoáng chất, vitamin. Hoạt chất lycopene trong Thanh long có khả năng chống ung thư, chống lão hóa, điều trị các bệnh về mắt, vô sinh nam, viêm và loãng xương, quản lý bệnh tiểu đường và bảo vệ gan. Giảm nồng độ homocysteine và cholesterol, ngăn ngừa bệnh tim mạch vành. Làm tăng hệ thống miễn dịch, giúp tiêu hóa và tuần hoàn máu. Giúp kiểm soát các áp lực tinh thần và vô hiệu hóa các chất độc trong cơ thể [18]. Thanh long được du nhập vào nước ta từ lâu, tuy nhiên trái Thanh long mới được quan tâm đến trong những năm gần đây. Diện tích trồng Thanh long phát triển nhanh, không những ở các tỉnh miền Nam, miền Trung mà miền Bắc cũng đã có nhiều nơi trồng Thanh long cho kết quả tốt. Do nhu cầu xuất khẩu ngày càng tăng cùng với hiệu quả kinh tế mà cây Thanh long mang lại đã giúp người nông dân nâng cao, cải thiện cuộc sống, diện tích trồng Thanh long đang được tăng lên đáng kể. Song song với sự phát triển đó, cây Thanh long có thể sẽ mất dần những đặc tính ưu việt và có khả năng giống cây Thanh long sẽ dần bị thoái hóa, đi cùng với vấn đề thiếu cây giống, mất dần sự đồng nhất về chất lượng. Do đó, việc duy trì nguồn giống sạch bệnh để có thể đáp ứng được nhu cầu cây giống chất lượng đồng nhất và cây sạch bệnh cho thị trường đòi hỏi ứng dụng các tiến bộ khoa học kĩ thuật. Thông thường, Thanh long được nhân giống bằng phương pháp giâm cành. Tuy nhiên, tỷ lệ nhân là rất thấp và rất khó để có đủ vật liệu trồng vì cần kích thước lớn (khoảng 50cm) của hom. Hơn nữa, nhân giống theo phương pháp truyền 1 thống không đảm bảo được cây sạch bệnh. Mặc dù hạt Thanh long có tỷ lệ nảy mầm khá cao (71-83%) [15] nhưng giống có nguồn gốc từ hạt thường sinh trưởng chậm, cần thời gian dài để ra hoa cho quả, trì hoãn sản xuất trái cây trong nhiều năm [3]. Phương pháp nuôi cấy mô giúp sản xuất cây Thanh long với số lượng lớn có chất lượng cao (sạch bệnh) [8]. Về phương diện hệ số nhân giống, nhân giống in vitro là phương pháp không gì có thể sánh kịp, kể cả phương pháp nhân giống bằng hạt. Thí dụ: Mai Thị Tân và cộng sự đã đạt được hệ số nhân 532 trong vòng một năm đối với cây khoai tây bằng phương pháp này [9]. Bằng phương pháp nhân nhanh in vitro, người ta có thể cung cấp được 500000 cây con giống hệt nhau trong vòng một năm [20]. Trên thế giới, nhiều nghiên cứu về nhân giống in vitro cây Thanh long đã được thực hiện như Dahanayake và Ranawake (2011) [14], Qing-Jie Fan (2013) [17]... Ở Việt Nam, cũng có một số nghiên cứu về nhân giống cây Thanh long bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào như nghiên cứu gần đây của Tô Thị Nhã Trầm và các cộng sự (2014) [3]; Đặng Văn Tùng, Nguyễn Trần Đông Phương (2014) [2].... Tuy nhiên, các nghiên cứu này đều sử dụng hạt Thanh long đã khử trùng làm vật liệu nghiên cứu. Vì vậy, xuất phát từ lý do trên, đề tài này được thực hiện nhằm hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro cây Thanh long từ đốt thân, góp phần sản xuất cây giống sạch cung cấp cho thị trường. 2. Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu 2.1. Mục tiêu Nghiên cứu quy trình nhân giống in vitro cây Thanh long từ đốt thân, góp phần sản xuất cây giống với số lượng lớn và chất lượng tốt cung cấp cho thị trường. 2 2.2. Nhiệm vụ nghiên cứu - Tạo vật liệu in vitro từ đốt thân cây Thanh long. - Nhân nhanh chồi: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng tái sinh và tạo đa chồi của cây Thanh long. - Tạo cây hoàn chỉnh: Ra rễ cho cây Thanh long in vitro. - Rèn luyện cây Thanh long in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên. 3. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn 3.1. Ý nghĩa lý luận - Nhằm bổ sung vào nguồn tư liệu khoa học cho nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy mô cây Thanh long. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn - Cung cấp nguồn giống cây trồng sạch bệnh với số lượng lớn. 3 NỘI DUNG CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về cây Thanh long 1.1.1. Phân loại Thanh long tên khoa học: Hylocereus undatus (Haw.) Britton & Rose Họ: Xương rồng (Cactaceae) Bộ: Cẩm chướng (Caryophyllales) Phân lớp: Cẩm chướng (Caryophyliidae) Lớp: Ngọc lan (Magnolyopsida) Loài này được (Haw.) Britton & Rose mô tả khoa học đầu tiên năm 1918 (trong tác phẩm Fl. Bermuda 256 1918) [23], [13]. 1.1.2. Nguồn gốc Thanh long có nguồn gốc ở các vùng sa mạc thuộc Mehico và Colombia. Thanh long được người Pháp đem vào trồng ở Việt Nam trên 100 năm nay, nhưng mới được đưa lên thành hàng hoá từ thập niên 1980. Cây phân bố tập trung tại Bình Thuận, còn lại là Long An, Tiền Giang, TP.HCM, Khánh Hoà và một số nơi khác [1]. Hình 1.1. Cây Thanh long trồng ngoài tự nhiên [22] 4 1.2. Đặc điểm sinh học 1.2.1. Sinh thái Là cây có nguồn gốc nhiệt đới, chịu hạn giỏi, nên được trồng ở những vùng nóng. Một số loài chịu được nhiệt độ từ 50oC tới 55oC. Nhưng nó không chịu được giá lạnh. Chúng thích hợp khi trồng ở các nơi có cường độ ánh sáng mạnh, vì thế hễ bị che nắng thân cây sẽ ốm yếu và lâu cho quả. Cây mọc được trên nhiều loại đất khác nhau như đất xám bạc màu (Bình Thuận), đất phèn (TP.HCM), đất đỏ …; nó có khả năng thích ứng với các độ chua (pH) của đất rất khác nhau. Khi trồng Thanh long nên chọn các chân đất có tầng canh tác dày tối thiểu 30 - 50 cm và để có năng suất cao nên tưới và giữ ẩm cho cây vào mùa nắng [1]. 1.2.2. Thực vật học Rễ cây Khác hẳn với chồi cành, rễ Thanh long không mọng nước nên nó không phải là nơi tích trữ nước giúp cây chịu hạn. Cây Thanh long có hai loại rễ: địa sinh và khí sinh. Rễ địa sinh phát triển từ phần lồi ở gốc hom. Sau khi đặt hom từ 10 - 20 ngày thì từ gốc hom xuất hiện các rễ tơ màu trắng, số lượng rễ tăng dần và kích thước của chúng cũng tăng dần theo tuổi cây, những rễ lớn đạt đường kính từ 1 - 2 cm. Rễ địa sinh có nhiệm vụ bám vào đất và hút các chất dinh dưỡng nuôi cây. Rễ phân bố chủ yếu ở tầng đất mặt (0 - 15 cm). Khi đất khô các rễ sợi sẽ chết đi, các rễ cái lớn hơn sẽ hóa bần làm giảm sự dẫn nước khoảng 10 lần để ngăn chặn sự mất nước vào đất thông qua rễ. Khi đất ẩm rễ lại mọc trở lại một cách dễ dàng. Rễ khí sinh mọc dọc theo thân cây phần trên không, bám vào cây chống (choái) để giúp cây leo lên giá đỡ. Những rễ khí sinh nằm gần đất sẽ đi dần xuống đất [1]. 