Tài liệu Nghiên cứu nuôi cấy in vitro và ảnh hưởng của phóng xạ (tia gamma nguồn co 60 ) vào giai đoạn callus

Luận văn Thạc sỹ Sinh học Vũ Xuân Dương ĐẶT VẤN ĐỀ LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI Lúa gạo là nguồn lương thực chính của khoảng 50% dân số thế giới. Hơn 90% lúa trồng được phân bố ở Châu Á. Trong những năm gần đây Việt Nam đã đạt được những thành tựu to lớn trong sản xuất lúa gạo, luôn là một trong những nước có tỷ trọng xuất khẩu gạo đứng hàng đầu thế giới. Kết quả xuất khẩu gạo trong năm 2008 đạt 4.679.050 tấn, trị giá FOB đạt 2,663 tỷ USD [37]. Đạt được những thành tựu đú cú sự góp phần rất lớn của khoa học công nghệ, đặc biệt là trong công tác chọn tạo giống mới. Dân số toàn cầu tăng lên một cách đáng kể, từ 2,3 tỉ trong thập niên 1940 đã tăng 6,45 tỉ vào năm 2005 [3]. Tốc độ tăng trung bình 1 tỉ dân trong 14 năm. Hình ảnh như vậy đã đặt ra cho chúng ta một chiến lược phát triển cây lúa trong điều kiện tài nguyên tự nhiên ngày một cạn kiệt, đặc biệt tài nguyên nước, sự ô nhiễm môi trường và sự thay đổi khí hậu toàn cầu. Chính vì vậy việc nghiên cứu để chọn tạo ra được những giống lúa mới có năng suất cao, chất lượng tốt và đặc biệt là có khả năng chống chịu được trong những điều kiện khắc nghiệt đang là một vấn đề cấp bách đặt ra cho các nhà khoa học. Việc sử dụng các phương pháp truyền thống để chọn tạo giống lúa mới tốn rất nhiều thời gian, có thể từ 8 đến 10 năm [18]. Chi phí cho việc chọn tạo giống mới cũng rất tốn kém. Một hướng mới trong công tác chọn tạo giống mới đó là sự kết hợp giữa nuôi cấy invitro và xử lý đột biến bằng phóng xạ, cùng với sự giúp đỡ của các chỉ thị phân tử (chỉ thị Isozyme, chỉ thị ADN) việc chọn lọc cỏc dũng đột biến có lợi được tiến hành dễ dàng và chính xác hơn [7], [12]. Gõy đột biến thực nghiệm là một trong những phương pháp được áp dụng rộng rãi trên thế giới và ở Việt Nam, cung cấp nguồn nguyên liệu đa 1 Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội Luận văn Thạc sỹ Sinh học Vũ Xuân Dương dạng và phong phú cho quá trình chọn tạo giống mới. Trong quá trình tạo giống bằng đột biến thực nghiệm, việc phân tích, đánh giỏ nhằm phát hiện được kiểu gen mong muốn cũng đòi hỏi chi phí nhiều thời gian và công sức do tính ngẫu nhiên, vô hướng của đột biến. Hơn nữa, quá trình chọn tạo cỏc dũng đột biến chủ yếu dựa vào kết quả quan sát kiểu hình, mà các đặc điểm hình thái lại phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện môi trường, trạng thái sinh lý cây trồng và kinh nghiệm của nhà nghiên cứu. Vì vậy mà nhiều kiểu gen đột biến quớ, cú tiềm năng có thể bị bỏ sót. Do đó, chỉ thị phân tử là một sự lựa chọn mới cho việc đánh giá sự sai khác trong bộ gen giữa cỏc dũng, giống đột biến so với giống gốc và phát hiện kiểu gen mong muốn trong thế hệ đột biến [17], [24]. Từ cơ sở lý luận và thực tiễn nêu trên, nhằm xây dựng quy trình nuôi cấy invitro phục vụ các nghiên cứu tiếp theo, đồng thời đánh giá ảnh hưởng của phóng xạ tia gamma nguồn Co60 vào các giai đoạn khác nhau, từng bước xác định cơ sở phân tử của các thể đột biến có ý nghĩa, thu được do chiếu xạ hạt nảy mầm và calus, bước đầu tiến tới làm sáng tỏ cơ chế di truyền của các biến dị đột biến, chúng tôi tiến hành đề tài "Nghiên cứu nuôi cấy in vitro và ảnh hưởng của phóng xạ (tia gamma nguồn Co60) vào giai đoạn callus và giai đoạn hạt nảy mầm của một số dòng lúa có triển vọng" 2 Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội Luận văn Thạc sỹ Sinh học Vũ Xuân Dương MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU 1- Nghiên cứu ứng dụng nuôi cấy invitro kết hợp xử lý đột biến phục vụ chọn tạo giống lúa chất lượng cao. 2- Đánh giá ảnh hưởng của tia Gamma nguồn Co60 (chiếu xạ callus và giai đoạn hạt nảy mầm) lên sự sinh trưởng và phát triển của cây sau chiếu xạ. NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU 1- Xây dựng qui trình nuụi cấy invitro 4 dòng lúa nghiên cứu. Chiếu xạ ở giai đoạn Calus với các liều lượng khác nhau, xác định ảnh hưởng của liều chiếu xạ đến sinh trưởng và phát triển của cây lúa sau chiếu xạ. 2- Nghiên cứu ảnh hưởng khi chiếu xạ vào giai đoạn hạt nảy mầm ở các liều lượng khác nhau đến sự sinh trưởng và phát triển của cây sau chiếu xạ. 3- Điện di isozyme các mẫu thu được và phân tích kết quả. Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI 1- Xây dựng được quy trình nuôi cấy invitro của 4 dòng lúa nghiên cứu. 2- Xác định được ảnh hưởng của chiếu xạ giai đoạn callus đến tỷ lệ sống sót, tỷ lệ tái sinh chồi, tỷ lệ nhõn chồi và phổ điện di isozyme esterase và peroxidase. 3- Xác định được ảnh hưởng của chiếu xạ ở giai đoạn hạt nảy mầm đến một số đặc điểm hình thái, thời gian sinh trưởng, và phổ điện di isozyme esterase và peroxidase của cỏc dũng lỳa nghiên cứu. PHẠM VI NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu là 4 dòng lúa có triển vọng, nhận từ Trường Đại học Nông nghiệp I: Dòng N18, N46, N91 và NV1. Một phần hạt giống được sử dụng để tiến hành chiếu xạ vào giai đoạn hạt nảy mầm (giai đoạn 66h), một phần được sử dụng để nghiên cứu nuôi cấy in vitro. 3 Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội Luận văn Thạc sỹ Sinh học Vũ Xuân Dương Địa điểm nghiên cứu: các thí nghiệm theo dõi hình thái được tiến hành nghiên cứu tại Vườn thực nghiệm Khoa sinh – Trường Đại học Sư phạm Hà Nội. Các thí nghiệm nghiên cứu nuôi cấy in vitro được tiến hành tại Bộ môn Vi sinh – Công nghệ sinh học – Trường Đại học Sư phạm Hà Nội. Các thí nghiệm nghiên cứu về biến dị điện di được tiến hành tại Bộ môn Di truyền – Khoa Sinh học – Trường Đại học Sư phạm Hà Nội. Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 8 năm 2008 đến tháng 10 năm 2009. 4 Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội Luận văn Thạc sỹ Sinh học Vũ Xuân Dương CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Khái quát về chi Oryza và vị trí cây lúa trồng trong chi Oryza Chi Oryza lần đầu tiên được Linne mô tả vào năm 1753. Ông chỉ phát hiện ra một loài là O. sativa dựa trên các mẫu lúa trồng từ Ethiopia. Qua hai thế kỷ sau đó, đó cú hơn 100 loài thuộc chi Oryza được các tác giả khác nhau công bố, điều này cho thấy đây là một chi rất phức tạp về mặt phân loại học. Các loài trong chi Oryza từ lâu đã gây nên sự chú ý của nhiều nhà khoa học vì tầm quan trọng đặc biệt của nó. Nhiều nghiên cứu về phân loại học, về chủng loại phát sinh và các mối quan hệ di truyền của các loài trong chi Oryza đã được tiến hành. Chi Oryza vô cùng đa dạng, được thể hiện ở các genome khác nhau, và ở sự khác biệt đáng kể về hình thái trong cùng một loài và giữa các loài. Mặt khác sự khác biệt lớn trong chi phân định không rõ ràng giữa một số đơn vị phân loại trong chi Oryza. Do đó các tác giả khác nhau cũng đề nghị các hệ thống phân loại khác nhau. Điều đó càng làm cho hệ thống phân loại của các loài trong chi Oryza trở nên rắc rối hơn. Có thể nói, cho đến nay chưa có hệ thống phân loại nào được tất cả các nhà khoa học trên thế giới công nhận chung. Chi Oryza L. thuộc tộc Oryzeae, họ phụ Oryzoideae, họ hòa thảo Poaceae (Gramineae). Chi này gồm có: hai loài lúa trồng là O. sativa L., O. graberrima Steud., và 22 loài lúa dại phân bố khắp các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Lúa trồng ở châu Á (O. sativa) là cây có ý nghĩa kinh tế quan trọng và bậc nhất vỡ nó là cây lương thực của hơn một nửa dân số trên thế giới. Tất cả các loài lúa trong chi Oryza, bao gồm cả lúa dại và lúa trồng tạo nên một vốn gen (genepool) cực kỳ có giá trị trong việc mở rộng nguồn di truyền trong các chương trình chọn tạo giống lúa. 5 Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội Luận văn Thạc sỹ Sinh học Vũ Xuân Dương Hiện nay trên thế giới có hai loài lúa trồng: O.sativa L. và O. glaberrima Steud. Loài lúa O. sativa L. được trồng ở châu Á nên được gọi là lúa trồng châu Á. Loài O. sativa L. có hai thứ là O. sativa var. utitissima A. Camus (lúa tẻ) và O. sativa var. glutinosa Tanka (lúa nếp). Loài lúa trồng châu Á O. sativa L. có nguồn gốc từ O. perennis Moench (hay O. rufipogon). Loài O.glaberrima được thuần hóa ở châu Phi, được trồng ở Tây Phi, xuất hiện vào khoảng 1500 trước công nguyên, có nguồn gốc từ O. breviligulata Chev. Hai loài lỳa trờn được thuần hóa thành lúa trồng một cách độc lập