Tài liệu Nghiên cứu khả năng thấm hút của màng BC được tạo ra từ Acetobacter

Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN ************** NGUYỄN THỊ THƠM NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG THẤM HÚT CỦA MÀNG BC TỪ ACETOBACTER KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vật học Người hướng dẫn khoa học ThS. Nguyễn Khắc Thanh HÀ NỘI - 2011 Nguyễn Thị Thơm i K33C - Sinh Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành được đề tài nghiên cứu khoa học này em đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của Th.S Nguyễn Khắc Thanh cùng các thầy cô bộ môn vi sinh, Khoa sinh - KTNN Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2. Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến sự giúp đỡ quý báu của thầy cô. Đồng thơi em cũng xin chân thành cảm ơn Thư viện Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện cho em tìm thông tin phục vụ cho nghiên cứu và hoàn thành đề tài này Hà Nội, ngày 15 tháng 05 năm 2011 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Thơm Nguyễn Thị Thơm ii K33C - Sinh Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là kết quả nghiên cứu của cá nhân tôi, đề tài nghiên cứu này không trùng với đề tài nghiên cứu nào khác Đề tài của tôi có trích dẫn một số nội dung của một số tác giả khác để bổ sung cho khóa luận của mình. Tôi xin phép và trân trọng cảm ơn. Sinh viên Nguyễn Thị Thơm Nguyễn Thị Thơm iii K33C - Sinh Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BC : Bacterial cellulose MC : Microbial cellulose S – BC : Static Bacterial cellulose CFU : Colony Forming Unit cs : Cộng sự Nguyễn Thị Thơm iv K33C - Sinh Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG SỐ LIỆU Bảng 1.1: Phân loại các nhóm vi khuẩn Aceticd theo Pastuer (1950) .............6 Bảng 1.2: Đặc điểm sinh hóa của chủng Acetobacter xylinum theo Pastuer (1950) ........................................................................................9 Bảng 2: Các bước xử lý màng BC ..................................................................22 Bảng 3.1: Lượng nước hút được của màng BC theo thời gian ........................28 Bảng 3.2: Lượng dịch nghệ hút được của màng BC theo thời gian.................29 Bảng 3.3: Lượng Berberin hút được của màng BC theo thời gian...................30 DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1: Lượng nước hút được của màng BC theo thời gian .................... 28 Biểu đồ 3.2: Lượng dịch nghệ hút được của màng BC theo thời gian............. 29 Biểu đồ 3.3: Lượng Berberin hút được của màng BC theo thời gian .............. 30 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Cellulose vi khuẩn và cellulose thực vật ......................................... 10 Hình 1.2: Qúa trình tổng hợp cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum .... 13 Hình 3.1: Kết quả nhuộm Gram của Acetobacter xylinum BHN2 ............................... 25 Hình 3.2: Khuẩn lạc của Acetobacter xylinum BHN2 trên môi trường thạch đĩa ............................................................................... 26 Hình 3.3: Màng BC sinh ra từ vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2 ....................... 