5 Thân, cành Thanh long (một loại xương rồng) trồng ở nước ta có thân, cành trườn bò trên trụ đỡ, trong khi ở một số nước trồng loại xương rồng thân cột. Thân chứa nhiều nước nên nó có thể chịu hạn một thời gian dài. Thân, cành thường có ba cánh dẹp, xanh, hiếm khi có 4 cánh. ở các nước khác có thứ 3, 4, 5 cánh. Mỗi cánh chia ra làm nhiều thùy có chiều dài 3 - 4cm. Đáy mỗi thùy có từ 3 5 gai ngắn [1]. Hoa Thanh long là cây ngày dài (trường quang kỳ). Tại Nam bộ hoa xuất hiện sớm nhất vào trung tuần tháng 3 dương lịch và kéo dài tới khoảng tháng 10 dương lịch, rộ nhất từ tháng 5 dương lịch tới tháng 8 dương lịch. Trung bình có từ 4 - 6 đợt ra hoa rộ mỗi năm. Hoa lưỡng tính, rất to, có chiều dài trung bình 25 - 35 cm, nhiều lá đài và cánh hoa dính nhau thành ống, nhiều tiểu nhị và 1 nhụy cái. Mùa ra hoa rộ là từ giữa tháng 5 tới cuối tháng 8 [1]. Quả và hạt Quả Thanh long hình bầu dục có nhiều tai lá xanh (do phiến hoa còn lại), đầu quả lõm sâu tạo thành “hốc mũi”. Khi còn non vỏ quả màu xanh, lúc chín chuyển qua đỏ tím rồi đỏ đậm. Thịt quả màu trắng cho đại đa số Thanh long trồng ở miền Nam Việt Nam [1]. 1.3. Giá trị sử dụng Thanh long là một loại cây ăn quả có giá trị xuất khẩu, hiệu quả kinh tế cao và đang có nhu cầu rất lớn ở trong và ngoài nước. Đặc biệt, Thanh long ruột đỏ được dùng làm thực phẩm, thuốc, mỹ phẩm vì có nhiều khoáng chất, năng lượng, vitamin, và một số chất có hoạt tính sinh học [6]. Hoạt chất lycopene trong Thanh long có khả năng chống ung thư, chống lão hóa, điều trị các bệnh về mắt, vô sinh nam, viêm và loãng xương, quản lý bệnh tiểu đường và bảo vệ 6 gan. Giảm nồng độ homocysteine và cholesterol, ngăn ngừa bệnh tim mạch vành. Làm tăng hệ thống miễn dịch, giúp tiêu hóa và tuần hoàn máu. Giúp kiểm soát các áp lực tinh thần và vô hiệu hóa các chất độc trong cơ thể [21]. Betacyanin là hợp chất tự nhiên làm giảm đáng kể nồng độ hormoncysteine (đồng phân của acid amine cysteine) trong cơ thể của chúng ta [19]. Bên cạnh đó Thanh long còn được xem là loại trái cây có thành phần chất xơ khá cao so với các loại trái cây khác giúp điều hoà hoạt động tiêu hoá, có khả năng làm giảm các chất béo, cholesterol… Trái Thanh long có thể ăn tươi, làm rượu, dùng làm các món cocktail, chè… giải nhiệt cho mùa hè nóng nực. 1.4. Tình hình sản xuất và tiêu thụ Thanh long ở nước ta Sản xuất cây ăn quả xuất khẩu đang là vấn đề quan tâm không chỉ đối với các nhà chuyên môn, mà cả đối với người dân. Thanh long ở miền Nam, đang có mặt ở nhiều thị trường trên thế giới và có hầu hết ở các vùng trên cả nước. Việt Nam có 