với nhau. Năm 1930 Kato đã phân biệt trong loài O.sativa có hai loài phụ: O.sativa ssp. Indica Kato và O.sativa ssp. Japonica Kato. Hai nhóm này khác nhau về hình thái, phân bố địa lý, có hiện tượng khó khăn khi lai giữa hai nhóm cũng như tính bất thụ của con lai tùy theo các dạng bố mẹ đem lai. Năm 1954, Morinaga lại xác định trong loài O.sativa có thờm nhúm thứ ba là O.sativa javanica, được tìm thấy ở Indonesia. Đến nay địa điểm xuất hiện của lúa trồng châu Á được cho là một vết dài từ chân phía Tây Nam và Đông Nam dãy núi Himalaya, qua Assam, tỉnh Yunnan của Trung Quốc, Burma, Lào, biên giới Thái Lan – Miến Điện và vùng Tây Bắc của Việt Nam. Có thể có ba trung tâm xuất hiện sớm nhất của cây lúa trồng châu Á: trung tâm Assam, trung tâm biên giới Thái Lan – Miến Điện và trung tâm Tây Bắc Việt Nam. í kiến này đã được nhiều nhà khoa học trên thế giới về nguồn gốc vùng trồng lúa và cây lúa trồng tán thành. Địa điểm xuất hiện cây lúa trồng châu Phi đơn giản hơn nhiều. Đó là vùng đồng bằng Mali, cùng một số nơi khác như vùng đất cao Guinec, đồng bằng ven biển Casamance, thượng lưu sông Niger, phần Tây Nam bờ biển Guinea. Hiện nay, lúa đang được trồng trong những điều kiện sinh thái và khí hậu rất khác nhau. Có thể nói, hầu hết cỏc vựng trồng lỳa trờn thế giới đều là địa bàn của cây lúa châu Á, kể cả ở châu Phi, dồn cây lúa thuần hóa ở lục địa 6 Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội Luận văn Thạc sỹ Sinh học Vũ Xuân Dương này (O.glaberrima Steud) vào Tây Phi và chỉ chiếm một diện tích nhỏ ở Guyana – Nam Mỹ. Điều này đã cho thấy sự đa dạng rất lớn của nguồn gen cây lúa châu Á. Đến năm 1995, viện nghiên cứu lúa quốc tế (IRRI) đó cú một ngân hàng gen lúa của khắp thế giới với hơn 81000 mẫu giống, trong đó lúa châu Á có 76200 mẫu, lúa châu Phi có 3000 mẫu và lúa dại có 2400 mẫu. 1.2. Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.2.1. Định nghĩa Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi trường dinh dưỡng trong điều kiện vô trùng. [18] [20] Nuôi cấy mô tế bào thực vật bao gồm: - Nuôi cấy cây non và cây trưởng thành. - Nuôi cấy cơ quan: rễ, thõn, lỏ, hoa, quả, bao phấn, noãn chưa thụ tinh. - Nuôi cấy phụi: phụi non và phôi trưởng thành. - Nuôi cấy mô sẹo (callus). - Nuôi cấy tế bào đơn (huyền phù tế bào). - Nuôi cấy protoplast: nuụi cấy phần bên trong tế bào thực vật tách vỏ, còn gọi là nuôi cấy tế bào trần 1.2.2. Cơ sở sinh học của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.2.2.1. Tính toàn năng của tế bào Haberlandt (1902) lần đầu tiên đã quan niệm rằng mỗi tế bào bất kỳ của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Theo quan niệm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đó phõn hoỏ đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ 7 Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội Luận văn Thạc sỹ Sinh học Vũ Xuân Dương của cả sinh vật đó. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Đó là tính toàn năng của tế bào (totipotency). Như vậy, tính toàn năng của tế bào thực vật là khả năng của các tế bào đã được biệt hóa (trừ một số tế bào đã được biệt hóa sõu như ống mạch, mao dẫn) có khả năng thể hiện toàn bộ hệ thống di truyền và có thể trong điều kiện phù hợp sẽ phát triển theo chu trình giống như sự phát triển phôi dẫn đến sự hình thành cây hoàn chỉnh mới. Nền tảng quan trọng trên con đường chứng minh toàn diện về tính toàn năng của tế bào soma ở thực vật đã ghi nhận vào những năm 60 khi Steward (1963) và Wetherell và Halperin (1963) đồng thời cùng thông báo rằng những tế bào cà rốt tự do khi nuôi cấy trên môi trường thạch đã tạo thành hàng nghìn phôi, các phôi này phát triển qua các giai đoạn giống như quá trình tạo phôi bình thường. Từ những khám phá trên, đến nay hàng loạt các thông báo về tính toàn năng của các tế bào soma đã được công bố. Dường như tế bào của tất cả các cơ quan đều có khả năng phát triển phụi. Phụi soma đã nhận được ở nhiều giống cây trồng như: Atrapoda, Begonia, Citrus, Coffea, Cymbidium, Hordeum, Kalanchoe, Nicotinana, Panax, Pinus, Ranumculus, Solanum, Oryza, và nhiều loài cõy khỏc nữa. 1.2.2.2. Sự phản phõn hoỏ và phõn hoỏ của tế bào Cơ thể thực vật trưởng thành là một nhóm chính thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, được hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau. Tuy nhiên tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên (tế bào hợp tử). Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử tiếp tục phân chia hình thành nhiều tế bào phôi sinh chưa mang chức năng riêng biệt (chuyờn hoỏ). 8 Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội Luận văn Thạc sỹ Sinh học Vũ Xuân Dương Sau đó từ các tế bào phôi sinh này chúng tiếp tục được biến đổi thành các tế bào chuyờn hoỏ đặc biệt cho cỏc mụ, cơ quan có chức năng khác nhau. Sự phõn hoỏ tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào mụ chuyờn hoỏ, đảm nhận các chức năng khác nhau. Ví dụ: Mô dậu làm nhiệm vụ quang hợp, mụ bỡ làm nhiệm vụ bảo vệ, nhu mô dự trữ làm nhiệm vụ dự trữ, mô dẫn làm chức năng dẫn nước và dẫn dinh dưỡng. Quá trình phõn hoỏ tế bào có thể biểu thị: Tế bào phôi sinh Tế bào dãn Tế bào phõn hoỏ có chức năng riêng biệt Tuy nhiên, khi tế bào đó phõn hoỏ thành các tế bào có chức năng chuyờn, chỳng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình. Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ. Quá trình đó gọi là phản phõn hoỏ tế bào, ngược lại với sự phõn hoỏ tế bào. Phõn hoỏ tế bào Tế bào phôi sinh Tế bào dãn Tế bào chuyờn hoỏ Phản phõn hoỏ tế bào Về bản chất thì sự phõn hoỏ và phản phõn hoỏ là một quá trình hoạt hoá, ức chế các gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen được hoạt hoá (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho ra tính trạng mới, còn một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động. Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hoá trong cấu trúc phân tử ADN của mỗi tế bào khiến quá trình sinh trưởng và phát triển của cơ thể thực vật luôn được hài hoà. 9 Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội Luận văn Thạc sỹ Sinh học Vũ Xuân Dương Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thường bị ức chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thước của từng khối mô sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự hoạt hoỏ cỏc gen của tế bào. Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật thực chất là kết quả của quá trình phõn hoỏ và phản phõn hoỏ tế bào. Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào xét cho đến cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo và vô trùng) một cách định hướng dựa vào sự phõn hoỏ và phản phõn hoỏ của tế bào trên cơ sở tính toàn năng của tế bào thực vật. Để điều khiển sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy, người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy hai nhóm chất điều tiết sinh trưởng thực vật là auxin và cytokinin. 1.2.3. Lịch sử phát triển kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật Năm 1902, Haberlandt lần đầu tiên thí nghiệm nuôi cấy mụ cõy một lá mầm nhưng không thành công. Năm 1934, Kogl lần đầu tiên xác định được vai trò của IAA, một hoocmon thực vật đầu tiên thuộc nhóm auxin có khả năng kích thích sự tăng trưởng và phân chia tế bào. Năm 1939, ba nhà khoa học Gautheret, Nobecourt và White đã đồng thời nuôi cấy mô sẹo thành công trong thời gian dài từ mô thượng tầng (cambium) ở cà rốt và thuốc lá, mô sẹo có khả năng sinh trưởng liên tục. Năm 1955, Miller và cộng sự đã phát minh cấu trúc và sinh tổng hợp của kinetin - một cytokinin đóng vai trò quan trọng trong phân bào và phõn hoỏ chồi ở mô nuôi cấy. Đến năm 1957, Skoog và Miller đã khám phá vai trò của tỷ lệ nồng độ các chất auxin:cytokinin trong môi trường đối với sự phát sinh cơ quan (rễ 10 Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội Luận văn Thạc sỹ Sinh học Vũ Xuân Dương hoặc chồi). Khi tỷ lệ auxin/ cytokinin (ví dụ: nồng độ IAA/ nồng độ kinetin) nhỏ hơn 1 và càng nhỏ, mô có xu hướng tạo chồi. Ngược lại khi nồng độ IAA/ nồng độ kinetin lớn hơn 1 và càng lớn, mụ cú xu hướng tạo rễ. Tỷ lệ nồng độ auxin và cytokinin thích hợp sẽ kích thích phõn hoỏ cả chồi và rễ, tạo cây hoàn chỉnh. Năm 1960, Morel đã thực hiện bước ngoặt cách mạng