26 Nguyễn Thị Thơm v K33C - Sinh Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp MỤC LỤC Phần 1: MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài........................................................................................1 2. Mục tiêu của đề tài .....................................................................................2 3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................2 4. Ý nghĩa của đề tài.......................................................................................2 Phần 2: NỘI DUNG CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Phân loại vi khuẩn Acetobacter ............................................................3 1.1.1 Các tiêu chí phân loại Acetobacter...............................................3 1.1.2 Lược sử phân loại Acetobacter ....................................................3 1.1.3 Vi khuẩn Acetobacter ..................................................................6 1.2 Vị trí và đặc điểm của vi khuẩn Acetobacter xylinum ..........................8 1.2.1 Vị trí............................................................................................8 1.2.2 Đặc điểm vi khuẩn Acetobacter xylinum .....................................8 1.2.3 Qúa trình tổng hợp cellulose của màng Bacterial cellulose ở vi khuẩn Acetobacter xylinum..................................................................10 1.3 Ứng dụng của màng BC .......................................................................14 1.3.1 Ứng dụng trong một số lĩnh vực ..................................................14 1.3.2 Ứng dụng trong điều trị bỏng.......................................................14 1.4 Tình hình nghiên cứu khả năng hấp thụ các chất lên màng BC .............16 CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu và thiết bị nghiên cứu..................................................................18 2.1.1 Giống ..........................................................................................18 2.1.2 Hóa chất và thiết bị......................................................................18 2.1.3 Môi trường ..................................................................................18 2.2 Phương pháp nghiên cứu ..........................................................................19 Nguyễn Thị Thơm vi K33C - Sinh Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp 2.2.1 Phương pháp vi sinh ....................................................................19 2.2.2 Phương pháp hóa sinh .................................................................21 2.2.3 Phương pháp xử lý màng BC từ Acetobacter xylinum.................22 2.2.4 Phương pháp vật lý......................................................................23 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khảo sát một số đặc tính của chủng Acetobacter xylinum........................25 3.1.1 Hình thái và tế bào học ..........................................................................25 3.1.2 Sinh trưởng trên môi trường thạch đĩa .........................................25 3.1.3 Sinh trưởng trên môi trường lỏng ................................................26 3.2 Khảo sát một số đặc tính của màng BC ....................................................27 3.2.1 Khả năng thấm hút của màng ......................................................27 3.2.2 Khả năng ngăn cản một số vi sinh vật của màng..........................30 Phần 3: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................33 Nguyễn Thị Thơm vii K33C - Sinh Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Màng BC (Bacterial cellulose) là một sản phẩm tự nhiên được tổng hợp từ một số loại vi khuẩn khi nuôi cấy trên môi trường dịch lỏng. Hầu hết các nghiên cứu đều chỉ ra rằng Acetobacter là loài vi khuẩn tổng