35.665 ha diện tích trồng Thanh long với tổng sản lượng đạt khoảng 614.246 tấn. Thanh long hiện đang được trồng trên 32 tỉnh/thành phố, nhưng phát triển mạnh thành các vùng chuyên canh quy mô lớn tập trung ở các tỉnh như Bình Thuận, Tiền Giang và Long An (Vinafruits, 2014) [11]. Diện tích Thanh long của ba tỉnh này chiếm 93% tổng diện tích và 95% sản lượng của cả nước. Theo đánh giá của trung tâm thông tin (Bộ Thương mại), Thanh long ở tỉnh Bình thuận đứng đầu cả nước về năng suất và sản lượng. Trong 10 năm gần đây, sản lượng Thanh long ở đây tăng bình quân 33-38%/ năm. Tỉnh Bình Thuận, thu được kim ngạch xuất khẩu gần 9 triệu USD từ Thanh long với lượng xuất khẩu 25.000 tấn. Tuy nhiên điều này chưa thực sự phát huy hết thế mạnh của cây trồng, vì sản lượng Thanh long mỗi năm ở Bình Thuận lên tới 95.000 tấn do có nhiều mặt hạn chế như chất lượng sản phẩm chưa được an toàn, sản phẩm chưa được đồng đều… [10]. 7 Trái cây Việt Nam nói chung và Thanh long nói riêng được xuất khẩu sang khoảng 40 quốc gia và vùng lãnh thổ khác nhau. Kim ngạch xuất khẩu chính ngạch của trái cây tươi nói chung của Việt Nam là 307 triệu USD, trong đó Thanh long chiếm 61,4%. Ngoài các thị trường truyền thống xuất khẩu Thanh long như Trung Quốc, Thái Lan, Indonesia, Malaysia, Hà Lan và Đài Loan; Thanh long còn được xuất sang các thị trường khó tính như Mỹ, Ý, Nhật, Singapore và đang thâm nhập một số thị trường mới như Ấn Độ, New Zealand, Úc và Chi Lê (VinaFruit, 2013) [11]. 1.5. Một số nghiên cứu về cây Thanh long Trong nước Theo nghiên cứu của Tô Thị Nhã Trầm và các cộng sự (2014): Vật liệu sử dụng ban đầu là hạt Thanh long đã qua khử trùng. Sau 90 ngày nuôi cấy, kết quả cho thấy môi trường MS có bổ sung BAP 0,5 mg/l thích hợp cho sự tái sinh chồi từ mô sẹo (đạt 11,84 chồi, chiều cao chồi 3,66 cm). Môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l NAA cho thời gian xuất hiện rễ sớm nhất là 10 ngày sau cấy, số rễ đạt 3,84 rễ cũng như chiều dài rễ cao nhất là 1,81 cm. Ở giá thể vườn ươm, giá thể tốt nhất cho sự sinh trưởng và phát triển của cây Thanh long là đất và xơ dừa phối trộn theo tỷ lệ 1:1 [3]. Đặng Văn Tùng và các cộng sự (2014), “Nhân giống in vitro cây Thanh long ruột đỏ”: Hạt được khử trùng bằng javel 10% trong 10 phút. Cụm chồi được tạo thành cây con cao 1cm trên môi trường MS + BAP 1 mg/l là tốt nhất. Rễ hình thành tốt nhất trên môi trường MS + 0,5 mg/l. Chất trồng để ươm cây gồm 10% tro trấu, 85% cát và 5% phân bò ủ hoai [2]. Thế giới Chaturani G.D.G (2005), nghiên cứu khả năng nảy mầm của Thanh long ở trong ống nghiệm và ngoài tự nhiên. Kết quả cho thấy, trong ống nghiệm tỷ lệ hạt Thanh long nảy mầm cao hơn (98,5% trong môi trường MS), so với 8 các điều kiện ngoài tự nhiên (50% trong giấy lọc, 45% trong cát, 35% trong xơ dừa) [15]. El Obeidy A.A. (2006), nghiên cứu về các nhân tố ảnh hưởng đến nhân giống cây Thanh long bằng hom và hạt. Kết quả nghiên cứu cho rằng cắt 