trong sử dụng kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng trong nhân nhanh các loại địa lan Cymbidium, mở đầu công nghiệp vi nhân giống thực vật. Năm 1964, Guha và Maheshwari lần đầu tiên thành công trong tạo được cây đơn bội từ nuôi cấy bao phấn của cây cà rốt. Năm 1971 Takebe và cộng sự đã tái sinh được cây từ tế bào trần mô thịt lá ở thuốc lá. Năm 1978, Melcher và cộng sự đã tạo được cây lai soma cà chua – thuốc lá bằng dung hợp tế bào trần Năm 1979, Marton và cộng sự đã xây dựng được quy trình chuyển gen vào tế bào trần bằng đồng nuôi cấy tế bào trần và Agrobacterium. Từ năm 1980 đến nay, hướng chuyển gen vào tế bào thông qua việc nuôi cấy mô tế bào và vi khuẩn Agrobacterium được triển khai rộng rãi. 1.3. Tác nhân phóng xạ gây đột biến 1.3.1 Phân loại Dựa vào khả năng ion hóa vật chất bị nhiễm xạ, có thể chia tác nhân phóng xạ gây đột biến thành 2 nhóm: * Nhóm phóng xạ ion hóa: Là loại phóng xạ gây phản ứng hóa phóng xạ, tạo ra các cặp ion hóa trong môi trường mà chúng thâm nhập hoặc gây ra sự kích động phõ tử. Nhóm này được chia làm 2 nhóm phụ: 11 Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội Luận văn Thạc sỹ Sinh học Vũ Xuân Dương + Nhóm bức xạ hạt: Nhóm bức xạ hạt được đặc trưng bởi khối lượng và điện tích khác nhau. Nhóm này gồm các hạt sơ cấp và dòng nguyên tử có vận tốc không đổi (V = const) Nhóm bức xạ hạt được chia làm 3 phân nhóm: - Nhóm hạt mang điện tích: gồm điện tử (e) và positon sinh ra do phản ứng hạt nhân. - Nhóm hạt nặng mang điện: gồm proton, hạt α và các hạt khác. - Nhóm trung tử (nơtron): hạt không mang điện nên có thể thâm nhập vào mọi hạt nhân nguyên tử. + Nhóm bức xạ sóng điện từ: nhóm này đặc trưng bởi vận tốc, độ dài bước sóng và được biểu thị bằng công thức: C = T.λ Trong đó: C – Vận tốc T – Tần số λ – Bước sóng Tia Gamma (γ), tia Rơnghen (tia X) thuộc nhóm này. Do bước sóng rất ngắn (1012 – 10-9 A0) và vận tốc rất lớn, không có khối lượng và điện tích, không bị lệch trong điện trường nờn chỳng cú sức xuyờn sõu lớn. Chúng không có khả năng điện ly trực tiếp mà chỉ có tác dụng gián tiếp. Năng lượng của tia gamma tùy thuộc vào tần số sóng, được biểu thị bằng công thức: E h.C  Trong đó: - E: Năng lượng của tia gamma - h: Hằng số Plăng (h = 6,62.10-27 erg/s) - T: Tần số sóng - C: Tốc độ ánh sáng -  : Bước sóng 12 Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội Luận văn Thạc sỹ Sinh học Vũ Xuân Dương Nguồn xạ thường dùng để tạo tia gamma là Co60. * Nhóm phóng xạ khụng gõy ion hóa: Đại diện cho nhóm này là tia tử ngoại (  = 10-7 – 10-5 A0). Khi xuyên qua cỏc mụ của cơ thể sinh vật, nó khụng gõy ion hóa mà chỉ kích động phân tử, do sức xuyên thấu yếu nờn nó thường được dùng để xử lý hạt phấn và bào tử. 1.3.2 Ảnh hưởng của tia Gamma (Co60) lên vật chất di truyền 1.3.2.1. Tác động của tia Gamma lên vật chất di truyền ở cấp độ phân tử Theo Oganhexian (1969), tính đặc thù của sự phát sinh đột biến có liên quan đến đặc điểm của quá trình từ thời điểm bắt đầu xâm nhập của các tác nhân vào tế bào, vận động đến một thời điểm nào đó trên nhiễm sắc thể, rồi gây ra biến đổi cấu trúc phân tử của gen dẫn đến trở thành đột biến. Khi chiếu xạ bằng tia gamma vào dung dịch ADN sẽ gây ra những biến đổi chủ yếu như sau: - Gây đứt đơn: đứt một mạch đơn của phân tử ADN, làm phân tử ADN biến dạng, tạo cuộn, giảm thể tích phân tử. - Gây đứt kép: phân tử ADN bị giảm chiều dài, giảm độ nhớt của dung dịch. - Tạo cầu giữa các phân tử: Làm tăng khối lượng phân tử, tăng độ nhớt, giảm độ hòa tan và tạo cỏc bỳi không tan. - Tạo các phân tử phân nhánh: do sự gắn một số đoạn của phân tử bị đứt vào phân tử khác còn nguyên vẹn. - Tạo liên kết protein-ADN: làm cho phân tử protein bị dính hay liên kết giữa bazơ pirimidin biến tính với các axit amin. - Phá hủy cấu trúc không gian của ADN (làm biến tính ADN) - Gây hiện tượng nhị trùng phân Timin. 