hợp màng BC có hiệu quả cao nhất [8]. BC có một số tính chất hóa lý đặc biệt như: độ bền cơ học cao, khả năng hấp thụ nước lớn, khẳ năng polyme hóa và trạng thái kết tinh lớn...Vì vậy, BC được ứng dụng rộng rãi trên thế giới trong nhiều lĩnh vực công nghệ. Như trong công nghệ thực phẩm BC để sản xuất thạch dừa, màng bảo quản thực phẩm. Trong công nghiệp giấy, màng BC để sản xuất giấy chất lượng cao, màng lọc nước công nghệ môi trường… Trong lĩnh vực mỹ phẩm màng BC dùng làm mặt nạ dưỡng da. Đặc biệt trong lĩnh vực y học, BC bước đầu nghiên cứu làm màng trị bỏng, da nhân tạo thay thế ra tạm thời, mạch máu nhân tạo… Hiện nay ở Việt Nam những nghiên cứu sản xuất và sử dụng màng BC mới chỉ được quan tâm vài năm gần đây và mới đạt được kết quả bước đầu Màng BC có thể hoàn toàn sản xuất trong nước bằng phương pháp lên men tĩnh của vi khuẩn Acetobacter trong môi trường lỏng. Hiện nay, việc nghiên cứu và ứng dụng màng BC trị bỏng ở nước ta là một vấn đề mới mẻ, gần đây có một số ít các nghiên cứu về tạo màng BC dùng trị bỏng [7]. Xuất phát từ thực tiễn về nhu cầu sử dụng màng BC dùng trị bỏng chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “ Nghiên cứu khả năng thấm hút của màng BC được tạo ra từ vi khuẩn Acetobacter ”. Nguyễn Thị Thơm 1 K33C - Sinh Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp 2. Mục đích của đề tài Màng BC ứng dụng trong trị bỏng có khả năng thấm hút dịch rỉ vết thương nhưng vẫn giữ cho vết thương có độ ẩm nhất định để tạo điều kiện tái sinh mô. 3. Nội dung nghiên cứu _ Tạo màng BC từ chủng Acetobacter _ Nghiên cứu khả năng thấm hút nước, dịch nghệ tươi và Berberin của màng BC từ vi khuẩn Acetobacter. _ Khảo sát khả năng ngăn cản một số vi sinh vật của màng BC. 4. Ý nghĩa của đề tài Nghiên cứu được khả năng thấm hút tốt nhất của màng BC ứng dụng trong trị bỏng. Nguyễn Thị Thơm 2 K33C - Sinh Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp NỘI DUNG CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Phân loại vi khuẩn Acetobacter 1.1.1. Các tiêu chuẩn phân loại Acetobacter Để phân loại Acetobacter, người ta dựa vào những tiêu chuẩn sau: - Địa điểm nơi phân lập: có liên quan đến điều kiện môi trường sống. - Đặc điểm hình thái: hình dạng tế bào, cách xắp xếp tế bào, màu sắc tế bào khi nhuộm Gram, khả năng di động, có tiên mao hay không, vỏ nhầy… - Đặc điểm sinh lý: mối quan hệ giữa các yếu tố: nhiệt độ, độ pH của môi trường, khả năng hình thành sắc tố, mối quan hệ với oxy, khả năng sử dụng chất vô cơ và hữu cơ… - Đặc điểm nuôi cấy: trạng thái, đặc điểm, tính chất, màu sắc… của khuẩn lạc trên môi trường thạch. Khi nuôi cấy trên môi trường lỏng chú ý sự biến đổi của môi trường sau thời gian nuôi cấy (đục hay trong, có mùi hay không mùi, màu sắc môi trường có biến đổi hay không…) 1.1.2. Lược sử phân loại Acetobacter Việc nghiên cứu Acetobacter nói chung và A.xylinum nói riêng đã và đang thu hút được nhiều nhà khoa học trong và ngoài nước đi sâu nghiên cứu tìm hiểu. Việc tiến hành phân loại vi khuẩn Acetobater được tiến hành từ thế kỷ XIX. Trong đó có một số khóa phân loại đáng chú ý sau: Khóa phân loại của Beijerinck năm 1899, ông đã tiến hành phân lập vi khuẩn acetic thuần khiết và chia chúng thành 4 nhóm cơ bản. Năm 1916, Janke đã tiếp theo công trình nghiên cứu của Beijerinck. Ông đã phân loại dựa trên 2 dấu hiệu: + Một là: sử dụng muối amoni làm nguồn cung cấp nitơ trong quá trình sinh trưởng và phát triển. Nguyễn Thị Thơm 3 K33C - Sinh Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp + Hai là: không hoặc có