5cm chiều dài hom Thanh long, sau đó nhúng vào dung dịch IBA (10mM) trong 10s có thể cho hiệu quả nhân giống. Tính khả thi là 83%. Sự nảy mầm của hạt từ 71- 83% tuỳ thuộc vào nhiệt độ, bắt đầu sau 6 ngày ở 24- 28 o C, cường độ chiếu sáng ở 1000- 2000 LX giảm số lượng hạt nảy mầm [16]. Dahanayake N. and Ranawake A.L. (2011), đã kiểm tra khả năng tái sinh trực tiếp của chồi Thanh long, từ lá và thân cây giâm hom thu được từ trong ống nghiệm khi cho nảy mầm cây giống. Môi trường MS có bổ sung 2,5 mg/l BAP và 0,01 mg/l NAA là môi trường thích hợp nhất cho sự tái sinh của chồi từ lá và thân cây Thanh long. Sự hình thành rễ cao nhất trên môi trường MS có bổ sung 0,01 mg/l NAA [14]. Theo Qing-Jie Fan và cộng sự (2013), môi trường tốt nhất để nhân nhanh chồi Thanh long là môi trường MS có bổ sung 2 mg/l BAP và 0,5 mg/l NAA cho hệ số nhân chồi cao nhất đạt 8,2 chồi/mẫu. Sau một tháng, những chồi phát triển tốt được chuyển sang môi trường lỏng có chứa 1 mg/l NAA, tỷ lệ ra rễ đạt 100%. Trong 3 tuần nuôi cấy, có 6-10 rễ/chồi, chiều dài rễ 5-8 cm. Rửa sạch thạch bám vào rễ trong vòi nước chảy và chuyển sang chậu có chứa hỗn hợp đất: cát với tỷ lệ 1:1 [17]. 9 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu Cây Thanh long do Phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật (Khoa SinhKTNN, trường ĐHSP Hà Nội 2) cung cấp. 2.2. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm 2.2.1. Dụng cụ Dao cấy, khay cấy, kéo, túi nilon, bình tam giác, đèn cồn, bình xịt cồn, vỉ xốp nuôi cấy,… 2.2.2. Thiết bị Các thiết bị sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật: Cân kĩ thuật (Sartorius, Đức), tủ lạnh sâu (FRIGO), máy đo pH (HM30G/TOA, Đức), Nồi hấp khử trùng (HV – 110/HIRAYAMA, Nhật), Tủ lạnh Hitachi (31AG5D, Thái lan), Máy cất nước hai lần (Hamilton, Mỹ), Buồng cấy vô trùng (AV – 110/TELSTAR), Máy khuấy từ gia nhiệt (ARE/VELP, Italia), Cân phân tích (Sartorius, Đức). 2.3. Môi trường nuôi cấy - Các thí nghiệm nuôi cấy in vitro đều sử dụng môi trường dinh dưỡng cơ bản là MS (Murashige và Skoog, 1962) [12]. - Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật được sử dụng là BAP (6-Benzyl amino purin), NAA (Napthlacetic acid). - Các thành phần khác: Đường saccarose: 30g/l Agar: 7g/l pH môi trường: 5,8 Môi trường được khử trùng trong nồi hấp khử trùng ở nhiệt độ 117oC trong 15 phút. 10 2.4. Điều kiện nuôi cấy in vitro Các thí nghiệm đều được thực hiện trong điều kiện nhân tạo. Thời gian chiếu sáng: 16 giờ sáng/ 8 giờ tối. Nhiệt độ: 25 ± 2o C Độ ẩm: 50 – 60% Cường độ chiếu sáng là 1.800- 2000 lux. 2.5. Phương pháp nghiên cứu 2.5.1. Sơ đồ nghiên cứu Các thí nghiệm được bố trí theo sơ đồ sau: Chồi Thanh long ngoài tự nhiên Cồn, javel Cây Thanh long in vitro + BAP, NAA Nhân nhanh Thanh long + NAA Tạo cây Thanh long in vitro hoàn chỉnh Đất, cát, xơ dừa Rèn luyện cây in vitro ngoài môi trường tự nhiên Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu 11