13 Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội Luận văn Thạc sỹ Sinh học Vũ Xuân Dương - Phá hủy gốc dị vòng chứa Nitơ. - Hydrat hóa cỏc bazơ nitơ. - Gây ra hiện tượng hỗ biến: Tia gamma làm thay đổi vị trí của nguyên tử hidro, dẫn tới hình thành các gốc lactim hay imin, hậu quả là sự sao chép sai của ADN, tạo ADN đột biến ở các thế hệ sau. 1.3.2.2. Tác động của tia gamma (Co60) lên vật chất di truyền ở cấp độ tế bào * Tác động của tia gamma (Co60) lên cấu trúc nhiễm sắc thể Theo Xvenson, bức xạ ion hóa có thể gây nên sự phân đoạn của nhiễm sắc thể. Có hai kiểu phân đoạn NST là: - Loại đứt thật: đứt rời thành từng khúc. - Loại tiềm tàng: chưa đứt rời mà ở trạng thái tiềm tàng, có thể chuyển sang đột biến sau một thời gian nhất định hoặc phục hồi lại trạng thái ban đầu. Crogodin và Lutxomic cho rằng, phóng xạ ion hóa có thể hủy hoại nhiễm sắc thể một cách trực tiếp và kéo dài. Nếu có các điều kiện tương ứng và đủ về thời gian thì sự hủy hoại tiềm tàng có thể trở thành hiện thực và đột biến bắt đầu xuất hiện trong cấu trúc của NST. Nói chung, khi xử lý các tác nhân phóng xạ ion hóa ở liều lượng trung bình cho đến liều lượng không qua ngưỡng chịu đựng của tế bào thì ở kỳ sau của nguyờn phõn thấy xuất hiện cầu, đoạn, vòng khuyên... Hiện tượng chuyển đoạn lớn và nhỏ hoặc đảo đoạn thường được phát hiện trong giảm phân, đó là sai hình NST. Mức độ sai hình NST thể hiện bằng các kiểu cấu trúc lại NST tăng dần theo liều chiếu xạ. * Tác động của tia Gamma (Co60) lên quá trình phân chia tế bào Trong quá trình nguyờn phõn, tia Gamma có thể gõy cỏc hiệu quả sau: 14 Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội Luận văn Thạc sỹ Sinh học Vũ Xuân Dương - Làm kìm hãm hay tạm dừng quá trình nguyờn phõn bằng cách kéo dài một pha nào đó trong chu kỳ tế bào. - Làm dừng hoàn toàn quá trình nguyờn phõn nhưng khụng gõy chết tế bào mà làm mất khả năng phân chia tế bào. - Làm tăng độ nhớt và kết dính NST dẫn đến sự chết tế bào. - Đôi khi chiếu xạ liều thấp lại kích thích sự phân chia tế bào. Trong quá trình giảm phân: Khi dùng tia X gây bức xạ ion hóa ở Longgiforum, Mistra đã thu được kết quả như sau: - Gây sai hình NST ở diplonem: các bivalent có thể kết dính với nhau tạo vòng NST lớn, phần lớn cỏc vũng này đều do chuyển đoạn phức tạp tạo nên. - Gây sai hình NST ở hậu kỳ I hoặc II. Các kiểu sai hình NST thường thấy trong giảm phân là: đứt đoạn NST, tạo 1 hoặc 2 đoạn NST và cầu NST, đứt cầu cromatit tạo ra sự lặp đoạn, tạo cầu cromatit, vòng và hai đoạn do chuyển đoạn, đứt cromatit, tạo nên cầu cromatit, vòng cromatit ở trạng thái kép; tạo NST có 2 tâm và 2 đoạn, hình thành các đoạn riêng rẽ và cầu cromatit ở kỳ sau I. (Mistra 1958, Sutka 1974, Nguyễn Minh Công và cộng sự 1975-1978) 1.3.2.3. Tác dụng của tia phóng xạ đối với thực vật Khi xử lý phóng xạ có thể tiến hành theo các phương pháp sau: - Chiếu xạ hạt khô hoặc hạt ướt. - Ngâm hạt trong dung dịch đồng vị phóng xạ. - Trồng cây trên đất cú bún chất đồng vị phóng xạ. - Đưa chất đồng vị phóng xạ vào cây. - Phóng xạ thực vật trong quá trình sinh trưởng và phát triển. 15 Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội Luận văn Thạc sỹ Sinh học Vũ Xuân Dương Ngày nay người ta còn chiếu xạ các cơ quan, bộ phận riêng rẽ của cây như: chồi, nụ hoa, bao phấn, bầu nhụy, hoặc xử lý cây đang trồng trong từng thời kỳ bằng trường Gamma hoặc thiết bị chiếu xạ chuyên dùng của các trung tâm chiếu xạ. Hiệu quả chiếu xạ thực vật ở thế hệ đầu thể hiện ở những biến đổi dương tính, đó là những biến đổi về cấu trúc, hình thái, sinh lý, sinh trưởng, sinh sản và gây chết. Người ta phân biệt tác dụng ngay sau khi sử lý phóng xạ (hiệu quả tức thời) với những biến đổi sau khi sử lý phóng xạ (hiệu quả chậm hay hiệu quả kéo dài). Về hiệu quả tức thời có thể kể ra một số hình thức chủ yếu sau: - Biến đổi hóa sinh và lý hóa sinh. - Biến đổi sinh lý giới hạn ở một số cấu trúc trong vật liệu bị phóng xạ. - Biến đổi vật chất di truyền. Hiệu quả chậm cũng gây ra những biến đổi như trên, nhưng diễn ra trong thời gian dài suốt quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật. Đối với các loài thực vật, chiếu xạ ở liều lượng thấp có tác dụng kích thích sinh trưởng, còn chiếu xạ ở liều lượng cao lại kìm hãm, cao quá giới hạn chịu đựng sẽ gây chết tế bào và cơ thể. Ở lúa, khi xử lý hạt khô bằng tia gamma ở các liều lượng 5krad, 10krad nhiều khi