khả năng di động trong quá trình phát triển. - Năm 1926, Henneberg dựa vào nơi sống mà chia vi khuẩn acetic làm 4 nhóm sau: + Nhóm 1: vi khuẩn không sinh trưởng trên bia, vì hoa huplon độc với chúng. + Nhóm 2: vi khuẩn sinh trưởng trên bia. + Nhóm 3: vi khuẩn phát triển trên dịch rượu vang. + Nhóm 4: vi khuẩn dùng để sản xuất giấm theo phương pháp nhanh. - Năm 1934, các nhà khoa học Hoa Kỳ đã nghiên cứu thành phần dinh dưỡng của vi khuẩn giấm thấy chúng có khả năng sử dụng các hợp chất tương đối đơn giản làm nguồn nitơ và nguồn cacbon nên đã xếp chúng vào họ Nitrobacteriaceae. Từ đó vi khuẩn acetic có tên gọi là Acetobacter. - Năm 1936, Kenyver, Wanneil và Staniel nghiên cứu khả năng di động vủa chúng thấy có hiện tượng ghép cực xoắn ở phần di động nên xếp chúng vào họ Pseudomonadaceae. - Năm 1948, Vanghn tiến hành nghiên cứu khả năng di động của một số loài Acetobacter (Acetobacter aceti, Acetobacter melanoginum, Acetobacter zances, Acetobacter pasteurianum, Acetobacter oxydans) nhờ đơn mao ở cực và đã xác nhận vị trí của vi khuẩn acetic trong họ Pseumodonadaceae. - Năm 1949, Krassilnicov nghiên cứu trên xạ khuẩn và vi khuẩn cùng một số tác giả người Mỹ trong các bài báo cáo của mình đều thống nhất xếp vi khuẩn Acetobacter vào họ Pseumodonadaceae. - Theo khóa phân loại mới của Bergey và nhiều tác giả khác thì vi khuẩn Acetobacter và Glucobacter – các vi khuẩn acetic được xếp vào họ Acetobacteriaceae. Nguyễn Thị Thơm 4 K33C - Sinh Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp - Năm 1914, dựa vào khả năng oxy hóa acid acetic, Bergey phân chia các loài trong Acetobacter thành 2 nhóm: + Nhóm 1: có khả năng oxy hóa acid acetic thành CO2 và H2O. Sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ duy nhất (sinh trưởng trên môi trường Hoyer) như: Acetobacter aceti. Không sử dụng muối amoni là nguồn nitơ duy nhất. Trên bề mặt môi trường dịch thể không tạo màng nhầy chứa cellulose như: Acetobacter rancens, Acetobacter pasteurianus, Acetobacter kneizigianus. Trên môi trường dịch thể tạo thành màng nhầy chứa cellulose như: Acetobacter xylinum. + Nhóm 2: không có khả năng oxy hóa acid acetic. + Tạo thành sắc tố trên môi trường glucose: sắc tố nâu tối đến đen nhạt (Acetobacter melanogenus); sắc tố trắng hồng (Acetobacter recens). + Không tạo thành sắc tố: nhiệt độ thích hợp khoảng 30 - 35oC (Acetobacter sobuxydans); nhiệt độ thích hợp nhất trong khoảng 18 - 21oC (Acetobacter oxydans). Năm 1950, Frateur chính thức đưa ra một khóa phân loại mới dựa trên các tiêu chuẩn cụ thể: - Khả năng tạo catalaze. - Khả năng tổng hợp các chất xeto từ rượu bậc cao như: glycerol, manitol, sorbitol. - Khả năng oxy hóa acd acetic thành CO2 và H2O. - Khả năng oxy hóa glucose thành gluconic. - Khả năng sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ và rượu etylic làm nguồn cacbon ( sinh trưởng trên môi trường Hoyer ) - Tạo sắc tố nâu. Nguyễn Thị Thơm 5 K33C - Sinh Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp - Tổng hợp cellulose. Trên cơ sở đó, Fasteur chia vi khuẩn acetic thành các nhóm theo bảng sau: Bảng 1.1: Phân loại các nhóm vi khuẩn aceticd theo Pasteur (1950) Stt Tên nhóm Vi khuẩn đại diện Đặc điểm cơ bản Acetobacter suboxydans. Không có khả năng oxy hóa 1 Suboxydans Acetobacter acid acetic thành CO2 và melanogennum H2O. Acetobacter aceti 2 Meroxydans Acetobacter xylinum Acetobacter meroxydan 3 4 Oxydans Peroxydans Có đầy đủ các đặc điểm trên Acetobacter ascendans Không có khả năng tạo các Acetobacter ransens hợp chất xeto từ rượu bậc Acetobacter lovaniens cao Acetobacter peroxydans Acetobacter paradoxum Không có hoạt tính catalase, không oxy hóa glucose thành acid gluconic 1.1.3. Vi khuẩn Acetobacter. Giống vi khuẩn Acetobacter thuộc họ Pseudomonadaceae, phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Có thể phân lập được các giống vi khuẩn này từ không khí, đất, nước, lương thực, thực phẩm, giấm, rượu, bia, hoa quả…Có khoảng 20 loài thuộc giống Acetobacter đã được phân lập và mô tả, trong đó có nhiều loài có ý nghĩa đáng kể. * Đặc điểm hình thái của Acetobacter Vi khuẩn Acetobacter bắt màu Gram âm (Gr - ). Thông thường Acetobacter có dạng hình que, kích thước thay đổi tùy theo loài (0,3 - 0,6 × 1 Nguyễn Thị Thơm 6 K33C - Sinh Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp - 8 µm), có thể di động (có tiêm mao hoặc chu mao), hoặc không di động (không có tiêm mao), hiếu khí bắt buộc, chịu được độ acid cao, tế bào đứng riêng rẽ hoặc kết thành từng chuỗi, có khả năng tạo thành váng trên môi trường lỏng. Tùy điều kiện môi trường nuôi cấy (nhiệt độ, thành phần môi trường nuôi cấy…), các vi khuẩn Acetobacter có thể sinh ra hình thái khác biệt (kéo dài hoặc phình to ra). Trên môi trường đặc, khuẩn lạc của vi khuẩn Acetobacter có hình dạng tròn, đều, đường kính trung bình khoảng 1 - 2 mm. Trên môi trường lỏng, vi khuẩn Acetobacter tập trung phát triển trên bề mặt môi trường, tạo thành lớp màng mỏng, trong suốt, có độ dày khác nhau. Khả năng tạo váng thay đổi tùy theo loài: Acetobacter xylinum tạo thành váng hemicellulose khá dày và chắc. Acetobacter orleanse váng mỏng nhưng chắc. Acetobacter pasteurianum váng khô và nhăn nheo. Acetobacter suboxydans váng mỏng dễ tan dã. Acetobacter curvum sinh ra acid acetic với nồng độ cao nhưng tạo váng không chắc chắn [2]. * Đặc điểm sinh trưởng. Vi khuẩn phát triển trong phạm vi nhiệt độ 12 - 35ºC, pH = 3,0 - 6,5; hiếu khí tuyệt đối. Vi khuẩn Acetobacter có khả năng sử dụng nguồn cacbon khác nhau để sinh trưởng và phát triển. Đa số các loài Acetobacter có khả năng đồng hóa muối amôn, có khả năng phân gỉai pepton. Acetobacter đòi hỏi phải có một số vitamin nhất định như acid pantothenic và các chất khoáng như K, Mg, Ca, Fe, S, P… ở dạng muối vô cơ và hợp chất hữu cơ. Do có bia, dịch thủy phân nấm men, nước mạch nha, nước trái cây… là nguồn dinh dưỡng tốt cho sự phát triển của vi khuẩn Nguyễn Thị Thơm 7 K33C - Sinh Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp Acetobacter. Tính chất đặc trưng của của Acetobacter là oxy hóa rượu thành acid acetic. Ngoài khả năng lên men tạo acid acetic, một số loài Acetobacter còn tổng hợp được vitamin B1, B2, oxy hóa propanol thành acid propionic, oxy hóa sorbit thành đường sorbose dùng trong công nghiệp sản xuất vitamin C, oxy hóa glycerin thành dioxyaceton, oxy hóa glucose thành acid gluconic [19]. 1.2. Vị trí và đặc điểm của vi khuẩn Acetobacter xylinum 1.2.1. Vị trí Acetobacter xylinum là tên gọi chính thức theo hệ thống danh pháp quốc tế 1990. Theo hệ thống phân loại của nhà khoa học Bergey thì Acetobacter xylinum thuộc giống Acetobacter, họ Pseudomonadaceae, bộ Pseudomonadales, lớp Schizomycetes. Việc phân loại vi khuẩn còn nhiều tranh cãi, có một số tác giả coi Acetobacter xylinum như một loài phụ của Acetobacter acetid [17]. 