kích thích quá trình sinh trưởng và phát triển. (Phạm Quang Lộc. Luận án PTS 1981). Tác dụng của phóng xạ vào hạt có thể gây hiệu quả ở mọi giai đoạn trong quá trình phát triển cá thể, chẳng hạn: - Tác động trực tiếp đến chiều hướng và tốc độ các phản ứng sinh hóa, chi phối sự nảy mầm. 16 Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội Luận văn Thạc sỹ Sinh học Vũ Xuân Dương - Tác dụng gây chết phôi mầm, đình chỉ ngay quá trình nguyờn phõn đầu tiên hoặc ngừng sự sinh trưởng của phôi. - Tác dụng xa hơn, có thể ở các cấp độ khác nhau như: Kìm hãm một pha nào đó của quá trình nguyờn phõn, làm suy giảm sức sống của phôi mầm, lá mầm, rễ mầm, cuối cùng là gây chết ngay ở thời kỳ mạ, hoặc gây chết muộn hơn ở thời kỳ đẻ nhánh, trỗ, chín; cũng có thể khụng gõy chết ở thời kỳ muộn mà lại gõy cỏc biến đổi về hình thái, sinh trưởng, phát triển. 1.3.3 Lược sử nghiên cứu hiệu quả gây đột biến của tia gamma (Co60) khi xử lý hạt nảy mầm Các tác giả Kawai (1965 - 1966); Guud, Fushuhara (1967); Janaka và Stamura (1968); Siddig và Swaminathan (1968 - 1969); Vũ Tuyên Hoàng 1972; Satoh và Omura (1979); Phan Hải, Bùi Chi Lăng, Nguyễn Quang Xu (1983); Trần Duy Quý (1981 - 1988) ...đã nghiên cứu hiệu quả gây đột biến của tia gamma khi xử lý hạt ướt (hạt thấm nước, hạt ngâm nước bão hòa), đều đi đến một kết luận chung là: Hạt ướt cảm ứng phóng xạ cao hơn, cho tần số đột biến hình thái, sinh trưởng và phát triển cao hơn so với xử lý hạt khô. Một số tác giả chiếu tia gamma trên hạt lúa hút nước bão hòa hoặc hạt nảy mầm để nghiên cứu tần số và phổ đột biến cấu trúc NST (Savin, Swaminathan, Sharma (1968), Trần Duy Quý và cộng sự (1977-1987)...), hoặc là để nghiên cứu so sánh hiệu quả với trường hợp xử lý hạt khô (Siddig và Swaminathan (1968), Soriano 1971, Siddig và Swaminathan 1971). Các công trình cũng đã rút ra kết luận tương tự về so sánh hiệu quả gây đột biến của tia gamma khi xử lý trên hạt khô so với hạt ướt. Nhiều tác giả đã chiếu xạ các loại thực vật khác nhau và đã xác định được độ cảm ứng phóng xạ phụ thuộc vào các pha của chu kỳ tế bào xếp theo thứ tự: 17 Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội Luận văn Thạc sỹ Sinh học Vũ Xuân Dương G2 > M > S > G1, Boocdanop (1965), Scott và Ewan (1967), Mitrophanop (1969), Demin (1974), Kaznadri (1977), Mitrophanop và Olimpienco (1980). Các nghiên cứu của Trần Duy Quý (1982 - 1985) khi xử lý tia gamma (Co60) trên hạt ẩm và hạt nứt nanh của lúa IR8, IR22, C4-63,...rồi cố định rễ mầm ở các thời điểm khác nhau, đã xác định được mối quan hệ giữa thời điểm cố định và tần số, phổ sai hình NST. Phạm Quang Lộc, Nguyễn Minh Công (1986). Đào Xuõn Tõn (1995), nghiên cứu sự phát sinh các đột biến lặn ở M2 khi xử lý tia gamma vào các thời điểm khác nhau của hạt nảy mầm ở 5 giống lúa nếp đã đi đến kết luận rằng: Phóng xạ vào thời điểm 72h hoặc 75h cho tổng tần số đột biến diệp lục cao nhất, tần số đột biến lặn về hình thái (hình dạng, màu sắc, kích thước của thõn, lỏ, bụng, hạt), về sinh trưởng và phát triển cao nhất, đặc biệt là các đột biến có ý nghĩa về chọn giống. 1.3.4 Một số thành tựu về chọn giống lúa bằng đột biến thực nghiệm trên thế giới và ở Việt Nam Bằng phương pháp cổ điển, muốn tạo được một giống cây trồng mới, năng suất cao, phẩm chất tốt và ổn định, phải cần từ 6 – 10 thế hệ. Với phương pháp chọn giống bằng đột biến thực nghiệm, một số giống mới được tạo ra chỉ trong vòng 6 thế hệ. Việc chọn giống cổ điển chủ yếu dựa vào nguồn biến dị tự nhiên, nguồn gen hoang dã hoặc những biến dị tổ hợp qua lai hữu tính, cả 3 nguồn biến dị này đều có những giới hạn. Thêm vào đó, chọn giống cổ truyền không có được những đột phá cần thiết. Với phương pháp đột biến thực nghiệm kết hợp với lai tạo và chọn lọc (hoặc lai tạo kết hợp với đột biến thực nghiệm), đã tạo ra nguồn biến dị phong phú. Sự sai khác di truyền trong lòng quần thể đã tạo nên vốn gen dồi dào cho việc chọn tạo, cải tiến giống hoặc phục vụ những mục đích nghiên cứu khác. Ngày nay, chọn giống bằng phương pháp đột biến thực nghiệm ngày càng trở thành một trong những phương pháp được ứng dụng rộng rãi trên thế giới và cả ở