1.2.2. Đặc điểm vi khuẩn Acetobacter xylinum * Đặc điểm hình thái Acetobacter xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, có thể di động hay không di động, không sinh bào tử. Chúng là vi khuẩn Gram âm, nhưng đặc điểm nhuộm Gram có thể thay đổi do tế bào già đi hay do điều kiện môi trường. Chúng có thể đứng riêng lẻ hay xếp thành chuỗi. Khuẩn lạc của Acetobacter xylinum có kích thước (đường kính khuẩn lạc đạt 1 – 2mm), tròn, bề mặt nhầy và trơn bóng, phần giữa khuẩn lạc lồi lên, dày hơn và sẫm hơn các phần xung quanh, rìa mép khuẩn lạc nhẵn [21]. * Đặc điểm sinh lý – sinh hóa + Đặc điểm sinh lý: Vi khuẩn Acetobacter xylinum phát triển ở nhiệt độ 25 - 350C, môi Nguyễn Thị Thơm 8 K33C - Sinh Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp trường pH = 4 - 6. Nhiệt độ và pH tối ưu tuỳ thuộc vào giống. Ở 370C, tế bào sẽ suy thoái hoàn toàn ngay cả trong môi trường tối ưu. Acetobacter xylinum có khả năng chịu được pH thấp, vì thế thường bổ sung thêm acid acetic vào môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ [9]. + Đặc điểm sinh hoá Năm 1950, Frateur đã chính thức đưa ra một khóa phân loại mới căn cứ vào các tiêu chuẩn: Khả năng oxy hóa acid acetic thành CO2 và H2O; hoạt tính catalase; khả năng sinh trưởng trên môi trường Hoyer… Theo quan điểm này A.xylinum là chủng thuộc chi Acetobacter, họ Pseudomonadaceae, bộ Pseudomonadales, lớp Schizomycetes. Đặc điểm phân biệt với các chủng khác trong cùng một chi được trình bày ở bảng dưới đây: Bảng 1.2. Đặc điểm sinh hoá của chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum theo Pasteur (1950) STT 1 2 3 4 5 6 7 Đặc điểm Hiện tượng Chuyển hoá môi trường chứa Oxy hoá ethanol Bromphenol Blue 0,04% từ màu thành acid acetic xanh sang màu vàng Hoạt tính catalase Hiện tượng sủi bọt khí Sinh trưởng trên Sinh khối không phát triển môi trường Hoyer Chuyển hoá Tạo kết tủa đỏ gạch trong dịch sau glycerol thành lên men dihydroxyaceton Vòng sáng xuất hiện xung quanh Chuyểnhoá khuẩn lạc trên môi trường chứa glucose thành acid CaCO3 Kiểm tra khả năng Không hình thành sắc tố nâu sinh sắc tố nâu Kiểm tra khả năng Váng vi khuẩn xuất hiện màu lam tổng hợp cellulose Nguyễn Thị Thơm 9 Kết quả + + _ + + _ + K33C - Sinh Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp 1.2.3. Sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum * Cấu trúc cellulose Các kỹ thuật hiện đại đã xác định được cấu trúc của cellulose vi khuẩn. Kỹ thuật nhiễu xạ tia X phân biệt các dạng cấu trúc và kích thước của cellulose vi khuẩn. Các kỹ thuật phổ Rama, phân tích phổ hồng ngoại phổ cộng hưởng từ hạt nhân giúp xác định các dạng kết tinh của cellulose vi khuẩn. Cellulose vi khuẩn có đường kính bằng 1/100 đường kính của cellulose thực vật (hình 1.1) Cellulose thực vật Bacterial cellulose Hình 1.1: Cellulose vi khuẩn và cellulose thực vật Cellulose vi khuẩn có cấu trúc siêu mịn và độ của cellulose vi khuẩn gần bằng với độ chịu lực của nhôm. Khi đem so sánh đường kính của cellulose vi khuẩn và cellulose nhân tạo cho thấy: kích thước của cellulose vi khuẩn còn nhỏ hơn kích thước của sợi tổng hợp hóa học có đường kính nhỏ nhất BC là một chuỗi polymer do các glucopyranose nối với nhau bằng liên kết ß - 1,4 glucan [12],[15]. Các sợi mới sinh ra của BC kết hợp lại với nhau để hình thành nên các sợi sơ cấp (subfibril) có chiều dài khoảng 1,5 nm, là những sợi mảnh nhất có Nguyễn Thị Thơm 10 K33C - Sinh Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp nguồn gốc tự nhiên. Các sợi sơ cấp kết hợp thành vi sợi (microfibril). Các sợi nằm trong các bó (bundle) và cuối cùng thành dải (ribbon). Cấu trúc của BC phụ chặt chẽ vào điều kiện nuôi cấy. Ở điều kiện nuôi cấy chính, vi khuẩn tổng hợp những màng celluose trên bề mặt nuôi cấy, tại danh giới giữa bề mặt dịch lỏng và không khí giàu oxi. Các màng BC được gọi là S - BC trên môi trường nuôi cấy tĩnh (S - BC: static BC). Các sợi cellulose sơ cấp liê tục được đẩy ra từ lỗ được xếp dọc trên bề mặt của tế bào vi khuẩn, kết tinh lại thành các vi sợi và bị đẩy xuống sâu hơn trong môi trường dinh dưỡng. Các dải cellulose từ môi trường tĩnh tạo nên các mặt phẳng song song như không có tổ chức, có vai trò chống đỡ cho quần thể tế bào Acetobacter xylinum. * Tính chất của cellulose Chung và Shyu (1999) đã nghiên cứu các tính chất của BC như độ cứng, độ dính, độ dai và ảnh hưởng của dung dịch đường, muối… lên tính chất của BC. Sản phẩm của của cellulose vi khuẩn có một số tính chất như sau: - Độ bền hóa học, độ bền cơ học và sức căng cao. - Khả năng giữ nước và độ ẩm cao, do đó có thể chỉnh độ xốp. - Do khả năng S - BC hình thành sẵn màng, khi ứng dụng trong làm vải không cần qua khâu dệt, làm giấy không cần qua khâu bột giấy. - Có thể theo dõi, kiểm soát lý tính của cellulose do cấu trúc của cellulose vi khuẩn có khả năng biến đổi trong quá trình nuôi cấy. - Kiểm soát được kích thước, cấu trúc và chất lượng của cellulose trong quá trình nuôi cấy tạo cellulose [14]. - Cellulose vi khuẩn là cellulose sinh học duy nhất được tổng hợp mà không gắn ligin, có thể dễ dàng bị phân hủy bởi một số nhóm vi sinh vật. Vì Nguyễn Thị Thơm 11 K33C - Sinh Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp vậy, cellulose vi khuẩn được xem là nguồn nguyên liệu mới có nhiều ưu thế [15]. * Quá trình tổng hợp cellulose của màng bacteria cellulose ở vi khuẩn Acetobacter xylinum. - Vi khuẩn Acetobacter xylinum khi nuôi cấy trên môi trường dịch lỏng trong điều kiện nuôi cấy tĩnh tạo nên một lớp màng trên bề mặt dung dịch, màng này có bản chất từ cellulose kết hợp với tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum gọi là màng BC. - Quá trình sinh tổng hợp BC là một tiến trình bao gồm nhiều bước được điều hoà một cách chuyên biệt và chính xác bằng một hệ thống chứa nhiều loại enzyme, phức hợp xúc tác và các protein điều hoà. - Các enzym tham gia quá trình sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn bao gồm: 1PFK: fructose - 1 - phosphate kinase CS: cellulose synthase PGI: phosphoglucoisomerase Fru - bi - P: fructose - 1,6 - bi phosphate UDPGlc: uridine diphosphoglucose PGM: phosphoglucomutase PTS: hệ thống phosphotransferase FK: fructokinase UGP: UDP - glucose pyrophosphophorylase Glc - 1 - P: glucose - 1 - phosphate GK: glucokinase Fru - 6 - P: fructose - 6 - phosphate PGA: phosphogluconic acid FBP: fructose - 1,6 - biphosphate phosphatase Glc - 6 - P: glucose - 6 - phosphate G6PDH: glucose - 6 - phosphate dehydrogenase Nguyễn Thị Thơm 12 K33C - Sinh Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp - Quá trình sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn gồm nhiều phản ứng liên tiếp nhau, được thực hiện bởi sự tham gia của một hệ các enzym [16]. Hình 1.2: Quá trình tổng hợp cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylium Giai đoạn polymer hóa Đầu tiên enzym glucokinase (GK) xúc tác phản ứng phosphoryl hóa chuyển glucose thànhglucose - 6 - phosphate. Enzym phosphoglucomutase tiếp tục chuyển hóa glucose - 6 - phosphate thành glucose - 1 - phosphate thông qua phản ứng isomer hóa. Glucose - 1 - phosphate nhờ enzym UDP glucose pyrophospholyase chuyển hóa thành UDP - glucose. Cuối cùng, UDP - glucose được tổng hợp nên sẽ được polymer hóa thành cellulose và cellulose được tiết ra môi trường ngoại bào nhờ một phức hợp protein màng là Nguyễn Thị Thơm 13 K33C - Sinh