Việt Nam. 18 Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội Luận văn Thạc sỹ Sinh học Vũ Xuân Dương * Trên thế giới: Theo cơ sở dữ liệu về các giống đột biến của FAO/IAEA (Tổ chức lương thực và nông nghiệp/ cơ quan năng lượng nguyên tử quốc tế): năm 1960 mới chỉ có 7 giống cây trồng được tạo ra bằng phương pháp chọn giống đột biến thực nghiệm, đến năm 1965 là 30 giống. Năm 1969, tại Hội thảo về vấn đề “Bản chất, tạo và sử dụng đột biến thực nghiệm ở thực vật”, tổ chức tại Pullman (Mỹ), Sigurbjonsson và Micke công bố danh sách 77 giống cây trồng đột biến. Năm 1991, cũng tác giả trên công bố 1330 giống cây trồng đột biến. Năm 1995, Maluszynski và cộng sự công bố 1970 giống cây trồng được tạo ra bằng đột biến thực nghiệm. Tính đến tháng 12 năm 1997, theo dữ liệu thống kê của FAO/IAEA (dẫn theo Maluszynski và cộng sự 1998), có 1847 giống (ngũ cốc chiếm 1357 giống). Sáu nước đứng đầu thế giới về số lượng giống cây trồng tạo ra bằng phương pháp đột biến thực nghiệm là: Trung Quốc (306 giống) chiếm 16,56%, Ấn Độ (249 giống) chiếm 13,48%, Liờn Xụ cũ và Nga (210 giống) chiếm 11,36%, Hà Lan (176 giống) chiếm 9,52%, Nhật Bản (118 giống) chiếm 6,39%, Mỹ (100 giống) chiếm 5,4%. Trong số 1357 giống ngũ cốc có 333 giống lúa và trong đó có 225 giống (chiếm 67,6%) được nhân trực tiếp từ các thể đột biến, số còn lại là do kết hợp với phương pháp lai tạo. Bảy nước đứng hàng đầu về số lượng giống lúa đột biến là: Trung Quốc (117 giống) chiếm 35,1%, Nhật Bản (46 giống) chiếm 13,8 %, Ấn Độ (31 giống) chiếm 9,3%, Guana (26 giống) chiếm 7,8%, Cot-di-voa (25 giống) chiếm 7,5%, Mỹ (23 giống) chiếm 6,9%, Việt Nam (14 giống) chiếm 4,2% (dẫn theo Maluszynski và cộng sự 1998). Chọn giống bằng phương pháp đột biến thực nghiệm đã tạo ra những giống lúa mới mang những đặc điểm hình thái và một số tính trạng nông học quý giá và làm tăng tính đa hình di truyền của lúa trồng: các giống lúa nửa lùn (129 giống), chín sớm (117 giống), đẻ nhánh khỏe (44 giống), chống bệnh tàn 19 Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội Luận văn Thạc sỹ Sinh học Vũ Xuân Dương lụi lá (28 giống), cây cao (25 giống), chất lượng hạt tốt (18 giống), thích ứng rộng (13 giống), chịu lạnh (13 giống), nội nhũ dẻo (8 giống), chịu mặn (6 giống), cảm ứng quang chu kỳ (3 giống)...(theo thống kê của FAO/IAEA 1998 - Maluszynski và cộng sự 1998). Những giống có đặc tính nông học quý rất được ưa chuộng nờn đó được gieo trồng trên diện tích rộng. * Việt Nam: Chọn giống cây trồng bằng phương pháp đột biến thực nghiệm ở Việt Nam đó cú những đóng góp đáng kể trong việc nâng cao sản lượng lương thực, trong đó đặc biệt là sản lượng lỳa. Cỏc nghiên cứu đột biến thực nghiệm hiện nay tập trung vào hướng chiếu xạ hạt khô, hạt nảy mầm, chiếu xạ hạt phấn, chiếu xạ hợp tử...để tạo ra những đột biến có lợi như: thấp cây, đẻ nhánh khỏe, chống đổ, chín sớm, năng suất cao, không cảm ứng quang chu kỳ, chống chịu với sâu bệnh và điều kiện bất lợi khác, hàm lượng protein cao, cơm dẻo, thơm... Những đột biến này có thể nhân trực tiếp thành giống hoặc sử dụng trong lai tạo giống hoặc trong nghiên cứu sự di truyền các tính trạng cây lúa. Trong số các giống mới được tạo ra tại Việt Nam thì số lượng giống được tạo ra bằng đột biến thực nghiệm hoặc bằng phương pháp xử lý đột biến kết hợp với lai giống chiếm một tỷ lệ đáng kể. Viện cây lương thực và Cây thực phẩm đã tạo được nhiều giống quốc gia và nhiều giống khu vực hóa bằng phương pháp đột biến thực nghiệm hoặc kết hợp với lai tạo: Xuân số 4, Xuân số 5, Xuân số 6 (1991), Xuân số 10 (1996), Xuân số 11 và N29 (1998) của tập thể tác giả Vũ Tuyên Hoàng, Trương Văn Kính và cộng sự. Từ năm 1989 – 2000, Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam đã công bố 6 giống quốc gia: DT10, DT11 (1989, 1990); DT13, DT33 (1991 - 1993), DT16 và Nếp thơm DT21 (2000). Trường Đại học sư phạm Hà Nội, Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam và Viện lúa Đồng bằng sông Cửu Long đã phối hợp nghiên cứu tạo ra hai giống quốc gia: Tài nguyên đột biến-100 (1997), Tép hành đột biến (1999), 20 Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội